IV Diskussion

Die nach der Infektion durch einen pathogenen Erreger im Organismus ablaufenden Abwehrmechanismen basieren, neben der unspezifischen Abwehr durch das Komplementsystem und der angeboren Immunität, auf der Aktivierung des humoralen und zellulären Immunsystems. Die Induktion neu-tralisierender Antikörper und zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs) führt im günstigen Fall zur raschen Klärung der Infektion und zu einem dauerhaften Schutz des Organismus vor einer erneuten Infektion durch den gleichen Erreger. Ziel der Impfstoffforschung ist die Entwicklung von Vakzinen und Impfstrategien, die einen solchen Effekt im gesunden Organismus induzieren und so den Impfling präventiv vor einer Infektion schützen.

Nicht jede Infektion kann durch eine schnelle und effektive Immunantwort geklärt werden. Zum Beispiel kann das humane Immundefizienzvirus durch das Immunsystem nicht aus dem Organismus eliminiert werden und führt in den meisten Fällen zum Ausbruch von AIDS und damit zum Tod des Wirtes. Eine Klärung des Virus aus einem infizierten Organismus durch das körpereigene Immunsystem oder durch antivirale Therapien ist bislang noch nicht beobachtet worden. Ob eine Klärung des Virus durch die Induktion neutralisierender Antikörper und/oder CTLs möglich sein wird, ist derzeit völlig unklar. Die in den letzten Jahren deutlich verbesserte antiretrovirale Therapie (HAART) führt trotz vorrübergehender Absenkung der Viruslast unter die Nachweisgrenze (ca. 20 RNA-Kopien/ml Blut) nicht zur Klärung des Virus aus dem Organismus. Auch klinische Studien zum passiven Immuntransfer zeigen, dass durch Applikation neutralisierender Antikörper (2F5/2G12) eine Senkung der Viruslast im peripheren Blut bis unter die Nachweisgrenze erreicht werden kann. In beiden Fällen kommt es jedoch nach länger anhaltender Therapie zum Therapieversagen durch die Bildung von Fluchtmutanten. Trotzdem zeigen die Studien zur passiven Immunisierung, dass durch neutralisierende Antikörper das Virus in seiner Replikation erheblich beeinträchtigt wird und freie Viren effektiv an der Infektion neuer Zellen gehindert werden können. Die Induktion solcher neutralisierender Antikörper durch einen präventiven Impfstoff könnte somit mit hoher Wahrscheinlichkeit die Ausbreitung von HIV nach dem Eindringen in den Organismus verhindern und so zu einer sterilen Immunität führen.

Ziel der Forschungen muss deshalb die Entwicklung eines präventiven Impfstoffes sein, der das Eindringen des Virus in die Zielzellen und dessen Ausbreitung im Wirtsorganismus verhindert. Die allgemeinen Anforderungen an einen effektiven Impfstoff sind im Folgenden aufgeführt (Janeway et al., 2002), wobei nicht jeder derzeit in breiter klinischer Anwendung befindliche Impfstoff alle diese Anforderungen erfüllt.

• Induktion eines nahezu 100%iger Schutzes der Impflinge vor der Infektion durch möglichst alle Varianten des Erregers.
• Die Impfung sollte mehrjährigen, im Idealfall lebenslangen Schutz induzieren und keine bzw. minimale Nebenwirkungen erzeugen.
• Besonders für die Anwendung in Ländern der dritten Welt sollte der Impfstoff kostengünstig produzierbar, leicht zu transportieren, zu lagern und zu applizieren sein.

