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2  Methodik

2.1 Allgemeine Methodik

2.1.1 Grundlagen der funktionellen Bildgebung

Zur Darstellung der neuronalen Netzwerke und des zeitlichen Verlaufs neuronaler Aktivität wurde in dieser Studie die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRI) angewendet. Bevor auf die dieser Methode physiologisch zugrunde liegende Neurovaskuläre Kopplung sowie die spezielle Methodik der durchgeführten Versuche näher eingegangen wird, soll zunächst kurz auf die allgemeinen Prinzipien funktioneller Bildgebungsverfahren sowie auf die biophysikalischen Grundlagen und Techniken der Kernspintomografie eingegangen werden. Grundsätzlich können Methoden zur nicht-invasiven funktionellen Bildgebung des Gehirns in zwei unterschiedliche Ansätze unterteilt werden: (1) elektromagnetische Techniken, zu denen die Elektroenzephalografie (EEG) und die Magnetenzephalografie (MEG) zählen, die beide eine hohe zeitliche Auflösung, jedoch nur eine beschränkte räumliche Auflösung haben, und (2) Techniken, die vaskulär-metabolische Veränderungen messen, wie funktionelle Kernspintomografie (fMRI) und Positronenemissionstomografie (PET). Diese beruhen auf der Kopplung von neuronaler Aktivität mit dem Energiestoffwechsel und dem Blutfluss (Roy und Sherrington, 1890). Ein signifikanter Vorteil einiger der auf vaskulär-metabolischen Ansätzen beruhenden Methoden gegenüber elektrophysiologischen Techniken ist eine gute räumliche Auflösung und eine präzise Zuordnung zu anatomischen Strukturen.

2.1.2 Funktionelle Kernspintomografie

Basierend auf den Prinzipien der klinisch etablierten konventionellen Kernspintomografie, die wiederum auf der von Bloch und Purcell entdeckten Magnetresonanz (Bloch, 1946; Purcell et al., 1946) beruhen, konnte die funktionelle Kernspintomografie (fMRI) in den frühen 90er Jahren als alternatives Bildgebungsverfahren zur strahlenbelastenden Positronenemissionstomografie (PET) etabliert werden. Als wichtigste fMRI-Methode gilt zur Zeit die Blood-oxygen-level-dependent-Technik (BOLD) (Villringer und Dirnagl, 1995), bei der aufgrund einer spezifischen Sensitivität gegenüber stimulusassoziierten Veränderungen der Blutoxygenierung auf die intravenöse Applikation eines Kontrastmittels, wie in der PET oder in einigen klinisch angewandten MRI-Methoden üblich, verzichtet werden kann.


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FMRI-Studien beinhalten neben den eigentlichen funktionellen Sequenzen in der Regel auch rein anatomische Messungen, da durch grafische Überlagerung (Alignment / Realignment) der in gleicher Schichtführung gemessenen anatomischen Bilder mit den funktionellen Daten eine leichtere topografische Zuordnung aktivierter Kortexareale möglich ist. Als Referenz dienen die in der klinischen Diagnostik etablierten hochauflösenden T1-gewichteten Sequenzen.

2.1.2.1 Biophysikalische Grundlagen

Wird ein biologisches Objekt in einen Magneten gebracht, so bildet sich ein Magnetfeld entlang der Magnetlängsachse aus. Dieses wird als Longitudinalmagnetisierung bezeichnet, welche mittels eines Radiofrequenzpulses (RF-Puls) in eine Transversalmagnetisierung überführt wird. Letztere kann daraufhin in den RF-Spulen (Antennen) durch Induktion einer Spannung nachgewiesen werden. Durch spezifische Schaltung von Schichtselektionsgradienten, d.h. variabler Schichtdicke und Position definierender Magnetfelder, wird eine Bildebene erzeugt, die die Grundlage der Ortskodierung bildet.

Bei den in der funktionellen Kernspintomografie zum Einsatz kommenden Pulssequenzen wird dann der mit der Zeitkonstante T2* bezeichnete Zerfall der Transversalmagnetisierung durch Ein- und Ausschalten von Gradientenpulsen kodiert, um wiederum eine Ortskodierung der Bildebene zu ermöglichen. Somit steht nach diversen elektromagnetischen Schaltungsvorgängen eine ausreichende, in Anlehnung an die Fourieroptik als k-Raum bezeichnete Datenmatrix für ein MRI-Bild zur Verfügung (Stehling et al., 1995).

2.1.2.2  Echo-planar-imaging (EPI)

Beim Echo-planar-imaging (EPI) handelt es sich um ein Messverfahren der funktionellen Kernspintomografie, deren Grundlagen in den 70er Jahren beschrieben worden sind (Mansfield und Maudsley, 1977). Hierbei wird die nach Applikation des RF-Pulses zur Verfügung stehende Transversalmagnetisierung zur Erzeugung mehrerer MR-Echos genutzt, was durch weitere schnelle Gradientenschaltungen möglich ist. Aus dem T2*-Zerfall können so bis zu 128 Gradienten-Echos erzeugt werden (Stehling et al., 1995).

