III Ergebnisse

Ziel der Arbeiten war die Induktion neutralisierender Antikörper gegen transmembrane Hüllproteine von Retroviren sowie die Aufklärung des Wirkmechanismus solcher Antikörper. In der vorliegenden Arbeit wurde dabei der Schwerpunkt auf das humane Lentivirus HIV und auf das porzine endogene Gammaretrovirus (PERV) gelegt. Durch die Aufklärung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus PERV-neutralisierender sowie des monoklonalen, HIV-neutralisierenden Antikörpers 2F5, sollten wichtige Hinweise zur Konstruktion von Antigenen erlangt und umgesetzt werden, die zur Induktion von neutralisierenden Antikörpern geeignet sind.

	Abb. III.1: Versuchsstrategie zur Induktion neutralisierender Antikörper gegen das porzine endogene Retrovirus (PERV) und das humane Immundefizienzvirus (HIV-1).
	Die Aufklärung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus PERV- bzw. HIV-neutralisierender Antikörper soll Basis für die Entwicklung effektiver Antigene sein, die sich zur Induktion einer schützenden Immunantwort eignen.

Zur Immunisierung von zwei Ziegen (Ziege 16 und 20) wurde die Ektodomäne des transmembranen Hüllproteins p15E rekombinant generiert. Dazu wurde aus PK15-Zellen, einer porzinen Nierenzelllinie, die kodierende Sequenz amplifiziert, in einen Expressionsvektor kloniert und als CBP-Fusionsprotein exprimiert. Durch Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem klonierten Konstrukt um die Sequenz des Hüllproteins von PERV-A handelt. Die Sequenz des rekombinanten p15E ist 100% homolog zu dem in späteren Neutralisationstest eingesetzten PERV-5°-Klon.

Die Aufreinigung des rekombinanten Proteins erfolgte affinitätschromatographisch über das als Fusionsprotein angefügte Calmodulinbindeprotein (CBP). Calmodulin ist ein in allen eukaryontischen Zellen anzutreffendes Protein. Seine Aminosäuresequenz, und die seines natürlichen Liganden, CBP, ist in den unterschiedlichsten Spezies sehr hoch konserviert. Humanes CBP ist zu 100% mit dem der Ratten und Ziegen identisch. Eine Induktion von CBP-bindenden Antikörpern war damit durch die natürliche Toleranz gegen körpereigene Proteine nicht zu erwarten und wurde auch nicht beobachtet.

	Abb. III.2: Schematische Darstellung des zur Immunisierung eingesetzten rekombinanten rp15E.
	Das Molekül ist im linearisierten Zustand dargestellt. Die N-terminale (NHR) und die C-terminale (CHR)- Helixregion sind grau hervorgehoben. Am N-Terminus wurde ein Fusionsprotein angefügt (CBP). Das N-terminale Fusionspeptid sowie der C-terminal gelegene Transmembrandurchgang und zytoplasmatische Teil wurden deletiert.

Western Blot Analyse und ELISA

Durch Western Blot Analyse und ELISA konnte gezeigt werden, dass in beiden Tieren p15E-spezifische Antikörper induziert werden konnten. In den immunchemischen Analysen wird sowohl das virale, wie auch das rekombinant generierte p15E detektiert (Abb. III.3 A). Die Deletion des Fusionspeptids, des Transmembrandurchgangs sowie des zytoplasmatischen Teils beeinflusst also nicht die Bindung der induzierten Antikörper an das virale p15E in der Western Blot Analyse.

Im ELISA wurden in beiden Seren hohe Titer an p15E-spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Eine spezifische Bindung war für beide Immunseren bis zu einer Verdünnung von 1x10⁶ detektierbar (Abb. III.3 B). Damit eigneten sich die induzierten Seren sowie das rekombinante p15E auch sehr gut als Kontrollseren bzw. Antigen für die Entwicklung immunologischer Nachweissysteme, analog zu den derzeit in der klinischen Praxis verbreiteten HIV-Testsystemen.

	Abb. III.3: Immunchemische Analyse der induzierten PERV-p15E-spezifischen Ziegenseren 16 und 20 gegen virales und rekombinantes p15E
	A: Nachweis p15-spezifischer Antikörper durch Western Blot Analyse: im Ziegenserum 20 gegen PERV-A-Viruspräparation (1), gegen affinitätschromatographisch isoliertes virales p15E (2), affinitätschromatographisch gereinigtes rekombinantes rp15E (3); im Ziegenserum 16 gegen PERV-A-Viruspräparation (4), gegen affinitätschromatographisch isoliertes virales p15E (5), affinitätschromatographisch gereinigtes rekombinantes rp15E (6). B: Analyse p15-bindender Antikörper in Präimmunserum (PS) und Immunserum (IS) mittels ELISA in verschiedenen Verdünnungen. Als Antigen wurde rp15E eingesetzt. Um unspezifische Bindungen zu minimieren, wurden die Seren durch acetongetrocknetes E. coli-Pulver adsorbiert. Die Werte wurden als Triplikate gemessen.

Immunfluoreszenz und FACS-Analyse

Zusätzlich wurde die Reaktivität der generierten Seren gegen PERV-5°-infizierte 293-Zellen in der Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) analysiert. Um möglichst native Strukturen zu erhalten, wurden für die Untersuchungen nicht permeabilisierte Zellen verwendet. In beiden Versuchen konnte eine spezifische Bindung der Immunseren an PERV-5°-infizierte Zellen gezeigt werden (Abb. III.4). Die FACS-Analyse zeigte für beide Immunseren eine Bindung p15E-spezifischer Antikörper an ca. 65% der eingesetzten Zellen.

Als Kontrolle wurden die entsprechenden Präimmunseren sowie ein nach gleichem Protokoll generiertes Anti-PERV-Gag-Serum eingesetzt (Ziegenserum 14). Da sich Gag-Proteine ausschließlich im Inneren der Partikel befinden und nicht auf der Virusoberfläche präsentiert werden, sind diese Proteine in nicht permeabilisierten Proben für die Antikörper nicht zugänglich. Folgerichtig konnte hier keine Bindung der anti-Gag-Antikörper an infizierte Zellen detektiert werden. In der FACS-Analyse wurde als zusätzliche Kontrolle ein gegen das TM-Protein von HIV-1 (gp41) induziertes Serum (Ziegenserum 23) eingesetzt. Die Befunde der Immunfluoreszenz konnten in der Durchflusszytometrie zu 100% bestätigt werden. Die Immunseren der Ziegen 16 und 20 binden ca. 65% der infizierten Zellen (Abb. III.4 B).

	Abb. III.4: Reaktivität der generierten Seren gegen PERV-5°-infizierte 293-Zellen in der Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse)
	A: Immunfluoreszenz auf PERV-5°-infizierten nicht permeabilisierten 293-Zellen (Vergrößerung 1:100). B: FACS-Analyse der Immunseren „Ziege16“ (linke Abb.) und „Ziege20“ (rechte Abb.). Als Kontrollen wurden die entsprechenden Präimmunseren, das anti-Gag-Serum „Ziege14“ und das anti-HIV-1-Serum „Ziege23“ eingesetzt. Zusätzlich zum Immunserum der Ziege20 wurden aus dem Serum (durch Affinitätschromatographie) isolierte p15E-spezifische Antikörper verwendet.

Durch diesen Versuch konnte gezeigt werden, dass die Bindungsstellen der induzierten Antikörper auf der Oberfläche sich abschnürender Viruspartikel zugänglich und nicht durch das Oberflächenprotein maskiert sind.

Epitopkartierung der Ziegenseren 16 und 20

Durch Epitopkartierung sollten einerseits Antikörperbindungsstellen identifiziert, andererseits festgestellt werden, wie viele verschiedene Populationen an p15E-bindenden Antikörper innerhalb der rekombinant generierten Ektodomäne induziert wurden.

Die Epitopkartierung erfolgte mit Hilfe einer PepSpot-Membran™. Durch die Anwendung dieser Methode war es möglich, antigene Strukturen bis auf zwei Aminosäuren genau einzugrenzen.

	Abb. III.5: Kartierung der Antikörperbindungsstellen innerhalb der Ektodomäne von p15E mittels PepSpot-Membran.
	Die Epitopkartierung für das Ziegenserum 20 zeigt die Bindung von Antikörpern an die Sequenzen GPQQLEK und FEGWFN (die Lage im p15E ist durch die unterbrochene Linie gekennzeichnet). Wie im Ziegenserum 20, sind im Ziegenserum 16 Antikörper gegen den C-(ITGPQQL) und N-terminalen(GWFEG) Bereich der p15E-Ektodomäne enthalten(die Lage im p15E ist durch die durchgehende Linie gekennzeichnet). Die Bindungsstellen der Antikörper beider Seren sind überlappend und um jeweils zwei Aminosäuren gegeneinander verschoben. Unten dargestellt ist die Sequenz des TM-Proteins des PERV-A. Die Sequenz der zur Immunisierung eingesetzten rekombinanten Ektodomäne ist durch Fettdruck hervorgehoben.

Es konnten in beiden Seren Antikörper gegen jeweils zwei Epitope identifiziert werden, eines im C-terminalen und eines im N-terminalen Bereich der Ektodomäne lokalisiert.

