In der vorliegenden Arbeit wurde die extrathymische, antigenspezifische Toleranzinduktion mittels Injektion von alterierten, stabilisierten Peptidepitopen untersucht. In einer Verkürzungsanalyse wurde zunächst die OVA_323-339 Sequenz auf ein Minimum an Aminosäuren (AS) verkürzt und die Wirkung auf DO11.10-T-Zellen untersucht, welche den transgenen, spezifischen T-Zellrezeptor (TZR) für OVA _323-339 tragen und dieses Peptid im I-A^d-Kontext erkennen.
Die antigene Potenz der entstandenen Peptide wurde dabei in Form von Proliferation der DO11.10 Zellen in vitro gemessen. In der Verkürzungsanalyse konnte OVA_323-339, ein 17 AS langes Peptid, auf OVA _327-337, ein 11 AS langes Peptid, verkürzt werden.
Gemessen an der stimulatorischen Potenz des Ausgangspeptides OVA _323-339, erreichte das Peptid OVA _327-337 die halbmaximale Proliferation bei einer ca. 20fach höheren Peptidkonzentration. Die Verkürzung auf 9 AS (OVA _328-336) ging mit einem beträchtlichen Verlust an stimulatorischer Potenz einher (ca. 150fach, siehe auch Tabelle 5.4). Vermutlich wurden hier für die Erkennung durch und die Aktivierung von DO11.10 Zellen wichtige AS entfernt. Entsprechend den Ergebnissen aus den Verkürzungsanalysen fehlt diesem Peptid das Valin in der Position 327 des OVAlbumins. Offensichtlich handelt es sich hier um eine so genannte Ankerposition des Peptides im Peptid/I-A^d-Komplex. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen auch Scott (1998, [115]) bei der Analyse der OVA/I-A^d Bindung. Hier liegt das Valin der Position 327 in der I-A^d-Tasche Nummer 4 und scheint somit dem Peptid/I-A^d –Komplex eine besondere Stabilität zu verleihen. Beeson et al. konnten 1999 [116] zeigen, dass die Position 327 sogar wahlweise in der Tasche 1 oder 4 des Peptid/I-A^d –Komplexes liegen konnte, was diese Position im Sinne des Wortes, doppelt wichtig für die Antigenpräsentation macht. Die hier durchgeführten Substitutionsanalysen zeigten im Widerspruch dazu, dass es offensichtlich unerheblich war, welche Aminosäure in dieser Position stand. In die Position 327 konnte hier jede D-Aminosäure ohne Stimulationsrückgang substituiert werden. Dies zeigt, dass offensichtlich diese Position zwar besetzt sein muss, die Peptid/ I-A^d Bindung aber auch von der Nachbarschaft (weitere Aminosäuresequenz, z.B. Besetzung der weiteren Taschen) abhängt. Bei näherer Betrachtung der zweiten Substitutionsanalyse fiel dann auf, dass, sobald die Position 327 durch ein rechtsdrehendes Tyrosin (y) besetzt war, keine weiteren Substitutionen (außer Glycin) in der Position 330 erlaubt waren. In der ersten Substitutionsanalyse waren noch ca. 9 weitere Substitutionen in der Position 330 akzeptiert worden. Beeson zeigte, dass, wenn die Position 327 in der ersten Peptid/ I-A^d –Tasche lag, die Position 330 in der vierten Tasche liegen musste. Diese Beobachtung erklärt vermutlich die oben beschriebenen Ergebnisse aus der zweiten Substitutionsanalyse.