2.1.2.3 Neurovaskuläre Kopplung

Ein Zusammenhang zwischen neuronaler Funktion und zerebrovaskulären Änderungen wurde bereits im 19. Jahrhundert beschrieben (Roy und Sherrington, 1890). Für eine präzise Interpretation funktioneller Datensätze, die mit vaskulär-metabolisch basierten Techniken erhoben wurden, ist es notwendig, die Beziehung zwischen neuronaler Aktivität und metabolischer bzw. vaskulärer Antwort zu verstehen (Villringer und Dirnagl, 1995). Obwohl die fundamentalen [Seite 19↓]biochemischen und elektrischen Vorgänge, die die neuronale Aktivität mit regionalem zerebralen Blutfluss, zerebralem Blutvolumen und Blutsauerstoffsättigung koppeln, noch nicht vollständig verstanden werden, besteht Gewissheit darüber, dass elektrische, vaskuläre und metabolische Parameter miteinander gekoppelt sind.

Unstrittig ist weiterhin, dass es bei einer Zunahme neuronaler Aktivität zu einer lokalen Zunahme des Energieverbrauchs und des lokalen zerebralen Blutflusses kommt (Roy und Sherrington, 1890; Sokoloff, 1981; Fox und Raichle, 1986). Da der regionale zerebrale Blutfluss (rCBF) stärker zunimmt als der Sauerstoffverbrauch (was von den nachfolgenden Autoren als focal uncoupling bezeichnet wurde) (Fox und Raichle, 1986; Fox et al., 1988), kommt es zu einer lokalen Hyperoxygenierung, die sich auch mittels optischer Methoden darstellen lässt und sich in einer Zunahme der Konzentration des oxygenierten Hämoglobins ([oxy-Hb]) und einer Abnahme des deoxygenierten Hämoglobins ([deoxy-Hb]) widerspiegelt (Malonek und Grinvald, 1996; Obrig et al., 1996; Wenzel et al., 1996b).

2.1.2.4 Modelle zur Erklärung der Hyperoxygenierung

Zur Erklärung des Phänomens der Hyperoxygenierung konkurrieren unterschiedliche Erklärungsmodelle. Eine Hypothese ist, dass der rCBF-Anstieg primär der Deckung eines gesteigerten Glukosebedarfes dient. Hierfür spricht einerseits, dass der Blutfluss proportional dem Glukoseverbrauch ansteigt (Fox et al. , 1988) und weiterhin der Glukosemetabolismus mit der synaptischen Aktivität gekoppelt ist (Schwartz et al. , 1979; Sibson et al. , 1998). Es ist in diesem Zusammenhang vorgeschlagen worden, dass der gesteigerte Energiebedarf zunächst nicht-oxidativ durch Glykolyse gedeckt wird (Shulman und Rothman, 1998; Sibson et al. , 1998; Magistretti und Pellerin, 1999). Dabei würden die Astrozyten, die ihren Energiestoffwechsel hauptsächlich durch Glykolyse decken, Glutamat aus dem Extrazellulärraum entfernen und in Glutamin umwandeln. Dies wurde zur Erklärung der Disproportionalität von Blutflussanstieg und Sauerstoffverbrauch bei gleichzeitiger Proportionalität von Glukoseverbrauch und Blutflussanstieg herangezogen. Unterstützt wird diese Hypothese durch Arbeiten, die mittels MR-Spektroskopie einen Anstieg der Laktatkonzentration während der Hirnaktivierung nachwiesen (Shulman et al. , 1993; Madsen et al. , 1998). Jedoch ist der Laktatanstieg zu klein und transient (Prichard et al. , 1991; Frahm et al. , 1996), um dem großen Bedarf an aus nicht-oxidativer Glykolyse gewonnener Glukose gerecht zu werden. Interessant ist in diesem Zusammenhang auch, dass der Laktatanstieg sich im Laufe einer prolongierten Stimulation zurückbilden kann (Sappey-Marinier et al. , 1992; Frahm et al. , 1996), was als recoupling , also eine Rückkehr zum oxidativen Metabolismus bezeichnet wurde. Weitere Evidenz für die Substratthese stammt aus einer MRI-Studie, in der gezeigt wurde, dass der Glukose-Verbrauch der Rate entspricht, mit der im Gehirn Glutamat in Glutamin umgewandelt wird (Sibson et al. , 1998).


