Methoden

Tierversuche i.v. Peptidinjektion

Je nach Experiment wurden 100µg bis 300µg Peptid in 300µl PBS gelöst und injiziert. Vor der Injektion wurden die Probenlösungen 15 min bei 2000facher Erdbeschleunigung (g) zentrifugiert, um Aggregate zu sedimentieren. Die i.v. Injektionen erfolgten in die laterale Schwanzvene. Die Negativkontrollen (Kontrollmäuse) erhielten PBS ohne Peptid injiziert.

s.c. Peptideinjektionen (Immunisierung)

Zu gegebenen Zeitpunkten (Tag 11, bzw. 33-34 oder 53-54 nach i.v. Injektion des Peptides) wurden die Mäuse durch eine subkutane Injektion von OVA_323-339 (100µg) in complete Freund´s adjuvans (CFA) pro Maus in vivo immunisiert. Es wurde Peptid in PBS (Konzentration 1mg/ml) in gleichem Volumen CFA gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit Hilfe eines Ultraschallrührstab zu einer Emulsion vermischt. Jeder Maus wurden 2x100µl Emulsion s.c. in das Hinterteil, rechts und links neben die Schwanzwurzel injiziert.

i.v. Adoptiv Transfer von DO11.10-Mausmilzzellen

Milzzellen (Präparation s.u.) aus DO11.10-Mäusen bzw. BALB/c x DO11.10- Mäusen wurden in Suspension gebracht, 3x in PBS gewaschen und 3x mit Cell-Strainern gesiebt. Jeder Maus wurden 3 x 10⁷Zellen in 300µl PBS i.v. in die laterale Schwanzvene injiziert. Bis zur weiteren Verwendung der transferierten Mäuse wurde eine Pause von 3 Tagen eingehalten. Hiermit sollte gewährleistet werden, dass die transferierten Zellen in der Empfängermaus normal verteilt sind.

Tötung von Versuchtieren

Die verwendeten Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet.

Entnahme von Geweben aus Versuchtieren

In der Regel wurden die Mäuse 6-8 Tage nach erfolgter s.c. Immunisierung getötet. Nachdem die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet waren, wurde das Fell mit 70% Alkohol desinfiziert. Die Haut über dem Bauch wurde mittels einer sterilen Schere mit einem ca. 5cm langen longitudinalen Hautschnitt eröffnet. Die Maus wurde nochmals mit 70% Alkohol desinfiziert. Durch einen weiteren Schnitt am linken Rippenbogen konnte die Milz dargestellt und gegebenenfalls entfernt werden. Zur Evaluation der Toleranz nach s.c. Immunisierung wurden folgende Lymphknoten entnommen: Die paarig angelegten inguinal-superfizialen und poplitealen Lymphknoten, weiterhin die 2-3 unpaarig angelegten periaortalen (iliakalen) Lymphknoten. Für eine Bestandsaufnahme z.B. für eine Kinetik nach adoptivem Transfer wurden zusätzlich zu den oben genannten Lymphknoten noch die axillären und brachialen Lymphknoten entnommen. Die Gewebe wurden mit Hilfe einer sterilen Pinzette entnommen und zügig in Kulturmedium (KM) überführt und wie in Punkt 4.2.1 geschildert weiterverarbeitet.

Zellbiologische Methoden

Alle Arbeiten an Zellen und Zelllinien wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, um Kontaminationen der Kulturen mit Pilzen, Bakterien, Viren, Mycoplasmen, etc. zu vermeiden. Die eingesetzte Zelllinie CTLL-2 wurde vor Einsatz in den Experimenten auf Durchseuchung mit Mycoplasmen überprüft. Die eingesetzte Zelllinie erwies sich als mycoplasmenfrei. Beim Umgang mit Tieren, Zellen, Gefahrenstoffen, Radioaktivität und Geräten wurde nach den derzeitigen arbeitsschutzrechtlichen Vorschriften gehandelt.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Lymphorganen

Die entnommene Milz bzw. entnommenen Lymphknoten wurden samt Medium in einen Zellsieb (engl. Cell-Strainer) gegossen und homogenisiert. Die entstandene Zellsuspension wurde 10 Minuten bei 200xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Um die Erythrozyten zu lysieren, wurden die sedimentierten Zellen in 10 ml Lysis-Puffer resuspendiert und 10 Minuten (min) bei 4°C (auf Eis) inkubiert, die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 ml Kulturmedium gestoppt. Die Zellsuspensionen wurden noch zweimal mit Wasch-Medium gewaschen und in Kulturmedium resuspendiert. Vor dem letzten Waschschritt wurde Zelldebris mittels eines Cell-Strainer entfernt. Die Zellzahl wurde bestimmt (s. 4.2.2.1). Im Anschluss wurden die Zellen auf die gewünschte Konzentration gebracht.