Entsprechend der Verkürzungsanalysen (siehe Tabelle 5.1) zeigten sich dann neben der Position 327 auch die Positionen 328 sowie 336 und 337 als wichtige Positionen. Diese hier gemachte Beobachtung entspricht exakt den Ergebnissen von Evavold et al. (2000, [117]). Weiterhin kamen die beiden oben genanten Autoren auch zu dem Schluss, dass ein und dasselbe Peptid verschieden im I-A^d-Kontext präsentiert werden kann. Evavold konnte durch die Verwendung von DO11.10 RAG-defizienten (RAG^-/-) Mäusen zusätzlich beweisen, dass die gesehene Proliferation von DO11.10-Zellen nicht durch die endogene Rekombination einer oder beider T-Zell-Rezeptorketten verursacht wurde. Das ist für die hier präsentierte Arbeit insofern bedeutsam, als dass die hier eingesetzten DO11.10 Mäuse der Rekombination eigener T-Zellrezeptoren fähig waren (RAG ^+/+).

Basierend auf dem 11mer OVA _327-337 wurden dessen AS durch rechtsdrehende Aminosäuren (D-AS) ausgetauscht. In diesen Substitutionsanalysen wurde jede einzelne Position in OVA _327-337 durch jede mögliche rechtsdrehende Aminosäure ersetzt und die jeweils entstandenen Peptide DO11.10 Zellen als Stimulans angeboten. Es zeigte sich, dass der Einbau von D-AS durch den T-Zellrezeptor je nach Position und substituierter Aminosäure toleriert wurde und dass DO11.10 Zellen mit den einzelnen Peptidvarianten zur Proliferation und IL-2 Sekretion angeregt werden konnten. Das Peptid OVA_{(327-338)327y,338a}.(yHAAHAEINEAa) erwies sich letztlich als besonders starker Agonist am DO11.10 T-Zellrezeptor mit einer dem OVA_323-339 vergleichbaren stimulatorischen Potenz. In vitro zeigten die aktivierten T-Zellen ein Th1-typisches Zytokinsekretionsmuster mit hoher IL-2 und INF γ Produktion. Dagegen produzierten diese Zellen nur wenig IL-4.
Bei den hier durchgeführten Substitutionsanalysen ist bemerkenswert, dass offensichtlich erneut einige der Positionen von besonderer Bedeutung für die Erkennung durch den DO11.10 T-Zellrezeptor sind. So zeigte der Austausch der Aminosäuren in den Positionen 331, 333 und 335 durch Glycin (kein Stereoisomer möglich) nur in diesen Positionen einen deutlichen Rückgang der Proliferation von DO11.10 Zellen. Diese simpelste aller Aminosäuren konnte ansonsten in alle anderen Positionen ohne Stimulationsrückgang eingesetzt werde. Da es hier aber primär um das Einbringen von rechtsdrehenden Aminosäuren ging, wurde diese Begebenheit nicht weiter untersucht. Eine sehr ähnliche Beobachtung machten allerdings Evavold et al. (2000 [117]), als sie in jede einzelne Position von OVA_323-339 ein Alanin (bzw. Serin) einsetzten. Peptide, welche in den Positionen 331, 333 und 335 ein Alanin substituiert bekommen hatten, zeigten einen deutlichen Proliferationsrückgang, wenn DO11.10 Zellen mit diesen inkubiert wurden. Evavold schloss daraus, dass diese Positionen (zumindest Position 333 und 335) wichtig für die Erkennung durch den T-Zellrezeptor sind, da sie, entsprechend der cristallographischen Untersuchungen über den OVA/I-A^d-Komplex, außerhalb einer I-A^d-Tasche liegen und somit nicht maßgeblich für die OVA/I-A^d-Bindung von Bedeutung sind. Die Beobachtung, dass sich OT-II Zellen (weiterer OVA_323-339 spezifischer Klon) bezüglich der oben geschilderten Substitutionsanalysen ähnlich verhielt, unterstützt diese Hypothese.
Anhand der erhobenen Proliferation schloss Evavold, dass unter den drei genannten Positionen die Position 333 am wichtigsten ist, und der durch DO11.10 Zellen erkannte Peptidteil an dieser Position beginnt, da in der Position 331 wesentlich mehr Substitution von DO11.10 Zellen akzeptiert wurden. Diese Daten konnten wir hier ebenfalls bestätigen, mit dem Unterschied, dass hier D-Aminosäuren substituiert wurden (Auswertung nicht gezeigt).
Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Arbeit über 1000 verschieden Peptide mit DO11.10 T-Zellen inkubiert, wobei ausschließlich nach agonistisch wirkenden Epitopen gesucht wurde. Im Überblick der durchgeführten Verkürzungsanalysen sowie Substitutionsanalysen konnte eine Vielzahl von Epitopen bestimmt werden, welche eine agonistische Wirkung am DO11.10 T-Zellrezeptor entfalteten. In den gezeigten Analysen lässt sich die volle Bandbreite von schwacher bis starker Stimulation beobachten, wenn, wie hier geschehen, Proliferation (ggf. auch IL-2 Produktion) als Maßstab gewählt werden. Diese Beobachtung bestätigt und erweitert Beschreibungen von Evavold (1991-1995, [111, 112, 118, 119]) und Wucherpfennig (1995, [120]), welche belegen, dass eine Diversität an Peptiden durch ein und denselbenT-Zellrezeptor erkannt werden. Entsprechend der „molecular mimikry“-Hypothese (Alvord et al. 1985 [79] , Oldstone et al. 1985 [80])^{kann diese Diversität auch im Rahmen von autoimmunen Erkrankungen eine Rolle spielen. Weiterhin wurde in der Vergangenheit gezeigt, dass je nach Ligand auch ein Antagonismus sowie ein so genannter partieller Agonismus am betreffenden T-Zellrezeptor möglich ist (Evavold siehe oben, Übersicht in Kersh 1996 [121]). Es muss davon ausgegangen werden, dass unter den hier gescreenten Peptiden und D-Peptiden auch Antagonisten und partielle Agonisten waren. Der Einsatz solcher Peptide in der Toleranzinduktion bei autoimmunen Erkrankungen erscheint deshalb ebenso interessant wie der Einsatz des originalen (natürlichen) Antigens. Es ist denkbar, dass die Blockierung des T-Zellrezeptor autoreaktiver T-Zellen durch Antagonisten zumindest einen kurzfristigen Rückgang der Krankheitsaktivität bei bestehender autoimmuner Erkrankung herbeiführen könnte. In weiteren Arbeiten könnten Vor- bzw. Nachteile dieser Peptide in vitro wie in vivo geklärt werden, wobei Experimente in Mäusen bezüglich der experimentellen Multiplen Sklerose (MS) bereits Erfolge zeigten (Franco 1994 [122]). Die Umsetzung dieser Art von Therapie in Patienten mit MS zeigte in einer Phase II Studie die iatrogene (therapieinduzierte) Exazerbation der Erkrankung in einigen mit Antagonisten behandelten Patienten und ist offensichtlich nicht ohne Weiteres vom Mausmodell auf den Menschen übertragbar (Bielekova 2000 [5], Zusammenstellung in Kamradt 2001 [6]).}

Die Analyse der in vitro Serumhalbwertszeit mittels HPLC erbrachte für die D-Aminosäuren- substituierten Peptide eine deutlich verlängerte in vitro Serumhalbwertszeit. Mausserum wurde mit den verschiedenen Peptiden inkubiert. Die in bestimmten Zeitintervallen entnommenen Proben wurden auf den verbleibenden Gehalt an Peptid untersucht und mit dem Gehalt zum Zeitpunkt 0 verglichen. Die Analyse der verschiedenen Peptide erbrachte eine deutliche Verlängerung der Serumhalbwertszeit bereits nach Einbau einer einzigen rechtsdrehenden Aminosäure. So zeigte yHAAHAEINEA (OVA_{(327-337)327y}) verglichen mit VHAAHAEINEA (OVA_327-337) eine ca. 10fach verlängerte in vitro Serumhalbwertszeit. Offensichtlich spielt für die Serumstabilität auch die Position im Peptid eine Rolle; so zeigte VHmAHAEINEA mit einer HWZ von unter 2h eine deutlich kürzere HWZ als yHAAHAEINEA mit ca. 5,5 Stunden. Peptide mit endständig positionierten D-Aminosäuren erbrachten eine höhere Serumstabilität als Peptide mit mittig stehenden D-Aminosäuren. Aufgrund dieser Beobachtung wurde ein 12mer hergestellt, der die Schlüsselposition in 337 (A, Alanin) behielt, aber N-Terminal durch ein y (D-Thyrosin) und C-Terminal durch ein a (D-Alanin) flankiert ist (yHAAHAEINEAa = OVA_{(327-338)327y,338a}). Dieses Peptid zeigte die längste in vitro Serumhalbwertszeit und die stärkste stimulatorische Potenz an DO11.10 Zellen aller getesteten Peptide. Dieses Peptid erschien uns als bester Kandidat, um dessen Wirkung mit der Wirkung der Originalpeptide OVA_323-339 und der verkürzten Version OVA_327-337 zu vergleichen. Alle drei Peptide zeigten in vitro eine vergleichbare stimulatorische Potenz an DO11.10 Zellen und führten bezüglich des Zytokinsekretionsmusters zu keinem Wechsel von Th 1 zu Th 2, unterschieden sich also hauptsächlich in ihrer Serumhalbwertszeit. Das Peptid mit der Sequenz yHAAHAEINqA (OVA_{(327-337)327y,336q}) wurde ebenfalls aufgrund seiner Serumhalbwertszeit von ca. 12h für die in vivo Versuche ausgewählt, zeigt aber eine deutlich reduzierte stimulatorische Potenz an DO11.10 Zellen in den in vitro Versuchen und erschien uns deshalb als nur bedingt vergleichbar.
Der Versuch, die in vivo Peptidkonzentration nach intravenöser Injektion von Peptid, durch direkte Messung der Peptidkonzentration im Serum der Mäuse zu bestimmen, gelang nicht. BALB/c Mäuse bekamen eine Injektion mit 0,3mg bzw. 0,6mg Peptid (jeweils OVA_327-337und OVA_{(327-337)327y,336q}im Vergleich) in 300µl PBS i.v.. In dem nach ½ Stunde bzw. nach 4 Stunden entnommenen Serum dieser Mäuse konnte mittels HPLC kein Peptid bestimmt werden. Weiterhin wurde in folgenden Versuchen Mäusen post injectionem von 0,3mg bzw. 0,6mg Peptid i.v. die Milzen entnommen und diese nach Bercovici (1999, [123]) als Antigen präsentierende Zellen für zuvor mit MACS sortierte DO11.10 CD4⁺- T-Zellen aus DO11.10-Mäusen eingesetzt. Die in vivo mit Peptid beladenen APC vermochten es zu keinem Entnahmezeitpunkt (0,5h, 2h, 4h u.a.), die CD4⁺ Zellen signifikant zur Proliferation zu stimulieren (Versuche nicht gezeigt). Berovici und seine Mitarbeiter benutzen in ihren Versuchen ein anderes System mit Mäusen, welche für das Influenza-Virus Haemaglutinin-Peptid transgen waren. Die injizierte Peptiddosis war mit 0.75 mg unwesentlich höher als in dieser Arbeit. Die einfachste Erklärung für unsere Beobachtung wäre, dass die Antigen präsentierenden Zellen nicht in der Lage waren, aktivierende Signale zu geben, weil sie sich bereits im Stadium der Toleranz befanden.
