Diskussion

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In der vorliegenden Arbeit wurden der Einbau und die Eigenschaften der künstlichen Ionenkanäle THF-gram, THF-gram-TBDPS sowie linked-gram-TBDPS in biologischen Membranen lebender Zellen untersucht. Zur Klärung dieser Fragestellung wurde nach extrazellulärer Applikation der genannten Substanzen die Stromantwort boviner Trabekelwerkszellen aufgenommen und mit der physiologischen Antwort verglichen. Weiterhin wurde das elektrophysiologische Verhalten der Zellen nach Applikation von Gramicidin A untersucht, um nach Vergleich mit den untersuchten künstlichen Kanälen Rückschlüsse auf Struktur-Funktions-Beziehungen dieser Strukturen gewinnen zu können. Als Methode wurde bei allen Experimenten der Whole-Cell-Modus der Patch-Clamp-Technik angewandt. In der folgenden Diskussion wird deutlich, dass das gewählte Experimentdesign entscheidende Erkenntnisse zur Beantwortung der Fragestellung brachte.

4.1  Charakterisierung der natürlichen Stromantwort von BTM-Zellen

An kultivierten Zellen des bovinen Trabekelwerks wurden die Ströme nach hyperpolarisierendem und depolarisierendem Spannungsreiz aufgenommen. Die Stromantwort entsprach im Wesentlichen dem bekannten Verhalten von BTM-Zellen (siehe Kapitel 1.4.1) mit einer intensiveren Auswärtsstromkomponente. Für die Polarität der Stromantwort ist zum großen Teil die Expression calciumabhängiger, auswärtsrektifizierender Maxi-K-Kanäle in BTM-Zellen verantwortlich, was in früheren Arbeiten bereits beschrieben wurde (Stumpff et al., 1997; Stumpff & Wiederholt, 2000). Dafür spricht auch der geringere Auswärtsstrom in Kontrollversuchen nach Reduktion der intrazellulären Calciumkonzentration (siehe Abbildung 3.1). Es ist anzunehmen, dass außer den Maxi-K-Kanälen weitere Ionenkanäle an der Stromantwort beteiligt waren. Der Beitrag von Chloridkanälen sowie Natriumkanälen zur Stromantwort der Trabekelwerkszellen wurde früher diskutiert (Wiederholt et al., 2000). Weiterhin könnten kationenselektive Kanäle eine Rolle spielen. Ihre Expression wurde bisher in Trabekelwerkszellen nicht untersucht, es ist jedoch bekannt, dass dieser Kanaltyp in glatten Muskelzellen exprimiert wird (So & Kim, 2003), zu denen Trabekelwerkszellen funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen (Lutjen-Drecoll, 1999). Überraschenderweise war unter cäsiumhaltigen Bedingungen die Polarität der Stromantwort weiterhin erhalten, auch wenn die Cäsiumkonzentrationen von Bad- und Pipettenlösung annähernd gleich waren. Die stärkere Antwort auf Depolarisationsreize wäre durch Ströme durch Chloridkanäle zu erklären, die wegen der Zusammensetzung der Patchlösungen (siehe Tabelle 2.1) nur einwärts möglich waren.

Um die zu untersuchenden Substanzen in der Badlösung applizieren zu können, wurden die Lösungsmittel Methanol und DMSO verwendet. Kontrollversuche unter Verwendung von Methanol und DMSO konnten einen Einfluss der Lösungsmittel auf die zelluläre Stromantwort ausschließen, da diese von der physiologischen nicht zu unterscheiden war. Darüber hinaus zeigten die Kontrollversuche, da die Stromantwort der Zellen auch über längere Zeiträume stabil war und keine oszillatorische Aktivität zeigte.

4.2 Effekte von künstlichen Ionenkanälen auf die Stromantwort von BTM-Zellen

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In dieser Arbeit wird erstmals gezeigt, dass die extrazelluläre Applikation der synthetischen Verbindungen THF-gram, THF-gram-TBDPS und linked-gram-TBDPS eine Veränderung der zellulären Stromantwort bewirkt. Der Einfluss von THF-gram, das einen deutlichen Effekt zeigte, und die etwas schwächer ausgeprägte Wirksamkeit von THF-gram-TBDPS waren mit den physiologischen Zellfunktionen vereinbar und führten nicht zum Zelltod. Hingegen erwies sich linked-gram-TBDPS als eine sehr potente Verbindung, die schon bei sehr geringen Konzentrationen nach kürzester Zeit mit Zelltod einherging. Eine weitere Beobachtung war die Irreversibilität des Einbaus, ein Phänomen, das allen Substanzen gemeinsam war.

4.2.1  THF-gram

Applikation von THF-gram in kultivierten BTM-Zellen bewirkte einen Anstieg der Gesamtstromdichte sowie eine Verlagerung des Umkehrpotentials in positiver Richtung. Es kann angenommen werden, dass die beobachteten Veränderungen auf den Einbau von THF-gram in die Zellmembran zurückzuführen sind. Die zusätzliche Stromdichte war etwa doppelt so hoch wie der Ausgangswert.

