D-Aminosäuren-substituierte Peptidepitope  induzieren T-Zell-Toleranz in vivo Johannes Falk1672892.1102.2112.32.3.1122.413142.5152.5.12.5.2162.5.2.12.5.2.2172.5.2.3182.5.2.4192.6202.7212.7.12.82223242.92.10253263.13.2273.33.3.1283.3.23.43.4.13.4.1.13.4.1.2293.4.2303.54314.14.1.14.1.24.1.34.1.44.1.5324.24.2.14.2.24.2.2.14.2.2.2334.2.2.34.2.2.44.2.2.54.34.3.1344.3.24.3.3354.3.44.3.5364.3.64.3.7374.3.84.3.8.138394.3.94.45405.15.1.1414243445.1.2455.1.346475.25.2.1485.2.249505.2.35.2.3.151525.2.3.253545.2.455565.2.55.2.5.1575.2.5.258595.2.6606162636646.1656.266676.3686.469707172736.5746.66.77576 7 Danksagung77 8 Abkürzungsverzeichnis7879 9 Literaturverzeichnis80818283848586 10 Anhang8710.1 Abkürzungen und Molekulargewichte für Aminosäuren 11 Erklärung an Eides statt 88deInhaltsverzeichnisHilfe Ergebnisse

Der Ergebnisteil gliedert sich in zwei Teile. Zunächst werden die Ergebnisse der in vitro Versuche und anschließend die Ergebnisse der in vivo Experimente gezeigt.
In vitro wurde zunächst ein minimales Epitop aus dem Peptid OVA323-339 (Aminosäuresequenz = ISQAVHAAHAEINEAGR) durch systematische Verkürzung identifiziert. Anschließend wurde in das verkürzte Epitop in mehreren sukzessiven Schritten D-Aminosäuren eingebracht. Von ausgewählten Peptiden wurde in vitro die Stabilität in Mausserum (als Serumstabilität) bestimmt.

In vitro Versuche OVA327-337 ist ein potentes minimales Epitop am DO11.10 T-Zellrezeptor

Zunächst wurde versucht, ein in seiner Aminosäuresequenz (AS-Sequenz) möglichst kurzes Peptidepitop zu finden. Wir zogen hierfür das bekannte Peptidepitop OVA323-339 (Amino-säuresequenz = ISQAVHAAHAEINEAGR) des Hühnereiweiß (im Weiteren auch als
OVA323-339 bezeichnet) heran und versuchten, es auf ein minimales Epitop zu verkürzen. Das minimale Epitop sollte sich im Idealfall dadurch auszeichnen, dass es bis auf ein notwendiges Maß (Länge) an Aminosäuren verkürzt werden kann, ohne dabei seine Antigenität zu verlieren. Als Maß der Antigenität der gekürzten OVA-Epitope wurde die Proliferation von OVA323-339 –spezifischen DO11.10 T-Zellen herangezogen.
In den Verkürzungsanalysen wurde OVA323-339 jeweils von einem Ende her um eine Aminosäure (AS) verkürzt (Siehe auch 4.3.2.). Die gezeigten Peptide wurden Zellulose gebunden synthetisiert, vom Träger abgespalten und für die Proliferationsassays in Lösung gebracht.Tabelle 5.1 zeigt das zusammengefasste Ergebnis der Verkürzungsanalysen.

Tabelle 5.1: Verkürzungsanalyse des OVA323-339
Verkürzungsanalyse von OVA323-339. Aufgeführt sind die AS-Sequenzen der getesteten Peptide und ihre Position im OVA323-339 Peptid. OVA323-339 wurde zunächst C-terminal (oberer Teil der Tabelle), dann N-terminal um eine Aminosäure verkürzt. Im unteren Teil wurden einige Peptide von beiden Seiten her verkürzt. DO11.10 Zellen wurden mit den entsprechenden Peptiden stimuliert und die gemessene Proliferation in CPM (counts per minute) angegeben. Der Versuch wurde dreimal wiederholt, die gezeigten Werte stellen den Mittelwert aus den drei Experimenten dar, in der Spalte SEM (Standard Error of Mean) ist der Standardfehler angegeben. Das Originalpeptid OVA323-339 wurde als Positivkontrolle mitgeführt (besonders gekennzeichnet). Die Negativkontrollen (Zellen ohne Peptid) proliferierten je nach Experiment zwischen 100 und 350 CPM (nicht gezeigt). Offensichtlich wichtige Positionen in der Sequenz von OVA323-339 wurden grau unterlegt. Rechts ist die entsprechende Anzahl der AS des jeweiligen Peptides aufgeführt.

Wie die Tabelle 5.1 zeigt, konnten DO11.10 Zellen auch mit deutlich kürzeren Epitopen ausreichend stark stimuliert werden. Die Entfernung der Aminosäuren an den Positionen 327, 328 und 336, 337 ergab einen deutlichen Proliferationsrückgang. Für die weiteren Experimente wählten wir das Peptid Nr. 26 (OVA327-337, VHAAHAEINEA, ein 11mer). Dieses Peptid zeichnet sich durch ein Minimum an AS bei voll erhaltener stimulatorischer Potenz aus. Im Weiteren wird dieses Peptid (Nr. 26 der Tabelle 5.1) als OVA327-337 bezeichnet.

Austausch von L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren in OVA 327-337
Um die Stabilität der Peptide gegenüber Proteasen zu erhöhen, begannen wir nun mit dem Austausch der ursprünglichen L-AS durch D-Aminosäuren.
Jede AS in OVA327-337 wurde in einem separaten Schritt durch jede mögliche, rechtsdrehende Aminosäuren (D-AS) ersetzt. Als Maß der Antigenität der synthetisierten Peptide wurde erneut die Proliferation von OVA323-339 spezifischen DO11.10 Zellen herangezogen, welche mit dem betreffenden Peptid stimuliert wurden (Tabelle 5.2).
Tabelle 5.2: Substitutionanalyse I:
Ausgehend von der originalen AS-Sequenz von OVA327-337(VHAAHAEINEA), wurde jede einzelne Position durch jede mögliche D-AS ersetzt. In der linken Spalte (1. Spalte) sind die eingesetzten D-AS gezeigt. Die Spalten 2 bis 12 zeigen die Position, in die ausgetauscht wurde. Zur Orientierung sind die Positionen im Gesamtprotein des Hühnereiweiß angegeben (Ausgangspeptid). DO11.10 Zellen wurden mit den entsprechenden Peptiden stimuliert und die gemessene Proliferation in CPM (counts per minute) angegeben. Positivkontrollen wurden mit OVA327-337stimuliert. Der Mittelwert lag hier bei 21098 +/- 7881 SEM. Die Proliferation der Negativkontrollen (Zellen ohne Peptid) lag zwischen 173 und 1132. Grau unterlegt sind Peptide, welche mit Werten über 24500 CPM (willkürliche gesetzter Schwellenwert) als interessant eingestuft wurden. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei Experimenten. *Da für Glycin (G) kein Stereoisomer existiert (keine rechtsdrehende Form möglich), wurden die Ergebnisse nicht in weitere Analysen miteinbezogen