Kultivierung von Lymphozyten aus Lymphorganen Zählen von Zellen

Für die Auszählung wurden die Zellen mit Trypanblau eins zu eins gemischt. Tote Zellen wurden durch Aufnahme von Trypanblau identifiziert und bei der Zählung nicht berücksichtigt.
Die Zellzahl wurde mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.

Eingesetzte Zellkonzentrationen

Milzzellsuspensionen wurden, wenn nicht anders erklärt, auf eine Konzentration von (2x10⁶ Zellen/ml) gebracht und in Tripletts (3 benachbart liegende Vertiefungen einer 96-Vertiefungen-Zellkulturplatte) mit einer Endkonzentration von 2x10⁵ Zellen/200µl/Vertiefung überführt.
Lymphknotenzellsuspensionen wurden, wenn nicht anders erklärt, auf eine Konzentration von (3x10⁶ Zellen/ml) gebracht und in Tripletts einer 96-Vertiefungen-Zellkulturplatte mit einer Endkonzentration von 3x10⁵ Zellen/200µl/ Vertiefung überführt.

In vitro Peptidkonzentrationen und unspezifische Stimulation

Es wurde eine Verdünnungsreihe der Peptide hergestellt und in Tripletts überführt. Wenn nicht anders bezeichnet, handelte es sich um die folgenden Peptidkonzentrationen des entsprechenden Peptidantigens: Es wurde mit einer Peptid-Konzentration von 100µg/ml begonnen und jeweils in 1:10-Schritten verdünnt zu 10, 1, 0.1 und 0.01µg/ml.
Die Hintergrundproliferation (Negativkontrollen) wurde an Tripletts festgestellt, die Zellen, aber kein Antigen enthielten. Als Positivkontrolle, d.h. als Kontrolle der Funktionalität und Proliferationsfähigkeit der Zellen, wurden folgende Substanzen zu den Zellen gegeben: 20ng/ml PMA und 500ng/ml Ionomycin.

Kulturbedingungen

Die Kulturplatten wurden unter sterilen Bedingungen in einem Inkubator untergebracht: Temperatur 37°C, CO₂-Konzentration 5%, Luftfeuchtigkeit 95%.

Überstände zur Zytokinbestimmung, Zellernte, Proliferationsmessung

Nach dem Ausplattieren der Zellen (s. o.) wurde die Platte für 48h im Brutschrank inkubiert. Nach 48h wurde jeweils 100µl/Vertiefung des zellfreien Überstandes vorsichtig abgenommen und auf eine andere 96- Vertiefungen-Platte übertragen. Das ausplattierte Schema wurde dabei beibehalten. Die Überstände wurden zur Analyse des Zytokingehaltes im ELISA oder CTLL-2, IL-2 Bioassay abgenommen und bis zur weiteren Verwertung mindestens 48h bei -20°C aufbewahrt. Nach Abnahme der Überstände wurde 1µCi ³H Thymidin (³H THY)/ Vertiefung gelöst in 20µl RPMI zugegeben und die Zellen für weitere 16h inkubiert und dann für mind. 24h eingefroren. Zum Messen der Proliferation wurden die Zellen aufgetaut und auf einer Filterplatte geerntet und nach Zugabe von Szintilationflüssigkeit mittels eines Scintilations-ß-Counters die Inkorporation des ³H THY gemessen. Jede Vertiefung auf der Platte wurde eine Minute lang gemessen, die gemessene Radioaktivität wurde als CPM (engl. counts per minute) ausgegeben.