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Eine konkurrierende Hypothese zur Erklärung der Disproportionalität von Blutflussanstieg und Sauerstoffverbrauch beruht auf dem Modell eines limitierten Gasaustausches an der Kapillarwand bei höheren Blutflussgeschwindigkeiten. Eine überproportionale rCBF-Zunahme ist in diesem Modell notwendig, um den erhöhten O2-Bedarf des bei während der Aktivierung gesteigerten oxidativen Metabolismus zu decken (Buxton und Frank, 1997). Das heißt, um im Gewebe auch nur einen geringen Anstieg des Sauerstoffbedarfes zu bedienen, muss der Blutfluss disproportional stark ansteigen. Der Anstieg des Blutflusses dient also letztlich genau dazu, den Bedarf an Sauerstoff zu decken. Verschiedene Modellierungen wurden hierfür vorgeschlagen (Buxton und Frank, 1997; Vafaee et al., 1999).

Aktuell kann keine der beiden Hypothesen die gemessenen Änderungen des Sauerstoffangebots und der Sauerstoffaufnahme oder des Glukose/Laktat-Metabolismus vollständig erklären, so dass eine Kombination beider Hypothesen notwendig erscheint (Gjedde und Marrett, 2001).

2.1.2.5 Verhältnis von neuronaler Aktivität und Blutfluss

Wie einleitend bereits erwähnt, besteht Einigkeit über die Kopplung neuronaler Aktivität und vaskulärer und metabolischer Parameter. Eine zentrale Frage dabei ist unter neurowissenschaftlichen Gesichtspunkten, welche Prozesse im Nervengewebe mit den beobachteten vaskulären und metabolischen Veränderungen korrelieren. Da jenseits der Hypothesen zur Erklärung der fokalen Hyperoxygenierung angenommen werden muss, dass der Blutflussanstieg der Deckung eines gesteigerten Energiebedarfes dient, kommt einer genaueren Aufschlüsselung des Energieverbrauches bei der neuronalen Erregung eine zentrale Bedeutung zu.

Über Jahrzehnte wurde angenommen, dass Aktionspotentiale nur zu einem sehr geringen Teil (0.3 bis 3%) zum Energieverbrauch beitragen (Creutzfeldt, 1975). Jueptner und Weiller kommen 1995 in einer Literaturübersicht zu dem Schluss, dass die synaptische Aktivität, genauer die präsynaptischen Axon-Endigungen, wichtigster Konsument der metabolisierten Glukose sind (Jueptner und Weiller, 1995). Arbeiten, die die Annahme stützen, dass synaptische Aktivität den Hauptenergieverbrauch darstellt, zeigten, dass die präsynaptischen Elemente der Axonterminale Orte mit hohem Metabolismus sind (Nudo und Masterton, 1986). Eine kürzlich erschienene Übersicht zum Energieverbrauch des Gehirns (Attwell und Laughlin, 2001) kam jedoch zu deutlich davon abweichenden Schlussfolgerungen. Für Aktionspotentiale wurden bei Nagern 47% und für postsynaptische Aktivität 34% (beim Menschen geschätzte 74%) des signalbezogenen Energieverbrauches veranschlagt, während für das Recycling von Glutamat der angestellten Rechnung zufolge nur 3% anfielen. Die Autoren folgerten abschließend, dass, wenn indirekte Methoden der funktionellen Bildgebung Veränderungen des Energiebedarfes reflektieren, ihr [Seite 21↓]Signal hauptsächlich von postsynaptischen Aktionen des Glutamats und den den Aktionspotentialen zugrunde liegenden Ionenströmen bestimmt ist, wobei beide sensitiv in Bezug auf die so genannte Spike-Aktivität sind.

Studien, die in der Ratte direkt den Einfluss von Spike-Aktivität und synaptischer Aktivität auf den rCBF untersuchten, kamen jedoch zu dem Schluss, dass die Spike-Aktivität einen vergleichsweise geringen Einfluss auf die Blutflussantwort hat (Lauritzen, 2001). Andererseits bestehen in dem in der Gruppe von Lauritzen genutzten Kleinhirnmodell jedoch abhängig von der Stimulationsart und -frequenz Korrelationen zwischen prä- und postsynaptischer Aktivität mit dem rCBF.

Die Frage nach der Korrelation des der funktionellen Kernspintomografie zugrunde liegenden BOLD-Kontrastes (s.u.) zu elektrophysiologischen Größen ist ebenfalls direkt untersucht worden. Logothetis und Mitarbeiter konnten in einer Untersuchung am Affen, in der gleichzeitig Einzel- und Multi-Unit Aktivität (MUA), lokale Feld- Potentiale (LFP) und Änderungen des BOLD-Kontrastes gemessen wurden, die beste Korrelation zwischen den LFP und der vaskulären Antwort aufzeigen (Logothetis et al. , 2001). Dabei ist anzunehmen, dass MUA die Spike-Aktivität der Neurone, die LFP die Superposition von synchronisierten dendritischen Entladungen reflektieren. Die methodische Stärke und damit die Wertigkeit der Befunde der zitierten Arbeit liegt sicherlich in der Kombination von elektrophysiologischen und kernspintomografischen Methoden. Demgegenüber beruhten jüngere Veröffentlichungen, die direkt eine proportionale Beziehung zwischen BOLD-Signal und neuronaler Entladungsrate (firing rate) postulierten, auf einem Analogieschluss von Befunden aus fMRI-Studien bezüglich verschiedener humaner visueller Areale und elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Kortex des Makake-Affen (Heeger et al., 2000; Rees et al., 2000).

