Material

Mäuse

BALB/c-Mäuse:

H-2d Haplotyp. Inzuchtstamm, ursprünglich Bar Harbor Main

DO11.10-Mäuse:

H-2d Haplotyp. Transgener Mäusestamm. Transgen für α/β-T-Zellrezeptor. Die T-Zellen dieser Mäuse exprimieren den α/β-T-Zellrezeptor der T-Zell-Hybridomlinie DO11.10, dieser ist für die Aminosäuresequenz (323-339) des Ovalbumin-Proteines spezifisch. Das Peptid wird gebunden am MHC-Klasse ΙΙ-Molekül-I-Ad erkannt. Die Mäuse werden auf dem BALB/c-Hintergrund gehalten.

BALB/c X DO11.10- Mäuse: Rückkreuzung, MPI für Infektionsbiologie,BgVV.

Alle verwendeten Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen in den Räumlichkeiten des BgVV Berlin Marienfelde gehalten.

Reagentien und Chemikalien

• Ammoniumchlorid:

Merck, D-64271 Darmstadt

• BSA (engl.,Bovin Serum Albumin):

ICN, D-37269 Eschwege

•Complete Freunds Adjuvants (engl., CFA)

Sigma, St. Louis, Missouri USA

• Dinatriumcarbonat:

Merck, D-64271 Darmstadt

• Dimethylsulfoxid:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Ethanol absolut:

Merck, D-64271 Darmstadt

• ExtrAvidin-Peroxidase:

Sigma, D-89552 Steinheim

• FCS:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Ficoll Paque:

Pharmacia Biotech, D-79111 Freiburg

• L-Glutamin:

Seromed, D-12247 Berlin

• Ionomycin:

Sigma, D-89552 Steinheim

• 2-Mercaptoethanol:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Natriumacetat:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Natriumazid:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Natriumchlorid:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Natriumhydrogencarbonat:

Sigma, D-89552 Steinheim

• NMS (Normal-Mausserum):

BALB/c DRFZ

• Paraformaldehyd:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Phosphate buffered saline (PBS):

Sigma, D-89552 Steinheim

• Penicillin-Streptomycin:

Seromed, D-12247 Berlin

• PMA:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Propidiumiodid (PI):

Sigma, D-89552 Steinheim

• Schwefelsäure:

Merck-Schuchardt, D-85662 Hohenbrunn

• [Methyl-^3H]-Thymidin:

Amersham, D-79111 Freiburg

• Microscint:

Packard, D-63303 Dreieich

• Tris:

ICN, D-37269 Eschwege

• TrypanBlue Solution (0,4%):

Sigma, D-89552 Steinheim

• 2,2,2-Tribromethanol:

Fluka, D-89231 Neu-Ulm

• TMB-Tabletten:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Tris-HCl:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Tween-20:

Merck-Schuchardt, D-85662 Hohenbrunn

• Wasserstoffperoxid:

Sigma, D-89552 Steinheim

• Zitronensäure:

Sigma, D-89552 Steinheim

Puffer und Zellkulturmedien Puffer

• PBS:

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

4,3 mM Na₂HPO₄•2H₂O

1,4 mM KH₂PO₄

• Lysis-Puffer:

0.83% NH₄Cl (w/v), 10 mM Tris, (pH=8,0) in PBS

• Saponin-Puffer:

0,5% Saponin (w/v), 0,5% BSA (w/v) in PBS

• FACS-Puffer:

PBS/0,5% BSA(w/v)/0.01% NaN₃(w/v)

• TMB-Puffer:

0,05 M Na₂HPO₄•2H₂O

243 mM Zitronensäure

• Block-Puffer(IL-2):

Dulbecco’s PBS/0,5% BSA

• Inkubations-Puffer (PBT):

PBS/0,5% BSA/0,05% Tween-20

• Wasch-Puffer:

PBS/ 0,05% Tween-20

• ELISA-Stop-Lösung:

12,5% H₂SO₄

• Zell-Fixierungspuffer:

PBS / 2% PFA (w/v)

Medien

Basierend auf RPMI 1640 der Firma Seromed, D-12247 Berlin.

Kulturmedium (KM): RPMI-1640, 10% FCS, 10 mM L-Glutamin, 20 µM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin
Wasch-Medium: RPMI-1640, 1% FCS

Zytokine, Antikörper und synthetische Peptide Antikörper und Zytokine Antikörper und Zytokine für ELISA

• Anti-murines-IL-2

: Klon JES6.1A12; rat IgG2a, DRFZ

• Anti-murines-IL-2-biot.

: Klon JES6.5H4, biotinyliert DRFZ

• Anti-murines-IL-4

: Klon 11B11 Ratten-IgG, DRFZ

• Anti-murines-IL-4-biot.

: Klon BVD 624-6, biotinyliert, DRFZ

• Anti-murines-INFγ

:Genzym INFγ ELISA KIT 80-3955-02

• Anti-murines-INFγ-biot.

