1 Einleitung

1.1  Ionenkanäle

↓1

Kontrolle der Ionenverteilung zwischen dem Zellinneren und der Umgebung ist eine Grundvoraussetzung für reguläre Zellfunktion. In jedem komplexen Organismus werden daher Transportmechanismen für Ionen benötigt. Diese Aufgabe wird u.a. von Ionenkanälen übernommen, die mit hoher Effizienz Kationenflux und Anionenflux entlang von Konzentrations- oder Elektrogradienten durch die Zellmembran vermitteln. Elektrische Phänomene, die durch die Aktivität von Ionenkanälen generiert werden, sind z.B. an der Erhaltung des Ruhemembranpotentials, der Nervensignalfortleitung und auch an Kontraktionsprozessen beteiligt (Ackerman & Clapham, 1997; Hamill, et al., 1981). Dadurch werden erst komplexe Funktionen wie Herzschlag, Fortbewegung oder Gedanken möglich.

Die Relevanz von Ionenkanälen wird noch deutlicher durch ihre pathophysiologische Bedeutung. Ausbleibende Expression oder fehlerhafte Funktion führen zur Manifestation einer Vielfalt von hereditären Erkrankungen. Durch Mutationen in Genen, die für Ionenkanalproteine kodieren oder in Sequenzen, die deren Expression steuern, kommt es zur fehlenden oder fehlerhaften Funktion der Kanäle. Die Konsequenzen sind vom betroffenen Kanaltyp abhängig und werden unter anderem als zystische Fibrose (Davis et al., 1996), Long-QT-Syndrom (Keating, 1996), hereditärer Bluthochdruck (Shimkets et al., 1994) oder verschiedene Typen von Myotonien (Hudson et al., 1995) manifest.

Nicht nur in angeborenen, sondern auch in erworbenen Krankheiten spielen Ionenkanäle mitunter eine entscheidende Rolle. Das Spektrum solcher Krankheiten reicht von gastroenterologischen Leiden wie dem peptischen Ulkus oder infektiösen Diarrhöen bis zu neurologischen Funktionsstörungen (Bernard et al., 2004; Flach et al., 2004; Laohachai et al., 2003; Peskar et al., 2002). Sogar bei Asthma und bei allergischen Reaktionen konnte die Beteiligung von Ionenkanälen gezeigt werden (Bradding & Conley, 2002). Als Angriffsziel von Medikamenten haben sich Ionenkanäle in der Therapie vieler Erkrankungen bewährt. Die prominentesten Beispiele sind chronische Herzinsuffizienz, Bluthochdruck sowie Diabetes mellitus, bei denen die Hemmung von Calcium- beziehungsweise Kaliumkanälen einen wesentlichen Teil des therapeutischen Managements darstellt (Elkayam, 1998; Mannhold, 2004; Romero et al., 2003).

1.1.1  Historische Grundlagen

↓2

Erstes Interesse für die Elektrizität lebender Organismen ist ins achtzehnte Jahrhundert mit Galvani´s Theorie von „Bioelektrizität“ zu datieren (Abbildung 1.1). Luigi Galvani, seiner Nachwelt besser als Erfinder der Batterie bekannt, stellte die Hypothese auf, dass Elektrizität an elementaren physiologischen Funktionen wie Muskelkontraktion oder Signalfortleitung in Nerven beteiligt ist. Seine Erkenntnisse läuteten das Ende der mittelalterlichen Auffassung von „animalischen Geisten“ und „mysteriösen Fluiden“ als auslösende Medien für Muskelbewegung ein (Piccolino, 1998).

Das 19. Jahrhundert brachte weitere Fortschritte im Verständnis elektrophysiologischer Phänomene. Aus dieser Zeit stammt die erste Erwähnung der Porentheorie als mögliche Erklärung für Osmoseprozesse. Die führende wissenschaftliche Gruppe auf dem Gebiet der Elektrophysiologie war als die Berlin-Gruppe bekannt und bestand aus Wissenschaftlern und Schülern um Johannes Müller (Hille, 1992; Lohff, 2001). Der Gruppe gelang es, zum ersten Mal die Geschwindigkeit der Nervensignalfortleitung zu messen sowie ein Phänomen zu beobachten, das sie „negative Fluktuation“ nannten und das später als Aktionspotential bekannt wurde (Goldensohn, 1998).Wenige Jahrzehnte später führte Bernstein die gleichen Experimente mit genaueren Messmethoden durch. Seine Resultate und Overton´s Permeabilitätsexperimente an Muskelzellen führten zur gemeinsamen Hypothese, dass Ionen durch Diffusionsprozesse an Signalfortleitung und Kontraktion beteiligt sein müssen (Bernstein, 1912; Nilius, 2003).

Abbildung 1.1 Ein Experiment von Galvani, das zu seiner Zeit großes Aufsehen erregte, war das „Froschschenkelexperiment“. Galvani verband einen offenpräparierten Oberschenkelmuskel mit einem Metalldraht, dessen andere Ende auf dem Dach befestigt war. Während eines Gewitters konnte Galvani Muskelzuckungen beobachten, die laut seinem Bericht im Augenblick des Blitzes auftraten, lange Zeit bevor der Donner gehört werden konnte. Die gezeigte Grafik stammt aus Galvanis Publikation „De Viribus Electricitatis in Motu Musculari Commentarius“ (aus Piccolino, 1998).1 Ein Experiment von Galvani, das zu seiner Zeit großes Aufsehen erregte, war das „Froschschenkelexperiment“. Galvani verband einen offenpräparierten Oberschenkelmuskel mit einem Metalldraht, dessen andere Ende auf dem Dach befestigt war. Während eines Gewitters konnte Galvani Muskelzuckungen beobachten, die laut seinem Bericht im Augenblick des Blitzes auftraten, lange Zeit bevor der Donner gehört werden konnte. Die gezeigte Grafik stammt aus Galvanis Publikation „De Viribus Electricitatis in Motu Musculari Commentarius“ (aus Piccolino, 1998).