Aufgrund der oben angeführten Ergebnisse stützen sich die hier besprochenen Daten nur auf die in vitro Messung der Serumhalbwertszeit, wobei noch folgendes beachtet werden sollte: Bezüglich eines Vergleiches der eingesetzten OVA-Varianten ist zu diskutieren, dass zum Beispiel die für OVA_323-339 angegebene in vitro Serumhalbwertszeit von unter zwei Stunden eventuelle, als Antigen wirksame „Metaboliten“, nicht berücksichtigt. Diese möglicherweise ebenfalls „wirksamen“ Abbauprodukte sind mit der HPLC-Methode nicht sicher zu identifizieren. Unter dem Aspekt, dass vorrangig endständige Aminosäuren als erste abgespalten werden, sind durchaus alle in den hier durchgeführten Verkürzungsanalysen gesehenen Peptide als Metaboliten möglich. Selbst das hier synthetisierte Peptid OVA_327-337(OVA_327-337 ) könnte prinzipiell unter den Abbauprodukten von OVA_323-339 sein. Aufgrund dieser Überlegung ist der Vergleich von OVA_323-339 zu den D-Aminosäuren-substituierten 11meren nur bedingt verwertbar. Diesbezüglich erscheint eigentlich nur der Vergleich von OVA_327-337 zu seinen D-Aminosäuren-substituierten Varianten ein ebenbürtiger Vergleich zu sein. Die weitere Verkürzung von OVA_327-337hatte einen drastischen Potenzrückgang zur Folge, so dass die hier entstehenden Metaboliten vernachlässigt werden können. Unklar ist, ob die von Scott (1998, [115]) sowie von Mc Farland (1999 [116]) beschriebenen alternativen Peptid/I-A^d-Bindungen hier auch eine Rolle spielen können. Bei zunehmender Entfernung von Aminosäuren aus den OVA-Peptiden werden auch die wichtigen Ankerpositionen für die Peptid/I-A^d-Bindungen entfernt und dieser Komplex zunehmend instabil. Entsprechend den Ergebnissen der oben genannten Arbeiten, bietet das OVA_323-339-Peptid aufgrund seiner Länge ggf. mehr alternative Bindungsmöglichkeiten als ein stark verkürztes Epitop, wobei hier nichts über die T-Zellerkennung ausgesagt werden kann.

Um einen möglichen Vorteil der verlängerten in vitro Serumhalbwertszeit der D-Aminosäuren-substituierten Peptide gegenüber OVA_323-339 und OVA_327-337 zu testen, wurde die Dosis der Peptidinjektion von 300µg auf 100µg je BALB/c Maus herabgesetzt. Es hatte sich in vorhergehenden Versuchen gezeigt, dass das Unterschreiten dieser Dosis zu einem markanten Anstieg der Proliferation der mit OVA_323-339 injizierten (tolerisierten) BALB/c Mäuse geführt hatte (Versuche nicht gezeigt).
BALB/c Mäuse wurden an Tag 0 mit 100µg der entsprechenden Peptide in PBS (bzw. PBS alleine) i.v. injiziert und an Tag 10 mit OVA_323-339 s.c. immunisiert. Eine Woche später wurden die drainierenden Lymphknoten dieser Mäuse entnommen und in vitro mit OVA_323-339 restimuliert.
Auch hier zeigte die Mehrheit der Lymphozyten von Peptid injizierten Mäuse eine reduzierte Proliferation und eine deutlich reduzierte IL-2 Sekretion. Mäuse die OVA_{(327-338)327y,338a} oder OVA_327-337bekommen hatten, zeigten im Vergleich zu OVA_323-339 behandelten Mäusen eine weniger starke Reduktion der Proliferation bzw. IL-2 Sekretion. Die Quote toleranter zu nicht toleranten Mäusen, die mit OVA_327-337 behandelt wurden, war vergleichbar mit den OVA_{(327-338)327y,338a} behandelten Mäusen (siehe Tabelle 5.7 und Tabelle 5.8). Bei der Betrachtung der Grafiken, in denen nur die toleranten Mäuse dargestellt sind, zeigten die mit OVA_{(327-338)327y,338a} behandelten Mäusen für die Proliferationsergebnisse eher schlechtere Daten. So benötigten diese Mäuse hier 100fach weniger Peptid um eine den OVA_323-339 behandelten Mäusen vergleichbar starke Proliferation zu bieten. Bezüglich der IL-2 Sekretion bestanden keine Unterschiede zwischen diesen beiden Gruppen.
