I Einleitung

Infektionskrankheiten sind seit jeher eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Die intensive Suche nach Mitteln zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten beschäftigt die Menschheit seit über 3000 Jahren. Es ist bekannt, dass bereits zur Zeit Pharaos Ramses V. (1148-1136 v. Chr.) verheerende Pockenepidemien in Ägypten, China und Indien aufgetreten sind. In dieser Zeit wurden auch die ersten belegbaren Impfungen durch Übertragung von getrocknetem Pockenschorf auf noch nicht erkrankte Personen durchgeführt.

In den vergangenen Jahrhunderten waren es vor allem bakterielle Infektionen, wie Pest (Yersinia pestis), Cholera (Vibrio cholerae) oder Tuberkulose (Mycobakterium tuberculosis) die zu großen Pandemien mit hoher Letalität führten. Aber auch Virusinfektionen, durch Pocken-, Influenza-, Masern- oder Polioviren forderten viele Todesopfer.

Obwohl heute immer noch jährlich ca. zwei Millionen Menschen an den Folgen einer Tuberkuloseerkrankung sterben (Young, 2003), sind mit der Entdeckung der Antibiotika durch A. Fleming die meisten bakteriellen Infektionen therapierbar geworden. Pest, Cholera und Tuberkulose, die während großer Epidemien regional über 30% der Bevölkerung auslöschten, spielen heute in den Industrieländern nur noch eine untergeordnete Rolle.

Dagegen haben in den letzten Jahrzehnten Virusinfektionen einen immer höheren Stellenwert eingenommen. Besonders in den Entwicklungsländern treten immer wieder neue virusassoziierte Krankheiten, wie z.B. AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome), SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) oder durch Filoviren ausgelöste hämorrhagische Fieber, auf. Diese Viren werden durch die gewachsene Mobilität der Menschen schnell verbreitet und stellen eine neue Herausforderung an die Entwicklung effektiver Therapien und präventiver Impfstoffe dar. Aber auch schon seit langem bekannte Virusinfektionen, wie die durch Influenza-, Masern-, oder Hepatitesviren hervorgerufenen Erkrankungen sind keinesfalls besiegt und fordern jedes Jahr Millionen Todesopfer.

Obwohl die Entdeckung der Viren und der wissenschaftliche Beweis für die mit ihnen assoziierten Krankheiten erst ca. 100 Jahre zurück liegt, sind sie seit Anbeginn Begleiter der Menschheit. Sie unterscheiden sich grundlegend von anderen Krankheitserregern, wie z.B. Bakterien oder Pilzen. Viren haben keinen eigenen Stoffwechsel, zur Replikation nutzen sie den Syntheseapparat der Wirtszelle. Diese enge Verbindung zwischen Virus und Wirtszelle macht eine Therapie oft sehr schwierig. Antivirale Medikamente sind meist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden, da sie in die Stoffwechselprozesse der Wirtszelle eingreifen. Breit wirkende Therapeutika, wie z.B. Antibiotika zur Therapie bakterieller Infektionen, stehen nicht zur Verfügung. Auch wenn die Entwicklung antiviraler Therapien in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht hat, kann so oft nur die Überlebenszeit der Patienten verlängert, jedoch keine Heilung erreicht werden. Des Weiteren sind mit der antiviralen Therapie meist hohe Kosten verbunden, die von den Gesundheitssystemen der Entwicklungsländer nicht aufgebracht werden können. Die HAAR-Therapie (highly active antiretroviral therapy) zur Behandlung von AIDS-Patienten verursacht Kosten von 13000-23000 US-$ pro Jahr und Patient (Freedberg et al., 2001). So steht der Mehrheit der HIV-Infizierten keine lebensverlängernde antivirale Therapie zur Verfügung.

Die optimale und kostengünstigste Strategie zur Bekämpfung von Virusepidemien ist nach wie vor die präventive Vakzinierung. Der Erfolg großer Impfkampagnen, wie z.B. gegen das Pocken- oder Poliovirus, zeigt die Effektivität solcher.

Retroviren (Familie Retroviridae) finden sich bei allen Vertebraten - von Säugetieren, Vögeln, Reptilien bis zu Fischen. Sie wurden erstmals 1908 durch Ellermann und Bang beschrieben. Peyton Rous konnte 1911 zeigen, dass durch zellfreien Extrakt aus Geflügelsarkomen diese Tumorerkrankung auf gesunde Hühner übertragen werden kann. Das in diesen Extrakten enthaltene Virus wurde nach ihm Rous-Sarkom-Virus (RSV) genannt.

1970 machten D. Baltimore, H.M. Temin und S. Mituzami die Entdeckung, dass diese Viren in der Lage sind, RNA zurück in DNA zu übersetzen. Bis zu diesem Zeitpunkt war man davon ausgegangen, dass die Übersetzung von DNA in RNA nur in eine Richtung möglich ist. Diese reverse Transkription wird durch die reverse Transkriptase initiiert. Dieses Enzym ist der Namensgeber der Retroviren.

Bis 1971 waren Retroviren nur in der Tierwelt beschrieben worden. 1971 wurde erstmals ein humanes Retrovirus, das humane Spumaretrovirus (HSRV), aus menschlichem Gewebe isoliert. R. Gallo brachte 1980 erstmals ein humanes Retrovirus mit Tumorbildung beim Menschen in Zusammenhang. Das von ihm beschriebene HTL-Virus (Human T-Cell Leukemia Virus) gilt als Auslöser von T-Zell-Leukämien. 1983 identifizierten L. Montagnier und R. Gallo das humane Immundefizienzvirus HIV-1 als Retrovirus und Auslöser der Immunschwächekrankheit AIDS. Auch können häufig Tumorerkrankungen mit Retrovirusinfektionen in Verbindung gebracht werden. Für diese Entdeckung erhielten John Michael Bishop und Harold Eliot Varmus 1989 den Nobelpreis für Medizin.

Die Familie der Retroviridae ist in sieben Genera eingeteilt. Die derzeit gängige Einteilung mit typischen Vertretern ist in Tabelle 1.1. dargestellt. Bis zum Jahr 1999 erfolgte die Einteilung in drei Unterfamilien: Onkoviren, Lentiviren und Spumaviren, wobei die Onkoviren anhand ihrer morphologischen und genetischen Unterschiede in weitere fünf Genera unterteilt wurden.

Weiterhin wird zwischen exogenen und endogenen Retroviren unterschieden. Endogene Retroviren sind in das Genom aller Zellen des Organismus integriert und werden vertikal über Keimbahnzellen übertragen. Die Eliminierung endogener Retroviren durch Züchtung oder Haltung unter SPF-Bedingungen (Specified Pathogen Free) ist daher nicht möglich. Obwohl diese Viren nicht dem Evolutionsdruck unterliegen und daher viele genetisch verkrüppelt sind, kann es unter bestimmten Umständen zur Produktion exogener infektiöser Partikel kommen. Im Rahmen der Forschung zur Virussicherheit der Xenotransplantation konnte das z.B. für die porzinen endogen Retroviren (PERVs) gezeigt werden. Nach Stimulation von primären Schweinelymphozyten konnte eine Freisetzung von infektiösen Viruspartikeln beobachtet werden, die in vivo an humane 293 Zellen adaptierten und diese produktiv infizierten (Denner et al., 2003; Specke et al., 2002).