In den durchgeführten Substitutionsanalysen wurde pro Durchgang nur jeweils eine Position ausgetauscht. Aus Tabelle 5.2 lässt sich entnehmen, dass die Position 327 durch nahezu jede D-AS ersetzt werden konnte, ohne das es zu einem Wirkungsverlust kam. Besonderes Augenmerk kam deshalb Substitutionen im Zentrum des Peptides zu. Die Festsetzung eines Schwellenwertes sollte weiterhin die Anzahl der ausgewählten Peptide auf ein überschaubares Maß beschränken. Aufgrund der Ergebnisse aus den gezeigten Stimulations-Versuchen wurden demnach folgende Epitope als interessant angesehen: yHAAHAEINEA, VkAAHAEINEA, VHAAHAhINEA, VHAAHAEINhA und zusätzlich VHAAHAEINEp, VHmAHAEINEA, und VHApHAEINEA. Diese Peptide wurden nochmals konventionell synthetisiert, aufgereinigt und in verschiedenen Verdünnungen mit DO11.10 Zellen inkubiert (Ergebnisse nicht gezeigt). Das Epitop mit der Sequenz yHAAHAEINEA erbrachte hierbei die besten Proliferationsergebnisse und wurde als Ausgangssequenz für weitere Substitutionsanalysen ausgewählt (siehe Tabelle 5.4). Das Peptid VHAAHAhINEA erbrachte die schlechtesten Ergebnisse und wurde deshalb nicht für weitere Versuche ausgewählt.
Tabelle 5.3: Substitutionsanalyse II
Ausgehend von dem Epitop mit der AS-Sequenz yHAAHAEINEA wurde jede einzelne Position durch jede mögliche D-AS ersetzt. In der linken Spalte (1. Spalte) sind die eingesetzten D-AS gezeigt. Spalten 2 bis 12 zeigen die Position, in die ausgetauscht wurde. Zur Orientierung sind die Positionen im Gesamtprotein des Ovalbumins angegeben. DO11.10 Zellen wurden mit den entsprechenden Peptiden stimuliert und die gemessene Proliferation in CPM (counts per minute) angegeben. Als Positivkontrolle wurde das OVA327-337mitgeführt, der Mittelwert lag hier bei 40986 CPM +/- 6010 SEM. Die Proliferation der Negativkontrollen (Zellen ohne Peptid) lag im Mittel bei 273 CPM. Grau unterlegt sind Peptide, welche mit Werten über 21000 CPM (willkürlich gesetzter Schwellenwert) als interessant eingestuft wurden. Der Versuch wurde 2mal wiederholt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment. *Da für Glycin (G) kein Stereoisomer existiert, wurden die nicht in weiteren Analysen miteinbezogen.

Aus Tabelle 5.3 lässt sich entnehmen, dass erneut die Position 327 durch nahezu jede D-AS ersetzt werden konnte, ohne dass es zu einem Wirkungsverlust kam. Die grau unterlegten Substitutionen wurden im Anschluss konventionell synthetisiert( ynAAHAEINEA, yHAAHAEINqA, yHAAHAEINEy) und DO11.10-Maus-Milzzellen damit stimuliert (Ergebnisse nicht gezeigt). Aus diesen drei Peptiden wurde daraufhin die Sequenz yHAAHAEINqA als Ausgangssequenz für die nächste Substitutionsanalyse ausgewählt. Dieses Peptid induzierte in diesem Test die stärkste Proliferation im Vergleich zu den anderen zwei genannten. Das Peptid wird im Weiteren als OVA(327-337)327y,336q bezeichnet.
In weiteren Experimenten (nicht gezeigt) wurde versucht, eine weitere Substitution in das yHAAHAEINqA-Epitop einzuführen. Interessanterweise konnte in diesen Experimenten keine vergleichbare Proliferation erzielt werden. Es zeigte sich hier bei allen weiteren Peptiden ein dramatischer Verlust der stimulatorischen Potenz verglichen zu dem Ausgangspeptid.
Aufgrund der Beobachtung, dass Alanin (A) in Position 337 wichtig für die Aktivierung der DO11.10 Zellen zu sein scheint, wurde diese Position in einem weiteren Experiment konserviert und, um das Peptid gegen Carboxypeptidasen zu schützen, willkürlich ein D-Alanin (a) als Position 338 angehängt ( Sequenz = yHAAHAEINEAa, ein 12mer). Dieses Peptid stimulierte DO11.10 Zellen etwa ebenso stark wie es das Originalepitop OVA323-339 vermochte. Das Peptid wird im Weiteren als OVA(327-338)327y,338a bezeichnet.

 In vitro Wirkung von ausgewählten D-Peptiden auf DO11.10 Zellen

Um sicherzustellen, dass die ausgewählten Peptide alle rein agonistische Wirkung besitzen, wurde neben der Proliferation hier auch das induzierte Zytokinmuster der stimulierten DO11.10 Zellen in vitro untersucht. Die ausgewählten Peptide aus den oben genannten Analysen wurden dazu konventionell synthetisiert, aufgereinigt und DO11.10 Zellen damit stimuliert. Die Messung der Proliferation der DO11.10 Zellen diente dabei als Maß für die Aktivierungspotenz der eingesetzten Peptide. Da bekannt ist, dass Peptidepitope einen Wechsel des Verhaltensmusters in T-Zellen induzieren können, wurde ebenso das Zytokinsekretionsmuster der stimulierten DO11.10 Zellen untersucht. Es sollte hierbei festgestellt werden, ob die verwendeten Peptide evtl. einen (unerwünschten) Wechsel von Th1 (Produktion von IL-2, INFγ ) zu Th2 (Produktion von IL-4) induzieren. Abbildung 5.1 zeigt exemplarisch die Ergebnisse.

Abbildung 5.1: in vitro Wirkung der OVA-Peptide auf DO11.10 Zellen im Vergleich DO11.10-Maus Milzzellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen an Peptid stimuliert und die Proliferation in CPM gemessen (A). Überstände aus A wurden in ELISA-Analysen auf den Gehalt an IL-2 (B), INFγ (C) bzw. IL-4 (D) überprüft. OD = optical density (x10-3). Jeder gezeigte Punkt auf der Kurve ist das Mittel aus drei Einzelmessungen (Tripletts) mit SEM. Gezeigt ist eines von zwei vergleichbaren Ergebnissen. Untere Nachweisgrenze für IL-2 ca. 45pg/ml, für INFγ ca. 102pg/ml, für IL-4 ca. 4,5pg/ml.

Auf Stimulierung mit den hier gezeigten Peptiden reagierten DO11.10 Zellen mit dem gleichen Aktivierungsmuster. Je nach Potenz der Peptide konnte eine unterschiedlich starke Proliferation, IL-2- und INFγ- Sekretion beobachtet werden. Die Menge an sezernierten Zytokinen korrelierte dabei mit der beobachteten Proliferation. IL-4 ließ sich nur spärlich detektieren. Mit gleichen Ergebnissen wurden weiterhin die Peptide OVA328-336 (HAAHAEINE), OVA(327-337)327y (yHAAHAINEA) und OVA(327-337)327y337y(yHAAHAEINEy) getestet, die Ergebnisse dieser Experimente sind unten in Tabelle 5.4 zusammengefasst.