↓3


Um 1930 begann mit Hodgkin und Mitarbeitern eine neue Ära für die Elektrophysiologie. Die Anwendung der Voltage-Clamp-Technik am Riesenaxon des Tintenfisches gipfelte in der ersten wissenschaftlichen Erklärung des Aktionspotentials (Hodgkin & Huxley, 1952). Diese Erklärung ging davon aus, dass das Aktionspotential durch spannungsabhängige Veränderung der Membranleitfähigkeiten für Kalium- und Natriumionen entstand (Hodkgin & Keynes, 1955). Spätere Experimente mit blockierenden Substanzen wie z.B. Tetrodotoxin (TTX) oder Tetraethylammonium (TEA) unterstützten diese Theorie (Narahashi et al., 1964; Tasaki & Hagiwara, 1957).

Der erste umfassende und detaillierte Nachweis von Ionenkanälen wurde schließlich im Jahr 1976 von Neher und Sakmann mit der Entwicklung und Anwendung der Patch-Clamp-Technik geliefert. Den beiden Wissenschaftlern gelang es, Einzelkanalmessungen von Acetylcholinrezeptoren an Froschmuskelzellen durchzuführen und somit eine Antwort darauf zu geben, dass Ionenkanäle verantwortlich für die beobachteten Ströme waren (Hille, 1992; Neher & Sakmann, 1976). Die Patch-Clamp-Technik und ihre Optimierung durch Entwicklung des „Gigaohm-Seal“ (GΩ-Seal) im Jahr 1981 (Hamill et al., 1981) war der Wegbereiter für die Verknüpfung von elektrischen Ereignissen mit Ionenkanalproteinen. Für ihre Leistungen wurden Neher und Sakmann 1991 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet.

Die letzten zwanzig Jahre brachten neue Methoden und Weiterentwicklungen. Das Klonen von Kanalgenen oder die Isolation von Kanalproteinen aus Membranextrakten wurden zu Standardwerkzeugen ihrer Erforschung (Hartshorne et al., 1986; Noda et al., 1983). Rekombinante DNS-Technologie und sogenannte „site-directed mutagenesis“ brachten neues Wissen über Struktur-Funktionsbeziehungen (Russo, 2003). In den letzten Jahren standen EDV-unterstützte Simulationen sowie röntgenkristallographische Methoden im Mittelpunkt der Forschung. Kaliumkanäle gehören heute zu den bestuntersuchten Strukturen, das fehlende Wissen wird aber auch bei anderen Kanälen nachgeholt (Doyle et al., 1998; Jiang et al., 2003; Kuo et al., 2003; Wendt et al., 2003).

↓4

1.1.2 Aktueller Wissensstand über Ionenkanäle

In der heutigen wissenschaftlichen Auffassung sind Ionenkanäle transmembranäre Glykoproteine, welche ionendurchlässige Poren bilden. Wie solche Poren entstehen, soll am Beispiel eines spannungsabhaängigen Kaliumkanals verdeutlicht werden (Abbildung 1.2): vier Untereinheiten, auch α-Untereinheiten genannt, bilden in der Membran eine Pore. Jede der α-Untereinheiten besteht aus 6 transmembranären Domänen (S1-S6) sowie aus den jeweiligen Verbindungssegmenten (loops) zwischen den Domänen, die extrazellulär oder intrazellulär verlaufen. Eine besondere Funktion wird von dem Segment zwischen den Domänen S5 und S6 übernommen, welches die Pore bildet. Die Domäne S4 übernimmt die Aufgabe eines Spannungssensors, der bei Änderungen des Membranpotentials eine Konformationsänderung bewirkt.


Abbildung 1.2 Schematischer Aufbau eines spannungsabhängigen Kaliumkanals. (A) gibt die Anordnung der α-Untereinheit mit 6 transmembranären Domänen in der Zellmembran wieder. In (B) richten sich vier α-Untereinheiten zu einer Pore aus wobei das Erbindungsstück zwischen S5 und S6 dem Poreninneren zugewandt ist. Zusätzlich können auf der intrazellulären Seite vier β-Untereinheiten an den Kanal gebunden sein (aus Schmidt, 1998)2 Schematischer Aufbau eines spannungsabhängigen Kaliumkanals. (A) gibt die Anordnung der α-Untereinheit mit 6 transmembranären Domänen in der Zellmembran wieder. In (B) richten sich vier α-Untereinheiten zu einer Pore aus wobei das Erbindungsstück zwischen S5 und S6 dem Poreninneren zugewandt ist. Zusätzlich können auf der intrazellulären Seite vier β-Untereinheiten an den Kanal gebunden sein (aus Schmidt, 1998).