Gegen die immundominante Schleife (IDO), gegen die im Verlauf retroviraler Infektionen (z.B. HIV, FeLV) in der Regel hohe Antikörpertiter gebildet werden, wurden keine Antikörper detektiert.

Ziel der Immunisierungsversuche war die Induktion PERV-neutralisierender Antikörper. Um zu testen, ob die Immunisierung zweier Ziegen mit rekombinanten p15E zur Induktion PERV-neutralisierender Antikörper geführt hat, wurde ein in vitro Neutralisationsassay auf Basis des Nachweises der Provirusintegration durch PCR angewendet.

Für beide Immunseren konnte eine deutliche Hemmung der Provirusintegration nachgewiesen werden. Der Neutralisationstiter der Immunseren wurde aus der Differenz des Titers in Anwesenheit des Präimmunserums und des Immunserums bestimmt. Für das Ziegenserum 20 beträgt der neutralisierende Titer 1x10^1,96, für die aus dem Ziegenserum 20 affinitätschromatographisch isolierten p15E-spezifischen Antikörper1x10^2,41 und für das Serum der Ziege 16 1x10^1,69. Die angegebenen Neutralisationstiter wurden bei einer Serumverdünnung von 1:10, bzw. in Anwesenheit von 20µg/ml spezifischer Antikörper bestimmt.

	Abb. III.6: In vitro Neutralisationsassay zur Bestimmung PERV-neutralisierender Aktivität der generierten Seren.
	Ausverdünnung (von links nach rechts 1:2, beginnend mit 1x104,16 TCID50) von PERV 5°-Virusüberstand auf 293-Zellen in Anwesenheit von Medium, Präimmunserum, Immunserum und affinitätschromatographisch aufgereinigten Antikörpern (nur aus dem Ziegenserum 20). Detektiert wurde provirale DNA (mittels PCR). Der Test wurde nach Standardprotoll durchgeführt. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen, jeweils eine Verdünnungsreihe ist hier exemplarisch dargestellt.

Ziel der weiteren Versuche war die genauere Charakterisierung der im Ziegenserum 20 enthaltenen neutralisierenden Antikörper. Dieses Serum zeigte von allen generierten Seren den höchsten Neutralisationstiter (Tab. III.1), die Blutentnahmen erfolgten regelmäßig über einen Zeitraum von zwei Jahren. Das Serum zeigte über den gesamten Zeitraum einen konstant hohen Neutralisationstiter. Ein möglichst hoher Titer von neutralisierenden Antikörpern im Serum über einen langen Zeitraum ist ein wichtiges Kriterium für die Induktion eines effektiven Impfschutzes (Kapitel 4.1).

Durch die Epitopkartierung konnten zwei Sequenzen innerhalb von p15E identifiziert werden, eine im N-terminalen und eine im C-terminalen Bereich der Ektodomäne (Abb. III.5). Durch die weiteren Untersuchungen sollte ermittelt werden, welche der beiden Bindungsstellen ein neutralisationskompetentes Epitop darstellt. Dazu wurden von den Epitopen E1 und E2 abgeleitete Peptide verwendet.

Die Bindungsuntersuchungen im ELISA zeigten, dass die im Serum enthaltenen Antikörper nur relativ schwach an die Einzelpeptide E1 und E2 binden. Auffällig ist die synergistisch gesteigerte Bindung der Antikörper an die Kombination beider Peptide, deutlich über den erwarteten additiven Effekt der Bindung an die beiden Einzelpeptide hinaus (Abb. III.7). Nur durch die kombinierte Adsorption der Peptide E1 und E2 konnte eine ähnlich hohe Absorption wie an rp15E beobachtet werden. Dieser Effekt ließ sich durch die Inkubation in Anwesenheit von Harnstoff noch deutlicher darstellen. Wurde das Serum in Anwesenheit von 2M Harnstoff inkubiert, kann an die einzeln adsorbierten Peptide keine spezifische Bindung mehr detektiert werden, wogegen die Bindung an die Kombination beider Peptide nur um ca. 35% abnimmt.

	Abb. III.7: : Bindung p15E-spezifischer Antikörper aus dem Ziegenserum 20 an die synthetischen Peptide PERV-E1 und -E2 im ELISA.
	Linker Graph: Bindung an die Einzelpeptide, an die Kombination der Peptide E1 und E2, an das ISU Peptid (Kontrollpeptid) und an rekombinantes p15E. Die Kombination beider Peptide hatte eine deutlich gesteigerte Bindung der im Ziegenserum 20 enthaltenen p15E spezifischen Antikörper zur Folge. Ein additiver Effekt wurde dabei durch die Kombination beider Antigene deutlich übertroffen. Rechter Graph: Inkubation des Serums in Gegenwart verschiedener Harnstoffkonzentrationen mit E1, E2 und auf den zusammen adsorbierten Peptiden E1+E2. Die synergistisch gesteigerte Bindung der p15E-spezifischen Antikörper an die Kombination der Antigene, konnte bei höheren Harnstoffkonzentrationen noch deutlicher dargestellt werden.

Um die möglicherweise die zwei im Ziegenserum 20 enthaltenene Antikörperpopulationen zu trennen, wurden die von den identifizierten Epitopen abgeleiteten Peptide E1 und E2 an Sepharose gekoppelt und eine Säule zur affinitätschromatographischen Trennung hergestellt. Um den Erfolg der Kopplung zu überprüfen, wurden geringe Mengen des Säulenmaterials in SDS-Probenpuffer aufgekocht und durch SDS-PAGE analysiert. Als Vergleich wurde eine rp15E-gekoppelte Sepharose herangezogen, mit der bereits in vorangegangenen Versuchen größere Mengen spezifischer Antikörper isoliert werden konnten. Für alle drei Kopplungen konnte eine annähernd identisch hohe Kopplungseffizienz nachgewiesen werden (nicht dargestellt).

Durch die Affintätschromatographie des Immunserums der Ziege 20 konnte keine Trennung möglicher Antikörperpopulationen erreicht werden. Von beiden Säulen konnten nur relativ geringe Antikörpermengen eluiert werden. Die eluierte Proteinmenge aller Fraktionen betrug jeweils ca. 400µg. Aus dem gleichen Volumen konnten in vorhergehenden Versuchen ca. 7mg p15E-spezifische Antikörper isoliert werden. Die Eluate beider Säulen unterschieden sich nicht in ihrer Reaktivität untereinander und zum Ausgangsmaterial (Abb. III.8). Der Versuch zeigt, dass durch Affinitätschromatographie keine Trennung verschiedener Antikörperpopulationen erreicht werden konnte.

Die schwach affine Bindung E1/E2-spezifischer Antikörper an die Einzelpeptide wurde bereits in den ELISA-Bindungsstudien beobachtet. Die Daten dieses Versuches bestätigen die in Abb. 3.7 dargestellten Daten der Bindungsstudien.

	Abb. III.8: Affinitätschromatographische Trennung E1- und E2-spezifischer Antikörper.
	Die eluierten Antikörper von der E1-Säule (anti-E1) und der E2 Säule (anti-E2) wurden im ELISA auf ihre Spezifität gegen rekombinantes p15E (rp15E) und die synthetischen Peptide E1/E2 untersucht. Verglichen wurde mit dem Präimmunserum (Prä20) und dem Immunserum der Ziege 20 (IS20), das als Ausgangsmaterial verwendet wurde.

In ELISA-Bindungsstudien konnte eine Interaktion zwischen den synthetischen Peptide E1 und E2 gezeigt werden. Im Vergleich zu den Einzelpeptiden führte die kombinierte Adsorption beider Peptide an die polymere Matrix der ELISA-Platten zu einer synergistischen Bindung des Ziegenserums 20 (Abb. III.7). Die Interaktion beider Peptide ist ein Hinweis auf die Bildung eines Konformationsepitops.

Durch diesen Versuch sollte untersucht werden, ob sich der im ELISA beobachtete Effekt auch in einem in vitro-Neutralisationsassay darstellen lässt. Je nach Neutralisationskompetenz der identifizierten Epitope, sollte die neutralisierende Aktivität der im Serum enthaltenen Antikörper durch die Zugabe von rp15E, Peptid E1, Peptid E2 sowie durch die Kombination beider Peptide verschieden stark gehemmt werden.

