Aus dem Institut für Klinische Physiologie der Medizinischen Fakultät der Charité -Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Elektrophysiologische Charakterisierung künstlicher Ionenkanäle in lebenden Zellen

zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von Pawel Fidzinski
aus Breslau

Dekan: Prof. Dr. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. O. Strauß
2. Prof. Dr. R. Grantyn
3. Priv. Doz. Dr. F. Kirchhoff

eingereicht: 03. Juni 2005

Datum der Promotion: 20. März 2006

Abstract (deutsch)

Durch Ausübung physiologischer Grundfunktionen spielen Ionenkanäle eine entscheidende Rolle für die reguläre Funktion von Zellen. Zum besseren Verständnis ihrer Struktur und Funktion sind Untersuchungen natürlicher und künstlicher Ionenkanäle wichtige Werkzeuge. Großes analytisches und therapeutisches Potential ist in der Untersuchung künstlicher Kanäle in lebenden Zellen vorhanden, was bisher wenig Beachtung fand. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung der künstlichen Ionenkanäle THF-gram, THF-gram-TBDPS sowie linked-gram-TBDPS auf elektrophysiologische Eigenschaften boviner Trabekelwerkszellen des Auges anhand von Patch-Clamp-Untersuchungen im Whole-Cell-Modus analysiert. Die Untersuchung brachte folgende Erkenntnisse: 1. Die Inkorporation aller drei Verbindungen war erfolgreich, was sich durch Anstieg der Stromdichte und Verschiebung des Umkehrpotentials zeigte. 2. Einbau von THF-gram und THF-gram-TBDPS war mit dem Überleben der Zellen vereinbar, während linked-gram-TBDPS aufgrund einer sehr potenten Antwort bereits bei sehr geringen Konzentrationen zum raschen Zelltod führte. 3. Eine Asymmetrie der Stromantwort zugunsten stärkerer Auswärtsströme wurde bei THF-gram und in schwächerer Ausprägung bei THF-gram-TBDPS festgestellt. Linked-gram-TBDPS zeigte keine derartige Asymmetrie. 4. Unter Verwendung von Cs+ als Ladungsträger war der beobachtete Anstieg der Stromdichte bei allen drei Verbindungen eindeutig stärker als unter physiologischen Bedingungen (Na+/K+). 5. Die dargestellten Erkenntnisse sind ein erster Schritt zur therapeutischen Anwendung von künstlichen Ionenkanälen. Eine Weiterentwicklung in Richtung höherer Selektivität und besserer Kontrolle ist jedoch genauso erforderlich wie die Klärung der klinischen Umsetzbarkeit.

Eigene Schlagworte: künstliche Ionenkanäle, Patch-Clamp-Technik, Gramicidin A, Trabekelwerk des Auges

Abstract (english)

Ion channels play a pivotal role for regular cell function. To better understand their structure and function, investigation of both natural and artificial ion channels is being performed to date. Investigation of artificial channels in living cells hides a big potential, however, little attention has been paid to this field so far. In this work, the effect of the artificial ion channels THF-gram, THF-gram-TBDPS and linked-gram-TBDPS on electrophysiological properties of bovine trabecular meshwork cells was investigated with the patch-clamp-technique. Following results were obtained: 1. Incorporation of all three compounds was successful, which was proven by increase of current density and cell depolarisation. 2. The cells survived after incorporation of THF-gram and THF-gram-TBDPS but not after linked-gram-TBDPS, which resulted in cell death at very low concentrations. 3. Larger outward currents were observed with THF-gram and, at a lower extent, with THF-gram-TBDPS. Linked-gram-TBDPS did not show such an asymmetry. 4. With Cs+ as charge carrier all three compunds showed a stronger increase of current density than under physiological conditions (Na+/K+). 5. The decribed results are a first step towards therapeutic application of artificial ion channels, however, further development towards higher selectivity and better control is as necessary as clarification of clinical feasibility.

