Ergebnisse

↓30

In der Whole-Cell-Konfiguration waren stabile Aufnahmen zwischen 5-20 min möglich. Längere Aufnahmezeiten wurden durch Instabilität der hochohmigen Zell-Pipettenverbindung sowie durch Aufbrechen der Zellmembran verhindert. Die Kontrolle der Membranleitfähigkeit erfolgte mittels Messung von Membranströmen unter Einsatz von zwei Pulsprotokollen (Kapitel 2.1.3). Es wurden nur Zellen eingeschlossen und den untersuchten Substanzen ausgesetzt, deren Kontrollströme über eine Zeitspanne von mindestens 5 min stabil waren.

Aufgrund der komplexen Synthese war die Verfügbarkeit der untersuchten Substanzen limitiert, was nur eine beschränkte Anzahl von Experimenten pro Experimentserie ermöglichte.

3.1  Kontrollexperimente

↓31

Messungen mit verschiedenen Ladungsträgern (Na+/K+ oder Cs+) wurden separat analysiert. Kontrollwerte für Stromdichte, Zellkapazität, Zellwiderstand und Umkehrpotential wurden vor Applikation der untersuchten Substanzen aufgenommen. In jedem Experiment wurden die Zellströme nach Erreichen des Whole-Cell-Modus über 60-120 s ohne Substanzapplikation aufgenommen. Somit konnte die Registrierung der Kontrollwerte erfolgen sowie instabile oder oszillierende Zellen ausgeschlossen werden.

BTM-Zellen zeigten eine Gesamtstromdichte von 4.0 ± 0.5 pApF-1 (n = 69) für Na+/K+ und 5.2 ± 0.4 pApF-1 (n = 31) für Cs+ als Ladungsträger. Bei beiden Ladungsträger war der Anteil der Auswärtskomponente am Gesamtstrom mit 69.5 ± 1.1 % für Na+/K+ (p<0.001) sowie 75.8 ± 1.7 % (p<0.001) für Cs+ stärker als die Einwärtskomponente. Die Zellkapazität wurde mit 60.3 ± 5.4 pF (Na+/K+, n = 69) beziehungsweise 62.5 ± 9.0 pF (Cs+, n = 31) gemessen. Der Zugangswiderstand der Zellen betrug vor Kompensation 10.1 ± 0.6 MΩ bei Na+/K+ und 11.1 ± 1.0 MΩ bei Cs+. Bei den genannten Werten wurde zwischen verschiedenen Ladungsträgern kein Unterschied festgestellt. Die Betrachtung der Kontrollwerte von Umkehrpotentialen ergab jedoch, dass unter Cs+-haltigen Bedingungen das Umkehrpotential mit -15.9 ± 2.8 mV signifikant positiver (p < 0.001) als in physiologischer Umgebung war. Tabelle 3.1 gibt eine Übersicht für die beiden verwendeten Lösungskombinationen wieder.

Tabelle 3.1 Kontrollwerte von BTM-Zellen für verschiedene Lösungen/Ladungsträger, die durch gemessene Ströme von Na1 Kontrollwerte von BTM-Zellen für verschiedene Lösungen/Ladungsträger, die durch gemessene Ströme von Na+/K+ oder Cs+ Ionen repräsentiert waren. Die Werte waren voneinander nicht signifikant unterschiedlich. Die einzige Größe, die einen signifikanten Unterschied zeigte, war das Umkehrpotential (fett markiert).

Ladungs-träger

Umkehrpotential (mV)

Stromdichte (pApF-1)

Zellkapazität (pF)

Zellwiderstand (MΩ)

Zellanzahl (n)

Na+/K+

-39.2 ± 1.7 mV

4.0 ± 0.5

60.3 ± 5.4

10.1 ± 0.6

69

Cs+

-15.9 ± 2.8 mV

5.2 ± 0.4

62.5 ± 9.0

11.1 ± 1.0

31

↓32

Um einen möglichen Einfluss der Lösungsmittel auf die Stromantwort auszuschließen, wurden BTM-Zellen nach extrazellulärer Applikation von 0.5% DMSO (Vol./Vol.) bzw. 0.5% Methanol untersucht. Die gewählte Konzentration von 0.5 % der Badlösung entsprach der maximal verwendeten Konzentration, um künstliche Ionenkanäle in Lösung zu bringen.

10 min nach Applikation von 0.5% DMSO veränderte sich die Stromdichte der BTM-Zellen auf 92.2 ± 9 % (n = 3) des Ausgangwertes. Das Umkehrpotential veränderte sich entsprechend um Δ +1.0 ± 1.5 mV (n = 3). In ähnlicher Weise bewirkte eine 0.5%-ige Konzentration von Methanol in der Badlösung eine Veränderung der Stromdichte auf 97.3 ± 11.3 % (n = 3) des Ausgangwertes und eine Verschiebung des Umkehrpotentials um Δ-0.53 ± 2.8 mV (n = 3). Die Werte vor und nach Applikation von DMSO bzw. Methanol waren voneinander nicht signifikant unterschiedlich. Abbildung 3.1 zeigt Verlaufsprotokolle von Zellen, die mit DMSO bzw. Methanol inkubiert wurden.