Trotz der deutlichen Veränderungen nach Substanzapplikation im Vergleich zur physiologischen Situation war die erreichte Stromantwort mit den Grundfunktionen der Zelle vereinbar. Eine Inkorporation von THF-gram führte im wirksamen Konzentrationsspektrum nicht zum anschließenden Zelltod, wie es z.B. nach Applikation von Gramicidin A der Fall war. Im Vergleich zu Gramicidin A fiel der Anstieg der Stromdichte nach THF-gram moderat aus, was die wahrscheinlichste Erklärung für das Überleben liefert. Diese Beobachtung ist entscheidend für mögliche therapeutische Anwendbarkeit von THF-gram.

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Erste Veränderungen der zellulären Stromantwort waren ab einer THF-gram-Konzentration von 10-8 M zu beobachten und zeigten eine Sättigung bei 10-6 M (Tabelle 3.2). Erstaunlicherweise waren weder die Erhöhung der Stromdichte noch die Verlagerung des Umkehrpotentials proportional zur verwendeten Konzentration, sondern gehorchten vielmehr einem „Alles oder Nichts“-Prinzip. Damit ist die Beobachtung des Ansprechverhaltens von BTM-Zellen auf THF-gram gemeint. Die Zellen zeigten entweder eine Reaktion durch Stromanstieg, welcher nicht proportional zur verwendeten Konzentration war, oder es war keine Änderung des Verhaltens zu beobachten. Eine Konzentrationsabhängigkeit konnte lediglich bei genauerer Analyse des Zeitpunktes vom Effekteintritt festgestellt werden, denn eine Erhöhung der Konzentration führte eindeutig zum schnellerem Einbau der Kanäle in die Zellmembran.

Warum war nur bei 70% der untersuchten Zellen eine Veränderung der Stromantwort zu sehen und warum gehorchte die Stromantwort einem „Alles oder Nichts“-Prinzip ohne Konzentrationsabhängigkeit?

Es ist denkbar, dass THF-gram in lebenden Zellen ein sehr enges Wirkunsspektrum zeigte, dessen Konzentrationsabhängigkeit durch Untersuchung einer Konzentrationreihe mit Zehnerpotenzen nicht aufgedeckt werden konnte. Weiterhin ist es möglich, dass in einigen Zellen die Stromantwort nach Einbau von THF-gram zu schwach war, um eine Differenz zur Kontrolle aufzudecken. Ebenfalls könnten verschiedene Differenzierungsstadien einen Einfluss auf das Zytoskelett und damit die Zellform, die Membranstruktur oder die Beschaffenheit der Glykokalix hatten, was unterschiedliche Bedingungen für den Einbau zur Folge hätte.

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Eine weitere Ursache für das „Alles oder Nichts“-Prinzip ist möglicherweise in der Interaktion zwischen Substanz und Zelle zu suchen. Mit höherer Konzentration in der Badlösung stieg die Wahrscheinlichkeit der Interaktion zwischen Substanzmolekül und Zellmembran pro Zeiteinheit an, folglich war eine raschere Inkorporation möglich. Unter THF-gram war kein Auswascheffekt aufgetreten, die vergrößerte Leitfähigkeit blieb auch erhalten, wenn die Zellen nach der Applikation mit THF-gram-freier Badlösung gespült wurden. Daher ist es nicht auszuschließen, dass sich THF-gram in der Membran anreicherte, bis eine Sättigung erreicht war und somit die Konzentration in der Badlösung eine untergeordnete Rolle spielte.

Es sollte auch berücksichtigt werden, dass THF-gram in Bilayermembranen mehrere Leitfähigkeitsstufen aufwies, also mehr als eine aktive Konformation vorliegen musste (Schrey et al., 2000). Es ist also nicht auszuschließen, dass außer den aktiven weitere, inaktive Konformationen auftraten. Im Fall von Gramicidin A und anderen Peptiden ist durch die vorgegebene Aminosäurensequenz die Anzahl der möglichen Konformationen beschränkt. Molekulare Flexibilität der THF-Moleküle macht bei THF-gram mehrere Konformationen wahrscheinlich. Inaktive Formen würden sowohl zur Erklärung der reduzierten Responderrate als auch zum „Alles oder Nichts“-Prinzip beitragen.

Bemerkenswert war die Verschiebung des Umkehrpotentials in Richtung positiver Werte nach Applikation von THF-gram. Diese Verlagerung war deutlich, dennoch blieb das Ruhemembranpotential der Zellen weit unter 0 mV. In Bilayermembranen war die Leitfähigkeit von THF-gram größer für Kalium- als für Natriumionen, daher hätte man annehmen können, dass sich das Ruhemembranpotential in negativer Richtung verschieben würde. Es sollte jedoch beachtet werden, dass im Ruhezustand einer Zelle bereits Kaliumkanäle geöffnet sind, um das Ruhemembranpotential aufrecht zu erhalten. Die zusätzliche Natriumpermeabilität nach Inkorporation von THF-gram erklärt die Verschiebung des Umkehrpotentials. Wie man anhand der Goldman-Gleichung (Abbildung ) nachvollziehen kann (Hille, 1992), würde dadurch ein neues Gleichgewicht entstehen, das schließlich zur Verlagerung des Umkehrpotentials zu positiven Werten führte.