Durch diesen Versuch sollten drei wesentliche Fragestellungen untersucht werden:

1. Die Hemmung der PERV-Neutralisation durch rp15E und von den identifizierten Epitopen abgeleitete Peptide sollte sicherstellen, dass die Neutralisation auf p15E-spezifische Antikörper zurückzuführen ist. Die Hemmung der Provirusintegration wurde in vorhergehenden Versuchen für dekomplementiertes Immunserum sowie für affinitätschromatographisch gereinigte Antikörper gezeigt. Lässt sich dieser Effekt durch die Zugabe des zur Immunisierung eingesetzten Antigens (rp15E) bzw. durch die von den Epitopen abgeleiteten Peptide, (E1/E2) aufheben, kann die Anwesenheit unspezifischer virusinhibierender Faktoren, wie z.B. Zytokine, ausgeschlossen werden.
2. Wie viele Antikörperpopulationen wurden durch die Immunisierung mit rp15E induziert und kann die neutralisierende Aktivität einem E1- bzw. E2-spezifischen Antikörper zugewiesen werden? Können durch die Epitopkartierung die Bindungsstellen aller im Serum enthaltenen Antikörper dargestellt werden? Ist die Neutralisation ausschließlich auf die Bindung an die den N-terminalen (E1) bzw. an den C-terminalen (E2) Bereich zurückzuführen, sollte die gehemmte TCID50 durch die Peptide der durch rp15E entsprechen.
3. Lässt sich der im ELISA beobachtete synergistische Effekt auch in einem in vitro Neutralisationsassay darstellen? Aus einer synergistischen Bindung der Peptide an die im Serum enthaltenen Antikörper sollte eine synergistisch gesteigerte Hemmung der PERV-neutralisierenden Wirkung des Immunserums resultieren.

	Abb. III.9: Hemmung der PERV-neutralisierenden Aktivität des Ziegenserums 20 durch rp15E und die synthetischen Peptide E1 und E2 im in vitro-Neutralisationsassay.
	Die Hemmung der PERV-Provirusintegration kann nur durch das zur Immunisierung eingesetzte rp15E und die Kombination der synthetischen Peptide E1 und E2 aufgehoben werden. Die Zugabe der Einzelpeptide hat keinen (E1) bzw. nur einen geringen Effekt (E2). Die Peptide und rp15E wurden im gleichen molaren Verhältnis eingesetzt. Die Berechnung der TCID50 und der Standardabweichungen (in Klammer angegeben) erfolgte aus drei Einzelwerten.

Die neutralisierende Wirkung des Ziegenserums 20 konnte durch die Zugabe von rp15E deutlich gehemmt werden. Eine vollständige Aufhebung wurde weder durch rp15E noch durch die synthetischen Peptide beobachtet. Peptide (0,8µg/ml) und rp15E (8µg/ml) wurden in einem molaren Überschuss von 4:1 zum Antikörper (20µg/ml) eingesetzt. Das entspricht einem Antigen-Paratop-Verhältnis von 2:1, da ein Antikörper über zwei identische Paratope verfügt. Möglicherweise kann die Hemmung der Neutralisation durch größere Antigenmengen und eine Vorinkubation der Antikörper mit dem Antigen bis zur vollständigen Aufhebung der Neutralisation verstärkt werden.

Durch die Zugabe der Einzelpeptide wurde keine signifikante Hemmung der Neutralisation beobachtet. Bei Kombination beider Peptide konnte, korrelierend zu den Befunden der ELISA-Bindungsstudien, eine synergistische Hemmung festgestellt werden. Die Hemmung der PERV-Neutralisation des Serums durch die Kombination der Peptide E1/E2, entspricht annähernd der Hemmung durch rp15. Die TCID50-Werte sind mit Standartabweichung in Abb. 3.9 dargestellt.

Die Daten der ELISA-Bindungsstudien (Abb. III.7) und des in vitro Neutralisationsassays (Abb. III.9) suggerieren die Bildung eines Konformationsepitops. Strukturmodelle des transmembranen Hüllprotein von HIV-1 (gp41) postulierten während des Infektionsvorgangs ein Klappmechanismus, durch den sich die beiden Helices zusammenlagern (Binley und Moore, 1997) und so die Annäherung der Wirtszellmembran zur viralen Membran vermitteln. Die an diesem Vorgang beteiligten Bereiche wiesen große strukturelle Homologien zu den transmembranen Hüllproteinen anderer Retroviren auf (z.B. FeLV, MuLV, PERV), so dass auch für das Transmembranhüllprotein von PERV eine offene Konformation im nativen Zustand angenommen wurde, die sich während des Infektionsvorganges zu einem Sechs-Helix-Bündel ausbildet. Von diesem Modell ausgehend, ist die Interaktion der Bereiche E1 und E2 zu einem Konformationsepitop erst während des Infektionsvorgangs möglich.

Die in dieser Arbeit durchgeführten FACS-Analysen und Immunfluoreszenz zeigten eine Bindung der Antikörper an sich abschnürende Viruspartikel (siehe 3.1.1.). Diese Daten weisen auf die Zugänglichkeit zumindest einer Antikörperbindungsstelle im nativen Virus hin. Wenn die induzierten PERV-neutralisierenden Antikörper das native Virus binden, wäre eine gesteigerte Neutralisation durch die Vorinkubation des Virus mit dem Ziegenserum 20 in Abwesenheit der Wirtszellen zu erwarten.

Der Versuch zeigte, dass die Vorinkubation keinen Einfluss auf das neutralisierende Potential des Ziegenserums 20 hatte. Der leichte Abfall der Provirusintegration mit länger andauernder Vorinkubation ist auch im Kontrollansatz (Vorinkubation mit Präimmunserum) zu beobachten und war damit nicht auf mehr spezifische Bindungen neutralisierender Antikörper an p15E zurückzuführen. Möglicherweise lag die Ursache hierfür in der äußerst schwachen affinen Bindung der Antikörper an die Einzelepitope.

	Abb. III.10: Einfluss der Vorinkubation der PERV-Überstände mit Präimmun- und Immunserum der Ziege 20.
	Die Virusüberstände und das Immunserum der Ziege 20 (1:10) wurden bei 37°C im Zellkulturbrutschrank in Abwesenheit der Wirtszellen vorinkubiert. Es ist keine signifikante Steigerung der PERV-Neutralisation nach Vorinkubation zu beobachten. Alle Werte wurden im in vitro Neutralisationsassay als Triplikate mittels PCR bestimmt.

Durch die Immunisierung mit rekombinant hergestellten p15E konnten PERV-neutralisierende Antikörper in zwei Ziegen induziert werden. In beiden Immunseren konnten Antikörper gegen den C-terminalen sowie den N-terminalen Bereich der Ektodomäne identifiziert werden (3.1.2.). Die Untersuchung des Ziegenserums 20 ergab, dass es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um ein neutralisierendes Konformationsepitop handelt, das von diesen beiden Bereichen während des Infektionsvorgangs gebildet wird.

Um diese Daten in einem anderen Tiermodell zu reproduzieren, wurden neun Wistar-Ratten mit dem gleichen Antigen immunisiert. Alle Tiere bildeten bereits nach der ersten Immunisierung hohe Titer an bindenden Antikörpern, die sich durch die Auffrischung (Boost) nach drei Wochen nur wenig erhöhten (Abb. III.11).

Ein effektiver Schutz vor einer möglichen Infektion setzt eine möglichst 100%ige Effektivität des eingesetzten Impfstoffes voraus. Alle gegen rp15E immunisierten Ratten bildeten hohe Titer an p15E-spezifischen Antikörpern. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die Seren ebenfalls PERV-neutralisierende Aktivität besitzen.

Die Präimmun- und Immunseren aller Versuchstiere wurden im in vitro Neutralisationsassay getestet. In allen Seren konnte PERV-neutralisierende Aktivität detektiert werden (Tab. III.1). Die Neutralisationstiter wurden aus der Differenz der Immunseren zu den jeweiligen Präimmunseren errechnet.

	Abb. III.11: Nachweis p15-spezifischer Antikörper im ELISA
	Alle Ratten bildeten bereits nach der ersten Immunisierung mit rp15E hohe Titer an bindenden Antikörpern. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen.

Tab. III.1: Neutralisationstiter der PERV-spezifischen Seren: 

Zur Induktion von PERV-spezifischen Antikörpern wurden verschiedene, aus dem Virus isolierte, abgeleitete Peptide oder rekombinant hergestellte Antigene verwendet. Neutralisierende Aktivität konnte nur in Seren festgestellt werden, die gegen rekombinantes p15E erzeugt wurden. Die Neutralisationstiter dieser Seren sind in Abbildung 3.12 vergleichend gegenübergestellt. In der Tabelle sind alle generierten PERV-spezifischen Seren zusammengefasst. In Seren gegen das Gag p27 oder gegen von p15E abgeleitete Peptide konnten keine PERV-neutralisierenden Antikörper nachgewiesen werden.

Epitopkartierung rp15E-spezifischer Rattenseren:

Analog zu den Immunseren der Ziegen sollte auch für die generierten Rattenseren eine Epitopkartierung durchgeführt werden. Für beide Ziegenseren konnten annähernd identische Antikörperbindungsstellen in der p15E-Ektodomäne identifiziert werden.

	Abb. III.12: Epitopkartierung PERV-neutralisierender Seren (Ziegenserum 16 und 20, Wistar-Ratten Gruppe A-C).
	Dargestellt ist die gesamte Sequenz des TM-Proteins, grau unterlegt die Sequenz der zur Immunisierung eingesetzten Ektodomäne (rp15E). Die von den einzelnen Seren gebundenen Sequenzen sind mit schwarzen Balken gekennzeichnet. Es wurde eine PepSpot-Membran (Jerini Biotools, Berlin) verwendet.