Die Injektion von 100µg OVA_{(327-337)327y,336q} brachte keinen Unterschied zu den oben genannten Daten (gleiches Verhalten wie bei 300µg i.v., Versuche nicht gezeigt)
Interessanterweise zeigten die Proliferationsdaten für das jeweilige Peptid zwischen 100µg und 300µg keine nennenswerten Unterschiede. Beim Vergleich der IL-2 Daten zeigte sich allerdings ein geringer Vorteil der mit 100µg gespritzten Mäuse (zumindest für die Peptide OVA_323-339 und OVA_327-337).
Anhand der oben geschilderten Daten ließ sich kein sicherer Vorteil der D-Aminosäuren-substituierten Peptide gegenüber den L-Peptiden herausarbeiten. Der Vergleich der Daten bei 100µg Peptid i.v. und 300µg Peptid i.v. erscheint die reduzierte Dosis von 100µg immer noch zu hoch, um einen deutlichen Unterschied zwischen den eingesetzten Peptiden darzulegen. Ggf. sollten Experimente mit Dosierungen von 75µg oder 50µg Peptid i.v. versucht werden.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auch die Dauerhaftigkeit extrathymisch induzierter antigenspezifischer Hyporesponsivität in BALB/c Mäusen untersucht. Es sollte festgestellt werden, ob die Dauer der induzierten Toleranz von dem injizierten Peptidantigen abhängig ist, bzw. ob ein Unterschied entsprechend der verlängerten Serumhalbwertszeit einiger Epitope festzustellen ist. In Hinblick auf den Einsatz von D-Aminosäuren-substituierten Peptiden in der Therapie autoimmuner Erkrankungen, war von Interesse, wie lange die induzierte Toleranz beobachtbar ist, und ob sich hier der Vorteil von D-Aminosäuren-vermittelter Serumstabilität bemerkbar macht.
BALB/c Mäuse wurden an Tag 0 mit 300µg der entsprechenden Peptide in PBS (bzw. PBS alleine) i.v. injiziert und an Tag 33 bzw. 53 mit OVA_323-339 s.c. immunisiert. Eine Woche später wurden die drainierenden Lymphknoten dieser Mäuse entnommen und in vitro mit OVA_323-339 restimuliert. Wie in den Tag 17 Experimenten (s.o.) wurde die Proliferation und IL-2 Sekretion gemessen. Hierbei richtete sich das Augenmerk vornehmlich auf den Vergleich von OVA_323-339 zu OVA_{(327-338)327y,338a}, da beide eine vergleichbar starke stimulatorische Potenz am DO11.10 T-Zellrezeptor zeigen.
Die Analysen der induzierten Toleranz zeigten innerhalb jeder Peptid-Gruppe für die Peptide OVA_323-339, OVA_327-337und OVA_{(327-338)327y,338a} vergleichbar konstante Ergebnisse über die gesamte beobachtete Zeit. Im Vergleich der einzelnen Peptide untereinander zeigten OVA_323-339 und OVA_{(327-338)327y,338a} einen leichten Vorteil gegenüber OVA_327-337
Die Analysen an Tag 40 und Tag 60 ergaben keine nennenswerten Unterschiede bezüglich Proliferation oder IL-2 Sekretion zwischen OVA_323-339 und OVA_{(327-338)327y,338a}.
Zusammenfassend zeigten die Lymphozyten der mit OVA_323-339 und OVA_{(327-338)327y,338a}behandelten Mäuse eine stabile Toleranz über die gesamte hier beobachtete Zeit, wobei die Quote der „Therapieversager“ mit der Zeit bei OVA_323-339 behandelten Mäusen eher früher zunahm. Bemerkenswerterweise nahm die Zahl der nicht toleranten Mäuse in der OVA_{(327-338)327y,338a} behandelten Gruppe mit der Zeit eher ab.
Bei Betrachtung dieser Ergebnisse wäre es interessant, das Zeitintervall zwischen der i.v. Gabe und der s.c. Immunisierung weiter zu strecken, um einen kritischen Bereich zu finden, in dem die Wirkung einer einmaligen i.v. Gabe deutlicher nachlässt. Besonders hier sollten sich Vor- oder Nachteile der eingesetzten Peptide zeigen.