↓5



Ionenkanäle werden nach ihrem Selektivitätsverhalten oder nach ihrer Aktivierbarkeit unterschieden. Selektive Kanäle haben eine selektive Permeabilität für ein bestimmtes Ion, z.B. für Kalium, die ca. vier Zehnerpotenzen höher ist als für anderen Ionen. Kaliumselektive Kanäle spielen eine wichtige Rolle für die Regulation des Ruhemembranpotentials (Hille, 1992); in glatten Muskelzellen nehmen sie dadurch Einfluss auf die Kontraktilität (Nelson & Quayle, 1995). Natrium- und Chloridkanäle sind essentiell für Signaltransfer in Neuronen, schließlich sind Calciumkanäle bei Kontraktionsvorgängen maßgeblich beteiligt (Hille, 1992). Der Vollständigkeit halber sollten an dieser Stelle Aquaporine erwähnt werden, dessen Funktion als selektive Kanäle für Wassermoleküle in der voletzten Dekade eingehend untersucht wurde (Heymann et al., 1998). Nicht selektive Kanäle sind meist für mehrere Ionen eines Typs durchlässig, z.B. für Kationen. Die Permeabilitäten für einzelne Ionen unterscheiden sich hier nur geringfügig. Als Beispiele kann man hier den Acetylcholinrezeptor oder TRP-Kanäle anführen (Barrantes, 1997; Beech et al., 2004).

Die Aktivierbarkeit, besser bekannt als „gating“, beschreibt die Eigenschaft der Kanäle, sich in einem stochastischen Prozess zu öffnen und wieder zu schließen. Die Offenwahrscheinlichkeit und die mittlere Offenzeit des Kanals sind entscheidend für den Gesamtstrom, der durch die Membran fließt. Aktivierungsmechanismen steigern sowohl die Offenwahrscheinlichkeit als auch die mittlere Offenzeit des Kanals und bewirken einen Stromanstieg. Es gibt spannungsabhängige Kanäle, z.B. Natriumkanäle in Neuronen (Arhem, 2004), deren Offenwahrscheinlichkeit in einem bestimmten Spannungsbereich höher als bei anderen Potentialen ist. Ligandenabhängige Kanäle benötigen zur Aktivierung eine bestimmte Substanz, z.B. Acetylcholin oder Glycin (Reeves & Lummis, 2002), die an den Kanal bindet und ihn somit aktiviert. Schließlich gibt es noch mechanosensitive Kanäle, die mit dem Zytoskelett verbunden sind und auf mechanische Reize reagieren (Sukharev & Anishkin, 2004). Die genannten Aktivierungsmechanismen können auch parallel zueinander wirken, was beim Maxi-K-Kanal zu sehen ist. Dieser wird über das Membranpotential und intrazelluläre Ca2+-Konzentration reguliert, was bei glatten Muskelzellen einen wichtigen Rückkopplungsmechanismus für die Kontraktilität darstellt (Rothberg, 2004).

Wie funktioniert Ionentransfer durch einen Kanal auf molekularer Ebene? In wässriger Lösung sind Ionen von einer Hydrathülle umgeben, wodurch ein optimaler, energiearmer Zustand entsteht. Die Wassermoleküle richten sich als Dipole so aus, dass einem Ion immer entgegengesetzte Ladungen gegenüberstehen. Beim Eintritt in einen Ionenkanal verlieren die Ionen diese Hydrathülle. Damit ein effizienter Transportvorgang annähernd der Diffusion mit Transportraten von 104 bis 108 Ionen pro Sekunde möglich ist, muss das Ion beim Kanaldurchtritt mit seiner Umgebung einen optimalen Energiezustand eingehen, indem der Kanal die Hydrathülle imitiert. Je nach Selektivität des Kanals sind dem Kanalinneren entweder positiv oder negativ geladene Aminosäurenreste zugewandt. Im Fall eines Kaliumkanals sind es z.B. Sauerstoffatome der Carboxylgruppen, die negativ geladen sind und somit bei Interaktion mit einem Kation einen energiearmen Zustand ermöglichen (Kuo et al., 2003).

↓6

Die entgegengesetzte Ladung von Ion und innerer Oberfläche des Durchtrittskanals ist jedoch nicht hauptsächlich entscheidend für Kanalselektivität. Viel wichtiger sind die Übergänge zwischen Hydrathülle und Kanal. Hier spielen die Durchmesser der Poren und der Ionen eine wichtige Rolle. So sind z.B. im Kaliumkanal Tryptophanreste so angeordnet, dass sie den Durchmesser des Durchtrittskanals fixieren, indem sie mit angrenzenden Fettsäuren eine lipophile Interaktion eingehen (Doyle et al., 1998). Die Fixierung führt dazu, dass Kaliumionen mit einem Durchmesser von 133 pm den Energieverlust durch Dehydratation besser kompensieren können als Natriumionen mit 95 pm. Durch diese günstigen Distanzverhältnisse zwischen Kaliumion und den Aminosäuren im Durchtrittskanal des Kaliumkanals wird seine Selektivität erklärt (Hille, 1992).

1.2 Gramicidin A

Die Natur hat mehr als einen Weg entwickelt, um Ionen durch Lipidmembranen zu schleusen. Zum Schutzrepertoire einiger Bakterienstämme gehört die Ausschüttung von kanalaktiven Peptiden. Solche Kanäle bauen sich aus dem extrazellulären Raum heraus in fremde Membranen ein, stören den Elektrolythaushalt und führen schließlich zum Zelltod. Viele dieser Substanzen waren als Antibiotika bekannt, bevor ihr Wirkmechanismus der Porenbildung entdeckt wurde. Dazu gehören unter anderem Amphotericin B, Nystatin, das Peptaibol Alamethicin und Gramicidin A (Urry et al., 1971).