Abbildung 3.1 Verlaufsprotokolle von BTM-Zellen, die entweder Methanol (A) oder DMSO (B) in einer Konzentration von 0.5% ausgesetzt wurden. Das Experiment mit Methanol wurde mit einer intrazellulären Lösung durchgeführt, welche nicht mit Ca-EGTA gepuffert war. Dies führte zu einer starken Aktivierung von auswärtsrektifizierenden, calciumabhängigen Maxi-K-Kanälen, sichtbar an der starken Stromantwort nach Depolarisation. Um diese Aktivierung zu vermeiden und mögliche Effekte künstlicher Ionenkanäle besser erkennbar zu machen, wurde in allen folgenden Experimenten inklusive des DMSO-Kontrollversuchs (B) mit Hilfe vom Ca-EGTA-Puffer die intrazelluläre Calciumkonzentration bei 12 nM (siehe Methoden) aufrechterhalten. Die niedrige Konzentration hatte wie erwartet eine Reduktion der Auswärtsströme zur Folge, was auf die schwächere Aktivierung von Maxi-K-Kanälen zurückzuführen war.1 Verlaufsprotokolle von BTM-Zellen, die entweder Methanol (A) oder DMSO (B) in einer Konzentration von 0.5% ausgesetzt wurden. Das Experiment mit Methanol wurde mit einer intrazellulären Lösung durchgeführt, welche nicht mit Ca-EGTA gepuffert war. Dies führte zu einer starken Aktivierung von auswärtsrektifizierenden, calciumabhängigen Maxi-K-Kanälen, sichtbar an der starken Stromantwort nach Depolarisation. Um diese Aktivierung zu vermeiden und mögliche Effekte künstlicher Ionenkanäle besser erkennbar zu machen, wurde in allen folgenden Experimenten inklusive des DMSO-Kontrollversuchs (B) mit Hilfe vom Ca-EGTA-Puffer die intrazelluläre Calciumkonzentration bei 12 nM (siehe Methoden) aufrechterhalten. Die niedrige Konzentration hatte wie erwartet eine Reduktion der Auswärtsströme zur Folge, was auf die schwächere Aktivierung von Maxi-K-Kanälen zurückzuführen war.

3.2 THF-gram

↓33

Der Einfluss von THF-gram auf die Leitfähigkeit von BTM-Zellen wurde in einem Konzentrationsbereich zwischen 10-6 M und 10-8 M untersucht. Bei diesen Konzentrationen zeigten die Zellen einen eindeutigen Anstieg der Membranstromdichte mit einer ausgeprägten Auswärtskomponente sowie eine Veränderung des Umkehrpotentials in Richtung positiverer Werte. Die maximale Ausprägung der Effekte war in einem Zeitraum zwischen 10 – 15 min nach Applikation von THF-gram zu beobachten. Eine Konzentrationsabhängigkeit wurde für die Zeitspanne zwischen Beginn der Substanzapplikation und erstem Effekteintritt festgestellt. In keinem der Experimente wurden Auswascheffekte beobachtet, die Veränderungen der Stromantwort blieben auch bei Spülung der Zellen mit substanzfreier Badlösung erhalten.

3.2.1  Experimente mit Na+/K+ als Ladungsträger

Unter physiologischen Bedingungen, d.h. mit Natrium- und Kaliumionen als Ladungsträger, wurde unter Verwendung einer THF-gram-Konzentration von 10-6 M ein Anstieg der Gesamtstromdichte um Δ+5.8 ± 2.0 pApF-1 (n = 7) beobachtet. Unter Kontrollbedingungen betrug dabei die Stromdichte 3.0 ± 0.6 pApF-1 und stieg auf den Maximalwert von 8.8 ± 2.0 pApF-1 nach Substanzapplikation. Bei 70% der untersuchten BTM-Zellen war ein Effekt zu beobachten, die restlichen Zellen zeigten keine Änderung der Stromantwort auf THF-gram. Die veränderte Leitfähigkeit der Zellmembran führte zu einer Verlagerung des Umkehrpotentials um Δ+12.1 ± 3.4 mV (n = 7) vom Initialwert von -48.1 ± 4.8 mV, so dass das Umkehrpotential nach Substanzgabe -36.0 ± 2.1 mV betrug. Die beobachteten Veränderungen waren signifikant unterschiedlich zu Kontrollwerten (Abbildung 3.2). Eine exemplarische Darstellung der THF-gram-Effekte auf die Zellantwort ist in Abbildung 3.3 sowie Abbildung 3.4 dargestellt.

Abbildung 3.2 Gegenüberstellung von Membranstromdichte (A) sowie Umkehrpotential (B) jeweils vor und nach Applikation von THF-gram (102 Gegenüberstellung von Membranstromdichte (A) sowie Umkehrpotential (B) jeweils vor und nach Applikation von THF-gram (10-6 M). Die dargestellten Balken repräsentieren Mittelwerte mit eingezeichneten Standardfehlerbereichen, Zahlen beziehen sich auf die untersuchte Zellzahl, der Asterisk auf den Signifikanzlevel der Differenz beider Balken.

↓34


Abbildung 3.3 Effekt der THF-gram-Applikation (103 Effekt der THF-gram-Applikation (10-6 M) auf Membranströme einer BTM-Zelle. R50-Protokolle (A und C) zeigen die Stromantwort auf Hyper- bzw. Depolarisation jeweils vor und nach Substanzgabe, das Verlaufsprotokoll (B) dokumentiert die kontinuierliche Zunahme der Leitfähigkeit (der Balken zeigt die Applikationsdauer an).


Abbildung 3.4 Im Diagramm werden die Strom/Spannungslinien dargestellt, die jeweils aus den Protokollen von Abbildung 3.3 A und C kalkuliert wurden. Die Änderung des Kurvensteilheit verdeutlicht dabei den Anstieg der Leitfähigkeit, die Verlagerung des Schnittpunktes mit der X-Achse (punktierte Linien) die Änderung des Umkehrpotentials.4 Im Diagramm werden die Strom/Spannungslinien dargestellt, die jeweils aus den Protokollen von Abbildung 3.3 A und C kalkuliert wurden. Die Änderung des Kurvensteilheit verdeutlicht dabei den Anstieg der Leitfähigkeit, die Verlagerung des Schnittpunktes mit der X-Achse (punktierte Linien) die Änderung des Umkehrpotentials.