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Abbildung 4.1: Goldman- Gleichung (vereinfacht)1: Goldman- Gleichung (vereinfacht)

Die Ergebnisse, die hier dargestellt wurden, bestätigen größtenteils die Beobachtungen aus Experimenten in künstlichen Bilayermembranen. Die Untersuchung des Selektivitätsverhaltens zeigte ebenfalls Analogien. Vor allem ist die höhere Cs+-Leitfähigkeit ein wichtiger Hinweis für die Wirkung von THF-gram in Zellen. Unter cäsiumhaltigen Bedingungen konnten nach Applikation von THF-gram deutlich höhere Stromdichten aufgenommen werden als bei Verwendung physiologischer Lösungen. Es kann angenommen werden, dass die Leitfähigkeit von THF-gram in BTM-Zellen höher für Cs+ als für K+ war. Somit ist davon auszugehen, dass die Eigenschaften von THF-gram in Bilayern und Membranen lebender Zellen vergleichbar sind.

Eine Ausnahme war die Polarität der Stromantwort nach Einbau von THF-gram in die Membran, was mit deutlich stärkerer Auswärtsstromkomponente einherging. Diese Polarität wurde in Bilayer-Membranen nicht beobachtet. Die Zellmembran selbst ist im Vergleich zur Bilayermembran ein polares Gebilde, einerseits wegen der extrazellulär lokalisierten Glykokalix, andererseits aufgrund der Membranproteine, welche nur auf einer Seite der Phospholipiddoppelschicht lokalisiert sein können (Vereb et al., 2003). Die Polarität der Membran könnte zur asymmetrischen Ausrichtung des THF-gram-Moleküls führen, das seinerseits asymmetrisch ist. Andererseits könnte die Polarität des Moleküls selbst zur asymmetrischen Stromantwort führen, da der THF-Anteil des Moleküls über einen anderen Mechanismus für Ioneneintritt als der Gramicidin-Anteil verfügt. In Lipidbilayern ist eher ein randomisierter Einbau wahrscheinlich, der die Asymmetrie aufheben würde.

4.2.2 THF-gram-TBDPS

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Analog zu THF-gram bewirkte die Applikation von THF-gram-TBDPS eine Veränderung der Stromantwort von BTM-Zellen in Form eine erhöhten Stromdichte und einer Verlagerung des Ruhemembranpotentials zu positiveren Werten. Bei THF-gram-TBDPS kann ebenso angenommen werden, dass die beobachteten Veränderungen auf Kanaleinbau zurückzuführen sind. Grundlegende, aus den observierten Ergebnissen resultierende Schlussfolgerungen und Überlegungen zum Einbau und zur Wirksamkeit der Verbindung wurden bereits bei THF-gram diskutiert, und ihre Gültigkeit ist ebenfalls für THF-gram-TBDPS wahrscheinlich. Einer weitergehenden Diskussion bedürfen jedoch einige Unterschiede zwischen den beiden Verbindungen.

Die Wirksamkeit von THF-gram-TBDPS in BTM-Zellen war deutlich geringer als unter THF-gram, was nicht durch schwächer ausgeprägten Stromdichteanstieg oder geringere Verlagerung des Umkehrpotentials deutlich wurde; der Einfluss auf diese beiden Größen war mit der Wirkung von THF-gram vergleichbar. Entscheidend waren zwei weitere Beobachtungen. Einerseits zeigte bei THF-gram-TBDPS mit ca. 30% ein deutlich geringerer Anteil der untersuchten BTM-Zellen eine Reaktion nach Substanzexposition, dabei gehorchte die Reaktion auch in diesem Fall dem „Alles oder Nichts“-Prinzip. Andererseits waren erste Veränderungen der Stromantwort mit einer größeren zeitlichen Verzögerung zu beobachten, als es bei THF-gram der Fall war.

Eine Konzentrationsabhängigkeit innerhalb der gewählten Testkonzentrationen konnte bei THF-gram-TBDPS nicht beobachtet werden. Die Löslichkeit der Substanz in DMSO oder Methanol erlaubte eine maximale verwendbare Konzentration von 10-6 M. Bei höheren Konzentrationen hätte der Anteil des verwendeten Lösungsmittels in der Lösung 0.5 % Vol./Vol. überschritten, und die Experimente wären damit nicht verwertbar gewesen. Da jedoch signifikante Effekte erst bei 10-7 M beobachtet wurden, war der untersuchte Konzentrationsbereich von einer Zehnerpotenz zu gering, um daraus eine Abhängigkeit herleiten zu können.

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Der Vergleich von Effekten in Bilayern und Zellen erfordert besondere Beachtung. Die Einzelkanalleitfähigkeit von THF-gram-TBDPS war in Bilayer-Membranen geringer ausgeprägt als bei THF-gram (Schrey et al., 2000), in BTM-Zellen waren aber die Veränderungen der Gesamtstromdichte nach Applikation von THF-gram bzw. THF-gram-TBDPS nicht zu unterscheiden. Allerdings zeigte sich bei THF-gram-TBDPS eine geringere Ansprechrate und späterer Effekteintritt.

Wie sind diese unterschiedlichen Beobachtungen miteinander zu vereinbaren?

