Aus dem Deutschen Rheumaforschungszentrum (DRFZ)

Dissertation

D-Aminosäuren-substituierte Peptidepitope
induzieren T-Zell-Toleranz in vivo

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Johannes Falk

aus Marburg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
1. PD Dr. T. Kamradt
2. Prof. Dr. C. Baerwald
3. Prof. Dr. O. Liesenfeld

Datum der Promotion: 07.08.2003

Zusammenfassung:

In dieser Arbeit wurde die Induktion spezifischer, immunologischer T-Zelltoleranz als therapeutische Strategie bei Autoimmunerkrankungen im Mausmodell untersucht. Da davon ausgegangen werden muss, dass viele der Autoimmunkrankheiten durch T-Zellen vermittelt sind, ist die Induktion spezifischer T-Zelltoleranz eine besonders interessante Therapiestrategie.
Spezifische T-Zelltoleranz kann mittels Injektion des entsprechenden Peptidantigens induziert werden. Insgesamt sind zur Induktion einer solchen Toleranz, zumindest beim Menschen, relativ hohe Dosen an Peptidantigen notwendig. Die Produktion dieser Peptidantigene ist teuer. Bei unvorsichtiger Gabe kann es zur Anaphylaxie kommen. Es sollte also von Vorteil sein, die zu applizierende Menge an Peptid möglichst gering, dabei aber effizient zu halten. Vermutlich werden Antigene in Form von Peptiden schnell von unspezifischen Peptidasen und Proteasen in nicht-immunogene Fragmente gespalten und ausgeschieden, was wiederum eine hohe Dosierung erforderlich macht.
Im Anfang der vorliegenden Arbeit stand die Hypothese, dass eine Stabilisierung des zu applizierenden Antigens zum Schutz vor Fragmentierung (und damit Wirkungsverlust) eine geeignete Methode sein könnte, Toleranzinduktion effektiver bzw. kostengünstiger zu gestalten.
Bezüglich einer Stabilisierung von Peptiden zeigte sich, dass Peptide, welche aus rechtsdrehenden (D-)Aminosäuren zusammengesetzt sind, nur verzögert durch Proteasen/Peptidasen abgebaut werden. Wir setzten deshalb in dieser Arbeit D-Aninosäuren-substituierte Peptid-Varianten des Ovalbumin_323-339-Peptidepitops (OVA_323-339) ein und betrachteten die Wirkung dieser Peptide in vitro sowie in vivo auf spezifische DO11.10 T-Zellen.
Basierend auf dem Peptidantigen OVA_323-339, wurde zunächst ein minimales Epitop definiert, welches bei etwa gleicher Potenz um 6 Aminosäuren verkürzt werden konnte. Anschließend wurde eine Substitutionsanalyse durchgeführt, in der die ursprüngliche Aminosäuresequenz durch Austausch einiger L-Aminosäuren mittels D-Aminosäuren verändert wurde. Diese neu synthetisierten Peptide wurden zunächst auf ihre Fähigkeit überprüft, die OVA_323-339 spezifischen DO11.10 T-Zellen in vitro zu aktivieren. Parallel konnte gezeigt werden, dass diese synthetisierten Peptidepitope in vitro eine deutlich verlängerte Serumhalbwertszeit aufwiesen.
Im Weiteren wurde versucht, durch systemische Injektion von 300µg D-Peptid-Varianten in BABLB/c Mäusen T-Zelltoleranz zu induzieren. Die ex vivo restimulierten Lymphknoten-Zellen dieser Mäuse präsentierten je nach appliziertem Peptid eine reduzierte Proliferationsbereitschaft und IL-2 Sekretion. Die hier induzierte Toleranz konnte bis zu 60 Tagen post injectionem sowohl für das OVA_323-339 als auch für einige der eingesetzten D-Peptide nachgewiesen werden. Auch nach Reduktion der Peptiddosis auf nur 100µg/Maus, waren die verkürzten und D-Aminosäuren-substituierten Peptide immer noch in der Lage sicher Toleranz zu induzieren. Die induzierte Toleranz durch D-Peptide war dabei der durch das Ausgangspeptid OVA_323-339 induzierten Toleranz vergleichbar stark.
Mit der Hilfe eines Transfermodells in unmanipulierte Mäuse, wurde das Verhalten der spezifischen T-Zellpopulation in vivo beobachtet. Durch den Transfer konnten in den Empfängermäusen (Balb/c) definierte T-Zellpopulationen bekannter Größe erzeugt werden. Mit dem Antikörper KJ1-26.1, der spezifisch den DO11.10-T-Zellrezeptor erkennt, konnten die transferierten Zellen in Geweben der Empfängermaus per FACS-Analyse nachgewiesen und deren Verhalten ex vivo studiert werden. Die intravenöse Injektion der serumstabilisierten Peptidanaloge führte in den transferierten Mäusen je nach Peptid zu einer funktionellen Nichtreaktivität (Anergie) als auch zur Deletion der für das Ausgangs(L-)Peptid spezifischen DO11.10 T-Zellen.
In den oben genannten Versuchen ergaben sich Hinweise dafür, dass die D-Peptide ebenso effektiv sind wie das wesentlich längere Ausgangspeptid OVA_323-339. Zukünftige Experimente werden weitere Aufschlüsse über einen möglichen Vorteil des Einsatzes von D-Peptiden in der Toleranzinduktion erbringen.