Im Unterschied zu den endogenen Retroviren erfolgt die Übertragung der exogenen Retroviren von Organismus zu Organismus. Durch spezifizierte pathogenfreie Haltung oder Züchtung kann das Virus meist leicht eliminiert werden.

Retroviren sind wirtsspezifisch, jedoch gilt die Übertragung einiger Retroviren über die Artgrenze hinaus, wie z.B. der Affen-Immundefizienzviren (SIV) oder des murine Leukämievirus (MuLV), als gesichert.

Das Genom der Retroviren besteht aus zwei identischen, einzelsträngigen RNA-Molekülen, die an den Enden polyadenyliert sind. Die Länge variiert zwischen 8 - 11 kB.

Alle Genome bestehen zumindest aus drei Genen: Gag (gruppenspezifische Antigene), Pol (reverse Transkriptase, Integrase, Protease) und Env (Hüllproteine). Diese Strukturgene sind von LTR-Sequenzen (long terminal repeats) eingerahmt, die Start und Ende der Transkription steuern. Diese Wiederholungssequenzen enthalten U3- (unique), R- (redundant) und U5-Regionen, die in gleicher Orientierung vorliegen (Abb. I.1). Genetische Veränderungen an der LTR können deutlich Veränderungen in der Virusreplikation zur Folge haben.

Für das porzine endogene Retrovirus (PERV) konnte in vivo gezeigt werden, dass das repetitive Einfügen kurzer Sequenzen während serieller Passagen zur gesteigerten LTR-Promotoraktivität und damit zur deutlich erhöhten Virusreplikation führt. Diese Steigerung wird auf die Multimerisierung von Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors NF-Y zurückgeführt, die dem Virus zusätzliche Replikation in den infizierten Zellen sichert (Denner et al., 2003).

Komplexe Retroviren, wie HIV, besitzen zusätzlich Gene, die für regulatorische und akzessorische Proteine codieren (Rev, Nef, Tat, Vif, Vpr, Vpu). Regulatorische Proteine können z.B. als Transaktivatoren (Tat-Proteine = transactivator of transkription) oder als Expressionsregulatoren (Rev-Protein = regulator of gene expression of virion proteins) fungieren. Akzessorische Proteine , wie z.B. das Vif- (viral infectivity factor) oder das Nef-Protein (negative factor) steigern vor allem die Infektiosität der Virionen.

	Abb. I.1: Schematische Darstellung der retroviralen Genomorganisation der in das Zellgenom integrierten Provirus-DNA:
	U3 und U5: besondere (unique) Regionen; R= wiederholte (redundant) Regionen; PB: (primer binding) Bindungsstelle für tRNA im RNA-Genom; φ: Verpackungssignal für die virale genomische RNA; PP: Polypurinstelle; Spleißdonor/-akzeptor: Lage der Spleißstellen für die Synthese jener RNA, von der die env-Proteine translatiert werden; LTR: (long terminal repeat) Anordnung der Sequenzelemente nach Bildung durch die reverse Transkriptase

Retrovirale Partikel haben einen Durchmesser von 80-130nm und bestehen aus einem inneren Kapsid, umgeben von einer äußeren Hülle. Die Hüllmembran besteht aus einer Lipid-Doppelschicht und ist von der Zytoplasmamembran der Wirtszelle abgeleitet.

	Abb. I.2: Schematische Darstellung eines Lentivirus (HIV-1). (http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/STRUCTURE/INDEX.HTML)

Die Virusmembran ist mit viralen Glykoproteinen assoziiert, die auf der Oberfläche intakter Partikel trimere Komplexe (Spikes) ausbilden. Diese Komplexe interagieren mit den Rezeptoren und Korezeptoren auf der Zelloberfläche und initiieren so die Infektion der Zielzelle. Sie setzten sich aus dem Transmembranhüllprotein (TM) und dem nicht kovalent assoziierten Oberflächenhüllprotein (SU) zusammen. Die Hüllproteine werden von einer einfach gespleißten RNA als gemeinsames Vorläuferprotein translatiert und während der Virusmorphogenese von einer, mit dem Golgi-Apparat assoziierten, zellulären Protease gespalten (Coffin et al., 1997).

Das Oberflächenhüllprotein des HIV-1 hat ein Molekulargewicht von 120kDa, das des PERV vom 70kDa. Die Oberflächenhüllproteine der Retroviren weisen meist einen sehr hohen Glykosylierungsgrad und eine hohe Sequenzvariabilität auf. Mit bis zu 32 Glykolysierungsstellen zählt gp120 zu den am stärksten glykolysierten Proteinen. Bis zu 50% der Molekülmasse besteht aus Kohlehydraten (Leonard et al., 1990). Durch Oligomerisierung, Glykolysierung, Konformations- und Strukturänderungen können neutralisationsresistente Virusvarianten gebildet werden (Evans und Desrosiers, 2001). Das gp120 ist in eine äußere und eine innere Domäne gefaltet, die durch eine Brücke aus vier β-Faltblättern (β-Bridging Sheet) miteinander verbunden sind. Die äußere Domäne besteht aus fünf variablen Schleifen (Loops), V1-5, die durch Disulfidbrücken stabilisiert werden. Die CD4-Rezeptorbindungsstelle ist zwischen diesen Domänen in eine Vertiefung eingebettet.

Die Bindung des Rezeptors führt zu einer Konformati-onsänderung, in deren Folge die Chemokinrezeptorbindungsstelle freigelegt wird.

	Abb. I.3: Strukturmodell der HIV-1 Oberlächenproteins gp120
	A: Anordnung der variablen Schleifen (V1-V5) im gp120 (Klasse und Sattentau, 2002). B: Computermodell der Raumstruktur des gp120-CD4-Komplexes (Rizzuto et al., 1998)

Im Gegensatz zu den Oberflächenhüllproteinen sind transmembrane Hüllproteine relativ schwach (HIV-1-gp41, drei Glykosylierungsstellen) oder gar nicht (PERV-p15E) glykosyliert. Im nativen Zustand sind sie nahezu vollständig vom Oberflächenprotein verdeckt und für das Immunsystem schwer zugänglich.

Das Transmembranhüllprotein untergliedert sich in einen extraviralen (Ektodomäne) und einen intraviralen (zytoplasmatischen) Bereich und ist über eine ca. 20 Aminosäurereste lange, zwischen diesen beiden Bereichen liegende, stark hydrophobe Sequen,z in der Membran verankert. Die Ektodomäne untergliedert sich in das Fusionspeptid (FP), die N-terminale Helixregion (NHR), eine Cysteinschleife (C-C Loop) mit immundominanter (IDO) und immunsuppressiver Domäne (ISU), eine C-terminale Helixregion (CHR) und in einen kurzen membranproximalen Bereich (Abb. I.4A). Von der ISU-Domäne abgeleitete Peptide wirken in vitro Proliferationshemmend (Denner et al., 1994, 1996) und modulieren die Cytokinproduktion (Denner, 1998). Der zytoplasmatische Teil kann je nach Virustyp unterschiedlich lang sein. Während er bei Gammaretroviren nur 30-40 Aminosäuren enthält, verfügen Lentiviren über einen relativ großen intraviralen Anteil (ca. 150 AS), der bei HIV zwei α-Helices enthält. Es ist unklar, welche Rolle der zytoplamatische Teil während der Infektion einnimmt. Versuche, in denen Teile des zytoplasmatischen Bereichs deletiert wurden, zeigen jedoch einen deutlich Rückgang der Infektiosität. Für Lenti- und Gammaretroviren sind gegen den intraviralen Teil gerichtete, neu-tralisierende Antikörper beschrieben worden (Cleveland et al., 2003, Nick et al., 1990), deren Wirkmechanismus allerdings völlig unklar ist.