Abbildung 3.5 Vergleich der maximalen zusätzlichen (Δ) Auswärts- und Einwärtsstromdichten nach THF-gram-Applikation bei einer Konzentration von 105 Vergleich der maximalen zusätzlichen (Δ) Auswärts- und Einwärtsstromdichten nach THF-gram-Applikation bei einer Konzentration von 10-6 M. Die Werte für beide Balken wurden aus Ergebnissen kalkuliert, die von gleichen Zellen stammten.

↓35


Der durch THF-gram induzierte Anstieg der Stromdichte war asymmetrisch. Der Anstieg der Auswärtsstromdichte war bei der Konzentration von 10-6 M mit Δ+4.7 ± 1.6 pApF-1 (n = 7) stärker ausgeprägt als der Anstieg der Einwärtskomponente, der bei Δ+1.1 ± 0.4 pApF-1 (n = 7) lag. Dieser Unterschied war statistisch signifikant (Abbildung 3.5). Untersuchungen mit geringeren Konzentrationen von THF-gram (10-7 M und 10-8 M), zeigten ein Verhalten von BTM-Zellen, das mit den Resultaten bei 10-6 molarer Konzentration vergleichbar war. Bei beiden Konzentrationen führte die Exposition mit THF-gram zu einem Anstieg der Leitfähigkeit sowie einer Verlagerung des Umkehrpotentials in Richtung positiver Werte.

Tabelle 3.2 fasst die Ergebnisse zusammen. Die Veränderungen der Stromantwort nach Applikation von THF-gram traten mit einer zeitlichen Verzögerung auf, die von der verwendeten Konzentration abhängig war. Bei einer Konzentration von 10-6 M waren erste Effekte 103 ± 26 s (n = 7) nach Beginn der Applikation sichtbar. Eine geringere Konzentration hatte eine größere Verzögerung der Stromantwort zur Folge, mit 119.0 ± 48.3 s (n = 4) bei 10-7 M und 240.4 ± 39.8 s (n = 5) bei 10-8 M. Die Reaktionszeiten bei verschiedenen Konzentrationen waren voneinander bei folgenden Gegenüberstellungen signifikant unterschiedlich: 10-6 vs. 10-8 M sowie 10-7 vs. 10-8 M (Abbildung 3.6). Folglich wurde die Reaktionszeit zwischen THF-gram-Applikation und erstem beobachteten Effekt als konzentrationsabhängig im Bereich 10-6 - 10-8 M beurteilt.

↓36

Tabelle 3.2 Zusammenfassung der Experimente mit THF-gram für die Konzentrationen 102 Zusammenfassung der Experimente mit THF-gram für die Konzentrationen 10-7 M and 10-8 M. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben. Sternchen deuten den Signifikanzlevel an. Folgende Abkürzungen wurden verwendet: D0 – Stromdichte unter Kontrollbedingungen; DS – Stromdichte nach Substanzapplikation; Din – zusätzliche (Δ) Einwärtsstromdichte nach Substanzapplikation; Dout – zusätzliche (Δ) Auswärtsstromdichte nach Substanzapplikation; P0 – Umkehrpotential unter Kontrollbedingungen; PS – Umkehrpotential nach Substanzapplikation; n.s. – nicht signifikant.

Konzentration (mol/l)

10-7

10-8

Anzahl reagierender Zellen

4

5

Anzahl untersuchter Zellen

5

6

Verhältnis reagierende/untersuchte Zellen in %

80

83

D 0 in pApF -1

4.4 ± 1.8

8.9 ± 4.9

D S in pApF -1

11.5 ± 3.4

17.7 ± 5.9

Differenz ΔD S – D 0 in pApF -1

7.1 ± 1.7

8.8 ± 2.5

p-Wert von Δ(D S – D 0 ), Signifikanzlevel

0.024, *

0.023, *

D In in pApF -1

2.8 ± 1.4

2.6 ± 1.2

D Out in pApF -1

4.4 ± 1.1

6.2 ± 1.5

p-Wert of D In vs. D Out , Signifikanzlevel

0.41, n.s.

0.033 *

P 0 in mV

-42.7 ± 7.5

-47.5 ± 15.5

P S in mV

-22.3 ± 10.5

-32.0 ± 12.5

Δ(P S - P 0 ) in mV

20.3 ± 7.7

15.5 ± 3.4

p- Wert of Δ (P S - P 0 ), Signifikanzlevel

0.094, n.s.

0.019, *

Abbildung 3.6 Konzentrationsabhängigkeit von THF-gram tritt als zeitliche Verzögerung des Stromanstiegs nach Substanzapplikation in Erscheinung. Die Abbildungen zeigen Verlaufsprotokolle von drei Zellen, denen THF-gram in abnehmender Konzentration (106 Konzentrationsabhängigkeit von THF-gram tritt als zeitliche Verzögerung des Stromanstiegs nach Substanzapplikation in Erscheinung. Die Abbildungen zeigen Verlaufsprotokolle von drei Zellen, denen THF-gram in abnehmender Konzentration (10-6–10-8 M von oben nach unten) appliziert wurde. Pfeile deuten jeweils auf den Applikationsbeginn sowie auf den ersten Stromanstieg. Im Diagramm (links) ist die verwendete Konzentration gegen die zeitliche Verzögerung des Effekteintritts aufgetragen. Alle Angaben als Mittelwerte ± Standardfehler.

3.2.2 Experimente mit Cs+ als Ladungsträger

In Experimenten mit künstlichen Membranen wurde für THF-gram eine Ionenselektivität in folgender Reihenfolge festgestellt: NH4 + > Cs+ > K+ > Na+. Diese Selektivität entspricht der Eisenmanreihe I für Kationen (Schrey et al., 2000). Damit das Selektivitätsverhalten auch in BTM-Zellen untersucht und mögliche Unterschiede in der Stromdichte und Antwortmuster erkannt werden konnten, wurde die Wirkung von THF-gram mit Cäsium als Ladungsträger überprüft (Kapitel 2.3.2). Dabei wurde eine THF-gram-Konzentration von 10-6 M verwendet.