Aufgrund ihrer vergleichsweise einfachen Struktur eignen sich diese Substanzen als Modelle, um die physiko-chemischen Interaktionen zu studieren, die für die Passage von Ionen durch Ionenkanäle wirksam sind. Gramicidin A ist eine der am besten untersuchten Verbindungen. Die geringe Größe des Moleküls, die rasche und stabile Formation von Kanälen in Membranen und die Möglichkeit röntgenkristallographischer Charakterisierung ermöglichen die Untersuchung prinzipieller Eigenschaften von Ionenkanälen an einem reduzierten und leicht zugänglichen Modell (Wallace, 1998; Wallace, 2000). Interessanterweise war Gramicidin A die erste Substanz, mit deren Hilfe Einzelkanalereignisse in Bilayer-Membranen gemessen wurden, und dies bereits einige Jahre bevor diese Leistung an nativen Kanälen in Zellen erbracht wurde (Bean et al., 1969; Hladky & Haydon, 1970).

↓7

Seinen Namen verdankt Gramicidin der Fähigkeit zur Tötung grampositiver Bakterien.Rene Dubos war der erste Wissenschaftler, der die Substanz 1939 aus dem Bakterium Bacillus brevis extrahierte und als hochwirksames Antibiotikum einzusetzen hoffte (Hotchkiss & Dubos, 1940). Die Idee der klinischen Anwendung wurde jedoch rasch wegen seiner humantoxischen Wirkung verworfen.

Gramicidin A ist ein Polypeptid aus 15 Aminosäuren mit alternierender Sequenz von linksdrehenden (L-) und rechtsdrehenden (D-) Aminosäuren (Abbildung 1.3). Bedingt durch die alternierende Sequenz bilden β-Helices die Sekundärstruktur, als Tertiärstruktur sind zwei Formen möglich, die Doppelhelix- und die Helixdimerform. Im ersten Fall sind ähnlich der DNS zwei β-Helices umeinander geschlungen. Bei der zweiten Form stehen sich zwei β-Helices mit den N-Termini gegenüber (Abbildung 1.4). Die Helixdimerform ist die aktive Form für Ionentransport. Nur bei dieser Konformation ist der innere Radius groß genug, um Ionenpassage zu ermöglichen. Die strukturelle Basis der Pore unterscheidet sich deutlich von nativen Kanälen, der Durchtrittkanal führt direkt durch das Innere der Helix. Durch Assoziation und Dissoziation der Monomere entsteht ein Wechsel zwischen offenem und geschlossenem Zustand. Die Ausbildung der kanalaktiven Konformation ist der angelegten Spannung proportional abhängig; diese Abhängigkeit ist durch weitere Faktoren wie ionale Zusammensetzung der Lösungen oder verwendete Membranart beeinflussbar (Sandblom et al, 2001). Die Länge des Moleküls fällt mit 260 pm in die Dimension von Phospholipiddoppelmembranen, so dass der Membraneinbau problemlos erfolgen kann (Wallace, 1998; Wallace, 2000).


Abbildung 1.3 Aufbau von Gramicidin A (Legende siehe Abkürzungsliste). In der Natur vorkommendes Gramicidin (=Gramicidin D) ist eine Vermischung aus drei Isoformen (Panchal et al., 2002): 80% Gramicidin A, 5% Gramicidin B, das an der Position 11 (fett markiert) Phenylalanin anstelle von Tryptophan trägt, sowie 15% Gramicidin C, dessen Position 11 mit Tyrosin besetzt ist.3 Aufbau von Gramicidin A (Legende siehe Abkürzungsliste). In der Natur vorkommendes Gramicidin (=Gramicidin D) ist eine Vermischung aus drei Isoformen (Panchal et al., 2002): 80% Gramicidin A, 5% Gramicidin B, das an der Position 11 (fett markiert) Phenylalanin anstelle von Tryptophan trägt, sowie 15% Gramicidin C, dessen Position 11 mit Tyrosin besetzt ist.

↓8


Die Tertiärstruktur sowie die Funktion von Gramicidin sind direkt auf beteiligte Aminosäuren zurückzuführen. Für die Stabilisierung des Moleküls in der Membran sind die Seitenketten der N-ständigen Tryptophane verantwortlich, die mit anliegenden Fettsäuren interagieren. Hingegen vermutet man in der Valin-reichen Region am C-Ende entsprechend den Aminosäuren 1-8 (gezählt vom C-Ende) einen Selektivitätsfilter für Kationen, da hier negativ geladene Carboxylreste dem Poreninneren zugewandt sind.Das Selektivitätsverhalten von Gramicidin A entspricht der Eisenman-Reihe I für monovalente Kationen mit Rb+>Cs+>K+>Na+ bei einem Verhältnis der Leitfähigkeiten von ca. 3:1 (Chadwick & Cardew, 1999). Nach heutigem Wissensstand erfolgt der Ionentransfer bei Gramicidin A ebenfalls durch Abstreifen der Hydrathülle und Eintreten des Kations in den Durchgangstunnel, in dem negativ geladene Gruppen als Leitschiene dienen. Die Reihenfolge der Leitfähigkeiten erklärt sich aus dem Durchmesserverhältnis der Pore und der jeweiligen Ionen zueinander.