	Abb. I.4: Strukturmodell des Transmembranhüllproteins gp41 von HIV-1
	A: Schematische Darstellung von gp41 (FP: Fusionspeptid; NHR: N-terminale Helixregion; Loop: Cystein-Cystein-Schleife; CHR: C-terminale Helixregion; TM: Transmembrandurchgang; α: α-Helix im zytoplasmatischen Teil) B: Haarnadelkonformation des Transmembranproteins nach Zusammenlagerung der Helices (Fiebig et al., 2003) C: Darstellung der Sechs-Helix-Konformation des gp41-Trimers nach Zusammenklappen der Helices (Marti et al., 2004) D: Aufsicht auf die Coiled Coil-Struktur der Sechs-Helix-Konformation (Marti et al., 2004)

Transmembran- und Oberflächenhüllprotein sind die einzigen, auf der Oberfläche von Retroviren exponierten viralen Proteine und damit die wichtigsten Angriffspunkte einer humoralen neutralisierenden Immunantwort. HIV-neutralisierende Antikörper gegen Gag-Proteine der Retroviren (Kageyama et al., 1996) sind zwar von einigen Gruppen beschrieben worden, spielen aber bei der Induktion einer virushemmenden Immunantwort eine untergeordnete Rolle. Im Laufe einer Infektion werden hohe Antikörpertiter gegen virale Proteine (wie Gag, SU und TM) gebildet, trotzdem kommt es im infizierten Wirt nicht zu einer effektiven Neutralisation. Nur wenige breit neutralisierende Antikörper konnten bisher aus HIV-Patienten isoliert werden (Tab. I.5), die Induktion solcher Antikörper ist trotz intensiver Bemühungen bisher noch nicht gelungen.

Zu den gruppenspezifischen Antigenen gehören die Matrix-, Kapsid- und Nukloekapsidproteine. Sie erfüllen verschiedene Funktionen, die z.B. zur Partikelbildung und -freisetzung, Struktur und Infektiosität der reifen Virionen beitragen. Alle Gag-Proteine werden als ein gemeinsames Vorläuferprotein translatiert, das im Verlauf der Virusmorphogenese von einer viralen Protease in die einzelnen Komponenten gespalten wird. Die sequentielle Abfolge der einzelnen Gag-Proteine im Vorläuferprotein ist bei allen Retroviren gleich, die Größe der einzelnen Komponenten kann dagegen sehr unterschiedlich sein. Das HIV-1 gag-Gen kodiert ein 55kDa großes Vorläuferprotein, das in ein 17kDa großes Matrixprotein, ein 24kDa großes Kapsidprotein, ein 7kDa großes Nukleokapsidprotein und in die Linkerproteine p6, p2 und p1 gespalten wird (Wiegers et al., 1998). Das Gag-Vorläuferprotein der porzinen endogenen Retroviren (60kDa) wird in das p27-Kapsidprotein (27kDa), das p15-Matrixprotein (15kDa), das p7-Nukleokapsidprotein (7kDa) sowie in das p12-Linkerprotein (12kDa) gespalten.

Die Matrixproteine sind über aminoterminal angefügte Myristinsäurereste, mit der Innenseite der Hüllmembran assoziiert. Im Partikelinneren bilden die Kapsidproteine, je nach Virustyp, ein konisches (Lentiviren) oder ikosaedrisches (α-, β-, γ-, δ- und Spumaviren) Viruskapsid. Es umschließt zwei identische RNA-Moleküle als Virusgenom, die Nukleokapsidproteine und die viralen Enzyme. Die Nukleokapsidproteine interagieren mit der RNA und bilden gemeinsam einen Ribonukleoproteinkomplex.

Das retrovirale Genom codiert die Enzyme Integrase, Protease und die reverse Transkriptase. Sie sind Produkte des pol-Gens und werden durch eine Leserasterverschiebung während der Gag-Polyprotein-Translation als gemeinsames Gag/Pol-Vorläuferpotein synthetisiert. Durch diese Leserasterverschiebung wird das gag-Stoppcodon überlesen und dem Gag-Polyprotein werden die Pol-Domänen angehängt. Dieses Ereignis findet etwa bei jedem zwanzigsten  Translationsvorgang statt. Die Proteolyse in die aktiven Enzyme erfolgt während der Virusreifung im bereits freigesetzten Partikel.

Die Integrase wirkt als Endonuklease und Ligase. Sie schneidet die Enden der doppelsträngigen proviralen DNA und katalysiert die kovalente Integration in das Genom der Wirtszelle.

Die Protease liegt im aktiven Zustand als Dimer aus zwei identischen Untereinheiten vor. Sie ist für die Proteolyse der Gag- bzw. Gag/Pol-Vorläuferproteine in die strukturellen Untereinheiten bzw. funktionellen Enzyme verantwortlich. Inhibitoren der viralen Protease des HIV simulieren die Proteasespaltstellen der Vorläuferproteine und können die Reifung der Partikel effektiv hemmen.

Die reverse Transkriptase kann als RNA- oder DNA-abhängige DNA-Polymerase oder auch als RNAase wirken. Sie katalysiert die Umschreibung der viralen RNA in provirale DNA und baut nach der Synthese der DNA/RNA-Hybriddoppelstränge den RNA-Anteil ab. Die reverse Transkriptase besitzt keine Mechanismen zur Kontrolle der Lesegenauigkeit und baut daher mit einer Wahrscheinlichkeit von 1:10^-3-10^-4 falsche Basen in den neusynthetisierten DNA-Strang ein. Diese hohe Fehlerrate sichert dem Virus eine hohe Sequenzvariabilität. Verschiedene Nukleosidanaloga, wie z.B. Azidothymidin (AZT) oder Didesoxycytidin, werden derzeit als Inhibitoren der reversen Transkriptase zur antiretroviralen Therapie eingesetzt. Der Einbau dieser chemisch veränderten Basenderivate in den neusynthetisierten DNA-Strang führt zum Kettenabbruch. Neben den Nuklosidanaloga werden auch Nicht-Nuklosidanaloga als RT-Inhibitoren eingesetzt.

Die Adsorption der Retroviren an die Zielzelle erfolgt über spezifische zelluläre Rezeptoren in Abhängigkeit vom jeweiligen Virustyp. Sie wird durch den externen Teil des Membranproteinkomplexes vermittelt. Am besten untersucht ist die Replikation der HI-Viren, daher soll der Infektionszyklus hier exemplarisch am HI-Virus erklärt werden.