Keywords: artificial ion channels, patch-clamp-technique, gramicidin A, trabecular meshwork

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung 
  • 1.1  Ionenkanäle 
    • 1.1.1  Historische Grundlagen 
    • 1.1.2 Aktueller Wissensstand über Ionenkanäle 
  • 1.2 Gramicidin A 
  • 1.3 Synthetische Ionenkanäle 
    • 1.3.1  THF-Gramicidin-Hybride und „kovalentes“ Gramicidin 
  • 1.4 Glaukom 
    • 1.4.1  Physiologie des Kammerwassertransportes und des Trabekelwerks 
  • 1.5  Fragestellung und Ziel 
• 2  Methoden 
  • 2.1  Patch-Clamp-Technik
    • 2.1.1  Experimentaufbau 
    • 2.1.2 Praktische Durchführung 
    • 2.1.3 Elektrische Stimulation und Pulsprotokolle 
    • 2.1.4 Statistische Auswertung und Analyse 
  • 2.2 Zellpräparation 
  • 2.3 Substanzen und Lösungen
    • 2.3.1  Zellkultur 
    • 2.3.2 Lösungen für Patch-Clamp-Experimente 
    • 2.3.3 Synthetische Ionenkanäle 
• 3  Ergebnisse 
  • 3.1  Kontrollexperimente 
  • 3.2 THF-gram 
    • 3.2.1  Experimente mit Na⁺/K⁺ als Ladungsträger 
    • 3.2.2 Experimente mit Cs⁺ als Ladungsträger 
    • 3.2.3 Vergleich von Effekten zwischen verwendeten Ladungsträgern 
  • 3.3 THF-gram-TBDPS 
    • 3.3.1  Akute Experimente mit Na⁺/K⁺ als Ladungsträger 
    • 3.3.2 Inkubationsexperimente  
    • 3.3.3 Experimente mit Cs⁺ als Ladungsträger 
  • 3.4 Linked-gram-TBDPS und Gramicidin A 
    • 3.4.1  Gramicidin A 
    • 3.4.2 Linked-gram-TBDPS 
• 4  Diskussion 
  • 4.1  Charakterisierung der natürlichen Stromantwort von BTM-Zellen 
  • 4.2 Effekte von künstlichen Ionenkanälen auf die Stromantwort von BTM-Zellen 
    • 4.2.1  THF-gram 
    • 4.2.2 THF-gram-TBDPS 
    • 4.2.3 Linked-gram-TBDPS 
  • 4.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 
    • 4.3.1  Mögliche Anwendung und Weiterentwicklung untersuchter Substanzen 
    • 4.3.2 Pathophysiologische Bedeutung von THF-Gramicidin-Hybriden für das Trabekelwerk 
• 5  Zusammenfassung 
• Literaturverzeichnis 
• Abkürzungsverzeichnis 
• Danksagung 
• Veröffentlichung von Teilen dieser Arbeit 
• Lebenslauf 
• EidesstaatlicheErklärung 