Eigene Schlagworte: Periphere T-Zelltoleranz, Toleranzinduktion, Anergie, D-Peptide, Ovalbumin, OVA323-339, DO11.10, alterierte Peptidepitope, Peptidstabilität, Autoimmunität

Abstract:

D-amino acid substituted OVA323-339-variants induce long lasting T cell tolerance in vivo
Induction of antigen-specific peripheral T cell tolerance in autoimmune diseases is an interesting therapeutically strategy. It can be induced by systemic injection of high-dose antigen. Investigations in induction of peripheral T cell tolerance in autoimmune mouse models revealed promising results. But it was also shown that the induced T cell tolerance spontaneously reverses after a period of time. This is probably due to a short in vivo half-life of the administrated peptide antigens. Since durable tolerance is required for this strategy to be of therapeutic value the administrated antigen-dose has to be of avery highand has to be injected repeatedly, and therefore bears an increased risk of anaphylactic reactions or exacerbation of the autoimmune disease. Because of these restrictions and also the high costs of peptide-production and purification, it is not surprising that this therapy didn’t really find its way in to the clinical practice. The discovery that Peptides assembled partly or totally from D-amino acids are much more stable to proteolysis then natural L-peptides and therefore show an increased stability, lead to a wide interest of pharmacologists and immunologists. In former investigations it was shown that D-peptides used as vaccines elicited high levels of neutralizing antibodies so that there is no doubt about their immunogenic potency in vivo. It is also known that a single T cell receptor recognizes a wide range of peptide analogues that closely mimic the natural antigen. These observations led to our hypothesis, that the induction of peripheral T cell tolerance by systemic administration of D-Peptide substituted antigen variants should be possible and could be much more effective than the induction by the wild-type L-peptide. To verify our hypothesis we have chosen the well known OVA323-339 antigen which is recognized by T cells through the presentation in the I-Ad context. In a first step we performed a truncation analysis of OVA323-339 to identify a minimal epitope in it. We were able to demonstrate that the sequence OVA327-337 is as well potent as the original and 6 amino acids longer OVA323-339 sequence. The potency of new defined epitopes was tested by stimulating the OVA323-339 -specific DO11.10 T cells in vitro. In a stepwise performed substitution analysis we attempted to insert some D-amino acids in this novel peptide epitope. The DO11.10 cells only tolerated a few D-amino acid substitutions into the original sequence with the effect of now showing reduced proliferation. Performing an analysis of their half-life in vitro we identified two peptides as interesting candidates for the in vivo tolerance induction experiments. In the in vivo part of this work we induced peripheral tolerance by injecting the novel peptides into BALB/c mice. To monitor the behaviour of the tolerated T cells we also performed adoptive transfer experiments by transferring DO11.10 cells into naive BALB/c mice. With the help of the KJ26-1 antibody whichspecificallyrecognizes the DO11.10 T cell receptor it became possible to detect the transferred T cells ex vivo. Our results demonstrate that induction of peripheral T cell tolerance through injection of D-peptides is possible and long lasting (up to 60 days). Even with a dose reduction we found a stable T cell tolerance under ex vivo restimulation with the original peptide. Summarizing we were able to show that D-peptides are at least as effective as the natural occurring L-peptides inducing tolerance. Much more, the transfer experiments revealed that the kind of induced T cell tolerance (i.e. anergy and/or deletion through activation induced cell death) is antigen dependent and probably differs due to the agonistic potency of the given antigen.