Der erste zelluläre Reaktionspartner der HI-Viren ist das CD4-Protein, das über eine konservierte Region im trimeren Komplex des Oberflächenproteins (gp120) gebunden wird. Das CD4-Molekül ist auf der Oberfläche von T-Helferzellen, Makrophagen, Monozyten und Fibroblasten exponiert. Sein natürlicher Ligand während der Induktion einer zellulären Immunantwort ist eine konstante Region innerhalb der MHC-Klasse-II-Moleküle. Die Bindung des CD4-Rezeptors an den gp120-Komplex ist konformationsabhängig. Sie bewirkt Konformati-onsänderungen im gp120, durch die weitere Wechselwirkungen mit Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzelle ermöglicht werden. Das HI-Virus nutzt die Chemokinrezeptoren CXCR4 oder CCR5 als Korezeptoren, die an die variablen Regionen der gp120 V1/2- und V3-Schleifen binden. Der Chemokinrezeptor CXCR4 wird auf der Oberfläche von T-Lymphozyten, CCR5 auf der Oberfläche von Makrophagen und Monozyten exprimiert. Virusvarianten, die zum Eintritt in die Zelle CXCR4 als Korezeptor nutzen, werden als lymphotroph, CCR5 bindende als makrophagotroph bezeichnet.

Das Transmembranhüllprotein vermittelt die Fusion zwischen Virus und der Zytoplasmamembran der Zielzelle. Die Bindung des Oberflächenhüllproteins an den bzw. die Rezeptoren bewirkt Konformationsänderungen, durch die eine stark hydrophobe Sequenz am aminoterminalen Teil des TM-Hüllproteins freigelegt wird. Dieses ca. 25 Aminosäuren lange Fusionspeptid dient als hydrophober Anker, der sich während der Infektion in die Lipidmembran der Zielzelle einlagert und so die Verschmelzung mit der Virushülle vermittelt. Der Membranenverschmelzung geht die Ablösung von gp120 und das Zusammenklappen der beiden Helixes des Transmembranproteins voraus (Abb. I.5).

	Abb. I.5: Schematische Darstellung der Konformationsänderungen des HIV-Glykoprotein-Komplexes während Membranfusion (Liu et al, 2003).

	Abb. I.6: Replikationszyklus von HIV-1:
	Der Infektionsvorgang beginnt mit der Anheftung von gp120 an CD4, gefolgt von der gp41-vermittelten Membranfusion. Nach der reversen Transkription erfolgt die Integration des doppelsträngigen DNA-Provirus in das Genom der Wirtszelle. Die Bildung neuer Viruspartikel beginnt mit der Transkription der frühen Gene und endet mit der Knospung und Reifung. (http://www.viro.med.uni-erlangen.de/schubert/Ws/Teil2.pdf)

Nach der Aufnahme des Virus-Kapsids in das Zytoplasma der Zielzelle, folgt der Uncoating-Prozess, durch den die virale RNA in das Zytosol freigesetzt wird. Durch reverse Transkription des viralen RNA-Genoms wird das doppelsträngige DNA-Provirus synthetisiert. Im Zellkern katalysiert die virale Integrase die kovalente Integration des Provirus in das Wirtszellgenom.

Die späte Phase der Virusreplikation beginnt mit der Transkription der viralen Gene durch die zelluläre RNA-Polymerase II. Die viralen Proteine und das Virusgenom lagern sich an der Zytoplasmamembran an. In der Folge kommt es zur Knospung der unreifen Partikel von der Zelloberfläche. Erst nach der Spaltung der Gag- und Gag/Pol-Vorläuferproteine durch die virale Protease entstehen infektiöse Partikel.

Gammaretroviren sind weniger komplex als Lentiviren aufgebaut, sie exprimieren keine regulatorischen oder akzessorischen Proteine.

Als Krankheiterreger spielten Gammaretroviren bislang nur in der Veterinärmedizin eine Rolle. Das feline Leukämievirus (FeLV) verursacht bei der Hauskatze Leukämien, Immunschwäche und opportunistische Infektionen, die oft tödlich verlaufen. Wie für die Lentiviren wurden auch für Gammaretroviren Transspeziesübertragungen unter natürlichen Bedingungen beschrieben (Denner, 2000). Die Übertragung eines endogenen Mausretrovirus (MuLV) auf Gibbonaffen ruft beim neuen Wirt als exogenes Retrovirus (Gibbon ape leukemia virus; GaLV) myeloische Leukämien und Lymphome hervor (Lieber et al., 1975).

Viele Transspeziesübertragungen führten im neuen Wirt zu ausgeprägten Krankheitsbildern. Aufgrund der besonderen Situation während der Xenotransplantation wird das Risiko der Übertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERV), besonders intensiv erforscht. Das Schwein gilt aus verschiedenen Gründen als favorisierte Spenderspezies (Tab. I.2), die potentielle Gefahr einer Transspeziesübertragung von PERVs auf Transplantatempfänger, kann derzeit nicht ausgeschlossen werden.

PERVs gehören zu den Gammaretroviren. Sie zeigen eine enge Verwandtschaft mit den Mäuseleukämieviren (MuLV), Katzenleukämieviren (FeLV) und dem Leukämievirus der Gibbonaffen (GaLV). Diese Viren rufen bei ihren Wirten Leukämien und Immundefizienzen hervor. PERVs sind endogen, d.h. sie werden vertikal über die Keimbahn nach den Mendelschen Regeln übertragen. Durch den fehlenden Evolutionsdruck sind die meisten Proviren degeneriert und nicht mehr replikationsfähig. Erstmals wurde PERV 1970 aus der porzinen Nierenzell-Linie PK-15 isoliert und charakterisiert (Breese, 1970). Es existieren 3 Subtypen (PERV-A, -B, -C), die sich vor allen durch ihre Hüllproteine unterscheiden. Durch in vitro Versuche konnte gezeigt werden, dass PERVs humane Zellen produktiv infizieren können (Patience et al., 1997). Untersuchungen zur Zytokinmodulation durch das transmembrane Hüllprotein haben gezeigt, dass die Veränderung der Zytokinexpression den Veränderungen durch gp41 ähnlich ist. Obwohl PERVs im Schwein apathogen sind, könnte eine Übertragung auf zukünftige Transplantatrezipienten zu einem pathogen Infektionsverlauf führen.

In Deutschland werden jährlich ca. 2300 Nieren, 550 Herzen und 720 Lebern transplantiert. Auf der Warteliste stehen jedoch 11000 Dialysepatienten, die eine Niere benötigen, und etwa 2000 Herz- und Leberpatienten. Ein Viertel dieser Patienten verstirbt, bevor sie ein Organ erhalten haben. Um diesen permanenten Mangel zu beheben, werden zurzeit verschiedene Lösungswege, wie z.B. das „Tissue-Engineering“ auf Basis von Stammzellen, bioartifizielle Systeme (z.B. ex vivo Perfusion) oder die Xenotransplantation diskutiert. Letztere ist von allen Alternativen zur Allotransplantation forschungsmäßig am weitesten fortgeschritten, alle Pro und Contras ihrer Anwendung werden in der Öffentlichkeit bereits intensiv diskutiert. Fortschritte bei der Erzeugung transgener Spendertiere machen die breite klinische Anwendung der Xenotransplantation immer wahrscheinlicher.