Die in vitro Serumstabilität der D-Peptidepitope zeigt sich in einer deutlich verlängerten Serumhalbwertszeit

Ziel dieser Arbeit war, Peptidepitope zu definieren, welche eine verlängerte Serumhalbwertszeit (Serum HWZ) aufweisen, um deren Verhalten in der in vivo Induktion peripherer T-Zelltoleranz zu beobachten. Zur Bestimmung der Serumhalbwertszeit wurden ausgewählte Peptidepitope in Mausserum inkubiert und der Restgehalt zu bestimmten Zeitpunkten mittels HPLC ermittelt (siehe auch 4.3.1). Abbildung 5.2 illustriert die Ergebnisse der Serum HWZ Messungen (in vitro).

Abbildung 5.2 in vitro Serumstabilität, Peptide im Vergleich Die gezeigten Peptidepitope wurden in Mausserum gelöst und ihre Konzentration zu den angegeben Zeitpunkten mittels HPLC bestimmt (s.a. 4.3.1).

Kürzel

Sequenz

Halbmax. Wirkung von
OVA 323-339 ca. Konz. [µg/ml]

Serumhalb
wertszeit (ca.)

OVA(327-338)327y,338a

yHAAHAEINEAa

2x10-2

14h

OVA323-339

ISQAVHAAHAEINEAGR

2x10-2

1.75 h

OVA327-337

VHAAHAEINEA

3x10-1

0.75h

OVA(327-337)327y

yHAAHAEINEA

3x10-1

5.5h

OVA(327-337)327y,336q

yHAAHAEINqA

2x100

12h

OVA(327-337)327y337y

yHAAHAEINEy

2x101

10h

OVA328-336

HAAHAEINE

3x100

Nicht getestet
Tabelle 5.4: Übersicht Peptide im Vergleich (Proliferation und in vitro Serumhalbwertszeit)
Übersicht über die eingesetzten Peptidepitope in ihrer stimulatorischen Potenz auf DO11.10 Zellen (bzw. DO11.10-Maus Milzzellen) unter Angabe der betreffenden in vitro Serumhalbwertszeit (s.a. 5.1.3). Die Peptidkonzentration bei halbmaximaler Proliferation ergeben sich aus den Experimenten in 5.1.2 (einige Peptide nicht gezeigt) und wurden Proliferations- und Zytokindiagrammen entnommen. Gezeigt ist die Konzentration in µg/ml an zugegebenem Peptid bei der DO11.10 Zellen die halbmaximale Proliferation von OVA323-339 erreichten.

Die D-Peptidepitope zeigten verglichen mit den herkömmlichen Peptiden eine deutlich verlängerte in vitro HWZ. Beispielsweise zeigte OVA(327-337)327y,336q gegenüber OVA327-337bei gleicher AS-Anzahl aber nach Einbau von zwei D-AS eine ca. 20fach verlängerte HWZ.

In vivo Versuche

Im folgenden Teil dieser Arbeit sollte das Verhalten der D-Aminosäuren-substituierten Peptide in vivo näher studiert werden. In Bezug auf einen künftigen Einsatz von D-Peptiden in der Therapie autoimmuner Erkrankungen sollten Vor- bzw. Nachteile dieser Peptide in vivo beobachtet und beschrieben werden.
Grundsätzlich sollten die durchgeführten Toleranz-Experimente folgende Fragen beantworten:
Kann durch eine i.v. Injektion von D-Peptid T-Zelltoleranz induziert werden?
Auf welche Art wird Toleranz induziert (z.B. Anergie oder Deletion) ?
Wie verhält sich die Toleranzinduktion bei Dosisreduktion und hat die Serumstabilität darauf Einfluss?
Wie lange hält die induzierte Toleranz an und hat die Serumstabilität hierauf einen Einfluss?

Das minimale Epitop OVA327-337 induziert immunologische Toleranz gegenüber OVA323-339 in vivo

Zunächst war von Interesse, ob es möglich ist, mit dem minimalen Epitop OVA327-337 Toleranz zu induzieren. Als Vergleich dienten Mäuse, die das Originalepitop OVA323-339 injiziert bekamen (Positivkontrolle). Als Negativkontrolle dienten Mäuse, denen kein Peptid (bzw. PBS ohne Peptid) gespritzt wurde. Siehe auch die Abschnitte 4.3.3 und 4.3.7.
Als Maß der induzierten T-Zelltoleranz mittels Peptid i.v. Injektionen diente die verminderte Proliferation und IL-2 Sekretion der Lymphknotenzellen behandelter Mäuse, nach Restimulation der Zellen ex vivo. Die i.v. Injektion von 300µg OVA327-337 führte zur Toleranz gegenüber dem Wildtyp-Epitop (WT-Epitop) OVA323-339. Die Lymphozyten der mit OVA323-339 bzw. OVA327-337 gespritzten Mäuse reagierten auf die s.c. Immunisierung mit OVA323-339 mit verminderter Proliferation und IL-2 Sekretion. Im Gegensatz dazu zeigten die PBS behandelten Mäuse (Negativkontrollen) auch in Bereichen niedriger Restimulation deutlich erhöhte Werte bezüglich Proliferation und IL-2 Sekretion (im Vergleich zu absolut unbehandelten Mäusen). Peptid behandelte Mäuse benötigten über 50x mehr Peptid um eine vergleichbare Proliferation oder IL-2 Sekretion zu erreichen. Das Verhalten der mit Peptid gespritzten Mäuse (Lymphozyten) entsprach damit jenem von toleranten Mäusen.

 Induktion peripherer Toleranz mittels D-Peptid-Epitope

Die D-Peptide wurden auf ihre Fähigkeit überprüft, durch eine i.v. Injektion Toleranz in BALB/c zu induzieren. Folgende Peptide wurden intravenös appliziert, und das Verhalten der injizierten Mäuse beobachtet: OVA(327-337)327y,336q (yHAAHAEINqA) und OVA(327-338)327y,338a (yHAAHAEINEAa). Als Positivkontrollen dienten BALB/c, welche OVA323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) i.v. erhielten, die Negativkontrollen erhielten kein Peptid i.v. (bzw. PBS alleine) Abbildung 5.3 zeigt die Ergebnisse.

