Studien zur Funktion des Proteasomen-assoziierten Proteins Blm3 in Saccharomyces cerevisiae

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Chemikerin Marion Fehlker
geb. am 2. 12. 70 in Lüdinghausen

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. P.-M. Kloetzel
2. Prof. Dr. B. Dahlmann
3. Prof. Dr. W. Dubiel

Tag der mündlichen Prüfung: 16. Juli 2004

Inhaltsverzeichnis

• 1 Zusammenfassung
• 2 Einleitung
  • 2.1  Saccharomyces cerevisiae
  • 2.2 Proteolyse
  • 2.3 Das Proteasom: Struktur, Biogenese und Lokalisation
    • 2.3.1  Das 20S Proteasom in Saccharomyces cerevisiae
    • 2.3.2 Das 26S-Proteasom
    • 2.3.3 Biogenese des 20S-Proteasoms
      • 2.3.3.1 Die Assemblierung des Proteasoms in Archae- und Eubakterien
      • 2.3.3.2 Die Assemblierung des Proteasoms in Eukaryonten
    • 2.3.4 Import des Proteasoms in den Zellkern
  • 2.4 Funktionen des Proteasoms
    • 2.4.1  Ubiquitin/Proteasom-System
    • 2.4.2 ERAD und UPR
      • 2.4.2.1 ER-Assoziierte Degradation (ERAD)
      • 2.4.2.2 Unfolded Protein Response (UPR)
    • 2.4.3 DNA-Reparatur
      • 2.4.3.1 Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen
      • 2.4.3.2 Nucleotide Excision Repair (NER)
    • 2.4.4 Apoptose
  • 2.5  Blm3
• 3 Zielsetzung der Arbeit
• 4 Material und Methoden
  • 4.1  Material
    • 4.1.1  Geräte
    • 4.1.2 Chemikalien und Zubehör
    • 4.1.3 Antikörper
    • 4.1.4 Kits
    • 4.1.5 Medien
      • 4.1.5.1  Medien für Hefekulturen
      • 4.1.5.2 Medien für E. coli-Kulturen
    • 4.1.6 Dauerkulturen
  • 4.2 Oligonucleotide, Plasmide und Stämme
    • 4.2.1  Verwendete Oligonucleotide
    • 4.2.2 Verwendete Plasmide
  • 4.3 Verwendete E. coli-Stämme
  • 4.4 Verwendete S. cerevisiae-Stämme
  • 4.5 Molekularbiologische Methoden
    • 4.5.1  Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
    • 4.5.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefe
    • 4.5.3 Isolierung chromosomaler DNA aus Hefe (Teeny Prep)
    • 4.5.4 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
    • 4.5.5 Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen
    • 4.5.6 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten
    • 4.5.7 Ligation von DNA-Fragmenten
    • 4.5.8 Transformation von E. coli-Zellen
      • 4.5.8.1  Herstellung kompetenter E. coli-Zellen für die chemische Transformation
      • 4.5.8.2 Chemische Transformation von E. coli
    • 4.5.9 Transformation von Hefezellen
      • 4.5.9.1 Transformation von Hefezellen nach der Lithiumacetat-Methode
      • 4.5.9.2 Transformation von Hefezellen durch Elektroporation
    • 4.5.10 Polymerasekettenreaktion (PCR) (Erlich, 1989, Innis et al., 1990)
    • 4.5.11 Rekombination von PCR-Fragmenten in den TOPO®-Vektor
    • 4.5.12 Southern Blot-Analyse
      • 4.5.12.1 Herstellung der Sonden-DNA
      • 4.5.12.2 Agarose-Gelelektrophorese für Southern Blot
      • 4.5.12.3 Transfer der DNA auf eine Membran
      • 4.5.12.4 Prähybridisierung/Hybridisierung
      • 4.5.12.5 Detektion
  • 4.6 Zellbiologische Methoden
    • 4.6.1  Kultur von E. coli-Zellen
    • 4.6.2 Kultur von S. cerevisiae-Zellen
    • 4.6.3 Pulse Chase für ER-Degradation von CPY* und CTG*
    • 4.6.4 Pulse Chase-Analyse der proteasomalen Maturierung
      • 4.6.4.1 Pulse Chase
      • 4.6.4.2 Immunpräzipitation
    • 4.6.5 Sporulation
    • 4.6.6 Zellfraktionierung
    • 4.6.7  In situ-Aktivitätstest (nach Wolf und Fink, 1975)
    • 4.6.8 Test auf Temperatursensitivität
    • 4.6.9 Test auf Bleomycin/Zeocin-Hypersensitivität