↓37

Unter diesen Bedingungen zeigten 62.5 % der untersuchten BTM-Zellen eine Veränderung von Stromdichte und Umkehrpotential nach Applikation von THF-gram. Der Anstieg der Stromdichte betrug bei reagierenden Zellen Δ+17.5 ± 2.6 pApF-1, das Umkehrpotential verschob sich um Δ+4.6 ± 1.0 mV von initial -9.0 ± 2.4 mV auf - 4.4 ± 2.6 mV nach Applikation (n = 5). Sowohl für die Stromdichte (p = 0.0026) als auch für das Umkehrpotential (p = 0.009) waren die Veränderungen statistisch signifikant. Überraschenderweise wurde auch unter cäsiumhaltigen Bedingungen eine Asymmetrie der Stromantwort festgestellt, die ähnlich der Reaktion unter physiologischen Bedingungen (Na+/K+) war. Der Anstieg der Auswärtsstromdichte (Δ+12.4 ± 2.0 pApF-1, n = 5) war signifikant höher (p = 0.009) als der Wert für die zusätzliche Einwärtsstromdichte, der bei Δ+5.1 ± 0.8 pApF-1 (n = 5) lag. Die zeitliche Verzögerung zwischen Applikationszeitpunkt und Effekteintritt betrug unter Cs+ 61.2 ± 18.1 s (n = 5).

3.2.3 Vergleich von Effekten zwischen verwendeten Ladungsträgern

Beim Vergleich der Effekte von THF-gram unter verschiedenen Ladungsträgern (also Na+/K+ vs. Cs+) ergab die Auswertung folgende Resultate: zusätzliche Stromdichte nach THF-Applikation war signifikant höher für Cs+ als für Na+/K+ (Abbildung 3.7). Die Asymmetrie der Stromantwort war bei Cs+ als Ladungsträger jedoch schwächer ausgeprägt als unter physiologischen Bedingungen. Die zusätzliche Einwärtsstromdichte betrug bei Na+/K+ 23 ± 3.1% (n = 7) der Auswärtsstromdichte und war damit deutlich kleiner als der entsprechende Anteil unter Verwendung von Cs+, der bei 42.2 ± 5.2% (n = 5) lag. Ein Vergleich der Umkehrpotentiale war nur bedingt möglich, da bereits die Verwendung von Cs+ im Kontrollexperiment das Umkehrpotential in positiver Richtung verschob (Kapitel 3.1). Was die Reaktionszeit betrifft, zeigten die Zellen bei vergleichbarer Konzentration keinen signifikanten Unterschied zwischen Cs+ and Na+/K+. BTM-Zellen, die mit Cs+-haltiger Lösung versetzt wurden, zeigten jedoch eine leichte Tendenz zu schnellerer Reaktion (61 ± 18 s; n = 5) als Zellen, die mit physiologischer Lösung gespült waren (103 ± 26 s; n = 7).

Abbildung 3.7 Der durch THF-gram (107 Der durch THF-gram (10-6 M) induzierte Anstieg der Stromantwort war von den verwendeten Lösungsträgern abhängig. Das Balkendiagramm zeigt mittlere Stromdichten sowie Standardfehlerbereiche für unterschiedliche Ladungsträger.

3.3 THF-gram-TBDPS

↓38

Aufnahmen von Strömen in Bilayer-Membranen hatten gezeigt, dass das Anhängen von TBDPS-Schutzgruppen die Kanaleigenschaften der THF-gram-Hybride verändern kann (Schrey et al., 2000). Um die Wirkung der geschützten Verbindung auf die Stromantwort von BTM-Zellen zu untersuchen sowie mögliche Unterschiede gegenüber dem ungeschützten THF-gram zu ermitteln, wurde das Verhalten der Zellen nach Applikation von THF-gram-TBDPS untersucht. Übereinstimmend mit den Resultaten aus Bilayerexperimenten wurde festgestellt, dass unter THF-gram-TBDPS der Einfluss auf die Stromantwort schwächer ausfiel als unter THF-gram. Auch in diesem Fall waren die Veränderungen nach Substanzapplikation durch Auswaschen nicht reversibel. Signifikante Effekte wurden nur in einem sehr engen Konzentrationsbereich von 10-6 bis 10-7 M beobachtet, ab einer Konzentration von 10-8 M waren keine Veränderungen sichtbar (Tabelle 3.3). Konsistent mit der schwachen Antwort war auch der geringe Anteil der reagierenden Zellen, der bei 10-6 M nur bei 30% der untersuchten Zellen lag. Daher wurde eine zweite Experimentreihe durchgeführt, bei der die Zellen über 1 Stunde mit THF-gram-TBDPS inkubiert wurden. Diese Experimentreihe diente dazu, mögliche Effekte nach längerer Substanzexposition aufzudecken.

3.3.1  Akute Experimente mit Na+/K+ als Ladungsträger

Nach Zugabe von THF-gram-TBDPS (10-6 M) zur Badlösung und anschließender Applikation zeigten 7 von 23 BTM-Zellen (≈ 30%) signifikante Veränderungen im elektrophysiologischen Verhalten. Die maximale Stromantwort trat 15-20 min nach Applikation auf, erste Effekte waren nach 204.6 ± 44.5 s (n = 7) sichtbar. Die Stromdichte stieg signifikant (p = 0.04) von initial 3.6 ± 0.8 pApF-1 bis auf 9.6 ± 3.1 pApF-1 an (Δ+6.0 ± 2.4 pApF-1. n = 7). Eine signifikante Verschiebung des Umkehrpotentials von -37.7 ± 6.0 auf -16.7 ± 4.8 mV (Δ+21.0 ± 4.5 mV, n = 7, p = 0.003) konnte ebenfalls festgestellt werden. Abbildung 3.8 zeigt eine exemplarische Stromantwort einer BTM-Zelle nach Applikation von THF-gram-TBDPS.