Als favorisierte Ausgangsspezies für die Xenotransplantation gilt derzeit das Schwein. Obwohl es phylogenetisch weiter vom Menschen entfernt ist als z.B. die nicht-humanen Primaten der Altwelt, weist es doch einige entscheidende Vorteile auf. Die Vor- und Nachteile verschiedener Spendertiere sind in der nachfolgender Tabelle gegenüber gestellt (nach Denner, 2000).

Tab. I.2: Vergleich der potentiellen Spendertiere für die Xenotransplantation

Bevor die Xenotransplantation klinische Realität werden kann, müssen drei Hauptprobleme gelöst werden. Neben der Überwindung der physiologischen und anatomischen Hindernisse, sind es vor allem immunologische Probleme, die eine erfolgreiche Xenotransplantation in der Vergangenheit verhindert haben. Nicht zuletzt muss das mikrobiologische Risiko, also die Gefahr von Xenosen, sowie mögliche Gegenmaßnahmen möglichst umfassend erforscht werden.

Die physiologischen und anatomischen Unterschiede bei xenogenen Transplantationen sind erheblich, besonders wenn sie nicht innerhalb einer zoologischen Familie oder gar Ordnung durchgeführt werden. Da nicht-humane Primaten aus verschiedenen Gründen als Spendertiere nicht in Betracht kommen (Tab. I.2), muss für die Xenotransplantation auf Spender einer anderen zoologischen Ordnung zurückgegriffen werden. Die Verwendung von Schweinen als potentielle Spenderspezies bringt für die Xenotransplantation gravierende physiologische und anatomische Probleme mit sich. Obwohl die Größe der Organe annähernd identisch ist, bringt das Verlagern der Organe von einer horizontalen, in eine vertikale Orientierung nachweislich eine Beeinträchtigung der Funktion mit sich (West et al., 1987). Auch die Frage nach unterschiedlicher Alterungsdynamik zwischen Spender und Empfänger könnte eine nicht unwesentliche Rolle spielen. Wichtigste physiologische Barriere ist jedoch die Hormon- und Enzymkompatibilität. Bisher sind nur wenige Stoffwechselabläufe in xenogenen Systemen untersucht. Klar ist, dass es neben analog ablaufender, wie z.B. die Insulinproduktion, auch völlig inkompatible Stoffwechselmechanismen gibt, die zwischen Empfänger und Transplantat keine Interaktion erlauben. Genauere Untersuchungen werden zeigen, welche Zellen, Gewebe oder sogar Organe sich für die Xenotransplantation eigenen. Trotz dieser physiologischen Hürden konnte in klinischen Studien bereits gezeigt werden, dass bestimmte xenogene Transplantate, wie z.B. Insulin-produzierende Langerhans-Inseln oder Dopamin-produzierende Neuronalzellen, im Menschen ihre Aufgabe erfüllen können.

Die Überwindung der immunologischen Abstoßung eines Transplantates ist in den letzten Jahren entscheidend vorangeschritten. Vor allem die Weiterentwicklung der knock-out-Technologie und die Entwicklung neuer Medikamente zur Kontrolle der Immunreaktion, scheinen die Transplantation von porzinen Zellen, Geweben oder sogar Organen in den Bereich des Möglichen zu rücken.

Die bei der Xenotransplantation auftretenden immunologischen Reaktionen lassen sich in vier zeitliche Phasen einteilen:

• Die hyperakute vaskuläre Abstoßungsreaktion (HAR)
  Die Transplantation von xenogenen Gewebe führt zur Aktivierung des Komplementsystems und damit zu einer hyperakuten Abstoßung des Transplantates nach wenigen Minuten bis Stunden. Ursache für diese Komplementaktivierung ist die Bindung präformierter Antikörper an Kohlehydratepitope auf den Gefäßendothelien des Transplantates. Diese Gal-α-1,3-gal Epitope sind auf den Zellen aller Säuger, ausgenommen des Menschen und einiger nicht-humaner Primaten exponiert (Galili et al., 1993). In den letzten Jahren konnten mehrere wirksame Strategien zur Vermeidung der HAR entwickelt werden. Durch Immunabsorption xenoreaktiver Antikörper (Lucchiari et al. 1997) oder der Einsatz löslicher Komplementinhibitoren konnte die akute Organschädigung deutlich vermindert werden (Kroshus et al., 1995). Den größten Erfolg verspricht jedoch die Entwicklung transgener Schweine. Anfänglich war es jedoch nicht gelungen, die Gene der α-1,3-Galactosyltransferase durch das knock-out Verfahren aus dem Genom des Schweins zu entfernen. Daher wurden die Schweine mit Genen ausgestattet, die den Transfer humaner Komplementregulatoren auf die Oberfläche der Zellen des Xenotransplantats bewirken und somit den Angriff durch das Komplementsystem des Empfängers inhibieren (Cozzi und White, 1995). Inzwischen ist es gelungen, die kodierenden Gene der α-1,3-Galactosyltransferase aus dem Genom der Schweine zu entfernen (Dai et al., 2002; Lai et al., 2002).
• Die verzögerte Xenotransplantatabstoßung
  Neben der hyperakuten Abstoßungsreaktion bildet der Organismus noch weitere Immunbarrieren, wie z.B. die verzögerte bzw. die akut vaskuläre Abstoßungsreaktion. Die verzögerte Transplantatabstoßung ist charakterisiert durch die Bildung von Thromben, intravasale und interstitielle Fibrinablagerungen sowie der Infiltration des Transplantates mit Killerzellen und Makrophagen. Diese Reaktion ist bisher noch nicht vollständig verstanden. Man geht davon aus, dass sie ebenfalls durch präformierte Antikörper gegen Kohlehydratepitope auf der Oberfläche des Transplantates ausgelöst wird. Die Bindung dieser Antikörper führt zur Endothelzellaktivierung TypII, die zu einer Abstoßung des Transplantats innerhalb weniger Tage führt. Durch eine weitere genetische Humanisierung des Transplantats könnte auch hier, wie bei der hyperakuten Abstoßung, eine deutliche Reduktion der verzögerten Abstoßungsreaktion erreicht werden.
• Die T-Zell-vermittelte Abstoßungsreaktion
  Als vermutlich letzte Phase der akuten Abstoßungsreaktion tritt die T-Zell-vermittelte zelluläre Transplantatabstoßung auf. Diese Reaktion ist, im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Abstoßungsreaktionen, nicht durch Antikörper vermittelt. Die Erkennung des Fremdgewebes erfolgt über die Präsentation von Peptidantigenen durch antigenpräsentierende Zellen, wie z.B. dendritischen Zellen oder Makrophagen. Obwohl bei der Xenotransplantation die T-Zell-vermittelte Abstoßungsreaktion nicht so stark ist wie bei der Allotransplantation, stellt sie das Bindeglied zwischen akuter und chronischer Abstoßungsphase dar. Sie läst sich in zwei Phasen, der Induktionsphase und der darauf folgenden Effektorphase, einteilen. In der Induktionsphase werden an MHC-Klasse-II-Moleküle gebundene Peptidantigene von CD4⁺ T-Helferzellen erkannt. In der Effektorphase kommt es durch zytotoxische T-Lymphozyten sowie der massiven Ausschüttung von Zytokinen und TNFα/β (Satake et al., 1996, Yamada et al., 1995) zur Schädigung des Transplantats. Zur Unterdrückung dieser Reaktion werden derzeit herkömmliche Immunsuppressiva (z.B. Cyclosporin A, Rapamycin) appliziert. Im Vergleich zur Allotransplantation ist jedoch eine höhere Medikation notwendig, die zur Entwicklung von Tumoren oder Lymphomen in den Rezipienten führen könnte. Eine Lösung des Problems könnte die Entwicklung neuer, speziell auf die Xenotransplantation zugeschnittener Medikamente sein.
• Die chronische Transplantatabstoßung
  Die chronische Transplantatabstoßung tritt binnen Monaten bis Jahren auf. Aufgrund von Verengungen durch Gewebeproliferation kommt es zum Verschluss von Gefäßen und zur interstitiellen Gewebsfibrose. Der Verschluss der Gefäße führt zu Nekrosen und letztlich zum Versagen des Transplantats. Die Auslöser dieser Prozesse sind bislang weitgehend unbekannt. Dieser Prozess kann nicht durch den Einsatz von Immunsuppressiva aufgehalten werden.