Testsysteme Messung der in vitro Serumstabilität der Peptide

Zur Messung der in vitro Serumstabilität wurde je 1mg Peptid in Mausserum aufgelöst und steril filtriert. Das Gemisch wurde bei 37°C in einem Schüttler inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden 50µl aus dem Peptid-Serum-Gemisch entnommen, in ein Röhrchen (Cryotube) überführt und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Negativkontrolle wurden bereits nach kurzem Mischen entnommen (Zeitpunkt t = 0). Bis zur endgültigen Messung wurden die Proben bei -70°C aufbewahrt.
Für die Messung wurden die Proben nacheinander aufgetaut und mit HPLC-Methode gemessen (20µl/Injektion). Zur Berechnung der Konzentration wurde die Fläche des jeweiligen Peptid-Peaks ermittelt und mit der des Peaks bei t = 0 verglichen und in Prozent umgerechnet. Um Schwankungen auszugleichen wurde ein unabhängiger Peak (Referenzpeak), der sich unabhängig und konstant in Größe und Zeitpunkt seiner Erscheinung zeigte, herangezogen. Dieser Referenzpeak entsprach einem unbekannten endogenen Molekül aus dem Mausserum. Bei Schwankungen des Referenzpeaks wurden die entsprechenden Peptid-Peaks rechnerisch korrigiert.

Peptid Schnelltests (Screening)

In einem ersten Screening wurde die Wirkung von synthetisierten Peptiden auf DO11.10 Zellen getestet. Die Peptide wurden dafür auf einer Zellulosematrix synthetisiert und, wie in 3.4.2 beschrieben, weiterverarbeitet. Für die Assays wurden die Peptide aufgetaut und 2h lang gemischt. Jeweils 5µl Peptidlösung wurden in eine Vertiefung einer 96-Vertiefungen-Platte pipettiert (Endkonzentration ca. 1µg Peptid/ml). Bei jedem Test wurde das OVA_323-339 als Positivkontrolle mitgeführt. Aus DO11.10 Mausmilzen wurde eine Einzelzellsuspension bereitet. Jeweils 1x10⁵ Zellen /Vertiefung in 100µl Komplettmedium wurden zu den Peptiden hinzupipettiert. Als Negativkontrollen dienten Zellen, die kein Peptid als Stimulus erhielten. Nach einer Inkubationszeit von 48h wurde 1 µCi ³H THY/ Vertiefung zugegeben und die Zellen nach weiteren 18h eingefroren. Wie in 4.2.2.5 beschrieben, wurden die Zellen geerntet und gemessen. Die Assays wurden 2-3 mal wiederholt

Versuchsablauf Toleranzinduktion

BALB/c bzw. transferierte BALB/c Mäuse (siehe 4.1.3) wurden an Tag 0 mit dem jeweiligen Peptide i.v. in die laterale Schwanzvene gespritzt. Es wurden 300µg bzw. 100µg Peptid/Maus gelöst in 300µl/PBS injiziert (Gesamtvolumen 300µl/Maus). Die Kontrollmäuse, in der Regel 3-4, erhielten 300µl PBS/Maus i.v. (s. 4.1.1).
Als (positive) Kontrollgruppe dienten in allen Toleranz-Experimenten 2-3 Mäuse, die das WT Antigen OVA_323-339 in der gleichen Menge i.v. erhielten.
Nach der i.v.-Injektion der Peptide wurde über mehrere Tage beobachtet, ob die Tiere die Injektion gut vertrugen. An Tag 10, bzw. 32-33, bzw. Tag 53 bekamen alle Mäuse eine s.c. Injektion von 100µ OVA_323-339 in CFA pro Maus. 7 Tage nach Immunisierung wurden die Mäuse getötet und die drainierenden Lymphknoten (s. 4.1.5) entnommen. Eine Einzelzellsuspension wurde bereitet und die Zellen mit verschiedenen OVA_323-339 Konzentrationen in vitro restimuliert. In der Regel wurden die Zellen jeder Maus getrennt von den Zellen anderer Tiere kultiviert und im Hinblick auf Toleranz untersucht. Nach 48h wurden, die Zellen wie unter 4.2.2.5 beschrieben, weiterbehandelt. Im Falle von transferierten Mäusen wurden am Tag der Tötung aus der bereiteten Einzelzellsuspension ca. 1x10⁶ Zellen entnommen und der FACS-Analyse zugeführt.