Abbildung 3.8 Elektrophysiologische Antwort von BTM-Zellen auf Applikation von THF-gram-TBDPS (10-7 M). Die Abbildungen zeigen respektive Stromaufzeichnungen unter Kontrollbedingungen (A) und nach Substanzapplikation (B und C). Schwarzer Balken zeigt die Applikationszeit.8 Elektrophysiologische Antwort von BTM-Zellen auf Applikation von THF-gram-TBDPS (10-7 M). Die Abbildungen zeigen respektive Stromaufzeichnungen unter Kontrollbedingungen (A) und nach Substanzapplikation (B und C). Schwarzer Balken zeigt die Applikationszeit.

↓39

Eine Asymmetrie zwischen der Auswärts- und Einwärtsstromdichte konnte bei THF-gram-TBDPS nicht beobachtet werden. Einige untersuchte Zellen zeigten zwar eine leichte Tendenz zu höherer Auswärtsstromdichte (3.9 ± 1.9 pApF-1 auswärts vs. 3.5 ± 2.1 pApF-1 einwärts; n = 7), dieser Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant.

In Einzelkanalmessungen fand man heraus, dass Gadoliniumionen (Gd3+) eine inhibitorische Wirkung auf die Kanalaktivität von THF-gram-TBDPS ausüben (nicht veröffentlichte Beobachtung aus dem Institut für Chemie, HU Berlin, Prof. Koert). Um zu untersuchen, ob dieser Effekt auch in biologischen Membranen auftritt, wurden diejenigen BTM-Zellen, die einen Stromanstieg zeigten, im Anschluss an die Applikation von THF-gram-TBDPS mit Gd3+ (0.5*10-3 M) behandelt. Die initiale Stromamplitude von 185.2 ± 51.7 pA stieg nach Zugabe von THF-gram-TBDPS bis auf 622.0 ± 268.5 pA. Anschließende Applikation von Gd3+ reduzierte den Strom auf 211.5 ± 82.0 pA (Abbildung 3.9) und somit auf einen mit der Kontrolle vergleichbaren Wert. Aufgrund einer sehr geringen Fallzahl von n=4 wurde für die beobachteten Effekte eine statistische Signifikanz nicht erreicht, der p-Wert betrug 0.14 für die zusätzlichen Ströme nach THF-gram-TBDPS Applikation versus Kontrolle und 0.2 für die Reduktion dieser Ströme nach Zugabe von Gd3+. Bei Kontrollversuchen stellte sich jedoch heraus, dass bei unbehandelten Zellen die Applikation von Gd3+ auch die natürliche Stromantwort reduziert bzw. fast komplett auslöscht. Gadolinium ist bekannt als unspezifischer Inhibitor von Ionenkanälen (Popp et al., 1993). Da nicht unterschieden werden konnte, ob die Stromreduktion durch Gd3+ auf Inhibition natürlicher oder künstlicher Kanäle zurückzuführen war und somit kein weiterer Erkenntnisgewinn erfolgen konnte, wurde auf weitere Experimente mit Gd3+ verzichtet.

3.3.2 Inkubationsexperimente

Bei kurzzeitiger Exposition (10-15 min) mit THF-gram-TBDPS zeigte nur ein geringer Anteil von BTM-Zellen eine Reaktion im Sinne eines Stromanstiegs. Um herauszufinden, ob die Reaktion nach längerer Exposition bei einem größeren Prozentsatz der Zellen auftritt oder ob die Stromantwort ein verändertes Bild zeigt, wurde nach üblicher Präparation (Kapitel 2.3.1) ein zusätzlicher Schritt eingeführt. In diesem Schritt wurden die Zellen vor Versuchsbeginn eine Stunde lang im serumfreien Medium inkubiert, das mit 10-6 M THF-gram-TBDPS versetzt war. Inkubation in Serum mit 0.5% DMSO diente als Negativkontrolle. Da Kontroll- und Zielwerte bei diesem Experimentdesign von verschiedenen Zellen stammten, wurde zur statistischen Analyse der T-Test für nicht gepaarte Experimente verwendet.

↓40


Abbildung 3.9 Einfluss von Gd9 Einfluss von Gd3+ auf Stromantwort nach Applikation von THF-gram-TBDPS. Gd3+ (0.5*10-3 M) reduzierte den THF-gram-TBDPS (10-6 M) induzierten Stromanstieg wieder auf Ausgangswerte. Nach Auswaschen von Gd3+ setzte sich der Anstieg der Leitfähigkeit fort.


Die Verlängerung der Expositionszeit führte tatsächlich zu einer größeren Zahl reagierender Zellen (sog. responder). In 35 von 41 (≈ 85%) Patch-Clamp-Experimenten zeigten die untersuchten Zellen im Vergleich zur Kontrolle deutlich höhere Stromdichten sowie eine Verschiebung des Umkehrpotentials zu positiveren Werten. Die Stromdichten betrugen 7.1 ± 1.6 pApF-1 (n = 35) für Zellen, die mit THF-gram-TBDPS inkubiert wurden sowie 2.4 ± 0.5 pApF-1 (n = 10) bei den Kontrollen. Konsistent dazu lag das Umkehrpotential von behandelten Zellen bei -6.3 ± 2.1 mV (n = 35), was deutlich positiver als das Kontrollpotential war (-20.9 ± 6.0 mV; n = 10). Sowohl die Werte für Stromdichte als auch für das Umkehrpotential waren signifikant unterschiedlich (p < 0.01) zwischen Kontrolle und Inkubation mit THF-gram-TBDPS. Abbildung 3.10 zeigt die Verteilung der Umkehrpotentiale bei Zellen, die mit THF-gram-TBDPS inkubiert wurden.