Bezüglich der Polarität des Stromdichteanstieges zeigte sich bei THF-gram-TBDPS eine Tendenz zu stärkeren Auswärtsströmen, die jedoch im Gegensatz zu THF-gram nicht signifikant war. Es ist möglich, dass die TBDPS-Schutzgruppen die Polarität der Verbindung bzw. ihrer Ausrichtung in der Membran verhindern oder einschränken. Somit wäre die Flexibilität des Moleküls durch Fixierung der Verbindung in der Membran eingeschränkt. Eine derartige Fixierung hätte zusätzlich eine Behinderung der Übergänge zwischen aktiven und nicht aktiven Konformationen zur Folge, was auch die schwächere Wirkung der Substanz erklären würde.

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Bezüglich der Selektivität konnte bei THF-gram-TBDPS kein signifikanter Unterschied zwischen Na+/K+ und Cs+ festgestellt werden, auch wenn eine Tendenz zu stärkerer Cs+-Leitfähigkeit zu beobachten war. Die Tendenz ist ein Hinweis darauf, dass THF-gram-TBDPS in biologischen Membranen Selektivitätsverhalten der Eisenmanreihe I zeigt. Eine größere Anzahl untersuchter Zellen pro Experimentserie hätte diese Frage beantworten können, war aber aufgrund der beschränkten Verfügbarkeit der zu untersuchenden Substanz nicht durchführbar.

Die wahrscheinlichste Antwort ist im strukturellen Unterschied zwischen THF-gram und THF-gram-TBDPS, also erneut bei den TBDPS-Schutzgruppen zu suchen. TBDPS-Schutzgruppen sind hydrophobe Moleküle. Somit könnte die Interaktion des Moleküls mit den hydrophilen Phospholipidköpfen der Zellmembran erschwert sein, was zum langsameren Einbau bzw. schwächerer Zellantwort führen würde. Diese Hypothese wird durch Ergebnisse aus Inkubationsexperimenten mit THF-gram-TBDPS unterstützt. Die Behinderung des Einbaus durch TBDPS würde den Anstieg der Ansprechrate nach Inkubation von 30% auf über 80 % erklären, da in dem Fall die längere Expositionszeit die erschwerten Einbaubedingungen kompensierte. Interessanterweise hatte die Inkubation keinen Einfluss auf das Ausmaß der Stromdichte, ihr Anstieg war von „akuten“ Experimenten nicht zu unterscheiden. Die letzte Beobachtung wäre im Einklang mit den bisherigen Überlegungen zur Konzentrationsabhängigkeit, da sowohl akut als auch nach Inkubation das „Alles oder Nichts“ Prinzip zu gelten schien.

Darüber hinaus könnte das hydrophobe Verhalten von TBDPS in wässrigen Lösungen einen Einfluss auf die Löslichkeit und das Verhalten des untersuchten Moleküls in der Lösung haben. Schließlich kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Schutzgruppen durch Wechselwirkung mit den übrigen Bausteinen innerhalb des THF-gram-TBDPS-Moleküls Einfluss auf die Raumstruktur der Verbindung ausübten und somit die Ausbildung zusätzlicher, inaktiver Konformationen begünstigten.

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Die erfolgreiche Inkubation von THF-gram-TBDPS lässt nicht nur Mutmaßungen über das molekulare Verhalten der Substanz zu, sondern ist auch eine wichtige Beobachtung für potentielle therapeutische Anwendbarkeit. Dass die Zellen nicht nur nach einer kurzzeitigen, sondern auch nach längerer, 1-2 stündiger Exposition am Leben blieben, ist dabei der wichtigste Faktor. Zum Vergleich führte eine Applikation von Gramicidin A in vergleichbaren Konzentrationen bereits nach 5-10 min zum Zelltod. Daher ist davon auszugehen, dass trotz des Einflusses auf elektrophysiologische Eigenschaften der Einbau von THF-gram-TBDPS mit der biologischen Funktion einer BTM-Zelle auch über längere Zeit vereinbar wäre.

Experimente mit Gd3+ als Inhibitor der Kanalaktivität von THF-gram-TBDPS konnten nicht als Bestätigung verwendet werden, dass die beobachteten Veränderungen auf den synthetischen Kanal zurückzuführen waren. Da Gd3+ auch dafür bekannt ist, natürlich exprimierte Kationenkanäle zu inhibieren (Popp et al., 1993), konnten die beobachteten Effekte nicht als spezifisch für THF-gram-TBDPS betrachtet werden.Lediglich das Ausmaß der Inhibition würde dafür sprechen, dass ein großer Teil der Stromreduktion auf die Wirkung von Gd3+ auf aktive THF-gram-TBDPS-Kanäle zurückzuführen war, denn die Ströme wurden nach Anstieg durch Gd3+ annähernd auf das Ausgangsniveau reduziert.

4.2.3 Linked-gram-TBDPS

Die extrazelluläre Exposition von BTM-Zellen mit linked-gram-TBDPS hatte Effekte zur Folge, die in ihrem Ausmaß die Wirkung aller bis dahin getesteten Substanzen, inklusive Gramicidin A, übertrafen. Bereits bei einer Konzentration von 10-14 M bewirkte die Applikation einen Anstieg der beobachteten Ströme. Bei dieser Konzentration wurden auch in Bilayern erste Effekte beobachtet (Arndt et al., 2001). Damit scheint linked-gram-TBDPS ein sehr hohe biologische Wirksamkeit aufzuweisen.