Tabellen

• Tabelle 2.1 Zusammensetzung der verwendeten Lösungen für Patch-Clamp-Experimente. Alle Angaben bis auf pH in mmol/l.1 Zusammensetzung der verwendeten Lösungen für Patch-Clamp-Experimente. Alle Angaben bis auf pH in mmol/l.
• Tabelle 3.1 Kontrollwerte von BTM-Zellen für verschiedene Lösungen/Ladungsträger, die durch gemessene Ströme von Na1 Kontrollwerte von BTM-Zellen für verschiedene Lösungen/Ladungsträger, die durch gemessene Ströme von Na⁺/K⁺ oder Cs⁺ Ionen repräsentiert waren. Die Werte waren voneinander nicht signifikant unterschiedlich. Die einzige Größe, die einen signifikanten Unterschied zeigte, war das Umkehrpotential (fett markiert).
• Tabelle 3.2 Zusammenfassung der Experimente mit THF-gram für die Konzentrationen 102 Zusammenfassung der Experimente mit THF-gram für die Konzentrationen 10^-7 M and 10^-8 M. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben. Sternchen deuten den Signifikanzlevel an. Folgende Abkürzungen wurden verwendet: D₀ – Stromdichte unter Kontrollbedingungen; D_S – Stromdichte nach Substanzapplikation; D_in – zusätzliche (Δ) Einwärtsstromdichte nach Substanzapplikation; D_out – zusätzliche (Δ) Auswärtsstromdichte nach Substanzapplikation; P₀ – Umkehrpotential unter Kontrollbedingungen; P_S – Umkehrpotential nach Substanzapplikation; n.s. – nicht signifikant.
• Tabelle 3.3 Zusammenfassung aller Experimente mit THF-gram-TBDPS, die nicht im Haupttext besprochen wurden. Abkürzungslegende: D3 Zusammenfassung aller Experimente mit THF-gram-TBDPS, die nicht im Haupttext besprochen wurden. Abkürzungslegende: D₀ – Stromdichte unter Kontrollbedingungen; D_S – Stromdichte nach Substanzapplikation; D_in – zusätzliche (Δ) Einwärtsstromdichte nach Substanzapplikation; D_out – zusätzliche (Δ) Auswärtsstromdichte nach Substanzapplikation; P₀ – Umkehrpotential unter Kontrollbedingungen; P_S – Umkehrpotential nach Substanzapplikation; n.s. – nicht signifikant.
• Tabelle 3.4 Effekte von Gramicidin A auf das elektrophysiologische Verhalten von BTM-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen und Ladungsträgern. Legende: D4 Effekte von Gramicidin A auf das elektrophysiologische Verhalten von BTM-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen und Ladungsträgern. Legende: D₀ – Stromdichte unter Kontrollbedingungen; D_S – Stromdichte nach Substanzapplikation; D_in – zusätzliche (Δ) Einwärtsstromdichte nach Substanzapplikation; D_out – zusätzliche (Δ) Auswärtsstromdichte nach Substanzapplikation; P₀ – Umkehrpotential unter Kontrollbedingungen; P_S – Umkehrpotential nach Substanzapplikation; n.s. – nicht signifikant.
• Tabelle 3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse nach Applikation von linked-gram-TBDPS. Legende: D5 Zusammenfassung der Ergebnisse nach Applikation von linked-gram-TBDPS. Legende: D₀ – Stromdichte unter Kontrollbedingungen; D_S – Stromdichte nach Substanzapplikation; D_in – zusätzliche (Δ) Einwärtsstromdichte nach Substanzapplikation; D_out – zusätzliche (Δ) Auswärtsstromdichte nach Substanzapplikation; P₀ – Umkehrpotential unter Kontrollbedingungen; P_S – Umkehrpotential nach Substanzapplikation; n.s. – nicht signifikant.