    • 4.6.10 Test auf Canavanin-Sensitivität
    • 4.6.11 Halotest auf H₂O₂-Sensitivität
    • 4.6.12 Direkte Fluoreszenzmikroskopie
    • 4.6.13 Überexpressionsstudien
  • 4.7 Proteinchemische Methoden
    • 4.7.1  Proteinbestimmung nach Bradford
    • 4.7.2 Proteinfällungen
      • 4.7.2.1 TCA-Fällung
      • 4.7.2.2 NaDOC-Fällung
    • 4.7.3 Zellaufschlüsse
      • 4.7.3.1  Alkalische Lyse (Schatzaufschluss)
      • 4.7.3.2 Glasperlenaufschluss
      • 4.7.3.3 Zellaufschluss mit flüssigem Stickstoff
      • 4.7.3.4 Zellaufschluss mithilfe der French Press
    • 4.7.4  Isolierung proteasomaler Komplexe
    • 4.7.5 Isolierung nativer proteasomaler Komplexe
    • 4.7.6 Isolierung des Proteins Blm3
    • 4.7.7 Glycerin-Dichtegradienten
    • 4.7.8  In vitro-Aktivitätstest
    • 4.7.9 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
    • 4.7.10 Nichtdenaturierendes Gel (Nativgel)
    • 4.7.11 Natives Gradientengel
    • 4.7.12 Auftrennung von Nativgel-Banden mithilfe der SDS-PAGE
    • 4.7.13 2D-Gelelektrophorese
      • 4.7.13.1 1. Dimension (NEPHGE)
      • 4.7.13.2 2. Dimension
    • 4.7.14 Western Blot
      • 4.7.14.1  Transfer auf eine Membran
      • 4.7.14.2 Detektion mit dem ECL-System
    • 4.7.15 Proteinsequenzierung
• 5 Ergebnisse
  • 5.1  Vorarbeiten
  • 5.2 Identifizierung des Proteasomen-assoziierten Proteins
  • 5.3 Blm3
    • 5.3.1  Datenbankinformationen zu Blm3
    • 5.3.2 Proteomik
    • 5.3.3 Blm3 und PA200
  • 5.4 Deletionsmutante ∆blm3::HIS3
  • 5.5 Untersuchung von ∆blm3-Zellen auf Phänotypen
    • 5.5.1  Untersuchung der Sensitivität gegenüber Bleomycin und Zeocin
    • 5.5.2 Temperatursensitivität von ∆blm3-Zellen
    • 5.5.3 Untersuchung der Canavanin-Sensitivität von ∆blm3-Zellen
    • 5.5.4  ∆blm3-Zellen zeigen keine H₂O₂-Sensitivität
  • 5.6  In situ und in vitro-Aktivitätstests
    • 5.6.1  In situ-Aktivität des ∆blm3-Stamms
    • 5.6.2  In vitro-Aktivität des Proteasoms aus dem ∆blm3-Stamm
    • 5.6.3 Einfluss von gereinigtem Blm3 auf die proteasomale Aktivität
  • 5.7  In vivo-Aktivität des Proteasoms aus ∆blm3-Stämmen
    • 5.7.1  Degradation von FBPase
    • 5.7.2  Degradation der ERAD-Substrate CPY* und CTG*
  • 5.8 Lokalisation des Proteasoms in ∆blm3
  • 5.9  Glycerin-Dichtegradienten
  • 5.10 Zusammensetzung von Proteasomen in wt- und ∆blm3-Zellen
  • 5.11 Lokalisation von Blm3
  • 5.12 Blm3 und Blm3-GFP-HA im Glycerin-Dichtegradienten
  • 5.13 Nicht-denaturierende PAGE von Wildtyp und ∆blm3
  • 5.14 Charakterisierung der Nativgelbanden der Proteasomenpräparationen
  • 5.15 Assoziation von Blm3 an proteasomale Vorläuferkomplexe
  • 5.16 Nativgele proteasomaler Vorläuferkomplexe
  • 5.17 Charakterisierung proteasomaler Vorläuferkomplexe
  • 5.18 Proteasomale Maturierung in Wildtyp- und ∆-Zellen
    • 5.18.1  Gleichgewichtszustände der Maturierung von Pre2/β5
    • 5.18.2 Kinetik der proteasomalen Maturierung
  • 5.19 Lokalisation von Blm3-GFP-HA in ∆ump1
  • 5.20 Doppeldeletion ∆blm3∆ump1
  • 5.21 Überexpression von Blm3
• 6  Diskussion
  • 6.1  Blm3 und PA200 als Regulatoren der proteasomalen Aktivität
  • 6.2 Blm3 und DNA-Reparatur
  • 6.3 Lokalisation von Blm3
  • 6.4 Assoziation von Blm3 an proteasomale Komplexe
  • 6.5 In ∆blm3-Zellen ist die Maturierung beschleunigt
  • 6.6 Beeinflusst Blm3 das Verhältnis von 20S- zu 26S-Komplexen?
• Abkürzungsverzeichnis 
• Anhang 1: Nomenklatur proteasomaler Untereinheiten 
• Literaturverzeichnis
• Danksagung 
• Eidesstattliche Erklärung  
• Lebenslauf 
• Wissenschaftliche Veröffentlichungen 

