Fetter, Ingmar: Der Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf Wachstum und Differenzierung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen

Aus dem Institut für Anatomie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Der Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf Wachstum und Differenzierung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Herrn Ingmar Fetter,
geboren am 15.07.1973 in Neuruppin

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. med. M. Gratzl
PD Dr. med. M. Bergmann
PD Dr. med. G. Grosse

Datum der Promotion: 28. Juni 1999

Abstract:

Structure and dimension of the dendritic arbor are important determinants of information processing by the nerve cell, but mechanisms and molecules involved in dendritic growth are essentially unknown. I investigated early mechanisms of dendritic growth using mouse fetal hippocampal neurons in primary culture, which form processes during the first week in vitro. I detected a key component of regulated exocytosis, SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDa)., in axons and axonal terminals as well as in dendrites identified by the occurrence of the dendritic markers transferrin receptor and MAP2. Selective inactivation of SNAP-25 by botulinum neurotoxin A (BoNTA) resulted in inhibition of axonal growth and of vesicle recycling in axonal terminals. In addition, dendritic growth of hippocampal pyramidal and granule neurons was significantly inhibited by BoNTA. These observations indicate that SNAP-25, but not synaptobrevin, is involved in constitutive axonal growth and dendrite formation by hippocampal neurons.

Keywords:
Dendrite, SNAP-25, botulinum neurotoxin A, mouse hippocampal neurons

Zusammenfassung:

Obwohl die Struktur und das Ausmaß dendritischer Verzweigungen eine wichtige Rolle bei der Informationsübertragung neuronaler Zellen spielen, ist bislang wenig über die Bausteine und Molekularmechanismen des Dendritenwachstums bekannt. Unter der Verwendung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen embryonaler Mäuse untersuchte ich frühe Stadien des Zellfortsatzwachstums. Dabei konnte ich SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDA), ein Schlüsselprotein der regulierten Exozytose, nicht nur in Axonen und terminalen Axonendigungen, sondern auch anhand von Doppelimmunmarkierungen mit den dendritischen Markern Transferrin-Rezeptor und MAP-2 in Dendriten lokalisieren. Die spezifische Inaktivierung von SNAP-25 durch Botulinumneurotoxin A (BoNT/A) führte zur Hemmung des Axonwachstums und des Vesikelrecyclings in terminalen Axonendigungen. Darüberhinaus wurde auch das Wachstum dendritischer Fortsätze von Körner- und Pyramidenzellen durch BoNT/A signifikant gehemmt. Daraus läßt sich schließen, daß SNAP-25, im Gegensatz zu Synaptobrevin, an konstitutiven Prozessen in den Axonen und Dendriten hippocampaler Neurone beteiligt ist.

Schlagwörter:
Dendrit, SNAP-25, Botulinumneurotoxin A, hippocampale Zellkulturen


Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDer Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf Wachstum und Differenzierung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen
Danksagung
1 Einleitung
1.1Die Synaptische Transmission
1.2Der Zyklus synaptischer Vesikel
1.3Präsynaptische Proteine und die SNARE-Hypothese
1.4Das synaptische Vesikelprotein SNAP-25
1.5Botulinumneurotoxine
1.6Die Entwicklungsstadien der hippocampalen Zellkultur
2 Ziele der Arbeit
3 Material und Methoden
3.1Geräte
3.2Chemikalien
3.3Gebrauchslösungen
3.4Versuchstiere
3.5Die primär dissoziierte hippocampale Zellkultur
3.6Proteinnachweis mittels Westernblotverfahren
3.7Nachweis von Proteinen auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene
3.7.1Die Avidin/Biotin-Methode
3.7.2Der Fluoreszenznachweis von Proteinen in der Zellkultur
3.7.3Die Pre-embedding-Methode für die elektronenmikroskopische Aufarbeitung
3.8Photographische Dokumentation
3.9Morphometrische Messungen
4 Ergebnisse
4.1Die neuronale Entwicklung in der primär dissoziierten hippocampalenZellkultur
4.2Zelluläre Verteilung von SNAP-25 im lichtmikroskopischen Bild
4.3Ultrastrukturelle Verteilung von SNAP-25
4.4Der Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf neuronale Zellkulturen
4.4.1Nachweis von SNAP-25 in BoNT/A-behandelten neuronalen Zellkulturen
4.4.2Qualitative Unterschiede zwischen BoNT/A-behandelten und Kontrollzellkulturen
4.4.3Quantitative Unterschiede zwischen BoNT/A-behandelten und Kontrollkulturen
4.4.4Der Einfluß von BoNT/A auf die regulierte Exozytose
4.4.5Die Zelldichte unter BoNT/A-Einfluß
4.5Die Wirkung von Botulinumneurotoxin C auf neuronale Zellkulturen
5 Diskussion
5.1Die neuronale Entwicklung in der primär dissoziierten hippocampalenZellkultur der embryonalen Maus
5.2Die entwicklungsabhängige Proteinsynthese und Lokalisation von SNAP-25 in der primär dissoziierten hippocampalen Zellkultur
5.3Der Einfluß von BoNT/A auf das Fortsatzwachstum kultivierter hippocampaler Neurone
6 Zusammenfassung
7 Schlußfolgerungen
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Bibliographie Literaturverzeichnis
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Arbeitskonzentrationen der Primärantikörper beim Westernblotverfahren
Tabelle 2: Konzentrationen der zytochemisch verwandten Primärantikörper
Tabelle 3: Konzentrationen der verwandten Sekundärantikörper
Tabelle 4: Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf das Wachstum von Axonen und Dendriten
Tabelle 5: Blockierung der Transmitterexozytose durch Botulinumneurotoxin A
Tabelle 6: Botulinumneurotoxin A beeinflußt die Zelldichte in hippocampalen Zellkulturen