Abbildung 1.4: Mögliche Konformationen von Gramicidin. Die Doppelhelix (DH)-Konformation (links) ist für Ionentransfer ungünstiger als die Helixdimer (HD)-Konformation (rechts) (aus Wallace, 1998).4: Mögliche Konformationen von Gramicidin. Die Doppelhelix (DH)-Konformation (links) ist für Ionentransfer ungünstiger als die Helixdimer (HD)-Konformation (rechts) (aus Wallace, 1998).


Neben der Erforschung des nativen Gramicidin A haben sich einige Arbeitsgruppen mit Modifikationen des Moleküls beschäftigt. So entstanden unter anderem kovalent gebundenes „Doppelgramicidin“, das nicht dissoziiert, sowie lichtempfindliches Gramicidin, das nur nach Lichteinfall bestimmter Wellenlänge aktiv wird (Armstrong et al., 2001; Borisenko et al., 2000; Kumita et al., 2000; Stankovic et al., 1989). Derartige Modifikationen ebneten den Weg für artifizielle Ionenkanäle, da offensichtlich wurde, dass strukturelle Veränderungen die Funktion als Ionenkanal erhalten und zum Teil sogar verstärken konnten.

1.3 Synthetische Ionenkanäle

↓9

Synthetische Ionenkanäle sind für die Forschung aus zwei Gründen interessant. Einerseits tragen Untersuchungen von Kanalmodellen zum besseren Verständnis natürlicher Kanäle bei, wie es bei Gramicidin A der Fall ist. Anhand solcher Modelle können die Beziehungen von Struktur und Funktion besonders gut studiert werden. Andererseits ist die Nachahmung physiologischer Kanalfunktion ein möglicher Ansatz zur Therapie von Channelopathien (Kanalerkrankungen). Eines der wichtigsten Langzeitziele ist es, Aktivierbarkeit und Selektivitätsverhalten derart zu beeinflussen, dass fehlerhafte oder fehlende Kanalfunktion ersetzt werden kann. Dieser Ansatz macht die pathophysiologische Relevanz synthetischer Ionenkanäle deutlich.

Die ersten artifiziellen Ionenkanäle wurden 1982 synthetisiert. Allerdings konnten diese Strukturen nur divalente Kobaltionen transportieren (Tabushi et al., 1982). In den darauffolgenden 20 Jahren entstanden etliche Modelle zur Imitation natürlicher Kanalfunktion, die physiologisch bedeutsame Ionen wie Natrium oder Kalium transportieren konnten. Dabei wurden sowohl Ansätze zur Kanalsynthese auf der Basis von Peptiden als auch unter Verwendung komplexer organischer Verbindungen, z.B. hydraphiler Moleküle, verfolgt (Ghadiri et al., 1994; Gokel & Mukhopadhyay, 2001; Gokel et al., 2001; Schrey et al., 2000).

1.3.1  THF-Gramicidin-Hybride und „kovalentes“ Gramicidin

In der Arbeitsgruppe um Koert werden Tetrahydrofurane (THF) als Ionenkanalbausteine untersucht. Tetrahydrofurane sind Ringmoleküle, die mit Kationen Komplexe eingehen, daher sind sie für die Aufgabe des Ionentransportes gut geeignet. Um sie in Peptidstrukturen einbinden zu können, mussten sie jedoch modifiziert werden. Entsprechend der nativ vorkommenden Aminosäuren wurde dem THF-Molekül ein N-Terminus (NH2) sowie ein C-Terminus (COOH) angehängt (Abbildung 1.5), so dass eine neue, synthetische Verbindung entstand, die THF-Aminosäure (Schrey et al., 1999; Stankovic & Schreiber, 1991). Nun war eine Leitstruktur notwendig, um die THF-Bausteine in eine funktionelle Position zu bringen. Dafür wurde ein Molekül ausgewählt, dessen Struktur und Funktion weitgehend bekannt ist und das sich als Ionenkanal bereits bewährt hatte: Gramicidin A.

↓10

Die Aminosäuren 1-8 von Gramicidin A, welche potentiell als Leitstruktur für den Ionendurchtritt dienen (Kapitel 1.2), wurden durch vier THF-Bausteine ersetzt (Abbildung 1.5). Gramicidin A ist nur als Dimer aktiv. Aus diesem Grund wurde der N-Terminus dieser neuen Verbindung mit dem N-Terminus eines weiteren Gramicidinmoleküls kovalent verbunden, um die Porenbildung zu erleichtern. Als Verbindungsstück (Linker) wurde dabei ein Tartratmolekül verwendet, das in früheren Studien bereits als Linker zwischen zwei Gramicidinmolekülen untersucht worden war (Armstrong et al., 2001; Stankovic et al., 1989). So entstand THF-Gramicidin (THF-gram). Eine weitere Verbindung entstand durch Modifikation der Endgruppen von THF-gram. Die Änderung bestand darin, die freien Ethanolaminenden mit zusätzlichen chemischen Bausteinen zu verknüpfen. Diese Bausteine dienen als Schutzgruppen vor Abbau durch Proteasen und Peptidasen und bestehen aus t-Butyldiphenylsilyl (TBDPS), einer komplexen chemischen Verbindung. Diese zweite Verbindung wurde THF-gram-TBDPS genannt (Schrey et al., 2000). Schließlich wurde eine dritte Verbindung synthetisiert, das linked-gram-TBDPS. Hier wurden die N-Termini von zwei Gramicidinmolekülen mit einem Linkermolekül aus Bernsteinsäure (Succinyl) kovalent verbunden, ohne Änderungen der Gramicidinsequenz vorzunehmen. Succinyl wurde ausgewählt, weil es am wenigsten die Ionenkanalfunktion beeinträchtigen würde, da in kernspinspektroskopischen Untersuchungen das succinylverbundene Gramicidin im Vergleich mit anderen Linkern am ehesten der Helixdimerkonformationähnelte. Auch bei der letzten Verbindung wurden am C-Terminus TBDPS-Schutzgruppen eingefügt (Arndt et al., 2001).