:Genzym INFγ ELISA KIT 80-3955-02, biotinyliert

• Anti-murines-IL-10

:Klon SXC2, DRFZ

• Anti-murines-IL-10-biot.

:Klon SXC1, biotinyliert, DRFZ

• murines IL-2

: rekombinantes murines IL-2, DRFZ

• murines IL-4

:rekombinantes murines IL-4, R&D Systems

• murines INFγ

:Genzym INFγ ELISA KIT 80-3955-02

• murines IL-10

:rekombinantes murines IL-10, DRFZ

Antikörper für FACS-Analyse

• Anti-Maus-OVA-T-Zellrezeptor

KJ1-26.1-FITC,
KJ1-26.1-PE,
KJ1-26.1-Biotin:

Klon KJ1-26.1; spezifisch gegen DO11.10α/β-T-Zellrezeptor; B-Zellhybridom, DRFZ, biotinyliert bzw. konjugiert.

• Anti-Maus-CD4-PE,
Anti-Maus-CD4-FITC:

Klon GK1.5; (DRFZ) konjugiert.

• SA-PerCP vonBecton-Dickinson, Heidelberg;
Streptavidin zur Bindung an Biotin als Sekundärfarbstoff für Biotin gekoppelte Antikörper eingesetzt.

Synthetische Peptide

Alle in dieser Arbeit verwendeten Peptide wurden hergestellt durch Dr. Achim Kramer, Institut für Medizinische Immunologie, Universitätsklinikum Charité, Humboldt-Universität, D-10117 Berlin.
Als Ausgangspeptid und Positivkontrolle wurde das Peptidepitop (323-339) des Ovalbumin-Proteins aus Hühnereiweiss (kurz: OVA_323-339) verwendet. Um die Spezifität der beobachteten Reaktionen zu überprüfen, wurde in den in vitro Experimenten Motten-Cytochrom-C (MCC) (88-103) als alternativer Antigenstimulus angeboten. Für die i.v. Injektionen wurden die Peptide in PBS (in der Regel 1mg Peptid/ml PBS) gelöst. Die Proben wurden bei -20°C gelagert.
In der Tabelle unten sind die in den Experimenten verwendeten Peptide im IUPAC-Einbuchstaben-Code (IUPAC= engl. International Union of Pure and Applied Chemistry) dargestellt siehe auch Tabelle 10.1.

Bezeichnung

Position

Aminosäuresequenz

OVA_323-339

323-339

I

S

Q

A

V

H

A

A

H

A

E

I

N

E

A

G

R

OVA_327-337

327-337

V

H

A

A

H

A

E

I

N

E

A

OVA_328-336

328-336

H

A

A

H

A

E

I

N

E

OVA_{(327-337)327y}

327-337

y

H

A

A

H

A

E

I

N

E

A

OVA_{(327-337)327y337y}

327-337

y

H

A

A

H

A

E

I

N

E

y

OVA_{(327-337)327y,336q}

327-337

y

H

A

A

H

A

E

I

N

q

A

OVA_{(327-338)327y,338a}

327-338

y

H

A

A

H

A

E

I

N

E

A

a

MCC

88-103

K

N

E

R

A

D

L

I

A

Y

L

K

Q

A

T

K

Tabelle 3.1: Verwendete Peptide:
In dieser Tabelle sind die in den Experimenten verwendeten Peptide im IUPAC-Einbuchstaben Code dargestellt. Die Bezeichnung wurde willkürlich gewählt. Zur Orientierung wird die Position in der Sequenz des Gesamtproteins (Ovalbumin) dargestellt. Großbuchstaben = linksdrehende AS, Kleinbuchstaben und Fett = rechtsdrehende AS).

Für das zunächst erfolgende Screening (Schnelltest) in der Verkürzungsanalyse ( engl. Truncationanalysis)und bei der Substitutionsanalyse wurden die Peptide auf einer Zellulosematrix synthetisiert (siehe auch Grogan und Kramer 1999 [81]). Nach der Synthese wurden die Peptide von der Zellulose durch Behandlung mit gasförmigen NH₃ abgespalten und die Spots ausgestanzt. Die ausgestanzten Spots wurden anschließend in sterilem Aqua bidest (1ml/Peptid/Spot) gelöst und archiviert. Die Peptid-Spots wurden bei -20°C verwahrt.
Für die Titrationsversuche sowie für die in vivo Versuche wurden die ausgewählten Peptide konventionell synthetisiert, aufgereinigt und mittels HPLC und Massenspektrometrie charakterisiert.

Geräte

ELISA-Reader:

MR5000 Microplate reader von Dynatech, Denkendorf

Durchflußcytometer:

FACScan von Becton Dickinson, Heidelberg

β-Szintillationszähler:

Microplate Scintillation Counter von Packard, Dreieich