Abbildung 3.10 Umkehrpotentiale von BTM-Zellen nach Inkubation mit THF-gram-TBDPS (1010 Umkehrpotentiale von BTM-Zellen nach Inkubation mit THF-gram-TBDPS (10-6 M) über 1h. Für eine übersichtliche Darstellung wurden die erfassten Potentiale in Spannungsbereiche von jeweils 10 mV aufgeteilt, die bei -85 bis -76 mV begannen und bei + 25 bis + 34 mV endeten. Im Diagramm beziehen sich die Balken auf die jeweiligen Fallzahlen in den Spannungsbereichen, die fettmarkierte Kurve spiegelt die Gaußverteilung wieder, die von der gesamten mit THF-gram inkubierten Zellpopulation berechnet wurde (mittleres Umkehrpotential: -6.3 mV). Zum Vergleich ist die Gaußverteilung der Kontrollzellen dargestellt (schmale Kurve).

3.3.3 Experimente mit Cs+ als Ladungsträger

↓41

Analog zu Experimenten mit dem ungeschützten THF-gram wurde die Verbindung THF-gram-TBDPS auf ihr Selektivitätsverhalten hin untersucht. Es wurden erneut cäsiumhaltige Lösungen verwendet, die Stromantwort nach Substanzapplikation aufgenommen, und die Ergebnisse mit Resultaten aus der Versuchsreihe mit physiologischer Badlösung (Na+/K+) verglichen.

Der Anteil der BTM- Zellen, die eine Reaktion zeigten, lag bei 50 - 55 % (10-6 M) und war somit geringfügig höher als unter physiologischen Bedingungen. Bei beiden Konzentrationen wurde sowohl ein signifikanter Anstieg der Stromdichte als auch eine positive Verschiebung des Umkehrpotentials beobachtet. Der Anstieg der Stromdichte war etwas stärker ausgeprägt als unter Na+/K+, allerdings wurde wegen großer Streuung der Daten keine Signifikanz erreicht (Abbildung 3.11). Eine Asymmetrie von Einwärts zu Auswärtsströmen wurde nicht beobachtet. Genaue Angaben sind in der Tabelle 3.3 aufgeführt.

Abbildung 3.11 Zusätzliche Stromdichte nach Applikation von THF-gram-TBDPS (1011 Zusätzliche Stromdichte nach Applikation von THF-gram-TBDPS (10-6 M) mit unterschiedlichen Ladungsträgern. Zahlenangaben in Balken beziehen sich auf die untersuchten Zellzahlen.

↓42

Tabelle 3.3 Zusammenfassung aller Experimente mit THF-gram-TBDPS, die nicht im Haupttext besprochen wurden. Abkürzungslegende: D3 Zusammenfassung aller Experimente mit THF-gram-TBDPS, die nicht im Haupttext besprochen wurden. Abkürzungslegende: D0 – Stromdichte unter Kontrollbedingungen; DS – Stromdichte nach Substanzapplikation; Din – zusätzliche (Δ) Einwärtsstromdichte nach Substanzapplikation; Dout – zusätzliche (Δ) Auswärtsstromdichte nach Substanzapplikation; P0 – Umkehrpotential unter Kontrollbedingungen; PS – Umkehrpotential nach Substanzapplikation; n.s. – nicht signifikant.

Konzentration (mol/l)

10-8

10-7

10-7

Ladungsträger

Na+/K+

Na+/K+

Cs+

Anzahl reagierender Zellen

4

3

6

Durchgeführte Experimente

12

8

11

Rate reagierender Zellen in %

33.3

37.5

54.5

D 0 in pApF -1

6.0 ± 2.6

6.5 ± 2.6

7.0 ± 2.5

D S in pApF -1

10.2 ± 4.2

10.0 ± 2.9

10.5 ± 3.3

Differenz ΔD S – D 0 in pApF -1

4.2 ± 1.8

3.6 ± 0.5

3.5 ± 1.0

p-Wert von Δ(D S – D 0 ), Signifikanz

0.1, n.s.

0.019, *

0.016, *

D In in pApF -1

1.0 ± 0.7

1.9 ± 0.6

0.7 ± 0.2

D Out in pApF -1

3.2 ± 1.2

1.6 ± 0.6

2.3 ± 0.9

p-Wert von D In vs. D Out , Signifikanz

n.s.

n.s.

0.08 n.s.

P 0 in mV

-35.5 ± 12.1

-28.7 ± 7.7

-5.0 ± 1.8

P S in mV

-36.2 ± 10.5

-6.7 ± 9.0

2.5 ± 2.3

ΔP S - P 0 in mV

0.7± 3.7

22.0 ± 8.1

7.5 ± 1.3

p-Wert von Δ(P S - P 0 ), Signifikanz

n.s.

0.07, n.s.

0.004, **

3.4 Linked-gram-TBDPS und Gramicidin A

Die Struktur der in dieser Arbeit untersuchten künstlichen Kanäle basierte auf Gramicidin A, das in der Dimerkonfiguration als Porenbildner und kationenselektiver Kanal wirksam ist. Die Primärstruktur von Gramicidin A wurde durch Ersatz der Aminosäuren an Position 1-8 durch THF-Aminosäuren und die Verbindung zweier Moleküle mit einem Linker modifiziert, so dass drei neue Verbindungen entstanden (Kapitel 1.3). Um den Einfluss des Linkers auf die Funktion zu eruieren und diesen Einfluss von den durch Ersatz der Aminosäuren ausgelösten Effekten zu unterscheiden, wurde die Verbindung linked-gram-TBDPS untersucht, welche eine kovalente Verbindung zweier Gramicidin A – Moleküle darstellt. Die Beobachtungen wurden mit den Effekten der Applikation von nativem Gramicidin A verglichen.