Abbildung 1.5 Aufbau der THF-Aminosäure, der THF-Gramicidin-Hybride sowie des Linked-gram-TBDPS (mit freundlicher Genehmigung von Prof. Koert, Universität Marburg).5 Aufbau der THF-Aminosäure, der THF-Gramicidin-Hybride sowie des Linked-gram-TBDPS (mit freundlicher Genehmigung von Prof. Koert, Universität Marburg).


Alle Verbindungen wurden säulenchromatographisch gereinigt. Methanol und DMSO dienten als Mediatorsubstanzen, um die Substanzen in wässrige Lösung zu bringen. Zunächst wurde die Leitfähigkeit anhand von Einzelkanalaufnahmen in Bilayermembranen bestimmt.

↓11

Bilayermembranen sind ein etabliertes Modell, das unter anderem zur Untersuchung von Ionenkanälen verwendet wird: zwei Doppelkammern werden von einer Platte getrennt, die eine 150 μm breite Öffnung enthält. Diese Öffnung wird mit einem Gemisch von Sojabohnenlecithin und n-Dekan beschichtet, das sich rasch zu einer Phospholipiddoppelmembran umorganisiert (Schrey et al., 2000). Anschließend werden in eine der Kammern die Substanzen appliziert. Die darauffolgende Messung von Ionenströmen zwischen beiden Kammern dient der quantitativen und qualitativen Bestimmung von Ionenkanaleigenschaften der getesteten Substanzen (Gokel & Mukhopadhyay, 2001).

In derartigem Versuchsaufbau wurde THF-gram auf seine Fähigkeit zum Ionentransport getestet. Hier zeigte sich THF-gram tatsächlich aktiv als Ionenkanal mit dafür typischen, stochastisch auftretenden Einzelkanalereignissen. Es wurden mehrere Einzelkanalleitfähigkeitsstufen beobachtet, was durch mehrere kanalaktive Konformationen zu erklären wäre (Abbildung 1.6). Das Selektivitätsverhalten war dem der Mutterverbindung Gramicidin A ähnlich und zeigte folgende Ionenpräferenz: NH4 + > Cs+ > K+ > Na+, wobei zwischen Ammonium- und Natriumionen ein Verhältnis von 2.6 : 1 für die Leitfähigkeit sowie 10 : 1 für die Permeabilität kalkuliert wurde.

Ein ähnliches Verhalten zeigte die zweite synthetische Verbindung, THF-gram-TBDPS. Auch in diesem Fall war typische Kanalaktivität mit Öffnungen und Schließungen zu beobachten, allerdings fiel diese schwächer aus, die Einzelkanalleitfähigkeit war ca. 10-40% geringer als bei THF-gram. Veränderung der aktiven Membrankonformation durch TBDPS-Schutzgruppen liefert die wahrscheinlichste Erklärung für die beeinträchtigte Leitfähigkeit, da diese Schutzgruppen große Moleküle sind und dementsprechend eine räumliche Störung darstellen. Die errechnete Ionenselektivität von THF-gram-TBDPS war vergleichbar mit THF-gram bei einem Verhältnis von 3.7 : 1 für die Leitfähigkeit sowie 10 : 1 für die Permeabilität.

↓12

Die Untersuchung von linked-gram-TBDPS ergab ein ungewöhnliches Aktivitätsmuster. Dieses Muster entsprach nicht den typischen Einzelkanalereignissen mit Öffnungen und Schließungen (Abbildung 1.7). Bereits bei einer Konzentration von 10-14 mol/l wurde erste Kanalaktivität beobachtet. Es kam kontinuierlich zu neuen Kanalöffnungen, die sich summierten, so dass auch die Gesamtleitfähigkeit anstieg. Kanalschließungen waren bis auf einzelne Ausnahmen nicht zu beobachten, die Moleküle behielten ihre aktive Konfiguration länger als 30 min. Die Einzelkanalleitfähigkeit dieser Verbindung war allerdings schwächer als beim nativen Gramicidin, was sich am wahrscheinlichsten durch die TBDPS-Schutzgruppe einerseits und das hydrophobe Verhalten des Linkermoleküls andererseits erklären liesse.

Abbildung 1.6 Einzelkanalaktivität von THF-gram und THF-gram-TBDPS (jeweils 106 Einzelkanalaktivität von THF-gram und THF-gram-TBDPS (jeweils 10-8 M) durch Bilayermembranen in 1 molarer KCl-Lösung nach Anlegen einer Spannung von 100 mV (mit freundlicher Genehmigung von Prof. Koert, Universität Marburg).