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Erstaunlich war nicht nur die Stärke der Stromantwort, die bei 10-12 M im Ausmaß des Stromdichteanstiegs der Wirkung von Gramicidin A bei 10-8 M entsprach, womit linked-gram-TBDPS weitaus effektiver als THF-gram oder THF-gram-TBDPS war. Bereits bei Gramicidin A wurde im Vergleich zu THF-gram-Hybriden ein rascher Wirkungseintritt und eine hohe Geschwindigkeit des Leitfähigkeitanstiegs auf Maximalwerte beobachtet. Die Applikation von linked-gram-TBDPS übertraf die Effekte von Gramicidin A deutlich, insbesondere was die Reaktionszeit betraf (Abbildung 4.1). Aus dieser Beobachtung ist die Schlussfolgerung möglich, dass auch in biologischen Membranen der rasche Wirkungseintritt durch Stabilisierung des Kanals aus zwei kovalent verbundenen Monomeren erfolgt. Die hohe Geschwindigkeit des Leitfähigkeitanstiegs erklärt sich aus der Permanenz der Kanalaktivität, die auch in Einzelkanalmessungen beobachtet wurde. Nach Membraneinbau war aufgrund des Linkers eine Dissoziation der Peptidbausteine nicht möglich. Die Kanäle folgten somit nicht dem üblichen Prinzip von Öffnung und Schließung, sondern sie blieben dauerhaft offen, was den fast sofortigen Anstieg des Stroms auf den Maximalwert zur Folge hatte. Der einzige limitierende Faktor war die Sättigung der Zellmembran mit Substanzmolekülen. Die Effektivität von linked-gram-TBDPS in BTM-Zellen ist ein weiterer Hinweis für die Bedeutung der Dimerbildung für Kanalfunktion von Gramicidin A, die ausführlich in früheren Arbeiten beschrieben wurde (Urry et al., 1971; Wallace, 1998; Wallace, 2000).

Abbildung 4.2: Vergleich der Reaktionszeiten von BTM-Zellen für den ersten Stromanstieg nach Substanzapplikation. Eindeutig ist der rasche Effekteintritt bei linked-gram-TBDPS (=linked-gA) (gA=Gramicidin A).2: Vergleich der Reaktionszeiten von BTM-Zellen für den ersten Stromanstieg nach Substanzapplikation. Eindeutig ist der rasche Effekteintritt bei linked-gram-TBDPS (=linked-gA) (gA=Gramicidin A).


Die Wirksamkeit der Substanz erklärt auch die sehr kurzen Überlebenszeiten der BTM-Zellen nach Applikation von linked-gram-TBDPS. Bei der maximal erreichten Leitfähigkeit konnte die Funktion der Zelle nicht aufrechterhalten werden, da die erreichte Membranpermeabilität eine Aufrechterhaltung der physiologischen Ionenkonzentrationen in der Zelle unmöglich machte und zum osmotisch bedingten Zelltod führte.

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Eine interessante Überlegung ergibt sich der beobachteten Stromantwort von linked-gram-TBDPS, die trotz ihrer Intensität in beiden Richtungen eine leichte, nicht signifikante Tendenz zu stärkeren Auswärtsströmen zeigte (siehe Tabelle 3.5). Seitens der Struktur der untersuchten Verbindung war keine Polarität zu erwarten, denn die kovalente Bindung ergab eine symmetrische Struktur. Die leichte Auswärtstendenz könnte durch den Einfluss von TBDPS-Schutzgruppen erklärt werden, durch die eine asymmetrische Inkorporation der Verbindung in der Zellmembran denkbar wäre. Diesbezüglich wurden auch ähnliche Beobachtungen und Überlegungen für THF-gram-TBDPS gemacht.

Der potentielle negative Einfluss von TBDPS-Gruppen auf die Wirksamkeit, wie bei THF-gram-TBDPS diskutiert wurde, wird durch die Ergebnisse von linked-gram-TBDPS relativiert. Im letzteren Fall war trotz Schutzgruppen sehr hohe Kanalaktivität vorhanden. Möglich ist jedoch, dass die negativen Effekte der Schutzgruppen durch den immensen Einfluss des Linkers überlagert waren.

Bezüglich des Selektivitätsverhaltens konnte die kovalente Dimerverbindung offensichtlich die Eigenschaften von Gramicidin A konservieren, da mit Cs+-haltigen Lösungen eine signifikante Erhöhung der Stromdichte erreicht wurde. Dieser Befund war im Einklang mit Bilayer-Beobachtungen. Eine Erhaltung der Selektivitätseigenschaften von Gramicidin A war zu erwarten, da durch die Modifikation die eigentliche Struktur von Gramicidin A, insbesondere die porenbildende Region von Carboxylgruppen im Inneren der Helix, nicht verändert wurde.

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Welche Schlüsse sind aus den vorliegenden Befunden für mögliche Konformationen der Verbindung in biologischen Zellen zu ziehen?