Abbildung 5.3: Zusammenfassung Toleranzinduktion mit D-AS substituierten Peptiden BALB/c Mäuse bekamen entweder 300µg OVA323-339,OVA327-337, OVA(327-338)327y,338a oder OVA(327-337)327y,336q i.v.. Die Negativkontrollen erhielten PBS alleine. Alle Mäuse wurden an Tag 10 post i.v. mit 100µg OVA323-339 in CFA immunisiert und am Tag 17 getötet. Die drainierenden Lymphknoten wurden entnommen und eine Einzellzellsuspension bereitet. Jeweils 3x105 Zellen wurden mit den gezeigten OVA323-339 Konz. restimuliert. Zu sehen ist der Mittelwert einer Gruppe für die jeweilige Konzentration. A zeigt die zusammengefassten Ergebnisse der Proliferationsversuche. B zeigt die Ergebnisse der IL-2 Bioassays zusammengefasst. In C und D sind nur die als tolerant eingestuften Mäuse zusammengefasst (C = Proliferation, D = IL-2). OVA323-339 n= 11(8) aus 4 Experimenten, OVA327-337n= 7(4) aus 3 Experimenten, OVA(327-338)327y,338an= 7 aus 2 Experimenten, OVA(327-337)327y,336q n= 7 aus 2 Experimenten, PBS n= 11 aus 5 Experimenten. In Klammern, Anzahl der auf IL 2 untersuchten Mäuse. Weiteres siehe auch Tabelle 5.5 und Tabelle 5.6.

Zunächst musste beobachtet werden, dass es durch Injektion des Epitops OVA(327-337)327y,336q (yHAAHAEINqA) in BALB/c Mäusen nicht möglich war, für das WT-Epitop (OVA323-339) Toleranz zu induzieren. Auch der IL-2 Bioassay zeigte keine Reduzierung der IL-2 Sekretion. Die OVA(327-337)327y,336q behandelten Zellen verhielten sich bei der ex vivo durchgeführten Restimulation wie die Negativkontrollen (PBS i.v.). Im Vergleich hierzu zeigten OVA(327-338)327y,338a (yHAAHAEINEAa) behandelte Mäuse eine den OVA323-339 und OVA327-337 behandelten Mäusen vergleichbares Verhalten. Sie zeigten eine deutlich reduzierte Proliferation und IL-2 Sekretion, wenn deren Lymphozyten ex vivo restimuliert wurden. OVA(327-338)327y,338a hatte sich gegenüber OVA(327-337)327y,336q bereits in den Proliferationsassays als stärkerer Aktivator gezeigt. OVA(327-338)327y,338a zeigt in der IL-2 Analyse (B) etwas schwächere Werte als die beiden original OVA-Epitope, in der Abbildung C und D zeigen alle toleranten Mäuse (ob original OVA-Epitope oder OVA(327-338)327y,338a behandelt) ein identisches Toleranzverhalten. Tabelle 5.5 und Tabelle 5.6 zeigen unter der Rubrik Tag 17 die, entsprechend der gesetzten Toleranzkriterien, zusammengefassten Ergebnisse der oben beschriebenen Versuche (wobei die Ergebnisse der mit OVA(327-337)327y,336q behandelten Mäuse aus oben genannten Gründen nicht gezeigt sind).

 Beobachtung der induzierten Toleranz über die Zeit

In Hinblick auf den klinischen Einsatz Peptid basierender Toleranzinduktion bei Autoimmunkrankheiten ist es von Interesse, wie lange die induzierte Toleranz anhält. Es soll hier beobachtet werden, ob sich die Serumstabilität D-Aminosäuren-substituierter Peptide günstig auf die Dauer der induzierten Toleranz auswirkt. Analysiert wurde deshalb das Verhalten der Lymphozyten 40 und 60 Tage nach i.v. Injektion des entsprechenden Peptidepitops. Der Versuchablauf ähnelt den oben beschriebenen Experimenten, mit der Ausnahme, dass die Zeit zwischen intravenöser Peptidinjektion und subkutaner Immunisierung von 10 auf 33 bzw. 53 Tage verlängert wurde. Die Mäuse erhielten an Tag 33 bzw. Tag 53 die subkutane Immunisierung mit OVA323-339 und wurden 7 Tage später (Tag 40 bzw. 60 nach Peptid i.v.) zur Analyse der Lymphozyten getötet.

Toleranz 40 Tage post i.v.

BALB/c-Mäuse erhielten an Tag 0 entweder OVA323-339, OVA327-337 oder OVA(327-338)327y,338ai.v.. Die Kontrollmäuse erhielten PBS alleine i.v.. An Tag 33 wurden alle Mäuse mit 100µg OVA323-339 s.c. immunisiert. An Tag 40 wurden alle Mäuse getötet und die Lymphozyten der drainierenden Lymphknoten in Kultur mit verschiedenen Konzentrationen OVA323-339 restimuliert. Wiederum wurden die Proliferation und IL-2 Sekretion als Toleranzkriterien erfasst. Die Abbildung 5.4 zeigt die zusammengefassten Proliferations- bzw. IL-2- Ergebnisse aller Tag 40 Experimente, wobei sowohl tolerante wie auch nicht tolerante Mäuse derselben Gruppe zu einem Graphen zusammengefasst wurden. Zur Differenzierung in tolerante bzw. nicht tolerante Mäuse (entsprechend der gesetzten Toleranzkriterien) wurden in den Abbildungen C und D nur die toleranten Mäuse zusammengefasst dargestellt. In Tabelle 5.5 und Tabelle 5.6 sind alle Mäuse nach tolerant/nicht tolerant aufgeschlüsselt. Alle Werte wurden nach dem bereits erläuterten Schema standardisiert und zusammengeführt.

Abbildung 5.4: Zusammenfassung Tag 40 BALB/c Mäuse bekamen entweder 300µg OVA(327-338)327y,338a, OVA323-339 oder OVA327-337 i.v.. Die Negativkontrollen erhielten PBS alleine. Alle Mäuse wurden an Tag 33 post i.v. mit 100µg OVA323-339 in CFA immunisiert und am Tag 40 getötet. Die drainierenden Lymphknoten wurden entnommen und eine Einzellzellsuspension bereitet. Jeweils 3x105 Zellen wurden mit den gezeigten OVA323-339 Konz. restimuliert. Zu sehen ist der Mittelwert einer Gruppe für die jeweilige Konzentration. A zeigt die zusammengefassten Ergebnisse der Proliferationsversuche. B zeigt die Ergebnisse der IL-2 Bioassays zusammengefasst. In C und D sind nur die als tolerant eingestuften Mäuse zusammengefasst (C = Proliferation, D = IL-2). OVA323-339 n= 13(12) aus 5 Experimenten, OVA327-337n= 8(7) aus 3 Experimenten, OVA(327-338)327y,338a n= 9 aus 2 Experimenten, PBS n= 11 aus 5 Experimenten. In Klammern, Anzahl der auf IL 2 untersuchten Mäuse. Weiteres siehe auch Tabelle 5.5 und Tabelle 5.6.

Aus der Abbildung 5.4 wird ersichtlich, dass die Toleranz nach Injektion von 300µg OVA323-339 oder OVA(327-338)327y,338a am Tage 40 nach Injektion noch nachweisbar war. Die Lymphozyten der OVA327-337 behandelten Mäuse erzielten weniger deutliche Ergebnisse. Entsprechend der Toleranzkriterien gelang es hier nicht sicher, mittels OVA327-337 anhaltende Toleranz zu induzieren, wobei durchaus einige Mäuse ein tolerantes Verhalten zeigten. Das Peptid OVA(327-338)327y,338a erbrachte bei nur zwei D-Aminsäuren-Substitutionen in die Originalsequenz eine deutliche Überlegenheit gegenüber OVA327-337. Diese Überlegenheit war dabei deutlicher in den IL-2 Analysen. Bezüglich der Qualität der induzierten Toleranz zeigten alle eingesetzten Peptide ein vergleichbares Verhalten (Abbildung C und D).
Aus Tabelle 5.5 und Tabelle 5.6 lässt sich die Quote toleranter zu nicht toleranten Mäusen entnehmen.