In allen Seren konnten Antikörper gegen den membranproximalen Bereich der Ektodomäne detektiert werden (E2-Epitop). Wobei die Epitope in einem Bereich von ca. 15 Aminosäuren von C-Terminus lokalisiert sind (AS121-136). Im N-terminalen Bereich konnten nur für fünf von insgesamt elf Immunseren Epitope identifiziert werden.

Die Verwendung von Peptidvakzinen kann entscheidende Vorteile haben. Besonders bei in Bakterien produzierten Proteinen kann die Abreicherung von unerwünschten Nebenprodukten, wie z.B. Lipopolysacchariden, aufwändig und teuer sein. Durch das Angebot einzelner, neutralisierender Sequenzen könnte die Effektivität einer Immunisierung erhöht werden. In den ELISA-Studien und im in vitro-Neutralisationsassay konnte eine Interaktion der Peptide PERV-E1 und -E2 mit den neutralisierenden Antikörpern aus dem Ziegenserum 20 gezeigt werden. Auch der Versuch der affinitätschromatographischen Trennung möglicher Antikörperpopulationen wies auf die Bildung eines Konformationsepitops hin.

Ziel des Versuches war die Nachbildung dieses diskontinuierlichen Epitops durch abgeleitete Peptide. Dazu wurden die Peptide an verschiedene Träger wie BSA, KLH oder Dextran gekoppelt. Um eine möglichst variable Ausrichtungen der Peptide zu ermöglichen, wurden verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Alternativ zur Kopplung an Trägermoleküle wurde mit über Cysteinbrücken gebildeten Di- bzw. Trimeren immunisiert. Für diese Versuche wurden 15mere bzw. 25mere Peptide eingesetzt (Tab. III.2)

Tab. III.2: Immunisierung von Wistar-Ratten mit von den identifizierten Epitopen (PERV-E1 u. PERV-E2) abgeleiteten synthetischen Peptiden.

Zur Generation der Antigene wurden 15mere (PERV-E1/E2) bzw. 25mere (PERV-E1/E2-Cys) verwendet. Die Kopplung erfolgte an BSA (Bovine Serum Albumin), KLH (keyhole limpet hemocyanin) oder an aktiviertes Dextran (MW: 6kDa). Die Immunisierung mit BSA oder KLH-Peptidkonjugaten induzierte keine im ELISA messbaren Antikörpertiter. Während durch die Immunisierung mit Dextran-Peptid-Konjugaten relativ hohe Titer an bindenden Antikörpern induziert wurden, konnte in keinem der generierten Seren PERV-hemmende Aktivität nachgewiesen werden

An ein effektives Vakzin wird die Anforderung gestellt, Schutz gegen möglichst alle Subtypen des Erregers zu induzieren. Derzeit sind drei Subtypen (PERV A, B und C) des porzinen endogen Retrovirus beschrieben. Nur die Subtypen A und B können humane Zellen infizieren. Die identifizierten Epitope E1 und E2 sind bei allen drei PERV-Subtypen stark konserviert (Tab. IV.1). Im in vivo-Neutralisationsassay konnte gezeigt werden, dass alle PERV-A neutralisierenden Seren auch den Subtyp B neutralisieren (Tab. III.3).

Besonders der membranproximale E2-Bereich ist bei allen Retroviren relativ stark konserviert, dagegen gibt es im E1-Bereich starke Abweichungen (Tab. IV.1). In vorangegangenen Versuchen konnte eine Interaktion zwischen dem E1 und E2-Bereich gezeigt werden. Seren, die ausschließlich gegen den E2-Bereich induziert wurden, sind nicht neutralisierend. Erwartungsgemäß wurden verwandte, in der E1-Sequenz stark abweichende Retroviren durch PERV-p15E spezifische Seren nicht neutralisiert.

Gleichzeitig konnte mit diesem Versuch gezeigt werden, dass es sich bei der replikationshemmenden Aktivität der induzierten Seren um eine PERV-spezifische Neutralisation handelt.

Tab. III.3: Test PERV-A neutralisierender Seren auf Kreuzreaktivität gegen den PERV-Subtyp B, FeLV-A, Mo-MuLV und HIV-1 IIIB. 

Nur PERV-B wurde durch die induzierten Seren neutralisiert. Die engverwandten Gammaretroviren FeLV und MuLV wurden trotz hoher Sequenzhomologie im E2-Bereich nicht neutralisiert. Auch gegen das Lentivirus HIV-1 konnte keine virushemmende Aktivität detektiert werden.

Für den Nachweis der PERV-Provirusintegration wurde ein Neutralisationsassay auf Basis einer Endpunktbestimmung etabliert. Der Nachweis proviraler DNA erfolgte durch PCR. Dazu wurden die Zellen nach der Infektion mehrmals passagiert um eine ausreichende Anreicherung proviraler DNA zu gewährleisten. Zur Quantifizierung der hemmenden Wirkung der Immunseren wurden in Anwesenheit konstanter Serummengen die Virusüberstände titriert. Dieses Verfahren erforderte große Mengen an Probenmaterial und aufwändige Zellkulturarbeiten.

	Abb. III.13: Entwicklung eines Realtime-PCR-Assays zum quantitativen Nachweis der PERV-Provirusintegration.
	Nachweis verminderter PERV-Provirusintegration durch Zugabe der Immunseren der Ziege 20 (Abb. A) und Ziege 16 (Abb. B). Als Kontrollen wurden Präimmunserum und uninfizierte 293-Zellen mitgeführt. Um die Hemmung quantifizieren zu können, wurde das Zelllysat infizierter Zellen (ca. 2x103 Zellen) auf dem Lysat uninfizierter Zellen (no Template) ausverdünnt. In diesem Versuch konnte bis zu einer Verdünnung von 1: 8192 ein spezifisches Signal detektiert werden. Das entspricht 0,25 Zellen im Reaktionsansatz. Der Anstieg des Graphen beträgt 1,0703, das entspricht annähernd einer 100%igen Effizienz (n=1) der PCR (Abb.C). Mit Hilfe des ermittelten Korrekturfaktors (Abb.C) kann die beobachtete Hemmung der Virusreplikation durch Zugabe des Immunserums (Abb. A und B) in Prozent dargestellt werden (Abb.D). Alle Werte wurden als Triplikate gemessen. Die Seren wurden in einer Verdünnung von 1:10 eingesetzt.

Die Detektion erfolgte durch PCR, wobei Triplikat-Messungen 36 Reaktionsansätze pro Serumprobe erforderten. Dieses Verfahren erwies sich, aufgrund der aufwändigen Zellkulturarbeiten als sehr zeit- und kostenintensiv und verhindert so einen hohen Probendurchsatz. Deshalb wurde zur Vereinfachung des Verfahrens ein Realtime-PCR-Assay etabliert. Die Quantifizierung proviraler DNA ist damit bereits 72 Stunden nach der Infektion möglich, das Passagieren der Zellen entfällt und pro Serumsprobe sind nur noch drei Reaktionsansätze notwendig. Grundlage der Quantifizierung der neutralisierenden Wirkung eines Immunserums im Vergleich zum entsprechenden Präimmunserum, ist die Verschiebung des ct-Wertes.

Die Versuche zur Induktion PERV-neutralisierender Antikörper zeigen, dass das transmembrane Hüllprotein von Retroviren generell zur Induktion neutralisierender Antikörper geeignet ist. Besonders die Isolation breitneutralisierender, gp41-spezifischer Antikörper aus HIV-Patienten (2F5 und 4E10) stützt diese These. Diese Antikörper binden den gleichen membranproximalen Bereich der Ektodomäne wie die durch rp15E induzierten PERV-neutralisierenden Antikörper. Die Übertragung der Erkenntnisse zum Neutralisationsmechanismus PERV-neutralisierender Antikörper, sowie die genaue Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 2F5 könnte die Basis für die Generation neuer Impfkonstrukte sein.

Analog zur Immunisierung gegen PERV-p15E wurde die Ektodomäne des TM-Proteins des HIV-1 gp41 rekombinant generiert und zur Immunisierung eingesetzt (Wistar-Ratten N1-3 und M2). Dieses Konstrukt wird im Folgenden CBP-rgp41 genannt. Das Expressionsprodukt präzipitierte in wässriger Lösung und konnte daher nicht wie PERV-rp15E affinitätschromatographisch aus dem Zelllysat isoliert werden. Um das gewünschte Antigen anzureichern, wurden die unlöslichen Rückstände mehrmals mit PBS gewaschen und in 8M Harnstoff in Lösung gebracht. Durch Harnstoff/PBS-Fällung konnte der überwiegende Teil unerwünschter E.coli-Proteine entfernt werden. Durch dieses Verfahren konnte CBP-rgp41 bis auf ca. 70% der Gesamtproteinmenge angereichert werden. Die Koreinigung eines ca. 40kDa großen E.coli-Proteins mit ähnlichem Löslichkeitsverhalten konnte mit dieser Methode nicht verhindert werden (Abb. III.14).