Zusammenfassend erscheint also die Zuordnung sogenannter ‚hot spots‘ vaskulär-metabolisch-neuronaler Aktivität (Lauritzen, 2001) zu bestimmten neuronalen Prozessen noch nicht vollständig beantwortet. Die Wertigkeit der genauen Aufklärung ist hoch, denn von ihr ist abhängig, ob „Aktivierung“ auf neuronaler Ebene synaptischen Transfer, lokale Feldpotentiale (LFP) oder Spike-Aktivität meint.

2.1.3  Das BOLD Signal

Die Abhängigkeit von T2- oder T2*-gewichteten MR-Signalen vom Oxygenierungsstatus des Hämoglobins konnte erstmals von Ogawa und Mitarbeitern demonstriert werden (Ogawa et al., 1990; Ogawa et al., 1993), der dieser Bildgebungstechnik den Namen Blood oxygen level dependent (BOLD, BOLD-Kontrast) gab. Er wird als magnetischer Suszeptibilitätskontrast zwischen intra- und extravaskulärem Raum aufgefasst. Da oxygeniertes Hämoglobin [Seite 22↓]diamagnetisch und deoxygeniertes Hämoglobin paramagnetisch ist, entsteht durch den paramagnetischen Anteil im Gefäß um das Gefäß ein magnetischer Feldgradient, der einen Abfall der Signalintensität im T2 und T2* gewichteten MR-Bild bewirkt. Eine Zunahme von [deoxy-Hb] führt zu einer Zunahme der magnetischen Suszeptibilität des Blutes (Thulborn et al., 1982). Umgekehrt ist der Signalanstieg bei Hirnaktivierung auf einen Abfall von [deoxy-Hb] zurückzuführen, wenn deoxygeniertes Hämoglobin den Hauptanteil endogener paramagnetischer Substanzen darstellt (Bandettini et al., 1992). Physiologische Grundlage des BOLD-Kontrastes bei funktioneller Aktivierung ist also die oben erwähnte Hyperoxygenierung mit einem Abfall der Konzentration des deoxygenierten Hämoglobins. Dies bedeutet, dass die drei wesentlichen physiologischen Einflussgrößen regionaler Blutfluss, Blutvolumen und lokaler Sauerstoffverbrauch sind.

2.1.4  Grafische 3D-Rekonstruktion

In der grafischen Darstellung von fMRI-Daten konnte in den letzten Jahren die dreidimensionale Oberflächenrekonstruktion des Kortex und dessen Auffaltung (cortex inflation) etabliert werden. Dieses aus den tierexperimentellen Arbeiten übernommene Verfahren (Carman et al., 1995; Van Essen et al., 1998) erleichtert die anatomische Lokalisation von Arealen in durch Faltungen überlagerten Sulci oder der von Frontal- und Parietallappen verdeckten Inselregion.

Beim Menschen wurden 3D-Rekonstruktion und Auffaltung in diversen fMRI-Arbeiten u.a. zur Bestimmung der Arealgrenzen des primären visuellen Kortex angewandt (Sereno et al., 1995; Tootell et al., 1995; Tootell et al., 1998). Mittlerweile sind sie Bestandteil vieler neurowissenschaftlicher Untersuchungen.


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2.2  Spezielle Methodik

2.2.1 Probanden

Die Untersuchungen von Versuchspersonen waren von der Ethikkommission der Charité genehmigt und wurden im Sinne der Erklärung von Helsinki durchgeführt.Vier Männer und eine Frau im Alter von 24-38 Jahren (alle Rechtshänder), deren Vorgeschichte keine Hinweise auf relevante neurologische Erkrankungen ergaben, nahmen teil. Vor den Messungen fand ein ausführliches Aufklärungsgespräch über die Risiken einer MRI-Messung statt. Alle Probanden gaben daraufhin ihr Einverständnis zu den Untersuchungen.

2.2.2 Versuchsaufbau

Zur Identifizierung bewegungssensitiver Kortexareale wurden zwei verschiedene Versuche am Probandenkollektiv durchgeführt, die zum einen vestibuläre- und zum anderen visuelle Afferenzen stimulieren sollten.