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Die minimalen Bindungsregionen der SNARE-Proteine
(nach Fasshauer1998 )
Abbildung 2: Der synaptische Fusionskomplex
(nach Sutton1998 )
Abbildung 3: Pyramidenzelle nach 1 DIV
Abbildung 4: Körnerzelle nach 2 DIV
Abbildung 5: Die hippocampale
Zellkultur nach 3 DIV
Abbildung 6: Sechs Tage altes Pyramidenneuron
Abbildung 7: Ultrastruktur der neuronalen Somata nach 6 DIV
Abbildung 8: Ultrastruktur eines Neurons nach 6 DIV
Abbildung 9: Ultrastruktur eines Neurons nach 6 DIV
Abbildung 10: Ultrastruktur von Axonen nach 6 DIV
Abbildung 11: Ultrastruktur des Axons einer Körnerzelle nach 6 DIV
Abbildung 12: Hippocampusneurone nach 11 Tagen Kultivierung
Abbildung 13: Ultrastruktur einer Synapse nach 11 DIV
Abbildung 14: 20 Tage alte Körnerzelle
Abbildung 15: Hippocampale Moosfaserboutons nach 32 DIV
Abbildung 16: Myelinscheide nach 32 DIV
Abbildung 17: Vorkommen von SNAP-25 nach 23 DIV
Abbildung 18: Verteilung von SNAP-25 nach 6 DIV
Abbildung 19: SNAP-25 nach 6 DIV
Abbildung 20:Transferrinrezeptor nach 6 DIV
Abbildung 21: SNAP-25 nach 11 DIV
Abbildung 22: Synaptophysin nach 11 DIV
Abbildung 23: Kolokalisation von SNAP-25 und Synaptophysin nach 12 DIV
Abbildung 24: SNAP-25 nach 23 DIV
Abbildung 25: Synaptophysin nach 23 DIV
Abbildung 26: Ultrastruktur eines axo-
dendritischen Kontaktes nach 13 DIV
Abbildung 27: Photomontage eines Axons
Abbildung 28: Ultrastruktur eines Perikaryonausschnittes
Abbildung 29: Ultrastruktur eines
axo-dendritischen Kontaktes
Abbildung 30: Ultrastruktur eines Dendriten
Abbildung 31: Der Einfluß von Bo/NT A auf sein Substrat SNAP-25
Abbildung 32: BoNT/A-vergiftetes Neuron
nach 2 DIV
Abbildung 33: Unbehandeltes Neuron
nach 2 DIV
Abbildung 34
Abbildung 35
Abbildung 36: SNAP-25 in der BoNT/A-
vergifteten Zellkultur
Abbildung 37: Synaptophysin in der BoNT/A-
vergifteten Zellkultur
Abbildung 38: BoNT/A hemmt die synaptische Exozytose
Abbildung 39: BoNT/C spaltet Syntaxin und SNAP-25

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Mon Mar 17 17:30:37 2003