Parallel zu diesem Versuch wurde ein von der Firma Roche erhaltenes gp41 eingesetzt, das hier im Folgenden als Roche-gp41 bezeichnet wird. Dieses ebenfalls rekombinant hergestellte gp41 ist mit einem ca. 60kDa großen Fusionsprotein versehen, durch das die Löslichkeit in wässriger Umgebung deutlich erhöht wird (Scholz et al., 2005). Wie das CBP-gp41-Konstrukt enthält es die Ektodomäne ohne Fusionspeptid, abgeleitet von HIV-1 (NL 4-3). Eine schematische Darstellung der Konstrukte ist in Abb. III.14 dargestellt.

	Abb. III.14: Schematischer Aufbau des zur Immunisierung verwendeten rekombinanten gp41.
	Zur Immunisierung wurden zwei, vor allem in den Fusionsproteinen unterschiedliche Konstrukte, eingesetzt. In beiden Konstrukten ist das N-terminale Fusionspeptid sowie der C-terminale Transmembrandurchgang und der zytoplasmatische Teil deletiert. Unterschiede waren vor allen in der Löslichkeit zu beobachten. Das Größenverhältnis zwischen der gp41-Ektodomäne und dem Fusionsanteil ist durch diese Darstellung nicht wiedergegeben.

Die Expressionsprodukte wurden durch SDS-PAGE und Western Blot Analyse charakterisiert. In der Western Blot Analyse zeigte mAb2F5 eine starke Bindung an das CBP-rgp41 und eine relativ schwache Bindung an das Roche-gp41 (Abb. III.15).

	Abb. III.15: Generierung der rekombinanten Ektodomäne von gp41 als CBP-Fusionsprotein. A: SDS-PAGE/Coomassie-färbung.
	Auftrag: Spur1: Roche-gp41 (ca.75kDa), Spur2: CBP-gp41. B.: Western Blot Analyse mit mAb2F5 (1:20000). Auftrag wie in der SDS-PAGE.

Vier Wistar-Ratten wurden mit CBP-rgp41, sieben mit dem Roche-gp41 nach dem Standartprotokoll immunisiert. Getestet wurden die Seren 21 Tage nach der zweiten Immunisierung (Boost). In allen Seren konnten spezifische Antikörper gegen gp41 detektiert werden (Abb. III.17). Um eine möglichst genaue Titerbestimmung der im Serum enthaltenen gp41-spezifischen Antikörper zu erhalten, wurde die Ausverdünnung der Seren auf dem jeweils anderen Antigen im ELISA durchgeführt. Dadurch sollte eine Abschätzung ermöglicht werden, in welchem Maß Antikörper gegen als Verunreinigung im Immunisierungsmaterial enthaltene E.coli-Proteine bzw. die angefügten Fusionsproteine induziert wurden.

Durch die Immunisierung mit CBP-rgp41 konnten in allen Ratten hohe Titer an gp41-spezifischen Antikörpern induziert werden. In allen Seren konnte eine spezifische Bindung an gp41 bis zu einer Verdünnung von 1:10⁵ detektiert werden. Die Unterschiede in Abhängigkeit vom adsorbierten Antigen sind dabei relativ gering, so dass man davon ausgehen kann, dass der überwiegende Teil der induzierten Antikörper gegen gp41 induziert wurde.

Durch die Immunisierung mit dem Roche-gp41 konnten ebenfalls hohe Titer an gp41-spezifischen Antikörpern induziert werden. Die deutlich geringere Bindung der anti-Roche-gp41-Seren an das CBP-gp41 deutet jedoch auch auf die Induktion von Antikörper gegen den Fusionsanteil hin (s.Abb. III.16). Diese Antikörper binden zwar das zur Immunisierung eingesetzte Roche-gp41, jedoch nicht das CBP-gp41 (Abb. III.16B). Der Unterschied in der Bindung an CBP-gp41 zwischen den beiden Gruppen (Abb. III.16A), weist auf geringere Titer an gp41-spezifischen Antikörper in den anti-Roche-gp41-Seren hin.

	Abb. III.16: Nachweis gp41-bindender Antikörper in den generierten Seren durch ELISA.
	Die Immunseren wurden in den Verdünnungen 1:103, 1:104, 1:105 und 1:106 eingesetzt. Die Präimmunseren in einer Verdünnung von 1:103. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen. A: Im ELISA bindende Antikörper gegen das zur Immunisierung der Tiere N1-3 und M2 eingesetzte CBP-rgp41. B: Im ELISA bindende Antikörper gegen das zur Immunisierung der Tiere J1-3, L1-3 und M3 eingesetzte Roche-gp41. Bis zu einer Verdünnung von 1:105 ist in allen Immunseren im Vergleich zu den jeweiligen Präimmunseren eine spezifische Bindung an gp41 detektierbar.

Alle generierten Seren wurden auf HIV-1-neutralisierende Aktivität untersucht. Für den Test wurden die Boost-Seren in einer Verdünnung von 1:16 eingesetzt. Als HIV-neutralisierend wurden Seren gewertet, die im Vergleich zum jeweiligen Präimmunserum mindesten 75% (∆ct>2) weniger Provirusintergration bewirkten. Für keines der induzierten Seren konnte nach den festgelegten Kriterien eine virushemmende Wirkung nachgewiesen werden.

Für die generierten Seren wurde eine Epitopkartierung durchgeführt. In allen Seren konnten Antikörper gegen den N-terminalen Bereich (E1-Bereich) der Ektodomäne nachgewiesen werden. In Anhängigkeit von dem zur Immunisierung eingesetzten Konstrukt wurde ca. 15 bis 55 Aminosäuren C-terminal vom Cysteinloop gelegen ein zweites Epitop im CHR-Bereich detektiert, wobei die Seren der Tiere J1, L2, L3 und M3 (gegen Roche-gp41 immunisiert) keine Antikörper gegen den CHR-Bereich enthielten. In keinem Serum konnten bindende Antikörper gegen den membranproximalen Bereich der Ektodomäne (E2-Bereich/2F5- oder 4E10-Epitop) nachgewiesen werden.

	Abb. III.17: Epitopkartierung der generierten HIV-1-gp41 spezifischen Immunseren.
	Dargestellt ist die Aminosäuresequenz der gp41-Ektodomäne. Die Tiere N1-3 und M2 wurden mit CBP-gp41, Tiere J1-3, L1-L3 und M3 mit Roche-gp41 immunisiert. Die Erkennungssequenzen der monoklonalen Antikörper 2F5(ELDKWA) und 4E10(NWFNIT) sind unterstrichen.

Die vollständige Aufklärung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus von 2F5 könnte ein wichtiger Beitrag zur Konstruktion von Antigenen sein, die in der Lage sind solche Antikörper zu induzieren.. Die Tatsache, dass durch Immunisierung mit Peptiden, die den Epitopen 2F5 und 4E10 entsprechen, keine neutralisierenden Antikörper induziert werden konnten, legt die Vermutung nahe, dass die Antikörper an Konformationsepitope binden.

Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des Neutralisations- und Bindungsmechanismus von 2F5. Die Erkenntnisse, die bei der Untersuchung des Wirkmechanismus der PERV-neutralisierenden Antikörper gesammelt wurden, wurden in die Versuchsplanung mit einbezogen werden.

Für 2F5 wurde eine Bindung an das lineare Epitop ELDKWA im membranproximalen Bereich der Ektodomäne von gp41 beschrieben (Muster et al., 1995). Diese Sequenz konnte von verschiedenen Arbeitsgruppen durch ELISA und Western Blot Analysen mit überlappenden Peptiden bestätigt werden.

In den durchgeführten Experimenten (Western Blot Analyse und ELISA) konnte die spezifische Bindung von mAb2F5 an ELDKWA-enthaltene Peptide (T20/DP178/NIH-6373) bestätigt werden (Abb. III.18,Abb. III.20). Es wurde jedoch eine deutliche stärke Bindung des Antikörpers an die rekombinant exprimierte gp41-Ektodomäne beobachtet. Die Präsentation des ELDKWA-Epitopes im Molekül der gp41-Ektodomäne führte, im Vergleich zur Präsentation in abgeleiteten Peptiden, zu einer deutlich gesteigerten Bindung von 2F5 (Abb. III.18).

	Abb. III.18: Vergleich der Bindung von 2F5 an DP178 und die gp41-Ektodomäne
	A: SDS-PAGE, Detektion der aufgetrennten Proteine durch Coomassie-Färbung. Das rekombinante gp41 bildet Dimere; B: Detektion von DP178 und gp41 durch Western Blot Analyse mit 0,5µg mAb 2F5. In beiden Versuchen wurden identische Proteinengen von DP178 (25µg) und rgp41 (10µg) aufgetragen. C: Vergleich der Bindung von 2F5 an T20/DP178 und rgp41 im ELISA. Als Kontrollen wurde das HIV-ISU-Peptid und rp15E von PERV eingesetzt. Der mAb 2F5 bindet im ELISA deutlich besser an das rgp41 als an das das ELDKWA-enthaltende T20/DP178. Keine Bindung erfolgte an das im gleichen E.coli-Stamm exprimierte rp15E und das HIV-ISU-Peptid. Die Proteine wurden in äquimolaren Mengen aufgetragen. ELISA-Werte wurden als Triplikate gemessen.