Die Ansprechrate von 100% und die Wirksamkeit der Verbindung könnten darauf hinweisen, dass alle Membrankonformationen von linked-gram-TBDPS dauerhaft aktiv sind bzw. dass nur eine, dauerhaft aktive Konformation existiert. Das Gramicidinmolekül kommt in zwei Konformationen vor, die sich jeweils aus der unterschiedlichen Anordnung der β-Helix Monomere zueinander ergeben (siehe Kapitel 1.2). Weitere Konformationen sind nicht bekannt. Da bei linked-gram-TBDPS die Flexibilität durch die kovalente Bindung aufgehoben war, ist demnach die Existenz von einer, der Gramicidin HD-Konformation äquivalenten Raumanordnung am wahrscheinlichsten.

4.3 Schlussfolgerungen und Ausblick

In der vorliegenden Arbeit wird zum ersten Mal die Implantation synthetischer THF-gram-Hybride sowie eines kovalent verbundenen Gramicidindimers in lebende Zellen beschrieben. Es ist somit der erste erfolgreiche Versuch, synthetische Kanäle in einem dynamischen biologischen System zu untersuchen. Bisher wurden künstliche Kanäle nur in synthetischen Membranen untersucht, die Untersuchung von Ionentransport in lebenden Zellen bezog sich hingegen auf natürlich exprimierte Kanalformen. Mit der Trennung beider Bereiche wurde die Komplexität umgangen, die durch Überlagerung von Effekten natürlicher Kanäle und der zu untersuchenden Substanzen entstand, was auch bei dieser Arbeit einen limitierenden Faktor für die Datenauswertung und Interpretation darstellte. Es ist anzunehmen, dass genau aus diesem Grund Untersuchungen künstlicher Kanäle in biologischen Systemen bisher so wenig Beachtung fanden. Derartige Experimente sind jedoch essentiell, damit künstliche Kanäle nicht nur als Werkzeug zum besseren Verständnis von molekularer Struktur und Funktion natürlicher Kanäle verwendet werden, sondern auch um sie auch als potentielle therapeutische Wirkstoffe zu betrachten.

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Zwei kürzlich erschienene Arbeiten, welche zu Beginn dieser Arbeit noch nicht veröffentlicht waren, beschreiben ebenfalls die Untersuchung künstlicher Kanalstrukturen in lebenden Zellen (Banghart et al., 2004; Leevy et al., 2004). Das wissenschaftliche und therapeutische Potential künstlicher Ionenkanäle lässt es als wahrscheinlich erscheinen, dass mit den genannten Publikationen erst der Beginn der intensiven wissenschaftlichen Auseinandersetzung markiert wird und weitere Resultate folgen werden. Auch im Bereich nativer Kanäle und Untersuchung ihrer Struktur wurden in den letzten Jahren weite Fortschritte erreicht. Die wissenschaftliche Nähe beider Gebiete könnte eine fördernde Wirkung für wissenschaftlichen Austausch und das Entstehen neuer Ideen haben.

Die geringe Zahl von Vergleichsmöglichkeiten mit anderen Arbeitsgruppen und Publikationen ist ein Nachteil für die vorliegende Diskussion. Beobachtungen aus Bilayern können nur bedingt zum Vergleich herangezogen werden. Daher sind einige Schlussfolgerungen, insbesondere zu möglichen Struktur-Funktionsbeziehungen, als spekulativ zu betrachten. Sie bedürfen weiterer, praktischer Überprüfung, was jedoch nicht Gegenstand dieser Arbeit sein soll.

4.3.1  Mögliche Anwendung und Weiterentwicklung untersuchter Substanzen

Unter praktischen Gesichtspunkten repräsentieren die aus dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eine wichtige Basis für die Anwendung von THF-gram-Hybriden. Es ist jedoch eine Reihe weiterer Studien notwendig, die sowohl die Weiterentwicklung künstlicher Kanäle mit spezifischen Eigenschaften als auch die Klärung der praktischen Umsetzbarkeit zum Ziel haben. Eine der Anwendungsmöglichkeiten ist der therapeutische Einsatz zum Ersatz fehlender natürlicher Kanalfunktion, was mehrere Anforderungen an die Eigenschaften der synthetischen Kanäle stellt. Als Grundvoraussetzung gilt, dass die Stromantwort nach Membraneinbau mit dem Überleben der Zelle vereinbar sein muss. Ansonsten würde ein derartiger Kanal durch Zerstörung der Zelle seine Zielsetzung, die Modifikation der Zellfunktion, verfehlen. Mit ihrer relativ schwachen Wirkung aufgrund inaktiver Konformationen und erschwertem Membraneinbau erfüllen THF-gram-Hybride diese Voraussetzung. Bei der Experimentdurchführung waren diese Eigenschaften von Nachteil, da sie mit einer geringen Ansprechrate einhergingen und die Untersuchungsbedingungen erschwerten. Unter dem Gesichtspunkt der praktischen Anwendung sind diese Eigenschaften jedoch eine gute Möglichkeit zur Kontrolle der Wirkungsstärke, insebesondere weil eine 100%-ige Einbaurate das physiologische Gleichgewicht stören und somit zum Zelltod führen könnte.