Toleranz 60 Tage post i.v.

BALB/c-Mäuse erhielten an Tag 0 entweder OVA323-339 oder OVA(327-338)327y,338a, die Negativkontrollen erhielten PBS alleine i.v.. An Tag 53 wurden alle Mäuse mit 100µg OVA323-339 s.c. immunisiert. An Tag 60 wurden alle Mäuse getötet und die Lymphozyten der drainierenden Lymphknoten in Kultur mit verschiedenen Konzentrationen OVA323-339 restimuliert. Wiederum wurden die Proliferation und die IL-2 Sekretion als Toleranzkriterien erfasst.
Die Abbildung 5.5 zeigt die zusammengefassten Proliferations- bzw. IL-2- Ergebnisse aller Tag 60 Experimente. Alle Werte wurden nach dem bereits erläuterten Schema standardisiert und zusammengeführt. OVA wurde entsprechend der Tag-40-Ergebnissen nicht weiter mitgeführt.

Abbildung 4.5 Zusammenfassung der Tag 60 Versuche BALB/c bekamen entweder 300µg OVA(327-338)327y,338aoder 300µg OVA323-339 i.v.. Die Negativkontrollen erhielten PBS alleine. Alle Mäuse wurden an Tag 53 post i.v. mit 100µg OVA323-339 in CFA immunisiert und am Tag 60 getötet. Die drainierenden Lymphknoten wurden entnommen und eine Einzellzellsuspension bereitet. Jeweils 3x105 Zellen wurden mit den gezeigten OVA323-339 Konz. restimuliert. Zu sehen ist der Mittelwert einer Gruppe für die jeweilige Konzentration. A zeigt die zusammengefassten Ergebnisse der Proliferationsversuche. B zeigt die Ergebnisse der IL-2 Bioassays zusammengefasst. In C und D sind nur die als tolerant eingestuften Mäuse zusammengefasst (C = Proliferation, D = IL-2). OVA323-339 n= 6 (5) aus 2 Experimenten OVA(327-338)327y,338an= 9 aus 2 Experimenten PBS n= 6 aus 2 Experimenten. In Klammern, Anzahl der auf IL 2 untersuchten Mäuse. Weiteres siehe auch Tabelle 5.5 und Tabelle 5.6.

Entsprechend der Abbildung 5.5 war die durch i.v.-Injektion von OVA323-339 und OVA(327-338)327y,338a induzierte Toleranz auch noch an Tag 60 nach Injektion deutlich vorhanden. Die Lymphozyten der mit Peptid behandelten Mäuse benötigten über 100x mehr Peptid zur Restimulation, um die halbmaximalen Werte der Negativkontrollen zu erreichen, und waren damit entsprechend der Toleranzkriterien sicher tolerant. Ein vermeintlicher Vorteil von OVA(327-338)327y,338a gegenüber OVA323-339 in der Proliferationsanalyse relativierte sich in den IL-2 Analysen.
Während in den oben gezeigten Grafiken alle Mäuse (d.h. sowohl tolerante als auch nicht tolerante (A + B) oder nur tolerante Mäuse (C + D)) zu der entsprechenden Peptidgruppe zusammengefasst wurden, sollen die unten gezeigten Tabellen Aufschluss darüber geben, wie viele Mäuse in der jeweiligen Peptidgruppe als tolerant bzw. nicht tolerant eingestuft wurden.
Tabelle 5.5 zeigt diese Ergebnisse für Tag 17, 40 und 60 bezüglich der Proliferationsassays zusammengefasst. Tabelle 5.6 zeigt die Ergebnisse an Tag 17, 40 und 60 für die IL-2 Bioassays zusammengefasst. Aus den Tabellen lässt sich entnehmen, dass OVA323-339 und OVA(327-338)327y,338a vergleichbar dauerhafte Toleranz erzeugten, ebenso scheinen beide vergleichbar zuverlässig Toleranz zu induzieren. Die Quote toleranter zu nicht toleranten Mäusen lag bei beiden um etwa 70-80%. Zusammengefasst zeigten diese beiden Epitope eine über die Zeit stabile und dauerhafte Toleranzinduktion.

Peptidepitop i.v.

OVA323-339

OVA327-337

OVA(327-338) 327y,338a

AS-Sequenz

ISQAVHAAHAEINEAGR

VHAAHAEINEA

yHAAHAEINEAa

Tolerant

%

Tolerant

%

Tolerant

%

Tag 17

9 (11)

82%

5 (7)

71%

5 (7)

71%

Tag 40

9 (13)

69%

5 (8)

63%

6 (8)

75%

Tag 60

4 (6)

67%

2 (3)

67%

7 (9)

78%

Tabelle 5.5: Dauerhaftigkeit der induzierten Toleranz im Überblick, Proliferation.
Gezeigt sind die bezüglich Proliferation gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind. Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben.

Peptidepitop i.v.

OVA323-339

OVA327-337

OVA(327-338) 327y,338a

AS-Sequenz

ISQAVHAAHAEINEAGR

VHAAHAEINEA

yHAAHAEINEAa

Tolerant

%

Tolerant

%

Tolerant

%

Tag 17

7 (8)

88%

3 (4)

75%

4 (7)

57%

Tag 40

8 (12)

67%

3 (7)

43%

6 (8)

75%

Tag 60

4 (5)

80%

n.u.

n.u.

8 (9)

89%

Tabelle 5.6: Dauerhaftigkeit der induzierten Toleranz im Überblick, IL-2 Sekretion.
Gezeigt sind die bezüglich IL-2 Sekretion gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind. Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben. (n.u. = nicht untersucht)

Beobachtung der induzierten Toleranz bei Dosisreduktion

In Hinblick auf eine mögliche Einsparung an Peptid im Falle eines therapeutischen Einsatzes, z.B. in der Behandlung autoimmuner Erkrankungen, wollten wir versuchen, die Peptide in niedrigeren Dosierung einzusetzen, um ggf. Vorteile der serumstabilisierten Peptide zu erarbeiten.
Um zu testen, ob eine verlängerte Serumhalbwertszeit eine Dosisreduktion der eingesetzten Peptide erlaubt, wurde die Peptiddosis auf 100µg/Maus reduziert.
Die Versuche wurden ansonsten nach demselben Protokoll wie oben durchgeführt: Die Mäuse erhielten an Tag 0 eine Injektion von 100µg Peptid/Maus i.v., die Kontrollen erhielten indes PBS alleine. An Tag 10 bekamen alle Mäuse eine s.c. Immunisierung mit 100µg OVA323-339. Nach weiteren 7 Tagen wurden alle Mäuse getötet und die drainierenden Lymphknoten entnommen und in vitro restimuliert. Abbildung 5.6 zeigt OVA323-339, OVA327-337 und OVA(327-338)327y,338a bei Dosisreduktion im direkten Vergleich.