2.2.2.1 Vestibuläre Stimulation

Als vestibulärer Stimulus innerhalb des Kernspintomografen konnte die kalorische Reizung der Vestibularorgane durch Kühlung des Gehörgangs etabliert werden. Diese wurde mit über einen Plastikschlauch applizierten kaltem Stickstoff (5°-7°C) durchgeführt. Nach orientierenden Vorversuchen außerhalb des Magneten erfolgte die Regulierung der Luftstromstärke nach einer individuellen Schwelle von Eigenbewegungswahrnehmung und Nystagmus. Bei allen Probanden führte eine 60s anhaltende Kühlungsphase zu reproduzierbarem Eigenbewegungsempfinden und Nystagmus, die 30 - 40s nach Stimulationsbeginn einsetzten und auch 90s nach Stimulusende noch nachweisbar waren. Der Nystagmus wurde zuvor in einem separaten Untersuchungsgang mit horizontaler Elektrookulografie (EOG) aufgezeichnet.

Bei jedem Probanden wurden beide Gehörgänge separat in je 6-10 fMRI-Experimenten (Runs) stimuliert. Ein Run (600s) bestand aus 304 EPI-Aufnahmen und beinhaltete zwei Kühlungsphasen von je 60s (Abbildung 2-1). Um visuelle Effekte zu minimieren, wurde der Raum komplett abgedunkelt und die Probanden wurden instruiert, während der Messung die Augen geschlossen zu halten. Unmittelbar reizungsbedingte Effekte auf somatosensorische sowie auditorische Afferenzen sollten durch einen Ausschluss der Stimulationsphase von der statistischen Analyse vermieden werden. Pro Messtag wurden zwei bis drei Runs durchgeführt. Für Details dieses Versuches sei auf die Arbeit von Kuhberg verwiesen (Kuhberg et al., 2001).


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Abbildung 2-1:
Versuchsprotokoll der vestibulären kalorischen Stimulation. Auf 60s Ruhebedingung (dunkelgrau) folgte eine ebenso lange Kühlungsphase. Nach Ende der Reizung war ein Nystagmus bei allen Probanden in den ersten 60s nachweisbar (hellgrau). Die schwarze Linie stellt den Verlauf der Stickstoffapplikation dar. Grundlage der statistischen Analyse bildeten die Nystagmusphase und die Ruhebedingung. Die übrigen Daten wurden verworfen.

2.2.2.2 Visuelle Stimulation

Der visuelle Reiz wurde in Anlehnung an den von Tootell zur Darstellung von MT etablierten Stimulus (Tootell et al., 1995) entwickelt und bestand aus mehreren konzentrisch angeordneten niedrig kontrastierten Ringen, die entweder unbewegt waren (Ruhebedingung - baseline) oder in unregelmäßigem Wechsel kontrahierten und expandierten (Bewegungsbedingung – motion) (Abbildung 2-2). In der Mitte befand sich ein Kreuz, das vom Probanden während der Messung fixiert werden sollte.

Das als Blockdesign konzipierte Stimulationsprotokoll für einen funktionellen EPI-Run (Abbildung 2-2) bestand aus vier Ruhebedingungen (je 60s) mit einer jeweils darauf folgenden Bewegungsbedingung (je 60s). Der Stimulus wurde manuell nach Ende der ersten vier EPI-Akquisitionen gestartet (s.u.) und der horizontal im Kernspintomografen liegenden Versuchsperson über einen an der Kopfspule angebrachten individuell einstellbaren Spiegel mit vorgesetzter Mattscheibe präsentiert. Der Spiegel reflektierte das computergenerierte Bild von einem sich im selben Raum befindenden LCD-Projektor (NEC 8000 G, Stuttgart). Die Projektorlinse wurde durch eine speziell angefertigte Linse ersetzt, um eine optimale Projektion zu gewährleisten. Der Stimuluscomputer befand sich außerhalb des Magnetfeldes neben der Steuerungskonsole.


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Abbildung 2-2:
Stimulus (links) und Versuchsprotokoll (rechts). Die schwarze Linie in (rechts.) zeigt den zeitlichen Verlauf des visuellen Stimulus in einem funktionellen Run an. Die weißen Abschnitte stellen die Bewegungsbedingung dar (motion). In den grauen war der Stimulus unbewegt (baseline).

Um Bewegungsartefakte der MRI-Messungen zu vermeiden, wurde der Kopf des jeweiligen Probanden innerhalb der Kopfspule in einem Vakuumkissen fixiert. Danach fand eine individuelle Justierung von Projektor, Linse und Spiegel statt. Das innerhalb des zentralen Rings gelegene Kreuz sollte scharf abgebildet in der Mitte des Gesichtsfeldes liegen und ohne Anstrengung fixierbar sein. An zwei bis drei Messtagen pro Versuchsperson fanden jeweils drei bis sechs visuelle Runs und zwei anatomische Messungen zum Realignment statt.