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Um optimale Kontrolle zu gewährleisten, wäre die Entwicklung einer Steuerung wünschenswert, welche den Kanal in offenen oder geschlossenen Zustand überführen kann. Die Übergänge zwischen aktiven und nicht aktiven Konformationen könnten durch einen „Schaltermechanismus“ kontrolliert werden, der z.B. mit Laserlicht bestimmter Wellenlänge betätigt werden könnte. Derartige Mechanismen wurden bereits für Gramicidin entwickelt (Borisenko et al., 2000; Lougheed et al., 2004) und könnten in angepasster Form auch bei THF-gram-Hybriden ihre Wirkung entfalten. Ein weiterer Vorteil eines solchen Schalters wäre die zielgerichtete Aktivierung der Kanäle im gewünschten Gewebe, ohne dass sich die Wirkung im umgebenden oder gar funktionell antagonistischen Gewebe entfalten würde. Zwar würden auch in diesem Geweben Kanäle eingebaut, aber durch fehlende Aktivierung wären diese funktionslos.

Aus den Überlegungen zur Kontrolle der Aktivität ergibt sich eine weitere praxisrelevante Frage, die auch unter dem Begriff des „targeting“ bekannt ist: wie erreicht ein Kanal das gewünschte Zielgewebe, in dem er seine Wirkung entfalten soll? Der Ansatz des Schaltermechanismus mit Aktivierung über Laserlicht ist nur dann anwendbar, wenn das Zielgewebe von außen erreicht werden kann. Bei anderen Geweben wäre dieser Ansatz nicht durchführbar. In der Onkologie werden aktuell Ansätze zur Kopplung therapeutischer Wirkstoffe an gegen das Zielgewebe gerichtete Antikörper geprüft (Henry et al., 2004; Safavy et al., 2004). Dieser Ansatz könnte auch bei der Anwendung von THF-gram-Hybriden von Bedeutung sein, er bedürfte jedoch weiterer Überprüfung.

Die Irreversibilität des Membraneinbaus sowie das schmale wirksame Konzentrationsspektrum bei THF-gram-Hybriden sind weitere Nachteile für die Kontrolle der Kanalaktivität. Der fehlenden Auswaschbarkeit von THF-gram-Hybriden steht zwar ihre moderate Wirkung gegenüber. Aus einer aktuellen Arbeit wird jedoch deutlich, dass Reversibilität des Einbaus ein wichtiges Werkzeug zur Steuerung der Effekte darstellen kann (Leevy et al., 2004).

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Außer der Kontrolle ist die Erfüllung spezifischer Eigenschaften bezüglich Selektivität und Leitfähigkeit entscheidend für therapeutische Anwendung. Als anschauliches Beispiel sei beim Glaukom das Trabekelwerk aufgeführt, bei dem zur Verbesserung des Kammerwasserabflusses ein kaliumselektiver Kanal notwendig wäre (siehe auch 4.3.2). Im Gegenteil dazu würde bei zystischer Fibrose in den betroffenen Epithelien ein derartiger Kanal keinen therapeutischen Beitrag leisten, ein PKA gesteuerter, chloridselektiver Kanal wäre notwendig. Auch bei der Leitfähigkeit sollte der künstliche Kanal in der induzierten Stromstärke ähnliche Eigenschaften wie der fehlende oder funktionslose Kanal haben. Daher muss die Ausbildung selektiver Eigenschaften und die Untersuchung der Leitfähigkeiten einen wichtigen Fokus der Weiterentwicklung von THF-Hybriden darstellen.

Einen Vorteil gegenüber nativen Strukturen bieten THF-gram-Hybride durch ihren einfachen Aufbau. Mit der Möglichkeit zur Synthese struktureller Kanalvarianten kann Einfluss auf die funktionellen Eigenschaften genommen werden. Die Arbeitsgruppe um Prof. Koert konnte die Umsetzbarkeit solcher Modifikationen zeigen; somit ist mit THF-gram-Hybriden das Potential zur raschen Entwicklung von geeigneten Kanälen zur praktischen Anwendung gegeben.

Eine besondere Möglichkeit zur therapeutischen Anwendung bietet sich für linked-gram-TBDPS. Für einen Einsatz als Antibiotikum ist die hohe Wirksamkeit der Substanz durchaus wünschenswert. Die Idee der antibiotischen und onkologischen Anwendung potenter synthetischer Ionenkanäle wird auch von anderen Arbeitsgruppen verfolgt (Panchal et al., 2002). Gramicidin wird im begrenzten Umfang in antimykotischen Kombinationspräparaten zur topischen Anwendung gegen lokale Pilzinfektionen verwendet (Hancock, 2001). Daher wäre es sinnvoll, auch linked-gram-TBDPS auf antibiotische oder antimykotische Wirksamkeit hin zu untersuchen.

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Außer der Möglichkeit der klinischen Anwendung leisten künstliche Ionenkanäle einen Beitrag zum Verständnis der Kanalfunktion. Mit dem Ersatz von Aminosäuren durch synthetische Bausteine, wie z.B. bei THF-gram, lässt sich die Funktion und die Struktur der Basissubstanz sowie der eingesetzten Bausteine besser verstehen. Durch Kombination röntgenkristallographischer Untersuchungen mit Experimenten in biologischen Milieus könnten zusätzliche wichtige Informationen über die Struktur und ihre Interaktionen mit biologischen Membranen gewonnen werden.