3.4.1  Gramicidin A

Ähnlich wie beim Experimentdesign mit THF-gram wurde die Wirkung von Gramicidin A bei zwei Konzentrationen (10-6 M and 10-7 M) sowie mit unterschiedlichen Ladungsträgern (Na+/K+ bzw. Cs+) untersucht. Im Gegensatz zu Experimenten mit THF-Verbindungen zeigten alle untersuchten Zellen (100%) eine Reaktion auf Gramicidin A. Ein Auswascheffekt war nicht zu beobachten. Bei 10-6 M war der erste Effekt 115 ± 20 s (n = 8) nach Applikation sichtbar, die maximalen Werte wurden 5-10 min nach Beginn bei einer Anstiegsrate für die Leitfähigkeit von 1.7 ± 0.3 pA/s erreicht. Der Effekt war so deutlich ausgeprägt, dass der Potential-Umkehrpunkt in den negativen Strombereich verschoben wurde, was am Drift der Basislinie zu erkennen war (Abbildung 3.12). In jeder untersuchten Zelle führten die Veränderungen nach 10-15 min zum Zelltod.

↓43

Unter physiologischen Bedingungen (Na+/K+) bewirkte eine 10-6 molare Konzentration von Gramicidin A in der Badlösung einen enormen Anstieg der Gesamtstromdichte um Δ23.8 ± 3.7 pApF-1 (n = 8; p<0.001). Davon gingen 13.5 ± 1.9 pApF-1 auf Auswärtsströme zurück, während die Einwärtsstromdichte 10.2 ± 1.9 pApF-1 betrug. Zwischen der Auswärts- und Einwärtskomponente war kein signifikanter Unterschied zu erkennen (p = 0.24). Das Umkehrpotential erfuhr eine Verschiebung von Δ + 22.6 ± 8 mV (n = 8; p < 0.05) ausgehend von - 35.2 ± 7.6 mV bei der Kontrolle bis zu - 12.6 ± 2.6 mV nach Substanzapplikation. Ähnliche Resultate wurden auch bei einer geringeren Konzentration von 10-7 M erzielt (Tabelle 3.4).

Wie erwartet, erwies sich Gramicidin A auch in Experimenten mit Cs+ als hauptsächlicher Ladungsträger als eine sehr effektive Substanz. Die Wirkung war mit der Versuchsreihe bei physiologischen Bedingungen vergleichbar, die Stromdichte stieg nach Applikation von Gramicidin A (10-6 M) signifikant um Δ 22.1 ± 3.4 pA/pF-1 (n = 6, p<0.001) von initial 6.3 ± 2.2 pA/pF-1 bis auf 28.4 ± 4.3 pA/pF-1 an. Das Umkehrpotential, das am Beginn der Experimente -29.9 ± 9.6 mV betrug, stieg auf den neuen Wert von –13.5 ± 9.4. Folglich betrug die Verschiebung Δ +16.3 ± 7.2 mV (n=6), was einen signifikanten Unterschied darstellte (p < 0.05).


Abbildung 3.12 Effekt von Gramicidin A (1012 Effekt von Gramicidin A (10-6 M) auf die Stromantwort von BTM-Zellen. R50-Protokolle zeigen die asymmetrische Distribution der Ströme vor Applikation (A) und die komplette Aufhebung der Zellmembranpolarität nach Exposition mit der Substanz (C). Im Verlaufsprotokoll (B) ist der Stromanstieg nach Applikation sowie die Verschiebung der Basislinie (↕) gezeigt. Die fette gestrichelte Linie zeigt den Level der Basislinie vor, die schmale gestrichelte Linie nach Applikation von Gramicidin A.

↓44

Tabelle 3.4 Effekte von Gramicidin A auf das elektrophysiologische Verhalten von BTM-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen und Ladungsträgern. Legende: D4 Effekte von Gramicidin A auf das elektrophysiologische Verhalten von BTM-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen und Ladungsträgern. Legende: D0 – Stromdichte unter Kontrollbedingungen; DS – Stromdichte nach Substanzapplikation; Din – zusätzliche (Δ) Einwärtsstromdichte nach Substanzapplikation; Dout – zusätzliche (Δ) Auswärtsstromdichte nach Substanzapplikation; P0 – Umkehrpotential unter Kontrollbedingungen; PS – Umkehrpotential nach Substanzapplikation; n.s. – nicht signifikant.

Konzentration (mol/l)

10-7

10-7

10-6

Ladungsträger

Na+/K+

Cs+

Cs+

Anzahl reagierender Zellen

3

7

6

Durchgeführte Experimente

3

7

6

Rate reagierender Zellen in %

100

100

100

D 0 in pApF -1

4.1 ± 0.8

11.6 ± 3.5

6.3 ± 2.2

D S in pApF -1

36.7 ± 12.5

44.3 ± 6.5

28.4 ± 4.3

Differenz ΔD S – D 0 in pApF -1

32.7 ± 11.8

32.7 ± 3.8

22.1 ± 3.4

p-Wert von Δ(D S – D 0 ), Signifikanz

0.1, n.s.

0.016, *

0.01, **

D In in pApF -1

14.9 ± 5.3

15.2 ± 3.1

11.5 ± 1.9

D Out in pApF -1

17.8 ± 6.5

15.9 ± 2.0

10.6 ± 1.5

p-Wert von D In vs. D Out , Signifikanz

n.s.

n.s.

n.s.