2.2.3 MRI-Messungen

Die Messungen wurden mit einem 1.5 Tesla Siemens Vision Kernspintomografen durchgeführt, der mit einem EPI-Booster aufgerüstet war.

2.2.3.1 EPI-Sequenzen

EPI-Sequenzen (TR = 2s, TE = 60ms, flip angle = 90° , Fov = 256x256mm, Bildmatrix = 64x64, Schichtdicke = 5mm, gap = 0.5mm) wurden in schräger Schichtführung positioniert, so dass die 16 Schichten den supratentoriellen Teil des Gehirns mit Ausnahme des antero-inferioren Frontallappens bedeckten (Abbildung 2-3). Die Sequenz erlaubte es, 16 Einzelbilder in eine Bildmatrix zu schreiben und somit die Limitierung des Siemens Systems auf 128 Messzeitpunkte zu umgehen. Ein EPI-Run des visuellen Stimulationsprotokolls beinhaltete 260 EPI-Akquisitionen.


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Abbildung 2-3:
Schichtführung der EPI-Sequenzen beim visuellen und vestibulären Versuchsparadigma bei einer repräsentativen Versuchsperson (saggitale Ansicht; Proband sh).

2.2.3.2 T1-Sequenzen

Zur anatomischen Orientierung und zur 3D-Rekonstruktion kamen drei verschiedene T1-Sequenzen zur Anwendung.

Jede Sitzung beinhaltete eine hochauflösende T1-gewichtete 3D-MP-Rage Messung (TR = 9.7ms, TE = 4ms, flip angle = 90°, Fov = 256x256mm, voxel size 1x1x1mm, 190 slices), um eine Transformation der EPI-Daten in den dreidimensionalen Raum sowie eine verschiedene Sitzungen integrierende Datenanalyse (s.u.) zu ermöglichen. Zur visuellen Kontrolle der räumlichen Transformation wurde eine zweidimensionale T1-gewichtete Messung (TR = 900 ms, TE = 14ms, pixel size 2x2mm, 16 slices) in gleicher Schichtführung wie die EPI-Sequenz durchgeführt.

In der ersten Sitzung wurde statt der MP-Rage von jeder Versuchsperson eine hochauflösende 3D-Flash-Sequenz (TR = 20ms, TE = 5ms, flip angle = 30°, Fov = 256x256mm, voxel size 1x1x1mm, 190 slices) gemessen, die als Grundlage der Kortexrekonstruktion und Auffaltung diente.

2.2.4 Datenanalyse

Die Daten wurden mit der von Prof. R. Göbel (Maastricht) entwickelten Software (Brainvoyager 4.1 ©) ausgewertet. Als Rechner stand ein 400 MHz PC mit Pentium II-Prozessor und 256MB RAM zur Verfügung.


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2.2.4.1  Anatomische Messungen

Die T1-gewichteten anatomischen Datensätze dienten als Grundlage der verschiedenen Realignment-Prozesse (2D-T1, 3D-MP-Rage) und der grafischen Überlagerung der funktionellen EPI-Daten auf die rekonstruierte 3D-Flash.

2.2.4.2 Funktionelle Messungen

Die jeweils ersten vier Bilder einer EPI-Messung wurden aufgrund des ungesättigten T1-Signals verworfen. Nach dem Einlesen der übrigen 300 Aufnahmen des vestibulären-, bzw. 256 Aufnahmen des visuellen Protokolls wurden diese mit den Daten der in gleicher Schichtführung durchgeführten T1-Messung überlagert (2D-2D-Alignment) (Abbildung 2-4). Das halbautomatische 2D-3D-Alignment, bei dem die funktionellen Daten anhand der in den Rohdaten enthaltenen Schichtpositionsparameter (Headerinformationen) in den dreidimensionalen Raum der MP-Rage Aufnahme transformiert wird, konnte visuell durch den hochauflösenden zweidimensionalen T1-Datensatz kontrolliert bzw. bei geringen Verschiebungen entsprechend modifiziert werden.

Abbildung 2-4:
Alignment der EPI-Daten mit der T1-Sequenz am Beispiel der Schichten 9-12 eines visuellen Runs. Da beide Aufnahmen in gleicher Schichtführung aufgenommen wurden, kann der funktionelle EPI-Datensatz (oben) mit dem anatomischen (unten) überlagert werden.

Eine weitere räumliche Transformation, die die MP-Rage in eine deckungsgleiche Position mit der in der ersten Sitzung akquirierten 3D-Flash brachte (3D-3D-Alignment), erfolgte durch einen in der Software integrierten automatischen Prozess, dessen Ergebnis wiederum der visuellen Kontrolle unterlag. Dies diente als Basis für eine Überlagerung jedes am individuellen Probanden erhobenen zweidimensionalen funktionellen Datensatzes (slice time courses), der aufgrund der verschiedenen Alignment-Prozesse in dreidimensionale so genannte volume time courses (vtc) verrechnet wurde, auf dieselbe anatomische Referenzmessung (3D-Flash).