Bilder

• Abbildung 1.1 Ein Experiment von Galvani, das zu seiner Zeit großes Aufsehen erregte, war das „Froschschenkelexperiment“. Galvani verband einen offenpräparierten Oberschenkelmuskel mit einem Metalldraht, dessen andere Ende auf dem Dach befestigt war. Während eines Gewitters konnte Galvani Muskelzuckungen beobachten, die laut seinem Bericht im Augenblick des Blitzes auftraten, lange Zeit bevor der Donner gehört werden konnte. Die gezeigte Grafik stammt aus Galvanis Publikation „De Viribus Electricitatis in Motu Musculari Commentarius“ (aus Piccolino, 1998).1 Ein Experiment von Galvani, das zu seiner Zeit großes Aufsehen erregte, war das „Froschschenkelexperiment“. Galvani verband einen offenpräparierten Oberschenkelmuskel mit einem Metalldraht, dessen andere Ende auf dem Dach befestigt war. Während eines Gewitters konnte Galvani Muskelzuckungen beobachten, die laut seinem Bericht im Augenblick des Blitzes auftraten, lange Zeit bevor der Donner gehört werden konnte. Die gezeigte Grafik stammt aus Galvanis Publikation „De Viribus Electricitatis in Motu Musculari Commentarius“ (aus Piccolino, 1998).
• Abbildung 1.2 Schematischer Aufbau eines spannungsabhängigen Kaliumkanals. (A) gibt die Anordnung der α-Untereinheit mit 6 transmembranären Domänen in der Zellmembran wieder. In (B) richten sich vier α-Untereinheiten zu einer Pore aus wobei das Erbindungsstück zwischen S5 und S6 dem Poreninneren zugewandt ist. Zusätzlich können auf der intrazellulären Seite vier β-Untereinheiten an den Kanal gebunden sein (aus Schmidt, 1998)2 Schematischer Aufbau eines spannungsabhängigen Kaliumkanals. (A) gibt die Anordnung der α-Untereinheit mit 6 transmembranären Domänen in der Zellmembran wieder. In (B) richten sich vier α-Untereinheiten zu einer Pore aus wobei das Erbindungsstück zwischen S5 und S6 dem Poreninneren zugewandt ist. Zusätzlich können auf der intrazellulären Seite vier β-Untereinheiten an den Kanal gebunden sein (aus Schmidt, 1998).
• Abbildung 1.3 Aufbau von Gramicidin A (Legende siehe Abkürzungsliste). In der Natur vorkommendes Gramicidin (=Gramicidin D) ist eine Vermischung aus drei Isoformen (Panchal et al., 2002): 80% Gramicidin A, 5% Gramicidin B, das an der Position 11 (fett markiert) Phenylalanin anstelle von Tryptophan trägt, sowie 15% Gramicidin C, dessen Position 11 mit Tyrosin besetzt ist.3 Aufbau von Gramicidin A (Legende siehe Abkürzungsliste). In der Natur vorkommendes Gramicidin (=Gramicidin D) ist eine Vermischung aus drei Isoformen (Panchal et al., 2002): 80% Gramicidin A, 5% Gramicidin B, das an der Position 11 (fett markiert) Phenylalanin anstelle von Tryptophan trägt, sowie 15% Gramicidin C, dessen Position 11 mit Tyrosin besetzt ist.
• Abbildung 1.4: Mögliche Konformationen von Gramicidin. Die Doppelhelix (DH)-Konformation (links) ist für Ionentransfer ungünstiger als die Helixdimer (HD)-Konformation (rechts) (aus Wallace, 1998).4: Mögliche Konformationen von Gramicidin. Die Doppelhelix (DH)-Konformation (links) ist für Ionentransfer ungünstiger als die Helixdimer (HD)-Konformation (rechts) (aus Wallace, 1998).
• Abbildung 1.5 Aufbau der THF-Aminosäure, der THF-Gramicidin-Hybride sowie des Linked-gram-TBDPS (mit freundlicher Genehmigung von Prof. Koert, Universität Marburg).5 Aufbau der THF-Aminosäure, der THF-Gramicidin-Hybride sowie des Linked-gram-TBDPS (mit freundlicher Genehmigung von Prof. Koert, Universität Marburg).