Um diese Beobachtung genauer zu untersuchen, wurde, wie schon bei der Kartierung von Epitopen bei PERV-p15E, eine PepSpot-Membran zur genauen Epitopkartierung verwendet. Durch fraktioniertes Blotten erlaubt diese Methode bedingt auch die Identifizierung von diskontinuierlichen Epitopen. Des Weiteren verfügen die auf der PepSpot-Membran am C-Terminus über einen Acetyl-Linker immobilisierten Peptide über eine höhere Beweglichkeit als die an ELISA-Platten adsorbierten Peptide, was zu einer bessern Ausbildung von schwachen Bindungen führen kann.

Durch diesen Versuch wurde die bereits veröffentlichte Sequenz des 2F5-Epitops bestätigt. Eine Bindung an weitere Sequenzen des gp41 wurde nicht beobachtet (Abb. III.19).

	Abb. III.19: Epitopkartierung des monoklonalen Antikörpers 2F5 unter Verwendung einer PepSpot-Membran.
	A: Bindung von 2F5 (200ng/ml) an die PepSpots 63-67. Eine Bindung an weitere PepSpots wird nicht detektiert. B: Sequenz der detektierten PepSpots. Alle Peptide enthalten ELDKW als gemeinsame Sequenz.

Die im Kapitel 3.4.1. gezeigten Daten implizieren, dass neben dem bereits identifizierten Epitop (ELDKWA) weitere Sequenzabschnitte innerhalb der gp41-Ektodomäne zur Bindung von 2F5 beitragen. Durch die Epitopkartierung konnte eine solche Sequenz jedoch nicht identifiziert werden. Durch ELISA-Bindungsstudien mit überlappenden Peptiden sollte untersucht werden, ob bindungssteigernde Sequenzen im Env- oder Gag-Protein identifiziert werden können.

Die Untersuchung zum Wirkmechanismus PERV-neutralisierender Antikörper zeigte die mögliche Interaktion zwischen den N- und C-terminal gelegenen Bereichen der Ektodomäne des Transmembranproteins. Diese Interaktion konnte durch in vitro-Neutralisationsassays sowie im ELISA dargestellt werden. Durch diese Versuche sollte überprüft werde, ob für den monoklonalen Antikörper 2F5 ein ähnlicher Bindungsmechanismus nachgewiesen werden kann.

Zunächst wurde mit einer Peptidbibliothek eine Epitopkartierung mittels ELISA durchgeführt. Die Peptidbibliothek besteht aus sich um jeweils 11 Aminosäuren überlappenden 15meren Peptiden und umfasst die komplette Sequenz des Env-Komplexes sowie des Gag-Proteins. Die Durchmusterung dieser Peptidbibliothek zeigte erwartungsgemäß ausschließlich eine Bindung an ELDKWA-enthaltende Peptide (Daten nicht gezeigt). Die stärkste Bindung von 2F5 wurde an das Peptid NIH-6373 detektiert. In diesem Peptid liegt die ELDKWA-Sequenz mittig. Mit Verlagerung der Sequenz zum N- bzw. C-terminus der Peptide nimmt die Bindung von 2F5 ab. Dies entspricht den bereits veröffentlichten Daten.

Um mögliche bindungsunterstützende Sequenzen zu identifizieren, wurde das Peptid mit der höchsten Affinität zu 2F5 (Peptid NIH-6373) in Kombination mit jedem weiteren Peptid des Peptidsets eingesetzt. Durch eine ähnliche Versuchsanordnung konnte die synergistisch gesteigerte Bindung von PERV-neutralisierenden Antikörper an die Peptide PERV-E1/E2 nachgewiesen werden. Um eine mögliche Steigerung der Bindungsstärke von mAb2F5 an das ELDKWA-Epitop durch die Kombination mit anderen Peptiden detektieren zu können, wurde der Versuch in Anwesenheit verschiedener Harnstoffkonzentrationen durchgeführt.

	Abb. III.20: Bindung des monoklonalen Antikörpers 2F5 an von der gp41-Ektodomäne abgeleitete Peptide unter verschiedenen Harnstoffkonzentrationen.
	Eine Bindung an Einzelpeptide konnte nur an ELDKWA-enthaltene Peptide festgestellt werden. Ausschließlich die Kombination des Peptides 6342 mit dem ELDKWA-enthaltenen Peptid 6373 führt zu einer deutlich gesteigerten Bindung, die auch in Anwesenheit höherer Harnstoffkonzentrationen deutlich über der an die Einzelpeptide liegt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist hier nur eine kleine Auswahl der getesteten Peptide dargestellt (Peptid 6337-6351, abgeleitet vom N-terminalen Bereich der Ektodomäne). Es wurden jeweils 100ng von jedem Peptid adsorbiert. 2F5 wurde in einer Konzentration 0,5µg/ml eingesetzt.

In diesem Experiment wurden insgesamt 334 Peptide auf eine Interaktion mit dem Peptid NIH-6373 untersucht. Es konnte ein Peptid (Peptid NIH-6342) identifiziert werden, das in Kombination mit Peptid NIH-6373 zu einer deutlichen Steigerung der Bindung von 2F5 führt. Die aktive Sequenz konnte nicht weiter eingegrenzt werden, da die benachbarten Peptide keine Auswirkung auf die Bindung von 2F5 zeigten. Eine Bindung von 2F5 an das Einzelpeptid NIH-6342 wurde nicht detektiert. Der Versuch wurde unter verschiedenen Harnstoffkonzentrationen durchgeführt. Mit steigender Harnstoffkonzentration kann die gesteigerte Bindung von 2F5 noch deutlicher dargestellt werden (Tab. III.4,Abb. III.20).

Tab. III.4: Ermittlung der Bindungsstärke von 2F5 an Einzelpetide und an die Kombination der Peptide mit dem das ELDKWA-Epitop enthaltenden Peptid 6373 im ELISA. 

Der Versuch wurde unter verschiedenen Harnstoffkonzentrationen (1M, 2M, 3M und 4M) durchgeführt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind hier exemplarisch die Daten für drei Peptide gezeigt. In diesem Versuch wurden insgesamt 334 überlappende Peptide (abgeleitet vom GAG bzw. ENV-Proteinen) eingesetzt. Peptid 6342 (Werte rot eingerahmt) führte als einziges Peptid zu einer deutlichen Bindungssteigerung von 2F5 an Peptid 6373.

Transmembranhüllproteine von Retroviren liegen auf der Virusoberfläche als Trimere vor. Drei NHR-Bereiche lagern sich dabei zentral zusammen, in die dadurch entstehenden äußeren Furchen lagern sich während des Infektionszyklus die drei C-terminalen Helices. Diese multimere Struktur könnte auch für die Präsentation des 2F5-Epitopes von Bedeutung sein.

Um zu untersuchen, ob verschiedene stöchiometrische Verhältnisse der Peptide 6342 zu 6373 Einfluss auf die Bindung von 2F5 haben, wurden im ELISA die Peptide in verschiedenen molaren Verhältnissen miteinander kombiniert.

In diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis beider Peptide einen deutlichen Einfluss auf die Bindung von 2F5 hat. Ab einem Verhältnis von 2:1 war eine Steigerung der Avidität von 2F5 auf das Doppelte zu beobachten. Der Versuch zeigt, dass die Bindung von 2F5 an die Peptide 6342/6373 ein Optimum erreicht (Abb. III.21). Die weitere Erhöhung des Anteils des Peptides 6342 führte zu keiner weiteren Steigerung der Bindung.

	Abb. III.21: Einfluss verschiedener stöchiometrischer Verhältnisse des Peptids P6342 zum Peptid P6373 auf die Bindung von 2F5.
	Die Inkubation des mAb2F5 (in allen Ansätzen 0,2µg/ml) wurde in Anwesenheit von 1M Harnstoff durchgeführt. Eingesetzte Peptidmengen der Peptid 6342/6373 [ng/well]: 100/0 (1:0); 600/100 (6:1); 300/100 (3:1); 200/100 (2:1); 100:100 (1:1); 50:100 (1:2); 33,3/100 (1:3); 16,6/100(1:6).

Durch Kombination des Peptides 6373 mit dem Peptid 6342 konnte eine deutliche Steigerung der Avidität des Antikörpers 2F5 zur ELDKWA-Sequenz beobachtet werden. Die überlappenden Peptide NIH-6341 und NIH-6343 führten nicht zu diesem Effekt. Um die bindungsunterstützenden Sequenzen genauer eingrenzen zu können, wurden im Peptid 6342 Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Dazu wurden die Peptide 6342mut1-5 synthetisiert und in ELISA-Bindungsstudien eingesetzt. Die Peptide wurden im optimalen stöchiometrischen Verhältnis (2:1, siehe 3.4.3) eingesetzt.

Durch diesen Versuch gelang keine genaue Eingrenzung von aktiv an der Bindung beteiligten Aminosäuren. Jedes der eingesetzten Peptide führte zu einer gesteigerten Bindung von 2F5, keines jedoch so stark wie das Wildtyppeptid (6342wt). Am stärksten wurde die Bindung durch die Aminosäureaustausche in 6342mut2 und 6342mut5 beeinflusst. Diese beiden Austausche sind etwa sieben Aminosäurereste voneinander entfernt, was zwei Drehungen einer α-Helix entspricht. Da dieser Bereich im viralen gp41 als α-Helix vorliegt, kann man jedoch davon ausgehen, dass Threonin, Leucin sowie Arginin aktiv die Bindung von 2F5 an ELDKWA beeinflussen.