Die mikrobiologische Sicherheit ist ein Aspekt der Xenotransplantation, der nicht von der medizinisch-technischen Durchführbarkeit abhängig ist. Handelt es sich bei den physiologischen, anatomischen und immunologischen Hindernissen um Probleme, die mit den heute zur Verfügung stehenden Mitteln noch nicht oder nur begrenzt überwunden werden können, ist die mikrobiologische Sicherheit eine Frage des Schutzes der Rezipienten und derer Kontaktpersonen. Wie die HIV-Epidemie, könnte eine Übertragung von PERVs auf den Menschen verheerende Folgen haben. Deshalb müssen im Vorfeld der Xenotransplantation die Risiken und mögliche präventive und therapeutische Maßnahmen gründlich evaluiert werden.

Die potentielle Verwendung von Schweinen als Spender für Xenotransplantate bringt hinsichtlich der mikrobiologischen Risiken einige Vorteile gegenüber den uns näher verwandten humanen und nicht-humanen Primaten. Die phylogenetische Nähe von Menschen und Primaten könnte eine Vermehrung von pathogenen Erregern im Menschen begünstigen. Ein weiterer großer Vorteil des Schweins ist, dass die meisten Erreger bekannt sind und mittels SPF-Haltung, Antibiotikabehandlung und präventiver Vakzinierung als Infektionsrisiko ausgeschlossen werden können.

Das größte Risiko geht daher von den endogenen Retroviren des Schweins aus, da diese in der Keimbahn verankert und nicht durch Züchtung oder Therapien zu eliminieren sind. Bei bislang durchgeführten Xenotransplantationen, wie der Übertragung von Neuronalzellen auf Parkinsonpatienten, Langerhans´schen Inselzellen auf Diabetespatienten oder extrakorporaler Perfusion von Schweinenieren konnten keine PERV-Infektion nachgewiesen werden (Heneine et al., 1998; Patience et al., 1998; Tacke et al., 2002; Irgang et al., 2003). Ein weiteres Risiko könnten unerkannte Erreger darstellen, die durch allgemeine Hygienemaßnahmen nur teilweise zu eliminieren sind (Denner, 2000).

Neutralisierende Antikörper sind für tierpathogene Gammaretroviren, wie MuLV und FeLV, beschrieben. Das feline Leukämievirus ist derzeit das einzige Retrovirus, gegen das erfolgreich geimpft wird.

In Deutschland sind derzeit verschiedene FeLV-Impfstoffe zugelassen (Tab. I.3). Obwohl neutralisierende Antikörper auch gegen das Transmembranhüllprotein beschrieben sind, kommen bevorzugt gp70-Antigene zur Anwendung (Kleiser et al., 1986; Elder et al. 1987; Nick et al., 1990). Das Transmembranhüllprotein ist weniger sequenzvariabel als das Oberflächenhüllprotein, so binden monoklonale Antikörper gegen p15E aller drei FeLV-Subtypen sowie verschiedene MuLV-Isolate (Youngren et al., 1984). Besonders neutralisierende Epitope im membranproximalen Bereich der C-Helix sind bei den Retroviren stark konserviert. In verschiedenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Immunisierung mit Vorläuferprotein (gp85) zu einem gesteigerten Titer von virusneutralisierenden Antikörpern führt (Kleiser et al., 1986, Elder et al., 1987; Nick et al., 1990). Keines der zugelassenenen Präparate bietet einen 100% Schutz (Sparkes, 1997), von den Herstellern wird eine jährlich Auffrischungsimpfung (30-45€) empfohlen.

Tab. I.3: In Deutschland zugelassene FeLV-Impfstoffe (Quelle: Paul-Ehrlich-Institut, 09/2003)

In der Europäischen Union wurden im Jahr 2004 über 205 Millionen Schweine produziert, dass entspricht mehr als einem halben Schwein pro Jahr und Einwohner. Die gängige industrielle Schweinehaltung ist nicht artgerecht, da die Tiere in engen, dunklen Ställen (vorgeschriebene Mindestgröße in Deutschland: 2,5 m²) bewegungslos aufgezogen werden. Dies führt oft zu Gelenk- und Muskelkrankheiten, Klauenverletzungen, Verhaltensstörungen und Kannibalismus. Die oft unwürdige Tierhaltung zur kostengünstigen Erzeugung von tierischen Produkten wird von der überwiegenden Mehrheit der Gesellschaft toleriert. Die Frage, wie das Lebensrecht des Menschen gegenüber dem des Tieres zu qualifizieren ist, sollte daher nicht im Zusammenhang mit der möglichen Rettung von Menschenleben durch Xenotransplantation diskutiert werden.

Auch ist eine hohe Akzeptanz bei Betroffenen, ihren Angehörigen sowie in der Bevölkerung, in Anbetracht einer möglichen Lebensrettung und Leidensverminderung, festzustellen. Die Frage, ob die Transplantation von xenogenen Material auf den Menschen die Schöpfungsordnung durchbricht oder ob Identitätsprobleme aufgeworfen werden könnten, spielt wohl primär in den Überlegungen von Theologen, Ethikern und Philosophen, jedoch weniger bei den Betroffenen und deren Angehörigen eine Rolle.

Natürlich muss die Entscheidung des potentiellen Rezipienten, eine mögliche Xenotransplantation nicht zu nutzen, in jedem Fall respektiert werden.

Lentiviren sind deutlich komplexer aufgebaut als die meisten anderen Mitglieder der Familie der Retroviridae. Bekannteste Vertreter sind die humanen Immundefizienzviren HIV-1 und HIV-2. Verwandte Lentiviren sind aber auch bei Affen (SIV), Katzen (FIV) oder Rindern (BIV) bekannt. Aufgrund der weltweiten Ausbreitung und der großen, stetig steigenden Zahl der Erkrankten, sind die HI-Viren von besonderem wissenschaftlichen Interesse und daher auch Gegenstand der Untersuchungen in dieser Arbeit.