• Abbildung 1.6 Einzelkanalaktivität von THF-gram und THF-gram-TBDPS (jeweils 106 Einzelkanalaktivität von THF-gram und THF-gram-TBDPS (jeweils 10^-8 M) durch Bilayermembranen in 1 molarer KCl-Lösung nach Anlegen einer Spannung von 100 mV (mit freundlicher Genehmigung von Prof. Koert, Universität Marburg).  
• Abbildung 1.7 Einzelkanalaktivität von Gramicidin A (107 Einzelkanalaktivität von Gramicidin A (10^-12 M) und linked-gram-TBDPS (10^-14 M) in Bilayermembranen in 1 molarer KCl-Lösung nach Anlegen einer Spannung von 100 mV (mit freundlicher Genehmigung von Prof. Koert, Universität Marburg). 
• Abbildung 1.8 Anatomie des Auges im schematischen Längsschnitt (A): a) Kornea, b) vordere Augenkammer, c) Iris, d) Linse, e) Ziliarkörper, f) Sklera, g) Choroidea, h) Retina, i) Nervus opticus. Zeichnung (B aus Weinreb & Khaw, 2004) und Kryostatschnitt (C, mit freundlicher Genehmigung der University of California Davis, Sacramento) sollen die genaue Lokalisation des Trabekelwerks und den Kammerwasserfluss (Pfeile) deutlich machen.8 Anatomie des Auges im schematischen Längsschnitt (A): a) Kornea, b) vordere Augenkammer, c) Iris, d) Linse, e) Ziliarkörper, f) Sklera, g) Choroidea, h) Retina, i) Nervus opticus. Zeichnung (B aus Weinreb & Khaw, 2004) und Kryostatschnitt (C, mit freundlicher Genehmigung der University of California Davis, Sacramento) sollen die genaue Lokalisation des Trabekelwerks und den Kammerwasserfluss (Pfeile) deutlich machen.
• Abbildung 2.1 Vereinfachtes Schema des Patch-Clamp-Experimentaufbaus: (1 Vereinfachtes Schema des Patch-Clamp-Experimentaufbaus: (1) Perfusionssystem mit: frischer Badlösung (a), Rollerpumpe (b), zuführendem Schlauch (c), abführendem Schlauch (d), benutzter Badlösung (e), (2) Invertmikroskop mit: Perfusionskammer auf einer beweglichen Metallplatte (a), Lichtquelle (b) und Monitor (c), (3) Mikromanipulatoreinheit mit: Patchpipette und Referenzelektrode (a), Mikromanipulator (b), (4) Patch-Clamp-Verstärker EPC-7, (5) AD/DA-Wandler, (6) Computer mit TIDA-Software zur Datenaufnahme und Analyse, (7) Schlauchsystem für Pipettendruck, (8) schwingungsgedämpfter Tisch, (9) Faradaykäfig (angepasst aus Rosenthal, 2000).
• Abbildung 2.2: Prinzip der Stromantwort auf Testpuls während der Entstehung eines GΩ-Seals und einer Whole-Cell-Konfiguration. Nachdem der Cell-Attached-Modus erreicht bzw. ein GΩ-Seal gebildet ist, fällt die Stromantwort nach einen Spannungspuls wegen des hohen Widerstandes auf < 10 pA, was durch die gestrichelte Linie verdeutlicht wird. Die durchgezogene Linie repräsentiert die Stromantwort nach Erreichen der Whole-Cell-Konfiguration. Nach Ansetzen von Spannung kommt es zu Stromfluss. Die Stromspitzen (●) jeweils am Anfang und Ende des Spannungspulses sind durch kapazitive Ströme aufgrund von Pipetten- und Membrankapazität sowie aufgrund von Verzögerung durch den Zugangswiderstand zu erklären (aus Molleman, 2003).2: Prinzip der Stromantwort auf Testpuls während der Entstehung eines GΩ-Seals und einer Whole-Cell-Konfiguration. Nachdem der Cell-Attached-Modus erreicht bzw. ein GΩ-Seal gebildet ist, fällt die Stromantwort nach einen Spannungspuls wegen des hohen Widerstandes auf < 10 pA, was durch die gestrichelte Linie verdeutlicht wird. Die durchgezogene Linie repräsentiert die Stromantwort nach Erreichen der Whole-Cell-Konfiguration. Nach Ansetzen von Spannung kommt es zu Stromfluss. Die Stromspitzen (●) jeweils am Anfang und Ende des Spannungspulses sind durch kapazitive Ströme aufgrund von Pipetten- und Membrankapazität sowie aufgrund von Verzögerung durch den Zugangswiderstand zu erklären (aus Molleman, 2003).