CTLL-2 / IL-2 Bioassay
Die CTLL-2 Zellen wurden 3-4 Tage nach Fütterung für die Detektierung des IL-2 aus Überständen der Zellkulturen eingesetzt. Vor dem Ausplattieren wurden die Zellen 3x mit Komplettmedium gewaschen, gezählt und in einer Konzentration von 2x10⁴/Vertiefung in 100µl auf eine 96- Vertiefungen-Rundbodenplatten ausplattiert. Die Platten mit Überständen wurden aufgetaut und auf 37°C aufgewärmt. 50µl Überstand wurden aus jeder Vertiefung aufgezogen und zu den CTLL-2 Zellen gegeben, das ausplattierte Schema wurde beibehalten. Auf jeder Platte wurde eine IL-2 Standardreihe (recombinantes Maus = rm IL-2) in Tripletts mitgeführt. Die IL-2 Verdünnungsreihe begann bei 50ng/50µl (1. Triplett) und wurde 1:4 bis zu 3pg/ 50µl (8.Triplett) verdünnt und zu den CTLL-2 hinzu pipettiert. Die Endkonzentration begann demnach bei 16ng/ml und endete bei 1pg/ml. Die Platten verblieben bei 37°C im Inkubator. Nach ca. 24h wurde 1µCi ³H THY/Vertiefung in 20µl zugegeben. Die Platten wurden nach weiteren 12h Inkubation eingefroren. Proliferationsmessung s. 4.2.2.5. Die Zelllinie wurde im experimentfreien Intervall alle 3-4 Tage 1:5 geteilt und mit 10U/ml rmIL-2 gefüttert.
Zytokin -ELISA
Alle Zytokin-ELISA wurden nach der Sandwichmethode durchgeführt. Die Vertiefungen einer polymeren Matrix (96-Vertiefungen- Mikrotiterplatte aus Polyvinylchlorid) wurden mit dem Primärantikörper in PBS, 50µl/ Vertiefung über Nacht bei 4°C beschichtet. Ungebundener Primärantikörper wurde durch 3x Waschen mit Wasch-Puffer abgespült. Unspezifische Bindungen wurden durch Zugabe von 0,5% (w/v) BSA in PBS, 200µl/ Vertiefung für 1h bei 37°C blockiert. Der Standard und die Kulturüberstände (50µl/ Vertiefung) wurden dazu pipettiert und für 1h bei 37°C inkubiert. Je nach Zytokin wurde eine entsprechende Standardreihe mitgeführt.
Standardreihen:

Rekombinantes Maus-Zytokin

IL-2

IL-4

INFγ

IL-10

Anfangskonzentration

100ng/ml

10ng/ml

10ng/ml

100ng/ml

Verdünnungsstufen/-faktor

8 / 3

8 / 3

8 / 3

8 / 3

Niedrigste Konzentration

0,05ng/ml

4pg/ml

4pg/ml

0,05ng/ml

Der Sekundärantikörper war stets an Biotin gekoppelt und wurde in 2µg/ml PBT gelöst, in 50 μl/ Vertiefung zugegeben und bei 37°C 1h inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte die Zugabe von Streptavidin (Extravidin, 1:1000 verdünnt in PBT, 50µl/ Vertiefung, 1h bei 37°C). Start der Farbreaktion durch Zugabe von Wasserstoffperoxid-H₂O₂. Hierfür wurde kurz vor Zugabe eine Lösung aus 10ml TMB-Puffer, einer Tablette TMB und 4 μl H₂O₂ frisch hergestellt und je 100µl pro Vertiefung rasch pipettiert. Je nach dem, wie weit die Färbung der Standardkurve fortschritt, wurde die Farbreaktion durch Zugabe von 12,5%iger Schwefelsäure (50µl/ Vertiefung) beendet.
Es erfolgt ein Farbumschlag von Blau zu Gelb. Die Extinktion wurde bei 450 nm in einem ELISA-Messgerät gemessen. Die Standardkurve mit Regressionslinie und die entsprechenden Zytokinkonzentrationen der Proben wurden mit Hilfe eines Computers ermittelt. Nach jeder Inkubation und nach dem Blocken wurden die Platten 5 bzw. 3x mit Wasch-Puffer abgespült.
Präsentation der Graphiken
Um die Ergebnisse untereinander besser vergleichen zu können, wurde eine Standardisierung der Präsentation durchgeführt. Prinzipiell wurden alle Mäuse einer Gruppe zu einem Graph zusammengefasst. Die Präsentation der Werte innerhalb einer Graphik wurden in % von PBS max angegeben. PBS max ist dabei der maximal erreichte CPM-Wert (~ höchste ³H THY Aufnahme) der Lymphknotenzellen von Mäusen, welche PBS erhalten hatten (Negativkontrollen). Jeder Wert innerhalb des gezeigten Experimentes wurde auf PBS max bezogen und in % von PBS max (zuzüglich des Standardfehlers SEM) angegeben. Diese Standardisierung wurde auch für die Präsentation der IL-2 Bioassays durchgeführt.
Festlegung der Toleranzkriterien
Um die Dosis/Immunantwort-Kurven zu erstellen, wurden der Mittelwert und die Standardabweichung aus den drei Einzelwerten für jeden Messzeitpunkt gebildet und in einem x/y-Diagramm aufgetragen. Auf der logarithmisch skalierten x-Achse wurde die Antigenkonzentration in µg/ml und auf der linear skalierten y-Achse wurden die CPM angegeben. Das Kriterium dafür, ob eine Maus, die mit Peptid i.v. injiziert wurde, tolerant war, wurde folgendermaßen festgelegt:
Zunächst wurde die Dosis/Immunantwort-Kurve der Kontroll-Mäuse betrachtet. Unabhängig davon, ob es sich nur um die Beurteilung der Proliferationsfähigkeit der Lymphozyten oder um das IL-2 Bioassay handelte, wurde der Maximalwert (in cpm) ermittelt. Dieser Wert wurde halbiert und dann die zu diesem Halbmaximalwert gehörige Antigenkonzentration abgelesen.
Eine mit Peptid injizierte Maus wurde dann als tolerant angesehen, wenn sie mindestens 50mal mehr Antigen als die Kontrolle benötigte, um diesen Halbmaximalwert zu erreichen.
Bei der Betrachtung der IL-2 Sekretion im CTLL-2 Bioassay, wurde die Toleranzschwelle ebenfalls auf 50 fach gesetzt. Abbildung 4.1 soll die Festlegung des Toleranzkriteriums veranschaulichen.

Abbildung 4.1: : Schema zur Veranschaulichung des Toleranzkriteriums Halblogarhithmische Darstellung. Kurve 1 stellt die Dosis/ Immunantwort der PBS-Kontrolle dar. Die Menge an inkorporiertem ^3H-Thymidin steigt mit zunehmender Ag-Konzentration. Kurve 2 ist eine nicht-tolerante Peptid i.v. behandelte Maus, die weniger als die 50fache Ag-Menge der PBS-Kontrolle zum Erreichen des Halbmaximalwerts benötigt. Kurve 3 steigt zwar mit zunehmender Ag-Konzentration, der „shift“ beim Halbmaximalwert ist jedoch größer/gleich 50mal. Maus 3 ist in diesem Fall tolerant. Bei Maus 4 ist der Shift so groß, dass der Halbmaximalwert nicht mehr im Rahmen des Diagramms erreicht wurde. Maus 4 ist ebenfalls tolerant.
FACS-Analyse mit Durchflußcytometrie Prinzip und Durchführung
Die Durchflußcytometrie gestattet es, durch Messung von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen Zellpopulationen in einem flüssigen Medium voneinander zu unterscheiden und zu charakterisieren. Die Lichtstreuung erfolgt in Vor- und Seitwärtsrichtung (engl. forward- und sidewart-scatter). Zusätzlich zur Streulichtmessung ist die Registrierung von Fluoreszensemissionen möglich. Zur weiteren Differenzierung der Zellen wurden diese mit Farbstoff gekoppelten Antikörpern (AK) beladen werden. Die AK richteten sich dabei spezifisch gegen CD4^{und OVA-T-Zellrezeptor (siehe 3.4.1.1). Durch Bestrahlung mit monochromatischem Licht wurden diese Farbstoffe zur Fluoreszenz angeregt. Zur Analyse wurde 1 ml der Zellsuspension (ca. 1x10⁶ Zellen) in ein Probenröhrchen gegeben. Die Zellen wurden einzeln mit einem fokussierten Argon-Laser (488 nm, 200 mW) durchstrahlt und die Streulicht- und Fluoreszenzsignale gemessen. Über einen angeschlossenen Computer wurden die Messdaten verarbeitet und gespeichert (Software: CellQuest®; Fa. Becton Dickinson, Heidelberg). Von jeder Zelle wurden die folgenden fünf Parameter analysiert :}