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Somit konnten die in verschiedenen Sitzungen gewonnenen Ergebnisse nach statistischer Analyse (s.u.) in funktionellen und anatomischen Bezug zueinander gesetzt werden.

2.2.4.3 Statistische Analyse

Preprocessing

Um Artefakte zu reduzieren, die durch minimale Positionsveränderungen des Kopfes während der Messungen oder durch lineare Signalabfälle des BOLD-Signals entstehen konnten, mussten vor der Korrelationsanalyse verschiedene Schritte der Datenprozessierung (preprocessing) durchgeführt werden.

Zunächst durchliefen die volume time courses eine an allen drei Raumebenen (x; y; z) orientierte Bewegungskorrektur, woraufhin Runs, die eine Verschiebung von >2mm in mindestens einer Koordinate aufwiesen, von der weiteren Analyse ausgeschlossen wurden. Um das Signal-Rausch-Verhältnis positiv zu beeinflussen, fand eine in der funktionellen Kernspintomografie übliche räumliche Glättung der Daten mit einem Gauss-Filter (FWHM=2; entspricht zwei funktionellen Voxeln) statt. Lineare Trends im Signalverlauf wurden entfernt.

Allgemeines Lineares Modell

Die von Bandettini beschriebene Auswertungstechnik, die die Errechnung der jeweiligen Korrelationen des zeitlichen BOLD-Signalverlaufs der funktionellen Daten mit dem Stimulationsprotokoll zum Gegenstand hat (Bandettini et al., 1993), konnte im Rahmen des Allgemeinen Linearen Modells (ALM) (Cohen, 1968) erweitert werden. Die Grundlagen dieser multiplen Regressionsanalyse sollen hier kurz dargestellt werden.

Sei y ij das geglättete MRI-Signal des Voxels j in der Messwiederholung i. Dann ist das ALM für yij durch die folgende multivariate Regressionsgleichung gegeben:

yij= gi1β1j+ gi2 β 2j + ... giK β Kj + eij.

(1)

Voraussetzung des ALM ist, dass die Fehler e ij zwischen den Bedingungen unabhängig und normalverteilt sind. Die Koeffizienten g ij bilden K Spaltenvektoren, die den Signalverlauf (insbesondere seinen Anstieg in den experimentellen Bedingungen) nach den Hypothesen des Experimentators vorhersagen. Sie werden deswegen als „Prädiktoren“ bezeichnet. Das Modell besitzt K unbekannte Parameter β für jedes Voxel j, die durch Minimierung der Fehler e ijbestimmt wird. Dazu wird die Gleichung in Matrixschreibweise formuliert:

Y = Gβ + e.

(2)

Y ist die fMRI-Datenmatrix; sie besitzt eine Spalte für jedes Voxel und eine Reihe für jede Messwiederholung. Die Designmatrix G besteht aus den Koeffizienten g ik. β ist die Parametermatrix mit Spaltenvektoren b jImpulsantwortfunktion für die K Parameter des Voxels j. Zur Lösung von [Seite 29↓]Gleichung (2) wird die Methode der kleinsten Quadrate verwendet. Dabei wird jene Parametermatrix β bestimmt, für die e´e minimiert wird:

e´e = (Y-Gβ)´(Y-Gβ) = min.

(3)

Wird e´e nach ß differenziert und die Ableitung gleich Null gesetzt, resultiert die Matrix b :

b = (G´G)-1G´Y.

(4)

Mit den fMRI-Daten der vestibulären und visuellen Stimulation wurden die ALM zunächst unabhängig voneinander berechnet. Da die Auswertung der vestibulären Versuche an anderer Stelle erfolgte (Kuhberg et al., 2001), beziehen sich die folgenden Ausführungen auf letzteren Versuch.

Für jede der experimentellen Bedingungen wurde ein Prädiktor g (i) definiert. Im ersten Schritt wurde der Referenzvektor r motion (i) durch „Dummykodierung“ bestimmt: Allen Messungen i während der Kontrollbedingung baseline wurde der Wert 0 zugeordnet, allen Messzeitpunkten während der experimentellen Bedingung motion wurde der Wert 1 zugeordnet.

Im zweiten Schritt wurden diese Referenzvektoren mit einer empirisch für das Areal V1 gewonnenen hämodynamischen Impulsantwortfunktion h gefaltet, um mit g motion (i) die Signalantwort aktivierter Areale möglichst realistisch zu modellieren (Cohen, 1997):

g (i) = r (i) * h (i),

(5)

wobei die kontinuierliche Funktion h durch

h (t) = [t / Τ (n-1) e - (t/T) ] / [Τ (n - 1)]

(6)

gegeben ist. Die Phasenverschiebung der Antwort wurde mit n = 2.5 und die Zeitkonstante ihres Anstiegs mit Τ= 1.25 s -1 festgelegt (Boynton et al., 1996).