Abbildung 5.6 Dosisreduktion im Vergleich, Zusammenfassung der Proliferation BALB/c bekamen entweder oder 100µg OVA323-339, 100µg OVA327-337 oder 100µg OVA(327-338)327y,338a, i.v.. Die Negativkontrollen erhielten PBS alleine. Alle Mäuse wurden an Tag 10 post i.v. mit 100µg OVA323-339 in CFA immunisiert und am Tag 17 getötet. Die drainierenden Lymphknoten wurden entnommen und eine Einzellzellsuspension bereitet. Jeweils 3x105 Zellen wurden mit den gezeigten OVA323-339 Konz. restimuliert. Zu sehen ist der Mittelwert einer Gruppe für die jeweilige Konzentration. A zeigt die zusammengefassten Ergebnisse der Proliferationsversuche. B zeigt die Ergebnisse der IL-2 Bioassays zusammengefasst. In C und D sind nur die als tolerant eingestuften Mäuse zusammengefasst (C = Proliferation, D = IL-2). (OVA323-339 n= 13(12) aus 5 Experimenten, OVA(327-338)327y,338an= 18 aus 4 Experimenten, OVA327-337n= 10(9) aus 3 Experimenten, PBS n= 11 aus 5 Experimenten). In Klammern, Anzahl der auf IL 2 untersuchten Mäuse. Weiteres siehe Tabelle 5.7 und. Tabelle 5.8.

Die „Versagerquote“ war in der Gruppe der OVA(327-338)327y,338a behandelten Mäuse bezüglich der Proliferationsergebnisse etwas erhöht. Die Abbildung C suggeriert auch ein etwas schlechteres Abschneiden gegenüber OVA323-339. Die Gruppe der OVA323-339 behandelten Mäuse benötigten deutlich mehr Peptid in der Restimulation, um eine vergleichbare Proliferation zu erreichen. Bezüglich der IL-2 Daten relativierte sich dieser Sachverhalt, hier verhielten sich beide Gruppen gleich (Siehe Abbildung D). Tabelle 5.7 stellt die durchgeführten Toleranzexperimente bei Dosisreduktion zusammen und vergleicht die Proliferationsdaten bezüglich der aufgestellten Toleranzkriterien. Tabelle 5.8 vergleicht die IL-2 Daten derselben Experimente.

Peptidepitop i.v.

OVA323-339

OVA327-337

OVA(327-338)327y,338a

AS-Sequenz

ISQAVHAAHAEINEAGR

VHAAHAEINEA

yHAAHAEINEAa

Tolerant

von Total

Tolerant

von Total

Tolerant

von Total

300µg i.v.

9 (11)

82%

5 (7)

71%

5 (7)

71%

100µg i.v.

10 (13)

77%

7 (10)

70%

11 (18)

61%

Tabelle 5.7: Toleranzinduktion bei Dosisreduktion, Proliferation.
Gezeigt sind die bezüglich Proliferation gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind. Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben.

Peptidepitop i.v.

OVA323-339

OVA327-337

OVA(327-338) 327y,338a

AS-Sequenz

ISQAVHAAHAEINEAGR

VHAAHAEINEA

yHAAHAEINEAa

Tolerant

von Total

Tolerant

von Total

Tolerant

von Total

300µg i.v.

7 (8)

88%

3 (4)

75%

4 (7)

57%

100µg i.v.

11 (12)

92%

7 (9)

78%

15 (18)

83%

Tabelle 5.8: Toleranzinduktion bei Dosisreduktion, IL-2 Sekretion.
Gezeigt sind die bezüglich IL-2 Sekretion gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind. Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben.

Visualisierung der Toleranzinduktion Erläuterung zur Adoptiv-Transfer-Methode

Durch eine Veränderung des Versuchsablaufs ist es möglich, die OVA-spezifischen T-Lymphozyten in BALB/c-Mäusen in vivo zu studieren. Bisher konnte keine Aussage über die Art der induzierten Toleranz gemacht werden. Um beobachten zu können, auf welche Art und Weise die eingesetzten Epitope periphere Toleranz induzieren, wurde ein adoptives Transfer Modell gewählt (siehe auch 4.1.3 und 4.3.3). In diesem System wurden Lymphozyten transgener DO11.10-Mäuse bzw. DO11.10 X BALB/c-Mäuse in gewöhnliche BALB/c Mäuse transferiert. Die OVA transgenen T-Zellen der DO11.10-Mäuse lassen sich zu beliebigen Zeitpunkten durch den klonotypisch monoklonalen Antikörper (MAk) KJ 26.1 (Fluoreszenz-) markieren und mittels FACS-Analyse in den untersuchten Geweben ex vivo nachweisen.
Die T-Zellen der DO11.10 Mäuse exprimieren den α/β-T-Zellrezeptor (TZR) des T-Zellklons DO11.10. Dieser ist für OVA 323-339/I-Ad des Ovalbumins-Proteins spezifisch. Die Anzahl der betreffenden OVA323-339 spezifischen T-Zellen ist in diesen Mäusen gegenüber anderen Mäusen (z.B. BALB/c) massiv erhöht, ohne dass diese T-Zellen jemals Kontakt mit OVA323-339 hatten.
Der KJ 26.1 Antikörper erkennt hoch spezifisch den OVA (bzw. DO11.10)-T-Zellrezeptor der transgenen DO11.10 Lymphozyten. Obwohl die DNA dieser Mäuse ein (gen)technisch eingesetztes Gen für T-Zellrezeptor-Vα und T-Zellrezeptor-Vβ besitzen, welche den DO11.10 α/β-T-Zellrezeptor codieren, sind nur zwischen 50% und 80% aller CD4+ T-Zellen dieser Mäuse durch den spezifischen AK KJ 26.1 detektierbar. Es existieren in diesen Mäusen auch CD4+ T-Zellen welche die transgene β-Kette mit einer endogenen, nicht transgenen α-Kette kombinieren. Diese CD4+ T-Zellen sind dann KJ 26.1 negativ, bzw. lassen sich nicht durch diesen AK detektieren und machen die restlichen 20-50% der CD4+ T-Zellen aus. DO11.10 T-Zellen sind in BALB/c Mäusen nur in geringer Anzahl vorhanden bzw. nicht detektierbar. Selbst nach Immunisierung mit OVA323-339 in CFA s.c. lassen sich DO11.10 tragende T-Zellen mit Hilfe des Fluoreszenz gekoppelten KJ 26.1 nicht ohne weiteres detektieren (Versuche nicht gezeigt).