Tabellen

• Tabelle 1: Verschiedene DNA-schädigende Agenzien, die durch sie verursachte Art der Schädigung und zugehörige Reparatur-Mechanismen (aus: Hoeijmakers, 2002).
• Tabelle 2: Ergebnisse der ESI-MS/MS-Analyse des hochmolekularen Proteasomen-assoziierten Proteins nach Alkylierung mit Iodacetamid und tryptischem Verdau.^a ein Serin phosphoryliert.
• Tabelle 3: Affinitätschromatographisch isolierte Proteinkomplexe aus S. cerevisiae, in denen das Protein Blm3 detektiert wurde (Bader et al., 2003; 1Ho et al., 2002; 2Gavin et al., 2002)

Bilder

• Abb. 1: Das 20S-Proteasom aus S. cerevisiae
• Abb. 2: 26S-Proteasom
• Abb. 3: Der Aufbau des 26S-Proteasoms
• Abb. 4: Modellvorstellungen zu frühen Schritten der proteasomalen Assemblierung
• Abb. 5: Modell zu späten Schritten der Assemblierung des 20S-Proteasoms
• Abb. 6: Der klassische NLS-abhängige Importmechanismus über Importin α/β
• Abb. 7: Das Ubiquitin/Proteasom-System
• Abb. 8: Das ERAD-System in Hefe
• Abb. 9: ERAD und UPR sind koordinierte Mechanismen
• Abb. 10: Modell zur genetischen Interaktion zwischen Rad23 und 19S in der NER.
• Abb. 11: Ein hochmolekulares Protein ist Bestandteil des affinitätsgereinigten Proteasoms
• Abb. 12: Der Genlokus von BLM3 umfasst die ORFs YFL007W und YFL006W
• Abb. 13: Proteinsequenz von Blm3
• Abb. 14: Deletion des ORFs YFL007W durch homologe Rekombination des HIS3-Gens in den ORF YFL007 W
• Abb. 15: blm3-Zellen zeigen weder Bleomycin- noch Zeocinsensitivität
• Abb. 16: Δblm3-Zellen sind leicht temperatursensitiv
• Abb. 17: ∆blm3-Zellen sind nicht Canavanin-sensitiv
• Abb. 18: ∆blm3-Zellen zeigen keine H₂O₂-Überempfindlichkeit
• Abb. 19: Die proteolytische in situ- Aktivität von ∆blm3-Zellen entspricht der von Wildtyp-Zellen
• Abb. 20: Blm3 inhibiert die in vitro-Aktivität des 20S-Proteasoms geringfügig
• Abb. 21: Der FBPase-Abbau in ∆blm3-Zellen ist gegenüber Wildtyp-Zellen leicht beschleunigt
• Abb. 22: CPY* und CTG* werden in ∆blm3- und Wildtyp-Zellen mit vergleichbarer Kinetik degradiert
• Abb. 23: ∆blm3- und ∆blm3∆ymr247c-Zellen zeigen Wildtyp-Verhalten bezüglich der Degradation von CPY* und CTG*