In der fMRI-Datenmatrix Y wurden alle volume time courses eines Probanden aneinander gehängt, nachdem diese zuvor z-transformiert wurden, um den Einfluss unterschiedlicher Ausgangssignalintensitäten von einem Sequenz-Durchlauf zum nächsten zu eliminieren. Aus b wurde für jedes Voxel j der multiplen Korrelationskoeffizient Rj bestimmt.

Die Vorteile der Implementierung des ALM in der funktionellen Kernspintomografie wurden ausführlich von Friston diskutiert (Friston et al., 1995).


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Konjunktions-Analyse

In einer anschließenden Konjunktions-Analyse, welche Aufschluss über gemeinsame Komponenten verschiedener Versuchsparadigmen gibt (Price und Friston, 1997), wurden die multiplen Korrelationskoeffizienten R der visuellen Stimulation mit den R-Werten des jeweiligen vestibulären Experiments verrechnet, wodurch nach farbkodierter Projektion auf den individuellen Flash-Datensatz ein Aktivierungsmuster von überlappenden Arealen beider Versuche entstand (activation maps). Als statistische Schwelle wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von mindestens p<10-6 festgelegt. Da bei zwei Probanden (Probanden rw,sh) aufgrund weniger artefaktbedingter Ausschlüsse von Datensätzen eine vergleichsweise hohe Anzahl von Runs in beiden Experimenten vorlag, konnte hier ein strengeres statistisches Kriterium von p<10-9 zugrunde gelegt werden.

2.2.4.4 Grafische Oberflächenrekonstruktion und Auffaltung des Gehirns

Die dreidimensionale Rekonstruktion der individuellen Kortexoberflächen erfolgte in mehreren Schritten anhand des 3D-Flash Datensatzes. Zunächst musste eine grafische Markierung der weißen Substanz durchgeführt werden (Segmentierung), die in jeder Schicht der drei Raumebenen unter visueller Kontrolle stattfand (Abbildung 2-5). Nach Entfernung von Hirnstamm und Kleinhirn wurde ein dreidimensionales Skelett der segmentierten weißen Substanz erstellt, auf welches nun in mehreren halbautomatischen Prozessen die graue Substanz rekonstruiert werden konnte. Dabei war wieder eine visuelle Kontrolle nötig, da Artefakte durch den schwer beurteilbaren Übergag zu den Hirnhäuten vermieden werden sollten. Nach mehreren grafischen Glättungen und einem strengen Vergleich mit den zugrunde liegenden Flashdaten entstand ein grafisch frei bewegliches Referenzmodell des Probandengehirns (Abbildung 2-6). Dieses konnte nun entfaltet werden, wobei die gyrale und sulcale Oberflächenstruktur durch ein spezifisches Schattierungsmuster erhalten blieb. Die Entfaltung erfolgte durch multiple Glättungen des rekonstruierten Referenzmodells.

Abbildung 2-5:
Segmentierung der weißen Substanz mit der Brainvoyager-Software (blaue Bereiche). Die Begrenzungen der einzelnen Gyri und Sulci wurden manuell markiert. Das Skelett der weißen Substanz diente als Grundlage zur Rekonstruktion.


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Abbildung 2-6:
Rekonstruktion und Glättung des in Abb. 2-5 dargestellten segmentierten Datensatzes. Zuerst wurde die graue Substanz auf das dreidimensionale Skelett (blau) rekonstruiert. Die nachfolgenden Glättungsschritte bestanden aus jeweils ca. 2000 einzelnen grafischen Glättungen. Mit jedem Probandendatensatz wurde dieser Prozess einmal durchgeführt, um mit dem unten dargestellten Modell eine optimale Projektionsfläche für die funktionellen Daten zu erstellen.


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2.2.4.5 Darstellung der funktionellen Daten beider Versuche auf der dreidimensionalen Kortexoberfläche

Bei gegebener statistischer Schwelle konnte das auf den 3D-Flash-Datensatz projizierte Aktivierungsmuster wiederum auf dem rekonstruierten und entfalteten Oberflächenmodell des jeweiligen Probandengehirns dargestellt werden. Die zwei verschiedenen activation maps, die zum einen die Überlappung zwischen linker vestibulärer kalorischer Stimulation und visueller Bewegungsstimulation (kl-mt), zum anderen zwischen rechter vestibulärer kalorischer Stimulation und visueller Bewegungsstimulation (kr-mt) enthielten, wurden durch verschiedene Farben gekennzeichnet. Die minimal dargestellte Arealgröße entsprach einer Fläche von 16 mm2, die wiederum der der Projektion zweier funktioneller Voxel auf die entfaltete Kortexoberfläche entsprach.


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19.10.2004