Keywords: Peripheral t cell tolerance, tolerance, Anergy, Autoimmunity, altered peptide ligands, D-peptides, D-amino acids, OVA323-339, Ovalbumin, DO11.10

meinen Eltern,
meiner Schwester

Inhaltsverzeichnis

• 1  Inhaltsverzeichnis
• 2  Einführung
  • 2.1 Das Immunsystem, die Autoimmunität
  • 2.2 T-Zellen
  • 2.3 T-Zell-Aktivierung
    • 2.3.1 Antigen Erkennung durch T-Zellen
  • 2.4 T-Zell-Aktivierung
  • 2.5  Immunologische Toleranz
    • 2.5.1 Zentrale Toleranzinduktion im Thymus
    • 2.5.2 Periphere Toleranzinduktion
      • 2.5.2.1 Periphere Deletion von T-Zellen/ Klonale Deletion
      • 2.5.2.2 Anergie
      • 2.5.2.3 Suppression durch regulatorische Zytokine
      • 2.5.2.4 Immunologische Ignoranz
  • 2.6 Verlust von T-Zell-Toleranz und Entwicklung von Autoimmunität
  • 2.7  (Wieder-) Herstellung von T-Zell-Toleranz
    • 2.7.1 Induktion immunologischer Toleranz durch Applikation von Antigen
  • 2.8  Modelle zur Untersuchung peripherer T-Zell-Toleranz
  • 2.9 Induktion peripherer Toleranz durch alterierte Peptidantigene
  • 2.10  Zielsetzung
• 3  Material
  • 3.1 Mäuse
  • 3.2 Reagentien und Chemikalien
  • 3.3 Puffer und Zellkulturmedien
    • 3.3.1 Puffer
    • 3.3.2  Medien
  • 3.4 Zytokine, Antikörper und synthetische Peptide
    • 3.4.1 Antikörper und Zytokine
      • 3.4.1.1  Antikörper und Zytokine für ELISA
      • 3.4.1.2 Antikörper für FACS-Analyse
    • 3.4.2  Synthetische Peptide
  • 3.5 Geräte
• 4  Methoden
  • 4.1 Tierversuche
    • 4.1.1  i.v. Peptidinjektion
    • 4.1.2 s.c. Peptideinjektionen (Immunisierung)
    • 4.1.3  i.v. Adoptiv Transfer von DO11.10-Mausmilzzellen
    • 4.1.4 Tötung von Versuchtieren
    • 4.1.5  Entnahme von Geweben aus Versuchtieren
  • 4.2 Zellbiologische Methoden
    • 4.2.1  Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Lymphorganen
    • 4.2.2  Kultivierung von Lymphozyten aus Lymphorganen
      • 4.2.2.1  Zählen von Zellen
      • 4.2.2.2 Eingesetzte Zellkonzentrationen
      • 4.2.2.3  In vitro Peptidkonzentrationen und unspezifische Stimulation
      • 4.2.2.4 Kulturbedingungen
      • 4.2.2.5  Überstände zur Zytokinbestimmung, Zellernte, Proliferationsmessung
  • 4.3 Testsysteme
    • 4.3.1  Messung der in vitro Serumstabilität der Peptide
    • 4.3.2  Peptid Schnelltests (Screening)
    • 4.3.3  Versuchsablauf Toleranzinduktion
    • 4.3.4 CTLL-2 / IL-2 Bioassay
    • 4.3.5 Zytokin -ELISA
    • 4.3.6 Präsentation der Graphiken
    • 4.3.7  Festlegung der Toleranzkriterien
    • 4.3.8 FACS-Analyse mit Durchflußcytometrie
      • 4.3.8.1 Prinzip und Durchführung
    • 4.3.9 Oberflächenfärbung
  • 4.4 Statistik
• 5  Ergebnisse
  • 5.1  In vitro Versuche
    • 5.1.1 OVA_327-337 ist ein potentes minimales Epitop am DO11.10 T-Zellrezeptor
    • 5.1.2  In vitro Wirkung von ausgewählten D-Peptiden auf DO11.10 Zellen
    • 5.1.3  Die in vitro Serumstabilität der D-Peptidepitope zeigt sich in einer deutlich verlängerten Serumhalbwertszeit
  • 5.2  In vivo Versuche
    • 5.2.1 Das minimale Epitop OVA_327-337 induziert immunologische Toleranz gegenüber OVA_323-339 in vivo
    • 5.2.2 Induktion peripherer Toleranz mittels D-Peptid-Epitope
    • 5.2.3 Beobachtung der induzierten Toleranz über die Zeit
      • 5.2.3.1 Toleranz 40 Tage post i.v.
      • 5.2.3.2 Toleranz 60 Tage post i.v.
    • 5.2.4 Beobachtung der induzierten Toleranz bei Dosisreduktion
    • 5.2.5 Visualisierung der Toleranzinduktion
      • 5.2.5.1 Erläuterung zur Adoptiv-Transfer-Methode
      • 5.2.5.2 Beispielhafte FACS-Analysen
    • 5.2.6 Toleranzinduktion im Adoptiv-Transfer-System
• 6  Diskussion
  • 6.1 Der DO11.10 T-Zellrezeptor erkennt auch verkürzte OVA-Varianten
  • 6.2 D-Aminosäuren-substituierte Peptide werden vom DO11.10 T-Zellrezeptor erkannt
  • 6.3 D-Aminosäuren-substituierte Peptide weisen eine deutlich verlängerte in vitro Serumhalbwertszeit auf
  • 6.4  D-Aminosäure substituierte OVA –Varianten induzieren periphere Toleranz
  • 6.5 Stabile Toleranzinduktion trotz Dosisreduktion
  • 6.6 Die induzierte Toleranz hält mindestens bis zu 60 Tage an
  • 6.7  Weitere Überlegungen
• 7 Danksagung
• 8 Abkürzungsverzeichnis
• 9 Literaturverzeichnis
• 10 Anhang
  • 10.1 Abkürzungen und Molekulargewichte für Aminosäuren
• 11 Erklärung an Eides statt