PARAMETER

BEMERKUNG

Vorwärtslichtstreuung (FSC=Forward Scatter 2-10° zum einfallenden Licht),

proportional zur Zellgröße

Seitwärtslichtstreuung (SSC=Sideward Scatter; 90° zum einfallenden Licht)

proportional zur Oberflächenstruktur (Membranfaltung) und Granularität der Zelle

Fluoreszenzintensität 1 (FL 1)

proportional zu der Intensität der Anfärbung mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC). FITC hat ein Absorptionsmaximum von 492 nm und ein Emissionsmaximum zwischen 520 nm und 530 nm.

Fluoreszenzintensität 2 (FL 2)

proportional zu der Intensität der Anfärbung einer Zelle mit R-Phycoerythrin (PE). Dieses hat ein Absorptionsmaximum von 488 nm und ein Emissionsmaximum zwischen 570 und 576 nm.

Fluoreszenzintensität 3 (FL 3)

proportional zur Intensität der Anfärbung einer Zelle mit Propidiumiodid (PI), αDIG-Cy5 oder SA-PerCP. PI hat ein Absorptionsmaximum von 536 nm und ein Emissionsmaximum von 617 nm. αDIG-Cy5 hat ein Absorptionsmaximum zwischen 625 und 650 nm und ein Emissionsmaximum von 670 nm. SA-PerCP hat ein Emissionsmaximum von 680 nm.

Mit Hilfe der Software lassen sich alle oben aufgeführten Parameter in einem Diagramm gegeneinander darstellen. (Zellen jeweils als Punkte dargestellt). Um aussagekräftige Werte zu erhalten, wurden in der Regel 5x 10⁴ Zellen, bei geringer Frequenz der gesuchten Population 1x 10⁵ Zellen ausgewertet (siehe Abbildung 5.7: ff).
Oberflächenfärbung
Die Zellsuspension wurde, wie in 4.2.1 beschrieben, hergestellt. 1x10⁶ Zellen wurden entnommen und bei 150 x g 8-10 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Sediment wurde durch Zugabe von jeweils 1ml FACS-Puffer und erneutes Zentrifugieren gewaschen, um Mediumreste vollständig zu entfernen. Unspezifische Bindungen wurden blockiert durch Inkubation der Zellen mit Normal-Maus-Serum (1:10 verdünnt in PBS/0,5% (w/v) BSA) in 50µl Volumen für 10 min auf Eis. Danach wurde der Antikörper zugefügt, geschüttelt und in einem 100µl-Endvolumen für 15 min bei 4°C (auf Eis) inkubiert. Anschließend wurde 1ml FACS-Puffer zupipettiert und ungebundene AK durch 2maliges Waschen entfernt. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment mit dem Sekundärfarbstoff wiederum für 15 min auf Eis inkubiert und 1x mit 1 ml FACS-Puffer gewaschen. Danach wurden die Zellen in 500µl -1ml FACS-Puffer aufgenommen und am FACScan® analysiert. Direkt vor der Messung wurde jeweils 1µl Propidiumiodid (PI) hinzu pipettiert (Markierung toter Zellen).
Als Kontrollen der Doppelfärbung bzw. Dreifachfärbung dienten Einzelfärbungen.
Folgende Farbstoff-Konjugate wurden eingesetzt:

Fluoreszenz

Antikörper

FL1

KJ1-26.1-FITC

FL2

Anti-CD4-PE

FL3

(PI)

Statistik
Sämtliche in den Experimenten ermittelten Werte (z.B. Proliferation in Tripletts) wurden als Mittelwerte mit Standardfehler angegeben.
Der Standardfehler wurde nach folgender Formel berechnet:

Dabei steht SEM für engl.: standard error of the Mean und wird aus dem Mittelwert x aus n Einzelwerten gebildet. Alle statistischen Analysen wurden mit dem Programm Excel^® von Microsoft^® und dem Programm PRISM^® von GraphPad^® durchgeführt.