 Beispielhafte FACS-Analysen

Die Abbildung 5.7: zeigt Ergebnisse exemplarischer FACS-Analysen. Sie sollen dem Betrachter einen Einblick in die Auswertung der durchgeführten FACS-Analysen geben. Alle Analysen zeigen die Färbung (Markierung) mit Anti CD4-PE (Ordinate) gegen KJ1.26-FITC (Abszisse). Aus den entnommenen Lymphknoten oder Milzen wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt und die Zellen mit den genannten Antikörpern und Propidiumiodid (PI) inkubiert. Alle gezeigten Zellen entstammen dem Lymphozyten-Gate. Mit PI angefärbte (tote) Zellen wurden ausgeblendet (ausgegatet). Folgende Zellpopulationen lassen sich mit Hilfe der durchgeführten Färbung beobachten und wurden in den Abbildungen durch ein Kreuz in Quadranten aufgeteilt: Es befinden sich oben links die CD4+und KJ1.26- (negativen) Zellen, oben rechts die CD4+ und KJ1.26+ doppelt positiven Zellen. In der Regel wurden 5x105 CD4+ Zellen analysiert, nicht CD4+ markierte Zellen wurden weitestgehend ausgeblendet. Aus der Population CD4+ Zellen wurde die Anzahl der CD4+ und KJ1.26+ doppelt positiven Zellen berechnet und als prozentualer Anteil der CD4+ Zellen bestimmt. Das Verhältnis wird im entsprechenden Quadranten als Prozentwert angegeben.

Abbildung 5.7: Exemplarische FACS-Analysen Vergleich BALB/c- vs. DO11.10 Maus A) Eine BALB/c-Maus (ca. 6 Wochen alt) wurde getötet und aus den Lymphknoten eine Einzelzellsuspension bereitet. Diese wurde gefärbt (mit AK inkubiert) und analysiert. Die Frequenz von 0,01% CD4+ und KJ- 26.1+ doppelt positiven Zellen ist vernachlässigbar klein. Dieser Versuch wurde mit denselben Ergebnissen wiederholt, Einzellfärbungen (nicht gezeigt) bestätigen diese Ergebnisse. B)Eine BALB/c-Maus (ca. 6 Wochen alt) wurde mit 100 µg OVA323-339 in CFA s.c. immunisiert. 6 Tage später wurde die Maus getötet und die drainierenden Lymphknoten entnommen. Eine Einzelzellsuspension wurde bereitet, gefärbt und analysiert. Trotz Immunisierung zeigt auch diese Maus eine vernachlässigbare Frequenz von 0,06% CD4+ und KJ- 26.1+ doppelt positiven Zellen. Würden diese Zellen in vitro mit OVA323-339 restimuliert, so würden diese im Vergleich zu naiven (nicht immunisierten) Zellen aber eine deutlich stärkere Proliferation zeigen. Dieses Verhalten zeigt an, dass diese Mäuse eigene, spezifische, nicht durch den KJ 26.1 detektierbare T-Zellrezeptor exprimieren. Dieser Versuch wurde mit denselben Ergebnissen wiederholt, Einzellfärbungen (nicht gezeigt) bestätigen diese Ergebnisse. C)Eine DO11.10-Maus (ca. 6 Wochen alt) wurde getötet und aus der Milz eine Einzelzellsuspension bereitet. Diese wurde gefärbt und analysiert. In allen hier dargestellten Abbildungen zeigen nur CD4+ Zellen, CD4- Zellen sind ausgeblendet. Die Doppelfärbungen wurden durch Einzellfärbungen kontrolliert (Versuche nicht gezeigt).

Abbildung 5.8:Exemplarische FACS-Analysen bei adoptivem Transfer Die gezeigten BALB/c-Mäuse erhielten an Tag 0 2x107 Milzzellen einer DO11.10-Maus gleichen Geschlechts und Alters (ca. 6 Wochen). A) An Tag 3 wurde diese Maus getötet und aus den Lymphknoten eine Einzelzellsuspension bereitet. Diese wurde gefärbt und analysiert. B) An Tag 10 wurde diese Maus getötet und aus den Lymphknoten eine Einzelzellsuspension bereitet. Diese wurde gefärbt und analysiert. C) An Tag 10 wurde diese Maus mit 100µg OVA323-339 in CFA s.c. immunisiert. An Tag 17 wurde die Mausgetötet und aus den drainierenden Lymphknoten eine Einzelzellsuspension bereitet. Diese wurde gefärbt und analysiert. Die Abbildungen zeigen nur CD4+ Zellen, CD4- Zellen sind ausgeblendet. Die Doppelfärbungen wurden durch Einzellfärbungen kontrolliert (Versuche nicht gezeigt).

Toleranzinduktion im Adoptiv-Transfer-System

Wie in 4.1.3 beschrieben, wurde ein adoptiver Transfer durchgeführt. Den Mäusen wurde drei Tage nach adoptivem Transfer von 3x107 DO11.10-Maus-Milzzellen das gezeigte Peptidepitop bzw. PBS (Negativkontrollen) i.v. injiziert. 11 Tage danach bekamen alle Mäuse OVA323-339 s.c. in CFA als Immunisierung. Wiederum eine Woche später wurden die Mäuse getötet und deren Lymphknotenzellen mit OVA323-339 restimuliert. Abbildung 5.9: zeigt die zusammengefassten Daten der adoptiven Transferexperimente. Zusätzlich zu den Proliferations- und IL-2- Daten wurde die mittlere Frequenz an DO11.10 Zellen in den entnommenen Lymphknoten per FACS bestimmt und für jede Peptidgruppe zusammengefasst, gemittelt und in Prozent angegeben.

Abbildung 5.9: Zusammenfassung Transferexperimente Am Tag 3 nach dem Transfer erhielten die Mäuse 300µg Peptid, die Negativkontrollen PBS alleine i.v.. Alle Mäuse wurden an Tag 10 post Peptid i.v. mit 100µg OVA323-339 in CFA s.c. immunisiert und am Tag 17 getötet. Die drainierenden Lymphknoten wurden entnommen und eine Einzelzellsuspension bereitet. Jeweils 3x105 Lymphknotenzellen pro Maus wurden mit den gezeigten OVA323-339 Konz. restimuliert. Zu sehen sind die zusammengefassten Daten aus allen Transferexperimenten für die jeweilige Peptidgruppe. Mittels FACS-Analyse wurde in jedem Experiment die Frequenz an DO11.10 Zellen in den entnommenen Lymphknoten für die jeweilige Peptidgruppe bestimmt (gemittelt). Die Frequenz wurde als prozentualer Anteil der DO11.10 Zellen an der Gesamtzellzahl der in Kultur genommenen Zellen angegeben. Die Frequenzen an DO11.10 Zellen wurden ebenfalls je Gruppe gemittelt und sind in der Legende angegeben. A zeigt die zusammengefassten Proliferationsergebnisse. B zeigt die Zusammenfassung der IL-2 Bioassays der Versuche aus A. CTLL2 Zellen wurden dafür mit den Überständen aus A stimuliert. In C und D sind nur die als tolerant eingestuften Mäuse zusammengefasst (C = Proliferation, D = IL-2). OVA323-339 n= 9 aus 4 Experimenten, OVA327-337 n= 7(6) aus 3 Experimenten, OVA(327-337)327y,336q n= 7(6) aus 3 Experimenten, OVA(327-338)327y,338a n= 10 aus 3 Experimenten, PBS n= 12 aus 4 Experimenten. In Klammern, Anzahl der auf IL 2 untersuchten Mäuse. Weiteres siehe Tabelle 5.9.