	Abb. III.22: Einfluss von Aminosäuresubstitutionen im Peptid NIH-6342 auf die Bindung von 2F5 im ELISA.
	Alle von 6342 abgeleiteten mutierten Peptide steigern die Bindung von 2F5 an das ELDKWA-Epitop, jedoch keines so stark wie das Wildtyppeptid. Die Inkubation von 2F5 (0,2µg/ml) erfolgte in Anwesenheit von 1M Harnstoff. Das Verhältnis der Peptide 6342 wt/mut zu 6373 betrug 2:1 (200ng:100ng). Die Sequenz der Peptide 6342 wt/mut 1-5 ist in der Legende dargestellt. Die Alaninsubstitutionen sind mit fett gedruckten Buchstaben gekennzeichnet.

Durch die von den innerhalb PERV-p15E identifizierten Epitopen abgeleiteten Peptide konnte die neutralisierende Aktivität der Seren deutlich gehemmt werden (Abb. III.9). In diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass die Kombination beider Peptide eine deutlich effektivere Hemmung zurfolge hatte. Dieser Effekt wurde auf die Bildung eines Konformationsepitops zurückgeführt. Durch Kombination beider Peptide konnte die Bindung des neutralisierenden Antikörpers an sein Antigen deutlich verstärkt werden, was eine stärkere Hemmung zur Folge hat.

Sollte der Wirkmechanismus der PERV-neutralisierenden Antikörper ähnlich dem Wirkmechanismus von 2F5 sein, wäre eine gesteigerte Hemmung von 2F5 zu erwarten. Die Daten der ELISA-Bindungsstudien (Kapitel 3.4.2-4.) deuten auf eine gesteigerte Affinität von 2F5 an die ELDKWA-Sequenz durch die Zugabe des Peptides 6342 hin. Da die Bindungsstärke eines Antikörpers an sein Epitop maßgeblichen Einfluss auf sein neutralisierendes Potential hat, könnte die Zugabe des Peptides 6342 eine gesteigerte Hemmung der Neutralisation durch 2F5 zur Folge haben. Im in vitro-Neutralisationsassay sollte untersucht werden, ob durch die Kombination beider Peptide die neutralisierende Aktivität von 2F5 stärker gehemmt werden kann als durch die Einzelpeptide.

In diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass Peptid 6342 alleine nicht die neutralisierende Aktivität von 2F5 beeinflusst. Durch die Kombination der Peptide 6373 und 6342 verschiebt sich der ct-Wert um etwa zwei Einheiten, was einer zusätzlichen Hemmung von 2F5 um ca. 75% entspricht. Die Kombination von 6373 mit einem Kontrollpeptid sowie das Kontrollpeptid alleine, hat keinen Einfluss auf die Wirkung von 2F5.

	Abb. III.23: Gesteigerte HIV-Provirusintegration durch Hemmung von 2F5.
	In Abhängigkeit von der Konzentration des Peptides 6373 wird die Neutralisation durch 2F5 gehemmt. Die Kombination des Peptides 6373 mit dem HIV-ISU-Peptid, sowie das HIV-ISU-Peptid und das Peptid 6342 als Einzelpeptide hatte keinen Einfluss auf die Wirkung von 2F5. Die HIV-neutralisierende Wirkung konnte durch Kombination des Peptides 6373 mit dem Peptid 6342 stärker gehemmt werden. Die Konzentration von 2F5 wurde mit 5µg/ml konstant gehalten.

In ELISA-Bindungsstudien und im vitro-Neutralisationsassay konnte eine gesteigerte Bindung von 2F5 an die Kombination der Peptide NIH-6342) und NIH6373 gezeigt werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Sequenz des N-terminalen Bereiches der gp41 Ektodomäne die Bindung von 2F5 an das ELDKWA-Epitop unterstützte. Zahlreiche, in der Literatur beschriebene Versuche zeigen, dass durch ELDKWA-enthaltende Peptide lediglich bindende, jedoch keine neutralisierenden Antikörper induziert werden konnten.

In diesem Versuch sollte untersucht werden, ob unter Verwendung der Kombination beider Sequenzen neutralisierende Antikörper induziert werden können. Für diese Versuche wurden synthetische 25mere verwendet, die von den identifizierten Bereichen abgeleitet wurden und im Folgenden HIV-E1 (enthält die Sequenz des NIH-6342) und HIV-E2 (enthält die Sequenz des NIH-6373) genannt werden. Die Sequenz dieser Peptide ist in Kapitel 2.3 aufgeführt. Es wurden freie und an Dextran gekoppelte Peptide zur Immunisierung von Wistar-Ratten eingesetzt.

Die Kopplung an Dextran (MW: 6kDa, im Folgenden Dextran6 oder Dex6 genannt) erfolgte ungerichtet über die Verknüpfung freier Aminogruppen mit den aktivierten Carbonylgruppen des Dextrans oder gerichtet über den bifunktionalen PDPH-Spacer (Pierce, Rockford, USA). Ausgehend von den Versuchen zum optimalen stöchiometrischen Verhältnis der Peptide NIH-6342/-6373 (Kapitel 3.4.3), wurde für die Immunisierung mit freien Peptiden sowie für die Kopplungen ein molares Verhältnis von 2:1 gewählt. Ungekoppelte Peptide wurden nicht aus dem Reaktionsansatz entfernt, um die Bildung von Komplexen mit gekoppelten Peptiden zu ermöglichen. Die Kopplungseffizenz wurde durch Gelelektrophorese und Western Blot Analyse überprüft (Abb. III.24).

	Abb. III.24:Charakterisierung der generierten HIV-E1/E2-Konjugate mittels SDS-PAGE und Western Blot Analyse.
	(1) Peptid HIV-E2; (2) Peptid HIV-E1; (3) Peptid HIV-E2 an Dextran6 gekoppelt; (4) Peptide HIV E1/E2 an Dextran6 gekoppelt; (5) Peptide HIV E1/E2 über PDPH-Spacer an Dextran6 gekoppelt; (6) rekombiante Ektodomäne des HIV-1-gp41 (CBP-rgp41). In beiden Versuchen wurden äquivalente Proteinmengen aufgetragen. Die Detektion erfolgte durch Coomassiefärbung bzw. durch DAB-Färbung.

Die Charakterisierung der Kopplungsprodukte zeigte für alle Peptid-Dextran-Konjugate ein sehr heterogenes Gemisch mit einem Molekulargewicht von 6-45 kDa (HIV-E2/Dex6 und HIV-E1/E2-PDPH-Spacer an Dextran6) bzw. 6-70 kDa (Peptide HIV E1/E2 an Dextran6). Durch die Western Blot Analyse konnten noch geringe Mengen höhermolekularer Produkte detektiert werden. Alle Konstrukte wurden mittels 2F5 detektiert. Über das Verhältnis der gekoppelten Peptide kann durch diesen Versuch keine Aussage getroffen werden. Das Peptid HIV-E2 und das Konjugat HIV-E2/Dex6 wurden relativ schwach erkannt. Konjugate, die aus beiden Peptiden erzeugt wurden, wurden besser, jedoch nicht so stark wie das CBP-rgp41 detektiert.

Mit diesen Konstrukten wurden jeweils drei Wistar-Ratten immunisiert. Die Immunisierung erfolgte nach Standardprotokoll. Getestet wurde das Serum der Abnahme drei Wochen nach der Boost-Immunisierung.

Alle Tiere bildeten Antikörper gegen die zur Immunisierung eingesetzten Antigene (Abb. III.25). Keines der Seren zeigte, wie der monoklonale Antikörper 2F5, eine gesteigerte Bindung an die Kombination beider Peptide. Der ELISA zeigte, dass auch gegen die linearen Einzelpeptide Antikörper gebildet wurden. Möglicherweise verhindert die Überlagerung der Effekte verschiedener Antikörperpopulation die Darstellung einer solchen gesteigerten Bindung

	Abb. III.25: Nachweis bindender Antikörper gegen die synthetischen Peptide HIV-E1/E2.
	Die Tiere Q2-4 wurde mit freien Peptiden, die Tiere R1-3 mit E1/E2-Dextran-Konjugaten und die Tiere S1-3 mit E1/E2-PDPH-Spacer-Dextran-Konjugaten immunisiert. Als Kontrolle wurden drei Tiere mit E2-Dextran-Konjugaten (P1-3) und zwei mit PERV-ISU-Dextran-Konjugaten immunisiert. Die Seren wurden in einer Verdünnung von 1:250 eingesetzt. Als Positivkontrolle wurden 0,2µg 2F5 eingesetzt.