• Abb. 24: ∆blm3∆ire1-Zellen zeigen keine synthetische Letalität bei 37°C
• Abb. 25: Proteasomale Untereinheiten sind in ∆blm3-Zellen nukleär
• Abb. 26: Proteasomale Untereinheiten sind in ∆blm3-Zellen auch bei 37°C nukleär
• Abb. 27: Der Maturierungsfaktor Ump1 ist in ∆blm3-Zellen nukleär
• Abb. 28: Proteasomale Untereinheiten sind in ∆blm3∆ymr247c-Zellen nukleär
• Abb. 29: Glycerin-Dichtegradienten zeigen gleiches Laufverhalten von proteasomaler Aktivität und proteasomalen Untereinheiten aus ∆blm3- und Wildtyp- Lysaten
• Abb. 30: Proteasomen-Präparationen aus Wildtyp- und ∆blm3-Zellen zeigen ein vergleichbares Bandenmuster
• Abb. 31: Proteasomenpräparationen aus Wildtyp- und ∆blm3-Zellen zeigen keine Unterschiede im Proteinmuster
• Abb. 32: Skizze zur Herstellung des Stamms Blm3-GFP-HA
• Abb. 33: GFP-markiertes Blm3 ist im Zellkern lokalisiert
• Abb. 34: Blm3-GFP-HA ist nach biochemischer Fraktionierung im Zellkern nachweisbar
• Abb. 35: Blm3 läuft im Glycerin-Dichtegradienten mit Ump1-HA, nicht mit der proteasomalen Aktivität
• Abb. 36: Aktivitäts-Überschichtungstest der Lysate aus Wildtyp- und ∆blm3-Zellen in nicht-denaturierenden Gelen
• Abb. 37: Wildtyp-Zellen enthalten einen proteasomalen Komplex, der in ∆blm3-Zellen nicht vorhanden ist
• Abb. 38: Blm3 ist an einen proteasomalen Komplex assoziiert, der den Maturierungsfaktor Ump1 enthält
• Abb. 39: Blm3 ist Bestandteil Ump1-assoziierter proteasomaler Vorläuferkomplexe
• Abb. 40: Wildtyp-Zellen enthalten proteasomale Vorläuferkomplexe, die in ∆blm3-Zellen nicht vorhanden sind
• Abb. 41: Charakterisierung Ump1-assoziierter proteasomaler Vorläuferkomplexe
• Abb. 42: ∆blm3-Zellen enthalten weniger unprozessiertes Pre2/β5 als Wildtyp-Zellen
• Abb. 43: Die Kinetik der proteasomalen Maturierung ist ∆blm3-Zellen beschleunigt
• Abb. 44: GFP-markiertes Blm3 ist in ∆ump1-Zellen nukleär
• Abb. 45: ∆blm3∆ump1-Zellen sind wie Δump1-Zellen stark temperatursensitiv
• Abb. 46: Skizze zur Herstellung der Stämme BLM3-ProA und GAL1-BLM3-ProA
• Abb. 47: Die Überexpression von Blm3-ProA ist letal
• Abb. 48: Die Überexpression von Blm3 ist toxisch
• Abb. 49: Modell zur proteasomalen Maturierung