• Abbildung 2.3: Konfigurationen der Patch-Clamp-Technik. Nach Ausbilden des Cell-Attached-Modus gelangt man durch Ansetzen von Unterdruck bzw. Zug an der Pipette zu den gewünschten Konfigurationen (aus Corey & Stevens, 2004).3: Konfigurationen der Patch-Clamp-Technik. Nach Ausbilden des Cell-Attached-Modus gelangt man durch Ansetzen von Unterdruck bzw. Zug an der Pipette zu den gewünschten Konfigurationen (aus Corey & Stevens, 2004).
• Abbildung 2.4: Schema des Strom-Spannungswandlers beim Patch-Clamp-Experiment. Legende: OPA – Operationsverstärker, R4: Schema des Strom-Spannungswandlers beim Patch-Clamp-Experiment. Legende: OPA – Operationsverstärker, R_f – Referenzwiderstand, U_soll - Kommandospannung, U_pip - Membranpotential, U_aus – Ausgangsspannung, Punkte 1 und 2 – siehe Haupttext (aus Numberger & Draguhn, 1996).
• Abbildung 2.5: Schema des R50 - Pulsprotokolls. Spannungsangaben geben Werte am Pulsbeginn sowie Maximal- und Minimalpotential an.5: Schema des R50 - Pulsprotokolls. Spannungsangaben geben Werte am Pulsbeginn sowie Maximal- und Minimalpotential an.
• Abbildung 2.6: Stimulationssequenz des Verlaufsprotokolls. Spannungsangaben geben Ausgangswerte sowie Maximalwerte des angesetzten Potentials wieder.6: Stimulationssequenz des Verlaufsprotokolls. Spannungsangaben geben Ausgangswerte sowie Maximalwerte des angesetzten Potentials wieder.
• Abbildung 3.1 Verlaufsprotokolle von BTM-Zellen, die entweder Methanol (A) oder DMSO (B) in einer Konzentration von 0.5% ausgesetzt wurden. Das Experiment mit Methanol wurde mit einer intrazellulären Lösung durchgeführt, welche nicht mit Ca-EGTA gepuffert war. Dies führte zu einer starken Aktivierung von auswärtsrektifizierenden, calciumabhängigen Maxi-K-Kanälen, sichtbar an der starken Stromantwort nach Depolarisation. Um diese Aktivierung zu vermeiden und mögliche Effekte künstlicher Ionenkanäle besser erkennbar zu machen, wurde in allen folgenden Experimenten inklusive des DMSO-Kontrollversuchs (B) mit Hilfe vom Ca-EGTA-Puffer die intrazelluläre Calciumkonzentration bei 12 nM (siehe Methoden) aufrechterhalten. Die niedrige Konzentration hatte wie erwartet eine Reduktion der Auswärtsströme zur Folge, was auf die schwächere Aktivierung von Maxi-K-Kanälen zurückzuführen war.1 Verlaufsprotokolle von BTM-Zellen, die entweder Methanol (A) oder DMSO (B) in einer Konzentration von 0.5% ausgesetzt wurden. Das Experiment mit Methanol wurde mit einer intrazellulären Lösung durchgeführt, welche nicht mit Ca-EGTA gepuffert war. Dies führte zu einer starken Aktivierung von auswärtsrektifizierenden, calciumabhängigen Maxi-K-Kanälen, sichtbar an der starken Stromantwort nach Depolarisation. Um diese Aktivierung zu vermeiden und mögliche Effekte künstlicher Ionenkanäle besser erkennbar zu machen, wurde in allen folgenden Experimenten inklusive des DMSO-Kontrollversuchs (B) mit Hilfe vom Ca-EGTA-Puffer die intrazelluläre Calciumkonzentration bei 12 nM (siehe Methoden) aufrechterhalten. Die niedrige Konzentration hatte wie erwartet eine Reduktion der Auswärtsströme zur Folge, was auf die schwächere Aktivierung von Maxi-K-Kanälen zurückzuführen war.