Als letztes sei die Anwendung künstlicher Ionenkanäle für neue Biotechnologien genannt. Ein Beispiel ist die Anwendung von Gramicidin als Nanosensoren in elektronischen Schaltkreisen (Cornell et al., 1997; Cornell et al., 1999). Im Vergleich zu Gramicidin könnten Nanosensoren mit THF-gram-Hybriden eine viel höhere Sensibilität aufweisen, wenn sie nur auf bestimmte Reagenzien, z.B. Kaliumionen, reagieren würden.

4.3.2 Pathophysiologische Bedeutung von THF-Gramicidin-Hybriden für das Trabekelwerk

Wie lassen sich THF-gram-Hybride im Fall von Glaukom und Trabekelwerk zur therapeutischen Anwendung umsetzen und welche Eigenschaften von Kanälen wären dazu notwendig?

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Ein wichtiges Therapieziel beim Glaukom ist die Senkung des Augeninnendruckes, da auf diese Weise das Risiko von Schäden am Nervus opticus gesenkt wird. Eine Senkung des Augeninnendruckes mittels Relaxation des Trabekelwerkes wäre durch Hyperpolarisation des Gewebes zu erreichen (siehe Kapitel 1.4.1). In solchem Fall würde die Aktivität spannungsabhängiger Calciumkanäle gesenkt werden, was zur abgeschwächten Kontraktilität des Gewebes führen würde. Physiologisch wird diese Aufgabe von Maxi-K-Kanälen übernommen, welche das Membranpotential unterhalb der Aktivierungsschwelle von Calciumkanälen aufrechterhalten. Mit dem Membraneinbau eines künstlichen Kanals mit ähnlichen Eigenschaften wie denen des Maxi-K-Kanals wäre eine negative Verschiebung des Ruhemembranpotentials und somit eine Senkung des Augeninnendruckes zu erwarten, womit das gewünschte Ziel erreicht wäre.

In Bilayerexperimenten zeigten sowohl THF-gram als auch THF-gram-TBDPS eine leichte Präferenz für Kalium- gegenüber Natriumionen. Leider erlaubte die geringe K+-Selektivität keine Hyperpolarisation der Zelle. Die gestiegene Natriumleitfähigkeit in BTM-Zellen durch Einbau des Kanals führte sogar zum entgegengesetzten Effekt. Daher sollte ein Ziel der Weiterentwicklung von THF-gram-Hybriden eine Erhöhung der K+-Selektivität sein. Im optimalen Fall sollte diese 2-4 Zehnerpotenzen höher als die Na+-Selektivität sein.

Die Auswirkung von THF-gram auf das Ruhemembranpotential ist von entscheidender Bedeutung für die Zellfunktion von BTM-Zellen. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass Calciumkanäle vom L-Typ eine entscheidende Rolle für die Kontraktilität von Trabekelwerkszellen spielen (Steinhausen et al., 2000). Weiterhin ist bekannt, dass in glatten Muskelzellen der Subtyp Ca V 1.2 des L-Typ Calciumkanals für Kontraktionsvorgänge verantwortlich ist (Diebold et al., 1992; Takimoto et al., 1997; Welling et al., 1997). Es ist anzunehmen, dass Ca V 1.2 auch im Trabekelwerk funktionell exprimiert wird. Dieser Subtyp wird bei einer Depolarisation auf -30 mV aktiviert. Die THF-gram-bedingte Potentialverlagerung brachte das Umkehrpotential genau in den Bereich der Aktivierungsschwelle von L-Typ Kanälen. Damit wäre eine verstärkte Kontraktilität von Trabekelwerkszellen zu erwarten, ohne dass die Grundfunktionen der Zelle durch zu starke Angleichung des Potentials an 0 mV beeinträchtigt wären. Die Untersuchung des Trabekelwerkes am Kontraktionsstand, die eine etablierte Methode zur funktionellen Betrachtung darstellt (Lepple-Wienhues et al., 1991), könnte in Zukunft Antworten auf diese Frage liefern.

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Ein Problem bei der praktischen Anwendung ist das bereits besprochene „targeting“. Sowohl die Idee des Antikörperkonjugats als auch des Schaltermechanismus wären im Fall des Trabekelwerkes zu diskutieren. Das Gewebe ist von extern gut erreichbar, was therapeutisch in Form von Augentropfen genutzt wird (Pfeiffer, 2001)(Pfeiffer, 2001). Die Anwendung des lichtgesteuerten Schalters wäre somit denkbar (siehe 4.3.1), die Aktivierung der Kanäle könnte z.B. durch eine Laserbehandlung erfolgen.

Bei möglichen Langzeiteffekten des Kanaleinbaus sollte berücksichtigt werden, dass veränderte elektrophysiologische Membraneigenschaften Kompensationsmechanismen aktivieren können. Solche Phänomene sind bei Membranproteinen bekannt, z.B. kommt es bei Therapie des Bluthochdrucks zur veränderten Expression der NO-Synthase (Li et al, 2002)(Li et al, 2002). Im Fall des Trabekelwerks wäre z.B. eine verminderte Expression von Maxi-K-Kanälen denkbar.

Eine therapeutische Anwendung von linked-gram-TBDPS beim Glaukom erscheint wegen seiner toxischen Potenz unwahrscheinlich. Es bleibt die Frage, inwiefern die Substanz bei anderen ophthalmologischen Erkrankungen, insbesondere bei Infektionskrankheiten, von Nutzen wäre.


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18.10.2006