Die getesteten Immunseren zeigten eine Hemmung der Provirusintegration von 0-99,5%. Den festgelegten Schwellenwert von ∆ct<2 überschritten die Seren der Tiere Q3 (immunisiert mit den freien Peptiden HIV-E1 und E2) und S3 (immunisiert mit den Peptiden HIV-E1 und E2 über PDPH-Spacer an Dextran gekoppelt). Für diese Seren konnte bei einer eingesetzten TCID50 eine Hemmung der Provirusintegration gegenüber der jeweiligen Präimmunseren von 99,53 bzw. 95,46% gemessen werden. Die Seren der Tiere, die nur gegen HIV-E2 bzw. mit PERV-ISU-Dextran immunisiert wurden, zeigten erwartungsgemäß keine HIV-neutralisierende Aktivität.

	Abb. III.26: Test der Boost-Seren nach Immunisierung im in vitro-Neutralisationsassay.
	Es wurden jeweils drei Wistar-Ratten mit einem Gemisch der freien Peptide HIV-E1/2 (Tiere Q2-4), mit an aktiviertes Dextran gekoppelte Peptide HIV-E1/2 (Tiere R1-R3), mit über den bifunktionalen Spacer PDPH an Dextran gekoppelte Peptide HIV-E1/2 (Tiere S1-3), mit an aktiviertes Dextran gekoppeltes Peptid HIV-E2 (Tiere P1-3) und mit an aktiviertes Dextran gekoppeltes PERV-ISU-Peptid (Tiere D1-2) immunisiert. Die Seren wurden in einer Verdünnung von 1:16 eingesetzt. Als Standard wurde der HIV-neutralisierende monoklonale Antikörper 2F5 in einer Konzentration von 10µg/ml eingesetzt. Die Infektion von 5x104 C8166-Zellen erfolgte mit einer TCID50 des HIV-1 IIIB. Alle Werte wurden aus vier Einzelwerten berechnet.

Um sicher zu stellen, dass die gemessene HIV-neutralisierende Wirkung auf einen HIV-spezifischen Effekt durch induzierte IgGs zurückzuführen ist, wurden verschiedene Versuche durchgeführt.

• Test der Anti-HIV-Seren Q3 und S3 im in vitro PERV-Neutralisationsassay
  Durch diesen Versuch sollte sichergestellt werden, dass in den Immunseren keine unspezifischen Faktoren mit unspezifischer antiviraler Wirkung, wie zum Beispiel Komplement, Zytokine oder Chemokine enthalten sind. Als Kontrolle wurde ein PERV-neutralisierendes Serum eingesetzt (Ratte B1, Abb. III.12). Eine Hemmung der PERV-Replikation durch die Immunseren Q3 und S3 konnte nicht beobachtet werden. Das PERV-spezifische Kontrollserum der Ratte B1 zeigte keine Wirkung auf die Replikation von HIV-1 IIIB (Abb. III.27).
• Hemmung der HIV-neutralisierenden Aktivität durch die synthetischen Peptide HIV-E1/E2
  Ist die detektierte neutralisierende Aktivität der Immunseren Q3 und S3 auf die Induktion spezifischer Antikörper gegen die Peptide HIV-E1/E2 zurückzuführen, sollte sich die hemmende Wirkung der Seren durch Zugabe der Peptide HIV-E1/E2 im in vitro Neutralisationsassay wieder aufheben lassen. Dafür wurden die Petide in einer Konzentration von je 2µg/ml zugesetzt. Beide Seren konnten durch die Peptide HIV-E1/E2 gehemmt werden. Die HIV-hemmende Wirkung ging durch Zugabe von 2µg/ml Peptid auf ca. 30% zurück, während das Kontrollpeptid keine Auswirkungen auf die HIV-Replikation zeigte. Auf die PERV-Replikation hat die Zugabe der Peptide keinen Einfluss (Abb. III.28).
• Virusneutralisation durch isolierte IgGs
  In einem weiteren Versuch zum Ausschluss einer antikörperunabhängigen Virusinhibition wurden IgG´s aus dem Serum der Ratte S3 und Q3 sowie dem PERV-p15E-spezifischem Serum der Ratte B1 durch ProteinG-Affinitätschromatographie isoliert.

	Abb. III.27: HIV-Neutralisation durch Immunseren und isolierte Immunglobuline G.
	Die E1/E2-spezifischen Seren der Tiere S3 und Q3 sowie die aus diesen Seren isolierten Immunglobuline der KlasseG (100µg/ml) hemmen die HIV-Replikation. Dieser Effekt konnte durch Zugabe der Peptide E1/2 teilweise wieder aufgehoben werden. Das PERV-p15E spezifische Serum sowie die aus dem Serum isolierten IgG´s der Ratte B1 hatten keinen signifikanten Einfluss auf die HIV-Replikation. Alle Seren wurden in einer Verdünnung von 1:16 eingesetzt. Als Positivkontrolle wurden 10µg/ml 2F5 mitgeführt. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen.

	Abb. III.28: PERV-Neutralisation durch Immunseren und isolierte Immunglobuline G.
	Die E1/E2-spezifischen Seren der Tiere S3 und Q3 sowie die aus diesen Seren isolierten Immunglobuline der KlasseG (50µg/ml) haben keinen Einfluss auf die PERV-Replikation. Das PERV-p15E spezifische Serum sowie die aus dem Serum isolierten IgGs der Ratte B1 hemmen die PERV-Replikation. Die Zugabe der Peptide HIV-E1/E2 hat heinen Einfluss auf die PERV-Replikation. Alle Seren wurden in einer Verdünnung von 1:16 eingesetzt. Als Positivkontrolle wurden 10µg/ml 2F5 mitgeführt. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen.

Aus 2ml Serum konnten insgesamt 0,7mg Immunglobulin G isoliert werden. Die Elutionsfraktionen wurden gegen PBS dialysiert und in einer Konzentration von 100µg/ml im PERV bzw. im HIV in vitro Neutralisationsassay eingesetzt.

Zur Kontrolle wurde parallel das gleichbehandelte PERV-neutralisierende Serum der Ratte B1 verwendet. Der Versuch zeigt, dass die HIV-Neutralisation durch das Rattenserum S3 und Q3 auf Immunglobuline der Klasse G zurückgeführt werden kann. Die Hemmung der Provirusintegration durch isolierte IgGs ist mit der Hemmung durch das Immunserum vergleichbar. Das Serum der Ratte B1 sowie die daraus isolierten IgGs zeigten keinen Einfluss auf die HIV-Replikation (Abb. III.27).

In einem parallel durchgeführten PERV-Infektionsversuch konnte gezeigt werden, dass der beobachtete Effekt HIV-spezifisch ist. Weder die Immunseren noch die daraus isolierten IgGs zeigten einen Einfluss auf die PERV-Replikation (Abb. III.28).

Die Versuche zeigten, dass durch die Immunisierung mit synthetischen Peptiden HIV-E1/E2 neutralisierende Antikörper induziert werden konnten. Eine Induktion virushemmender Faktoren, wie Zytokine oder Chemokine, wird ausgeschlossen. Die Bestätigung der Daten durch ein unabhängiges Labor mit alternativen Methoden konnte für die Seren der Tiere S3 und Q3 leider nicht durchgeführt werden, da für diese Versuche in der Lebenszeit der Tiere nicht ausreichend Immunserum gesammelt werden konnte.

Zur Reproduktion der Daten wurde die Immunisierung durch die freien Peptide HIV-E1/E2 nach gleichem Protokoll in einer größeren Gruppe (10 Wistar-Ratten) durchgeführt. Um die Daten in einem unabhängigen Labor durch einen alternativen Neutralisationsassay bestätigen zu lassen, wurde die Immunseren parallel im Labor von Dr. S. Norley mittels p24-Capture-ELISA getestet.

	Abb. III.29: Bindung der induzierten Antikörper an die Peptide HIV-E1/E2.
	Es wurden 25ng/well Peptid adsorbiert. Zum Vergleich wurde das neutralisierende Rattenserum S3 sowie 0,2µg/ml 2F5 mitgeführt. Die Seren wurden in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen.

Wie im ersten Versuch konnte in allen Seren bindende Antikörper gegen die zur Immunisierung eingesetzten Peptide nachgewiesen werden. Allgemein wurde ein deutlich geringerer Titer an bindenden Antikörpern in den Immunseren detektiert. Auffällig ist die Dominanz E1-spezifischer Antikörper, währenddessen gegen das E2-Epitop nur geringe Mengen an Antikörpern gebildet wurden.

Die Boost-Seren wurden unabhängig mittels Realtime-PCR und p24-Capture-ELISA auf Hemmung der HIV-Neutralisation getestet. In keinem der Seren konnte HIV-neutralisierende Aktivität nachgewiesen werden.

In den durchgeführten Versuchen konnten viele Gemeinsamkeiten zwischen PERV-neutralisierenden Antikörpern und dem HIV-neutralisierenden Antikörper 2F5 nachgewiesen werden.

Tab. III.5: Gegenüberstellung der experimentellen Daten der Untersuchungen zu PERV- bzw. HIV-neutralisierender Antikörper: 

Zusammengefasst sind die Daten der in dieser Arbeit durchgeführten Neutralisationsassays und der Bindungsstudien. Die Daten basieren auf der Untersuchung des Ziegenserums 20 (PERV) und des monoklonalen Antikörpers 2F5 (HIV) sowie der Seren, die durch Immmunisierung mit rekombinanten Proteinen oder synthetischen Peptiden gewonnen wurden.