Aus der Abbildung 5.9: lässt sich entnehmen, dass die Lymphozyten der mit Peptid behandelten Mäuse bei Restimulation eine deutlich reduzierte Proliferation und IL-2 Sekretion zeigten. Entsprechend der gesetzten Toleranzkriterien wurden die Peptid behandelten Mäuse somit als tolerant eingestuft. So benötigten diese Zellen in der Restimulation mind. 50x mehr Peptid, um die halbmaximale Proliferation der Negativkontrollen (PBS) zu erreichen. Eine Ausnahme bildeten wie auch in den nicht Transferexperimenten die mit OVA(327-337)327y,336q behandelten Lymphozyten. Bezüglich der Proliferation erreichten diese Zellen nicht das Toleranzkriterium. Sie benötigten nur etwa 10x mehr Peptid, um die halbmaximale Proliferation der Negativkontrollen zu erreichen. Gemessen an der IL-2 Sekretion zeigte sich dennoch eine deutlich reduzierte IL-2 Sekretion. Die Zellen benötigten hier über 60x mehr Peptid, um die halbmaximalen Werte der Negativkontrollen zu erreichen. Entsprechend der gesetzten Toleranzkriterien waren diese Mäuse zumindest hier tolerant. Zusammengefasst wurde die deutlichste Toleranz bei Injektion von OVA323-339, OVA327-337und OVA(327-338)327y,338a erreicht. Zellen dieser Mäuse benötigten deutlich mehr Peptid, um die halbmaximalen Werte der Negativkontrollen zu erreichen (sowohl in den Proliferations- als auch in den IL-2 Analysen). Die Abbildungen C und D suggerieren eine Überlegenheit von OVA327-337 gegenüber den anderen Peptiden, wobei die Quote toleranter zu nicht toleranten Mäusen klar für die Gruppen OVA323-339 und OVA(327-338)327y,338a behandelter Mäuse spricht. Die Tabelle 5.9 zeigt die Ergebnisse der Transfer-Experimente zusammengefasst.

Peptidepitop i.v.

OVA 323-339

OVA 327-337

OVA (327-338) 327y,338a

OVA (327-337) 327y,336q

AS-Sequenz

ISQAVHAAHAEINEAGR

VHAAHAEINEA

yHAAHAEINEAa

yHAAHAEINqA

Tolerant

von Total

Tolerant

von Total

Tolerant

von Total

Tolerant

von Total

Proliferation

7(9)

78%

5(7)

71%

8 (10)

80%

4 (7)

57%

IL-2 Sekretion

8 (9)

89%

4(6)

67%

9 (10)

90%

3 (6)

50%

Tabelle 5.9: Zusammenfassung der Transfer-Experimente
Gezeigt sind die bezüglich Proliferation und IL-2 Sekretion gemäß den gesetzten Toleranzkriterien als tolerant eingestuften Mäuse. Vor der Klammer ist die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse, in Klammern die Gesamtzahl der mit dem entsprechenden Peptid behandelten Mäuse angegeben. Die Anzahl der als tolerant eingestuften Mäuse setzt sich wie folgt zusammen: Von der Gesamtzahl wurden all diejenigen Mäuse abgezogen, die nach den Toleranzkriterien als nicht tolerant anzusehen sind Zusätzlich wurde der tolerante Anteil in Prozent angegeben.

Bei der Betrachtung der Daten aus den vorausgegangenen Ergebnissen fiel auf, dass die Frequenz an DO11.10 zwischen den einzelnen Peptidgruppen deutlich und reproduzierbar differierte.
Wegen der schlechten Vergleichbarkeit der Ergebnisse der einzelnen Peptidgruppen untereinander aufgrund unterschiedlich hohen Anteils an DO11.10 Zellen, wurden die Proliferations- und IL-2- Daten auf die Frequenz an DO11.10 Zellen bezogen und normiert. Hierzu wurde der erreichte Proliferationswert (als % von PBS max) durch die in den Legenden der Abbildung 5.9: (A u. B)angegebene Frequenz an DO11.10 Zellen dividiert und damit auf die Frequenz an DO11.10 Zellen normiert. Die Abbildung 5.10: zeigt die normierten Daten bezüglich der Proliferation und der IL-2 Sekretion.

Abbildung 5.10: Frequenz normierte Zusammenfassung der adoptiv-Transfer-Experimente Zu sehen sind die Daten aus Abbildung 5.9:. A und B, welche durch die Frequenz an DO11.10 Zellen der jeweiligen Gruppen dividiert (normiert) wurden. A zeigt die normierten Daten der Proliferation, B die normierten IL-2 Daten. Eine Normierung der Daten aus Abbildung 5.9: C und D wurde nicht durchgeführt, da die Frequenzen an DO11.10 Zellen aus für das jeweilige Peptid gepoolten Zellsuspensionen stammte (darin tolerante und nicht tolerante Mäuse).

Betrachtet man nun die Ergebnisse der Abbildung 5.10:, zeigt sich ein anderes Bild. Bezogen auf den Gehalt an DO11.10 Zellen muss festgestellt werden, dass die Zellen der mit OVA(327-337)327y,336qbehandelten Mäuse die geringste Proliferation und IL-2 Sekretion pro DO11.10 Zelle zeigen. Gemäß der Abbildung 5.9: (A und B) erreichten diese Zellen nicht die halbmaximale Proliferation oder IL-2 Sekretion der Negativkontrollen. Eine Normierung der Daten aus Abbildung 5.9: C und D wurde nicht durchgeführt, da die Frequenzen an DO11.10 Zellen aus für das jeweilige Peptid gepoolten Zellsuspensionen stammte (darin tolerante und nicht tolerante Mäuse). Im Kontrast hierzu verhielten sich die Zellen der OVA327-337und OVA323-339 behandelten Mäuse. Die Zellen dieser Mäuse übertrafen die Negativkontrolle bei Restimulation im Bereich hoher Peptidkonzentration um über 20%. Mit anderen Worten zeigte sich hier eine höhere Proliferationsbereitschaft und IL-2 Sekretion pro DO11.10 Zelle verglichen mit den Zellen unbehandelter Mäuse. Dieses Verhalten zeigte sich deutlicher im Bereich hoher restimulativer Peptiddosen und war deutlicher bezüglich der IL-2 Sekretion, weniger deutlich bezüglich Proliferation. Die Zellen der mit OVA(327-338)327y,338a verhielten sich ähnlich denen der mit den original OVA-Epitopen behandelten Mäuse, wobei nur bei maximaler Stimulation die Negativkontrollen überboten wurden. In der Normierung der IL-2 Analysen zeigen OVA(327-338)327y,338a behandelte Mäuse etwas bessere Ergebnisse als die mit OVA327-337und OVA323-339 behandelten Mäuse.