• Abbildung 3.2 Gegenüberstellung von Membranstromdichte (A) sowie Umkehrpotential (B) jeweils vor und nach Applikation von THF-gram (102 Gegenüberstellung von Membranstromdichte (A) sowie Umkehrpotential (B) jeweils vor und nach Applikation von THF-gram (10^-6 M). Die dargestellten Balken repräsentieren Mittelwerte mit eingezeichneten Standardfehlerbereichen, Zahlen beziehen sich auf die untersuchte Zellzahl, der Asterisk auf den Signifikanzlevel der Differenz beider Balken.
• Abbildung 3.3 Effekt der THF-gram-Applikation (103 Effekt der THF-gram-Applikation (10^-6 M) auf Membranströme einer BTM-Zelle. R50-Protokolle (A und C) zeigen die Stromantwort auf Hyper- bzw. Depolarisation jeweils vor und nach Substanzgabe, das Verlaufsprotokoll (B) dokumentiert die kontinuierliche Zunahme der Leitfähigkeit (der Balken zeigt die Applikationsdauer an).
• Abbildung 3.4 Im Diagramm werden die Strom/Spannungslinien dargestellt, die jeweils aus den Protokollen von Abbildung 3.3 A und C kalkuliert wurden. Die Änderung des Kurvensteilheit verdeutlicht dabei den Anstieg der Leitfähigkeit, die Verlagerung des Schnittpunktes mit der X-Achse (punktierte Linien) die Änderung des Umkehrpotentials.4 Im Diagramm werden die Strom/Spannungslinien dargestellt, die jeweils aus den Protokollen von Abbildung 3.3 A und C kalkuliert wurden. Die Änderung des Kurvensteilheit verdeutlicht dabei den Anstieg der Leitfähigkeit, die Verlagerung des Schnittpunktes mit der X-Achse (punktierte Linien) die Änderung des Umkehrpotentials.
• Abbildung 3.5 Vergleich der maximalen zusätzlichen (Δ) Auswärts- und Einwärtsstromdichten nach THF-gram-Applikation bei einer Konzentration von 105 Vergleich der maximalen zusätzlichen (Δ) Auswärts- und Einwärtsstromdichten nach THF-gram-Applikation bei einer Konzentration von 10^-6 M. Die Werte für beide Balken wurden aus Ergebnissen kalkuliert, die von gleichen Zellen stammten.
• Abbildung 3.6 Konzentrationsabhängigkeit von THF-gram tritt als zeitliche Verzögerung des Stromanstiegs nach Substanzapplikation in Erscheinung. Die Abbildungen zeigen Verlaufsprotokolle von drei Zellen, denen THF-gram in abnehmender Konzentration (106 Konzentrationsabhängigkeit von THF-gram tritt als zeitliche Verzögerung des Stromanstiegs nach Substanzapplikation in Erscheinung. Die Abbildungen zeigen Verlaufsprotokolle von drei Zellen, denen THF-gram in abnehmender Konzentration (10^-6–10^-8 M von oben nach unten) appliziert wurde. Pfeile deuten jeweils auf den Applikationsbeginn sowie auf den ersten Stromanstieg. Im Diagramm (links) ist die verwendete Konzentration gegen die zeitliche Verzögerung des Effekteintritts aufgetragen. Alle Angaben als Mittelwerte ± Standardfehler.
• Abbildung 3.7 Der durch THF-gram (107 Der durch THF-gram (10^-6 M) induzierte Anstieg der Stromantwort war von den verwendeten Lösungsträgern abhängig. Das Balkendiagramm zeigt mittlere Stromdichten sowie Standardfehlerbereiche für unterschiedliche Ladungsträger.