Abbildung 1.7 Einzelkanalaktivität von Gramicidin A (107 Einzelkanalaktivität von Gramicidin A (10-12 M) und linked-gram-TBDPS (10-14 M) in Bilayermembranen in 1 molarer KCl-Lösung nach Anlegen einer Spannung von 100 mV (mit freundlicher Genehmigung von Prof. Koert, Universität Marburg).

1.4 Glaukom

↓13

Auch unter der Bezeichnung „grüner Star“ bekannt, ist das Glaukom ein ophthalmologisches Krankheitsbild, das durch progressive Degeneration retinaler Ganglienzellen und ihrer Axone gekennzeichnet ist. Die Konsequenz der Degeneration ist ein langsam fortschreitender Gesichtsfeldverlust, der schließlich zur völligen Blindheit führt (Fechtner & Weinreb, 1994). Das Glaukom ist neben diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration eine der häufigsten Erblindungsursachen in hochentwickelten Ländern. Von der Erkrankung sind in der gesamten Weltbevölkerung mehr als 50 Millionen Menschen betroffen; davon sind ca. 6 Millionen bilateral erblindet (Quigley, 1996).

Man kennt unterschiedliche Glaukomformen. Die am häufigsten verwendete Einteilung unterscheidet zwischen Offenwinkel- und Winkelblockglaukomen, jede dieser Formen kann je nach Entstehungsursache weiter in primäre oder sekundäre Formen eingeteilt werden. Das primäre Offenwinkelglaukom stellt mit annähernd 90% aller Glaukomformen die am häufigsten auftretende Variante in der westlichen Welt dar (Pfeiffer, 2001).

Die Pathophysiologie des Glaukoms ist komplex und bis heute nicht bis in alle Details verstanden. Im Fall des primären Offenwinkelglaukoms könnten mehrere Faktoren die Ursache des Zelluntergangs von retinalen Ganglienzellen sein, die toxische Wirkung erhöhter Glutamatspiegel gilt dabei als wahrscheinlichster Kandidat. Als weitere, möglicherweise ursächliche Faktoren werden erhöhter intraokulärer Druck, der Einfluss von Immunmodulatoren, z.B. TNF-α, sowie lokale retinale Hypoxie diskutiert (Weinreb & Khaw, 2004).

↓14

Erhöhter intraokulärer Druck ist der einzige Faktor, der nachweislich mit Ganglienzelluntergang assoziiert ist, wobei keine Klarheit darüber besteht, ob dieser Faktor Ursache oder Konsequenz der Erkrankung ist. Der vermutete Mechanismus, der von erhöhtem Druck zu Ganglienzellverlust führt, wird durch drei Hauptkomponenten bestimmt: Einerseits sind die Ganglienzellen durch mechanischen Stress aufgrund der erhöhten lokalen Druckgradienten direkt beeinträchtigt. Ein weiterer, indirekter Effekt wird an der Lamina cribrosa vermutet, einer tunnelartigen Struktur für Axone des Nervus opticus. Durch erhöhten Druck wird die Lamina deformiert, was zur Beeinträchtigung des axoplasmatischen Transportes und der Versorgung des Ganglienzellsoma führt. Schließlich trägt der veränderte Druckgradient zur Minderperfusion der Retina und somit zur Hypoxie bei, was den Degenerationsprozess zusätzlich beschleunigt (Bellezza, et al. 2003; Fechtner & Weinreb, 1994; Quigley et al., 2000).

1.4.1  Physiologie des Kammerwassertransportes und des Trabekelwerks

Wie kommt es zum erhöhten Augeninnendruck beim primären Offenwinkelglaukom? Der physiologische Druck ist durch das Gleichgewicht zwischen Sekretion, Transport und Drainage von Kammerwasser in der Augenkammer definiert. Störung dieses Gleichgewichtes, entweder durch erhöhte Sekretion oder verminderten Abfluss, führt zum erhöhten Druck. Die Sekretion von Kammerwasser erfolgt auf zellulärer Ebene über das Ziliarepithel, einem zweischichtigen Epithel, das die Fortsätze des Ziliarkörpers in der hinteren Augenkammer abschließt. Das Kammerwasser fließt anschließend zwischen Iris und Linse in die vordere Augenkammer, um im Kammerwinkel über den Schlemm-Kanal wieder in das Blut- und Lymphsystem aufgenommen zu werden (Abbildung 1.8).


Abbildung 1.8 Anatomie des Auges im schematischen Längsschnitt (A): a) Kornea, b) vordere Augenkammer, c) Iris, d) Linse, e) Ziliarkörper, f) Sklera, g) Choroidea, h) Retina, i) Nervus opticus. Zeichnung (B aus Weinreb & Khaw, 2004) und Kryostatschnitt (C, mit freundlicher Genehmigung der University of California Davis, Sacramento) sollen die genaue Lokalisation des Trabekelwerks und den Kammerwasserfluss (Pfeile) deutlich machen.8 Anatomie des Auges im schematischen Längsschnitt (A): a) Kornea, b) vordere Augenkammer, c) Iris, d) Linse, e) Ziliarkörper, f) Sklera, g) Choroidea, h) Retina, i) Nervus opticus. Zeichnung (B aus Weinreb & Khaw, 2004) und Kryostatschnitt (C, mit freundlicher Genehmigung der University of California Davis, Sacramento) sollen die genaue Lokalisation des Trabekelwerks und den Kammerwasserfluss (Pfeile) deutlich machen.