P 0 in mV

-42 ± 5.7

-15.5 ± 8.6

-29.9 ± 9.6

P S in mV

-10.1 ± 1.6

1.0 ± 3.0

-13.5 ± 9.4

ΔP S P 0 in mV

31.9 ± 5.9

16.5 ± 1.8

16.3 ± 7.2

p-Wert von Δ(P S - P 0 ), Signifikanz

0.038, *

0.002, **

0.04, *

3.4.2 Linked-gram-TBDPS

BTM-Zellen zeigten von allen in dieser Arbeit getesteten Substanzen bei linked-gram-TBDPS die stärksten und schnellsten Effekte. Bereits eine Konzentration von 10-14 M war ausreichend, um eine Reaktion der Zellen in Form eines Stromanstiegs hervorzurufen. Bei 10-12 M erfolgte die Zellantwort in kürzester Zeit, bereits 33.3 ± 7.2 s (n = 6) nach Beginn der Applikation kam es zum Anstieg der Membranleitfähigkeit mit einer mittleren Anstiegsrate von 5.0 ± 1.2 pA/s (n=6). Bei dieser Anstiegsgeschwindigkeit waren die Maximalwerte spätestens nach 2 min Expositionszeit erreicht. Der Effekt war so stark ausgeprägt, dass er bei 100% der untersuchten Zellen zum Zelltod führte, der 5-10 min nach Applikationsbeginn auftrat. Ähnlich der Beobachtung bei Gramicidin A verschob auch linked-gram-TBDPS die Basislinie in Richtung negativer Ströme (Abbildung 3.13).

↓45

Bei Na+/K+ als Ladungsträger und einer Konzentration von 10-12 M stieg nach Exposition mit linked-gram-TBDPS die Gesamtstromdichte um Δ 8.6 ± 1.9 pApF-1 (n = 5, p < 0.01), ausgehend vom Kontrollwert von 6.6 ± 3.0 pApF-1 bis zum Maximum von 15.2 ± 4.4 pApF-1, das 230% der Kontrollstromdichte entspricht. Eine Asymmetrie zwischen Einwärts- und Auswärtsströmen konnte nicht festgestellt werden. Das Umkehrpotential erfuhr eine Verschiebung um ∆+11.4 ± 4.0 mV (n = 5, p < 0.05), von initial -24.8 ± 6.8 mV auf -13.4 ± 7.7 mV. Mit Cs+ als Ladungsträger betrug der Anstieg der Gesamtstromdichte Δ 18.4 ± 2.4 pApF-1 (n = 3, p < 0.05). Das Umkehrpotential wurde von - 22.3 ± 4.7 mV auf - 15.7 ± 2.6 mV (n=3) verlagert, aufgrund der kleinen Zellzahl war dieser Unterschied jedoch nicht statistisch signifikant. Bei einer Konzentration von 10-14 M wurden vergleichbare Effekte in einem geringeren Ausmaß beobachtet (Tabelle 3.5).

Abbildung 3.13 Wirkung von linked-gram-TBDPS (1013 Wirkung von linked-gram-TBDPS (10-12 M) auf die Stromantwort einer BTM-Zelle. Abbildungen A und C zeigen den Unterschied im Muster der Stromantwort vor und nach Inkorporation der Substanz auf, in Abbildung B wird die Progression des Stromanstiegs sowie der Verlust der Polarität zwischen Auswärts- und Einwärtsströmen deutlich. Ebenso beachtlich wie der Stromanstieg ist die Verschiebung (≈200mA) der Basislinie (=Stromstärke bei Klemmspannung von -40 mV), welche durch den Pfeil (↕) dargestellt wird.

Tabelle 3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse nach Applikation von linked-gram-TBDPS. Legende: D5 Zusammenfassung der Ergebnisse nach Applikation von linked-gram-TBDPS. Legende: D0 – Stromdichte unter Kontrollbedingungen; DS – Stromdichte nach Substanzapplikation; Din – zusätzliche (Δ) Einwärtsstromdichte nach Substanzapplikation; Dout – zusätzliche (Δ) Auswärtsstromdichte nach Substanzapplikation; P0 – Umkehrpotential unter Kontrollbedingungen; PS – Umkehrpotential nach Substanzapplikation; n.s. – nicht signifikant.

Konzentration (mol/l)

10-14

10-12

10-12

Ladungsträger

Na+/K+

Na+/K+

Cs+

Anzahl reagierender Zellen

7

5

3

Durchgeführte Experimente

7

5

3

Rate reagierender Zellen in %

100

100

100

D 0 in pApF -1

2.1 ± 1.1

6.6 ± 3.0

6.8 ± 3.0

D S in pApF -1

5.7 ± 1.9

15.2 ± 4.4

25.2 ± 4.4

Differenz ΔD S – D 0 in pApF -1

2.8 ± 1.0

8.6 ± 1.9

18.4 ± 2.4

p-Wert von Δ(D S – D 0 ), Signifikanz

0.037, *

0.009, **

0.017, *

D In in pApF -1

0.5 ± 0.2

3.5 ± 0.8

6.1 ± 1.7

D Out in pApF -1

2.3 ± 0.9

5.2 ± 1.2

12.3 ± 1.5

p-Wert von D In vs. D Out , Signifikanz

n.s.

n.s.

n.s.

P 0 in mV

-36.9 ± 7.3

-24.8 ± 6.8

-22.3 ± 4.7

P S in mV

-19.8 ± 6.7

-13.4 ± 7.7

-15.7 ± 2.6

ΔP S P 0 in mV

17.1 ± 4.6

11.4 ± 4.0

6.7 ± 4.2

p-Wert von Δ(P S - P 0 ), Signifikanz

0.02, *

0.046, *

n.s.


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18.10.2006