Das mit einer HIV-Infektion assoziierte Krankheitsbild wurde erstmals um 1980 in den USA beobachtet. Es ist durch das Auftreten opportunistischer Infektionen und seltener maligner Tumore gekennzeichnet, ausgelöst durch eine ausgeprägte Schwächung des Immunsystems. Inzwischen gilt es als gesichert, dass HIV-1 und HIV-2 das Ergebnis von Transspeziesübertragungen simianer Lentiviren ist. Für HIV-1 konnte das simiane Immundefizienzvirus der Schimpansen (SIVcpz), für HIV-2 das der rauchgrauen Mangabe (SIVsm) als Ursprungsvirus identifiziert werden. Diese Viren sind in ihren natürlichen Wirten apathogen, können jedoch in anderen Spezies AIDS auslösen. Die Mechanismen, die der Apathogenität der Viren im natürlichen Wirt zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig verstanden, könnten jedoch hilfreich für die Entwicklung antiretroviraler Therapien sein.

	Abb. I.7: Globale Ausbreitung der HIV-1 Epidimie:
	Am stärksten betroffen ist die Bevölkerung in den Gebieten der Subsahara und Südafrika (ca. 9% der Bevölkerung infiziert) und Asien (Quelle: UNAIDS, 2003)

Aufgrund der Sequenzunterschiede wird HIV-1 in drei Subtypen M (major), O (outlier) und N (new) eingeteilt. Der Subtyp M wird weiter in die Genotypen (clades) A bis I unterteilt. Die Verbreitung bestimmter Subtypen bzw. der Genotypen kann regional sehr unterschiedlich sein. In Westeuropa und den USA sind der Genotyp B, in der Subsahara und Südafrika der Genotyp C des HIV-1-Subtyps M die am weitesten verbreiteten Virusvarianten.

1986 wurde in Westafrika erstmals eine neue Virusvariante, HIV-2, isoliert. Derzeit sind sechs Genotypen (A-F), die vermutlich unabhängig voneinander entstanden sind, bekannt. Die HIV-2-Infektion hat sich nicht so rasant wie die HIV-1-Infektion ausgebreitet und blieb anfänglich vor allem auf Westafrika beschränkt. Heute hat auch HIV-2 die Kontinentgrenzen überschritten und ist in vielen anderen Regionen, besonders in Indien, nachzuweisen.

Das HI-Virus kann über Verletzungen der Schleimhaut, durch Samen- oder Vaginalflüssigkeit, beim Stillen durch infizierte Frauen oder direkten Blut-Blutkontakt übertragen werden. Die Infektion verläuft in drei Phasen: der Primärinfektion, inapparent oder mit leichten, grippeähnlichen Symptomen; dem symptomfreien Latenzstadium, in dem nur wenig Virus im peripheren Blut des Infizierten nachgewiesen werden kann und der klinischen Phase, mit der Ausprägung einer akuten Immundefizienz. Die Mechanismen, mit denen HIV eine Immundefizienz hervorruft, sind noch nicht vollständig aufgeklärt.

Das symptomfreie Stadium ist von einem Gleichgewicht zwischen Virusreplikation und Immunabwehr gekennzeichnet. Die Zerstörung CD4-positiver Zellen hält sich mit der Regeneration die Waage. Aufgrund hoher Mutationsraten und des stetigen Selektionsdrucks durch die humorale und zelluläre Immunantwort, werden permanent neue Virusvarianten gebildet. Mit der Ausbildung von resistenten Virusvarianten verändern sich die Replikationseigenschaften und der Zelltropismus der Viren. Während am Anfang der Infektion hauptsächlich langsam replizierende, makrophagotrophe Viren nachgewiesen werden können, findet man in der symptomatischen Phase bevorzugt schnellrepliziernde lymphotrope Varianten. Der Infektionsverlauf ist mit einem langsamen Abfall der CD4⁺- und der naiven CD8⁺-Lymphozyten und letztlich mit dem Zusammenbruch des Immunsystems und der Ausbildung der klinischen AIDS-Symptome verbunden.

Bei einigen Virusvarianten (z.B. HIV-1 IIIB) kann in Zellkulturen die Bildung von Syncytien und die Lyse infizierter Zellen beobachtet werden. Da aber nur wenige Zellen im Patienten infiziert sind, werden als Ursache für die Abnahme dieser Zellen indirekte Mechanismen wie Apoptose, Lyse durch zytotoxische T-Zellen oder die Hemmung der Neubildung aus Vorläuferzellen angenommen.

In den letzten Jahren konnte die antiretrovirale Therapie deutlich verbessert werden. Derzeit stehen zur Therapie HIV-infizierter Patienten verschiedene Therapeutika zur Verfügung, die zur klinischen Behandlung der Patienten miteinander kombiniert werden. Sie lassen sich in verschiedene Wirkstoffgruppen einteilen (Tab. I.4).

Steht den Patienten eine optimale medizinische Versorgung zur Verfügung, kann durch eine hoch aktive antiretrovirale Therapie (HAART) die asymptotische Phase der HIV-Infektion über Jahre verlängert werden. Um Resistenzbildungen möglichst lange zu verzögern, wird bei der HAART eine Kombination aus nukleosidischen, nichtnukleosidischen RT-Hemmern und Proteaseinhibitoren eingesetzt.

Tab. I.4:HIV-Therapeutika in klinischer Anwendung.

Obwohl durch die HAAR-Therapie die Viruskonzentration im peripheren Blut bis unter die Nachweisgrenze gesenkt werden kann, erfolgt keine Eliminierung der Proviren aus den Zellen des Organismus und damit keine Heilung. Das Virus verfügt im Organismus über Reservoire, die durch die HAART nicht getroffen werden. Das Auftreten resistenter Viren während der Therapie führt daher langfristig zum Therapieversagen.

Seit dem Jahr 2003 ist ein weiterer antiviraler Hemmstoff als HIV-Therapeutikum zugelassen. Das 38 Aminosäurereste lange Peptid, T20, ist von der CHR-Domäne des gp41 abgeleitet und hemmt durch Anlagerung an die NHR-Domäne des viralen gp41 den Fusionsprozess (Wild et al. 1995). Nach längerer Anwendung wurde jedoch auch hier die Bildung resistenter Virusstämme beobachtet. T20 wird in Kombination mit anderen Hemmstoffen eingesetzt. Die jährlichen Kosten dieser Therapie betragen ca. 25000 US$ (James, 2003).

Ein weiterer, noch im klinischen Test befindlicher Ansatz, ist die passive Immunisierung HIV-Infizierter mit einer Kombination aus den breitneutralisierenden Antikörper 2F5, 4E10 und 2G12 (Tab. I.5). Durch die Applikation großer Mengen gereinigter, monoklonaler Antikörper, konnte die Viruslast im peripheren Blut deutlich gesenkt werden (Stiegler et al., 2002). Eine Klärung des Virus aus dem Organismus kann auch mit dieser Therapie nicht erreicht werden. Auch hier dürften die hohen Kosten der Therapie einer breiten klinischen Anwendung entgegenstehen. Alle derzeit in klinischer Anwendung oder Erprobung befindlichen Therapieansätze haben die Bildung resistenter Virusstämme gemeinsam, die früher oder später zum Therapieversagen und zur Entwicklung von AIDS führen.