↓15

Der Abfluss des Kammerwassers erfolgt größtenteils durch das Trabekelwerk, einen netzwerkartigen Zellverbund im Kammerwinkel. Das Kammerwasser fließt zwischen den einzelnen Trabekeln in den Schlemmkanal. Bei großem Abstand der einzelnen Trabekel untereinander kann die Abflussrate hoch sein, ein dichtes Trabekelwerk stellt eine Abflussbarriere dar. Jahrelang wurde das Trabekelwerk als passives Gewebe angesehen, dessen Spannungszustand vom Ziliarmuskel reguliert wird, mit dem es über Zonulafasern und Skleralsporn verbunden ist (Gong et al., 1996). Heute ist bekannt, dass das Trabekelwerk als kontraktiles Gewebe zusammen mit dem Ziliarkörper an der Abflussregulation beteiligt ist. Die Zellen des Trabekelwerkes zeigen Eigenschaften, die mit glatten Muskelzellen vergleichbar sind. Kontraktion des Trabekelwerks reduziert den Kammerwasserabfluss, Relaxation erhöht die Abflussrate. Es ist möglich, diesen Mechanismus pharmakologisch zu beeinflussen (Stumpff & Wiederholt, 2000; Wiederholt et al., 2000). Aus diesem Grund eignet sich das Trabekelwerk gut als pharmakologisches Zielgewebe, insbesondere weil es im Gegensatz zum Ziliarmuskel nicht an der Akkomodation der Linse beteiligt ist.

Die physiologische Regulation der Trabekelwerkskontraktilität erfolgt über einen Ca2+-abhängigen sowie einen Ca2+-unabhängigen Mechanismus. Beim Ca2+-abhängigen Mechanismus stellt das korrekte Zusammenspiel von Ionenkanälen einen der wichtigsten Faktoren dar. Erhöhte intrazelluläre Calciumkonzentration führt zur Kontraktion des Gewebes. Die dafür notwendigen Calciumionen stammen aus zellinternen Speichern sowie aus dem extrazellulären Raum. Im letzteren Fall gelangen sie über Calciumkanäle vom L-Typ ins Zytosol. Die Calciumkanäle sind spannungsabhängig; sie werden bei einer Depolarisation aktiviert. Auswärts rektifizierende Kaliumkanäle vom Maxi-K-Typ sind maßgeblich an der Regulation des Membranpotentials beteiligt. Die Aktivität der Maxi-K-Kanäle ist von der Ca2+-Konzentration abhängig, bei erhöhter intrazellulärer Ca2+-Konzentration führt ihre vermehrte Aktivität zur Hyperpolarisation. Dieser Rückkopplungsmechanismus beeinflusst die intrazelluläre Calciumkonzentration, folglich auch die Kontraktionseigenschaften der Zellen. Kontraktilität glatter Muskelzellen ist über einen bestimmten Bereich linear abhängig vom Membranpotential (Greger & Windhorst, 1996). Die Aktivität der Maxi-K Kaliumkanäle ist somit entscheidend für Relaxation des Trabekelwerks (Stumpff et al., 1997).

1.5  Fragestellung und Ziel

Die Untersuchung synthetischer Ionenkanäle in Bilayermembranen hat eine Menge zum Verständnis der Ionenkanäle, ihrer Struktur und Funktion beigetragen. Der therapeutische Einsatz erweist sich jedoch als komplexe Aufgabe und Herausforderung. Um als Ersatz fehlender Kanalfunktion zu dienen oder die Zelleigenschaften zu modifizieren, müssen künstliche Kanäle in einem komplexen biologischen Milieu funktionell sein. Ungeachtet ihrer Bedeutung für potentielle Anwendung ist die Untersuchung von künstlichen Kanälen in lebenden Zellen ein Bereich der Wissenschaft, der bisher bis auf einzelne Ausnahmen wenig Beachtung fand (Rottenberg & Koeppe, 1989).

↓16


In dieser Arbeit sollten daher die folgenden Untersuchungen erfolgen:

  1. Ermittlung der Wirksamkeit von THF-gram, THF-gram-TBDPS und Linked-gram-TBDPS als Ionenkanäle in lebenden Zellen.
  2. Analyse des Kanaleinbaus unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses auf physiologische Zellfunktion.
  3. Untersuchung der Wirksamkeit von Gramicidin A, um die synthetischen Strukturen mit der Muttersubstanz zu vergleichen.


Als zu untersuchendes Material wurden kultivierte Zellen vom Trabekelwerk des bovinen Auges (BTM) ausgewählt. Bereits aus technischen Gründen sind BTM-Zellen für diese Aufgabe gut geeignet. Die Zellkultur und die Zellpräparation sind gut etabliert. Die Anwendung der Patch-Clamp-Technik ist bei BTM-Zellen ausgereift, die Zellen bilden relativ schnell und häufig GΩ-Seals aus und bleiben über längere Zeiträume stabil. In früheren Untersuchungen wurden BTM-Zellen elektrophysiologisch charakterisiert (Stumpff et al., 1997), ihr Verhalten entspricht weitesgehend humanen Trabekelwerkszellen.

↓17

Ein weiterer Grund für die Auswahl war die pathophysiologische Relevanz von Ionenkanälen für das Zielgewebe, insbesondere der Einfluss des Membranpotentials auf die Trabekelwerkskontraktilität.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
18.10.2006