Tabellen

• Tabelle 3.1: Verwendete Peptide:  In dieser Tabelle sind die in den Experimenten verwendeten Peptide im IUPAC-Einbuchstaben Code dargestellt. Die Bezeichnung wurde willkürlich gewählt. Zur Orientierung wird die Position in der Sequenz des Gesamtproteins (Ovalbumin) dargestellt. Großbuchstaben = linksdrehende AS, Kleinbuchstaben und Fett = rechtsdrehende AS).
• Tabelle 5.1: Verkürzungsanalyse des OVA_323-339
  Verkürzungsanalyse von OVA_323-339. Aufgeführt sind die AS-Sequenzen der getesteten Peptide und ihre Position im OVA_323-339 Peptid. OVA_323-339 wurde zunächst C-terminal (oberer Teil der Tabelle), dann N-terminal um eine Aminosäure verkürzt. Im unteren Teil wurden einige Peptide von beiden Seiten her verkürzt. DO11.10 Zellen wurden mit den entsprechenden Peptiden stimuliert und die gemessene Proliferation in CPM (counts per minute) angegeben. Der Versuch wurde dreimal wiederholt, die gezeigten Werte stellen den Mittelwert aus den drei Experimenten dar, in der Spalte SEM (Standard Error of Mean) ist der Standardfehler angegeben. Das Originalpeptid OVA_323-339 wurde als Positivkontrolle mitgeführt (besonders gekennzeichnet). Die Negativkontrollen (Zellen ohne Peptid) proliferierten je nach Experiment zwischen 100 und 350 CPM (nicht gezeigt). Offensichtlich wichtige Positionen in der Sequenz von OVA_323-339 wurden grau unterlegt. Rechts ist die entsprechende Anzahl der AS des jeweiligen Peptides aufgeführt.
• Tabelle 5.2: Substitutionanalyse I:
  Ausgehend von der originalen AS-Sequenz von OVA_327-337(VHAAHAEINEA), wurde jede einzelne Position durch jede mögliche D-AS ersetzt. In der linken Spalte (1. Spalte) sind die eingesetzten D-AS gezeigt. Die Spalten 2 bis 12 zeigen die Position, in die ausgetauscht wurde. Zur Orientierung sind die Positionen im Gesamtprotein des Hühnereiweiß angegeben (Ausgangspeptid). DO11.10 Zellen wurden mit den entsprechenden Peptiden stimuliert und die gemessene Proliferation in CPM (counts per minute) angegeben. Positivkontrollen wurden mit OVA_327-337stimuliert. Der Mittelwert lag hier bei 21098 +/- 7881 SEM. Die Proliferation der Negativkontrollen (Zellen ohne Peptid) lag zwischen 173 und 1132. Grau unterlegt sind Peptide, welche mit Werten über 24500 CPM (willkürliche gesetzter Schwellenwert) als interessant eingestuft wurden. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei Experimenten. *Da für Glycin (G) kein Stereoisomer existiert (keine rechtsdrehende Form möglich), wurden die Ergebnisse nicht in weitere Analysen miteinbezogen
• Tabelle 5.3: Substitutionsanalyse II
  Ausgehend von dem Epitop mit der AS-Sequenz yHAAHAEINEA wurde jede einzelne Position durch jede mögliche D-AS ersetzt. In der linken Spalte (1. Spalte) sind die eingesetzten D-AS gezeigt. Spalten 2 bis 12 zeigen die Position, in die ausgetauscht wurde. Zur Orientierung sind die Positionen im Gesamtprotein des Ovalbumins angegeben. DO11.10 Zellen wurden mit den entsprechenden Peptiden stimuliert und die gemessene Proliferation in CPM (counts per minute) angegeben. Als Positivkontrolle wurde das OVA_327-337mitgeführt, der Mittelwert lag hier bei 40986 CPM +/- 6010 SEM. Die Proliferation der Negativkontrollen (Zellen ohne Peptid) lag im Mittel bei 273 CPM. Grau unterlegt sind Peptide, welche mit Werten über 21000 CPM (willkürlich gesetzter Schwellenwert) als interessant eingestuft wurden. Der Versuch wurde 2mal wiederholt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment. *Da für Glycin (G) kein Stereoisomer existiert, wurden die nicht in weiteren Analysen miteinbezogen.