• Abbildung 3.8 Elektrophysiologische Antwort von BTM-Zellen auf Applikation von THF-gram-TBDPS (10-7 M). Die Abbildungen zeigen respektive Stromaufzeichnungen unter Kontrollbedingungen (A) und nach Substanzapplikation (B und C). Schwarzer Balken zeigt die Applikationszeit.8 Elektrophysiologische Antwort von BTM-Zellen auf Applikation von THF-gram-TBDPS (10-7 M). Die Abbildungen zeigen respektive Stromaufzeichnungen unter Kontrollbedingungen (A) und nach Substanzapplikation (B und C). Schwarzer Balken zeigt die Applikationszeit.
• Abbildung 3.9 Einfluss von Gd9 Einfluss von Gd³⁺ auf Stromantwort nach Applikation von THF-gram-TBDPS. Gd³⁺ (0.5*10^-3 M) reduzierte den THF-gram-TBDPS (10^-6 M) induzierten Stromanstieg wieder auf Ausgangswerte. Nach Auswaschen von Gd³⁺ setzte sich der Anstieg der Leitfähigkeit fort.
• Abbildung 3.10 Umkehrpotentiale von BTM-Zellen nach Inkubation mit THF-gram-TBDPS (1010 Umkehrpotentiale von BTM-Zellen nach Inkubation mit THF-gram-TBDPS (10^-6 M) über 1h. Für eine übersichtliche Darstellung wurden die erfassten Potentiale in Spannungsbereiche von jeweils 10 mV aufgeteilt, die bei -85 bis -76 mV begannen und bei + 25 bis + 34 mV endeten. Im Diagramm beziehen sich die Balken auf die jeweiligen Fallzahlen in den Spannungsbereichen, die fettmarkierte Kurve spiegelt die Gaußverteilung wieder, die von der gesamten mit THF-gram inkubierten Zellpopulation berechnet wurde (mittleres Umkehrpotential: -6.3 mV). Zum Vergleich ist die Gaußverteilung der Kontrollzellen dargestellt (schmale Kurve).
• Abbildung 3.11 Zusätzliche Stromdichte nach Applikation von THF-gram-TBDPS (1011 Zusätzliche Stromdichte nach Applikation von THF-gram-TBDPS (10^-6 M) mit unterschiedlichen Ladungsträgern. Zahlenangaben in Balken beziehen sich auf die untersuchten Zellzahlen.
• Abbildung 3.12 Effekt von Gramicidin A (1012 Effekt von Gramicidin A (10^-6 M) auf die Stromantwort von BTM-Zellen. R50-Protokolle zeigen die asymmetrische Distribution der Ströme vor Applikation (A) und die komplette Aufhebung der Zellmembranpolarität nach Exposition mit der Substanz (C). Im Verlaufsprotokoll (B) ist der Stromanstieg nach Applikation sowie die Verschiebung der Basislinie (↕) gezeigt. Die fette gestrichelte Linie zeigt den Level der Basislinie vor, die schmale gestrichelte Linie nach Applikation von Gramicidin A.
• Abbildung 3.13 Wirkung von linked-gram-TBDPS (1013 Wirkung von linked-gram-TBDPS (10^-12 M) auf die Stromantwort einer BTM-Zelle. Abbildungen A und C zeigen den Unterschied im Muster der Stromantwort vor und nach Inkorporation der Substanz auf, in Abbildung B wird die Progression des Stromanstiegs sowie der Verlust der Polarität zwischen Auswärts- und Einwärtsströmen deutlich. Ebenso beachtlich wie der Stromanstieg ist die Verschiebung (≈200mA) der Basislinie (=Stromstärke bei Klemmspannung von -40 mV), welche durch den Pfeil (↕) dargestellt wird.
• Abbildung 4.1: Goldman- Gleichung (vereinfacht)1: Goldman- Gleichung (vereinfacht) 
• Abbildung 4.2: Vergleich der Reaktionszeiten von BTM-Zellen für den ersten Stromanstieg nach Substanzapplikation. Eindeutig ist der rasche Effekteintritt bei linked-gram-TBDPS (=linked-gA) (gA=Gramicidin A).2: Vergleich der Reaktionszeiten von BTM-Zellen für den ersten Stromanstieg nach Substanzapplikation. Eindeutig ist der rasche Effekteintritt bei linked-gram-TBDPS (=linked-gA) (gA=Gramicidin A).