Die Induktion von Antikörpern mit einem breiten Neutralisationsspektrum scheint derzeit als ein möglicher Ansatz zu einer effektiven HIV-Prophylaxe. Verschiedene solcher Antikörper konnten in den letzten Jahren aus infizierten Patienten isoliert werden (Tab. I.5)

Die Ergebnisse der klinischen Studien zur passiven Immunisierung bei infizierten Patienten bestätigen das hohe Potential solcher neutralisierenden Antikörper. Durch die passive Immunisierung mit einer Kombination der monoklonalen Antikörper 2G12, 4E10 und 2F5 konnte die Viruslast im peripheren Blut der Patienten bis unter die Nachweisgrenze gesenkt werden (Stiegler et al., 2002; Wolbank et al., 2003).

Tab. I.5: Neutralisierende monoklonale Antikörper gegen HIV-1 Hüllproteine

Alle bekannten breit neutralisierenden Antikörper wurden aus HIV-infizierten Patienten isoliert. Trotz zahlreicher Versuche in Tiermodellen und klinischen Studien ist es bisher jedoch noch nicht gelungen, eine gegen unterschiedliche Subtypen gerichtete schützende Immunantwort im Patienten zu induzieren. Die genaue Aufklärung des Wirkmechanismus dieser Antikörper könnte wichtige Hinweise auf die Beschaffenheit geeigneter Antigene geben.

In der Veterinärmedizin ist das pathogene Potential der Retroviren seit langem bekannt. In den letzten drei Jahrzehnten konnten auch humanpathogene Retroviren identifiziert und mit bestimmten Krankheiten assoziiert werden. Während Retroviren in ihrem natürlichen Wirt häufig apathogen sind (z.B. SIV), können sie nach einer Transspeziesübertragung zu tödlichen Erkrankungen im neuen Organismus führen.

Die krankheitsauslösenden Mechanismen können sehr unterschiedlich sein. Am häufigsten kommt es durch die Integration des Provirus in das zelluläre Genom des Wirtsorganismus zur Inaktivierung essentieller Gene oder zu einer veränderten Regulation durch die viralen LTR-Elemente. Kommt es dadurch zu einer Aktivierung von Protoonkogenen oder zur Schädigung von Tumorsuppressorgenen, kann das zur Tumorentwicklung führen. Zusätzlich können Retroviren Onkogene tragen, deren Genprodukte in die Regulationsmechanismen infizierter Zellen eingreifen und so eine Tumorbildung auslösen.

Des Weiteren kann eine Infektion durch Retroviren zur Ausprägung einer Immunsuppression und damit zur Immunschwäche führen. Dafür verantwortlich sind vermutlich konservierte Domänen innerhalb der Hüllproteine, besonders innerhalb der Transmembranhüllproteine. So konnte z.B. für das murine Leukämievirus (MuLV) oder das humane Immunschwächevirus (HIV) gezeigt werden, dass deren Transmembranhüllproteine p15E bzw. gp41 in der Lage sind, die Lymphozytenproliferation zu hemmen und eine umfangreiche Modulation der Zytokinexpression zu bewirken. Auch wenn der genaue Mechanismus, wie Retroviren Immunsuppression auslösen noch unklar ist, zeigt das Beispiel der HIV-Infektion, zu welchen fatalen Folgen eine Infektion führen kann.

Heute gilt es als allgemein anerkannt, dass der Ausbruch der AIDS-Epidemie auf eine Zoonose von SIV auf den Menschen zurückzuführen ist. Welche Gefahren durch Zoonosen entstehen können, zeigt auch als jüngstes Beispiel die SARS-Epidemie. Das von Zibetkatzen auf den Menschen übertragende Coronavirus löst eine schwere Infektion der Atemwege aus, die im Jahr 2003 bei ca. 800 Menschen zum Tode führte.

Auch die Übertragung von PERV auf Xenotransplantatempfänger könnte fatale Folgen haben. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Transmembranhüllproteine der Gammaretroviren, ähnlich wie das Transmembranhüllprotein von HIV, Zytokinmodulation hervorrufen können. Eine dadurch ausgelöste Immunsuppression könnte zu einem ähnlichen Krankheitsbild wie während einer HIV-Infektion führen.

In dieser Arbeit sollte ein effektives Antigen entwickelt werden, das geeignet ist, mögliche Transplantatempfänger durch eine präventive Vakzinierung vor einer möglichen Infektion durch PERVs zu schützen. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Induktion eines Impfschutzes gegen verwandte Gammaretroviren (FeLV und MuLV) durch Immunisierung mit dem Oberflächenprotein (gp70) möglich ist. Alle in Deutschland derzeit zugelassenen FeLV-Impfstoffe, basieren auf dem Oberflächenprotein gp70. Keiner dieser Impfstoffe zeigt jedoch eine 100%ige Effektivität und von den Herstellern wird eine jährliche Auffrischungsimpfung empfohlen. Die Induktion neutralisierender Antikörper gegen das TM-Protein der Gammaretroviren ist für FeLV und MuLV beschrieben worden, hat aber bei der Entwicklung effektiverer Impfstoffe bislang keine Beachtung gefunden. In dieser Arbeit wurde daher als Basis für einen PERV-Impfstoff das unglykosylierte, weniger sequenzvariable Transmembranprotein gewählt. Die Eignung eines rekombinant generierten PERV-p15 zur Induktion einer neutralisierenden Immunantwort sollte untersucht werden. Die Reproduzierbarkeit und statistische Absicherung der Daten sollte in unterschiedliche Spezies erfolgen.
Die Charakterisierung der induzierten Antikörper soll wichtige Hinweise auf den Bindungs- und Neutralisationsmechanismus neutralisierender Antikörper gegen Hüllproteine anderer Retroviren, besonders HIV-1 geben. Durch diese Daten sollte die Grundlage für die Entwicklung geeigneter Peptidantigene gelegt werden.

Zirka 20 Jahre nach der Identifizierung des HI-Virus als Ursache der tödlichen Immunschwächekrankheit AIDS, steht weder eine virusklärende Therapie noch ein effektives prophylaktisches Vakzin zur Verfügung. Alle bisherigen Versuche zur Entwicklung eines Impfstoffes schlugen fehl. Die genaue Untersuchung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus neutralisierenden Antikörper, die aus infizierten Patienten isoliert wurden, könnte ein wichtiger Beitrag zum Design geeigneter Antigene sein.

In dieser Arbeit sollte der monoklonale Antikörper 2F5 durch Bindungsstudien und in vivo-Neutralisationsassays charakterisiert werden. 2F5 bindet an ein hochkonserviertes Epitop im membranproximalen Bereich der gp41-Ektodomäne des HIV-1 und wurde erfolgreich in Studien zum passiven Immuntransfer eingesetzt. Zahlreiche fehlgeschlagene Versuche zur Induktion neutralisierender Antikörper gegen diese Region weisen auf eine weitaus komplexere Beschaffenheit des Epitops hin, als bisher bekannt. Auf der Grundlage der Untersuchungen des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus von 2F5 und PERV-neutralisierender Antikörpern, sollten neue rekombinante und synthetische Antigene entwickelt und in Immunisierungsstudien eingesetzt werden.