• Tabelle 5.4: Übersicht Peptide im Vergleich (Proliferation und in vitro Serumhalbwertszeit)
  Übersicht über die eingesetzten Peptidepitope in ihrer stimulatorischen Potenz auf DO11.10 Zellen (bzw. DO11.10-Maus Milzzellen) unter Angabe der betreffenden in vitro Serumhalbwertszeit (s.a. 5.1.3). Die Peptidkonzentration bei halbmaximaler Proliferation ergeben sich aus den Experimenten in 5.1.2 (einige Peptide nicht gezeigt) und wurden Proliferations- und Zytokindiagrammen entnommen. Gezeigt ist die Konzentration in µg/ml an zugegebenem Peptid bei der DO11.10 Zellen die halbmaximale Proliferation von OVA_323-339 erreichten.
• Tabelle 5.5: Dauerhaftigkeit der induzierten Toleranz im Überblick, Proliferation.
  Gezeigt sind die bezüglich Proliferation gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind. Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben.
• Tabelle 5.6: Dauerhaftigkeit der induzierten Toleranz im Überblick, IL-2 Sekretion.
  Gezeigt sind die bezüglich IL-2 Sekretion gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind. Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben. (n.u. = nicht untersucht)
• Tabelle 5.7: Toleranzinduktion bei Dosisreduktion, Proliferation. Gezeigt sind die bezüglich Proliferation gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind. Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben.
• Tabelle 5.8: Toleranzinduktion bei Dosisreduktion, IL-2 Sekretion.
  Gezeigt sind die bezüglich IL-2 Sekretion gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind. Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben.
• Tabelle 5.9: Zusammenfassung der Transfer-Experimente
  Gezeigt sind die bezüglich Proliferation und IL-2 Sekretion gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben.
• Tabelle 10.1 Abkürzungen und Molekulargewichte für Aminosäuren nach IUPAC (= engl. International Union of Pure and Applied Chemistry)

Bilder

• Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des T-Zellrezeptor/CD3-Komplexes
• Abbildung 2.2: T-Zell-Aktivierung
• Abbildung 2.3: Postulierte Mechanismen für periphere T-Zell-Toleranz
• Abbildung 4.1: : Schema zur Veranschaulichung des Toleranzkriteriums
• Abbildung 5.1: in vitro Wirkung der OVA-Peptide auf DO11.10 Zellen im Vergleich
• Abbildung 5.2 in vitro Serumstabilität, Peptide im Vergleich
• Abbildung 5.3: Zusammenfassung Toleranzinduktion mit D-AS substituierten Peptiden
• Abbildung 5.4: Zusammenfassung Tag 40
• Abbildung 4.5 Zusammenfassung der Tag 60 Versuche
• Abbildung 5.6 Dosisreduktion im Vergleich, Zusammenfassung der Proliferation
• Abbildung 5.7: Exemplarische FACS-Analysen Vergleich BALB/c- vs. DO11.10 Maus
• Abbildung 5.8:Exemplarische FACS-Analysen bei adoptivem Transfer
• Abbildung 5.9: Zusammenfassung Transferexperimente
• Abbildung 5.10: Frequenz normierte Zusammenfassung der adoptiv-Transfer-Experimente