Derzeit werden in der Impfstoffentwicklung verschiedene Ansätze zur Induktion einer aktiven Immunantwort verfolgt. Klassische und für zahlreiche Pathogene erfolgreiche Ansätze, wie die Applikation von inaktivierten Totvakzinen (z.B. Poliomyelitis-Impfung), attenuierten Erregern (z.B. Pocken-Impfung) oder Subunitvakzinen (z.B. Hepatitis B-Impfung) führten im Fall von HIV nicht zum erhofften Erfolg. In den letzten Jahren wurde daher mit großer Intensität an der Entwicklung von DNA-Impfstoffen gearbeitet. DNA-Impfstoffe bieten den Vorteil, neben der Induktion von Antikörpern auch das zelluläre Immunsystem zu aktivieren. Die Präsentation der Antigene als MHC I -Komplex auf der Zelloberfläche führt zur Induktion einer zytotoxischen T-Zell-Antwort und damit in Idealfall zur Lyse der infizierten Zellen. Zur Induktion einer solchen Immunantwort stehen dabei verschiedene replikationskompetente virale und nicht virale Vektorsysteme zur Verfügung. Durch das Einfügen entsprechender Leitsignale ermöglichen diese Systeme auch die Präsentation der Antigene auf der Zelloberfläche, ein besonders für die Induktion neutralisierender Antikörper gegen transmembrane Proteine vielversprechender Ansatz. Trotz höherer Effizienz viraler Systeme werden derzeit nicht-virale Vektoren bevorzugt, da diese nicht das Risiko der Insertationsmutagenese und damit die Induktion von Tumoren beinhalten. Tierversuche belegen die Wirksamkeit solcher Impfstoffe, wobei die Übertragung auf den Menschen noch zahlreiche Probleme birgt. Derzeit ist in Deutschland kein DNA-Impfstoff für die Anwendung in der Humanmedizin zugelassen. Auch die Entwicklung HIV-spezifischer DNA-Vakzine führte bisher noch nicht zum gewünschten Erfolg. Daher wird seit kurzem wieder verstärkt an der Entwicklung neuer Antigene zur Induktion einer neutralisierenden humoralen Immunantwort gearbeitet.

Da ein optimales HIV-Vakzin beide, die humorale und zelluläre Immunantwort stimulieren sollte, verspricht die Kombination beider Ansätze derzeit den größten Erfolg. Auch die Induktion einer effektiven Schleimhautimmunität könnte in diesem Zusammenhang zur Optimierung eines HIV-Vakzins beitragen.

Geeignete Antigene zur Induktion neutralisierender Antikörper

Transmembran- und Oberflächenhüllproteine sind entscheidend an der Infektion der Zielzelle beteiligt. Neben verschiedenen zellulären Proteinen sind sie die einzigen viralen Proteine, die auf der Oberfläche der Retroviren präsentiert werden und somit die bevorzugte Zielstruktur für die Induktion neutralisierender Antikörper. Obwohl auch neutralisierende Antikörper gegen das HIV-1-Gag-Protein und den zytoplasmatischen Teil des HIV-1-TM-Proteins gp41 sowie des FeLV-TM-Proteins p15E beschrieben wurden, sind diese Daten zumindest kritisch zu betrachten, da beide Strukturen im Inneren des Viruspartikels verborgen und während des Infektionsvorgangs für das humorale Immunsystem nicht zugänglich sind. Der Neutralisationsmechanismus solcher Antikörper ist völlig unklar. Für die mutmaßliche Existenz weiterer Transmembrandurchgänge der TM-Proteine des HIV-1 und des FeLV-A, die Strukturen des zytoplasmatischen Teils auf der Oberfläche exponieren, konnten keine Beweise erbracht werden.

Das Oberflächenprotein als Antigen zur Induktion neutralisierender Antikörper

Das Oberflächenhüllprotein der Retroviren, insbesondere von HIV, ist genetisch sehr variabel. Durch starke Glykosylierung, Konformation und Sequenzvariabilität bietet es nur wenige Angriffspunkte für neutralisierende Antikörper. Das SU-Protein des HIV-1, gp120, besteht bis zu 50% aus Zuckerresten und zählt damit zu den am stärksten bekannten glykolysierten Proteinen. Im Laufe einer Infektion werden hohe Titer an spezifischen Antikörpern gebildet, die jedoch nicht zur Neutralisation des Virus führen. Die hohe Sequenzvariabilität in den äußeren, dem Immunsystem zugänglichen Bereichen der Oberflächenproteine, führt zu einer raschen Bildung von Fluchtmutanten.

Allerdings konnte trotz der aufgeführten Fluchtmechanismen bei HIV durch die Immunisierung mit dem Oberfächenhüllprotein von Retroviren Immunität induziert werden. In breiter Anwendung sind derzeit verschiedene FeLV-Impfstoffe, die aus Viruspräparationen isoliertes gp70 (z.B. Leukocell 2, Pfizer Inc., USA) oder rekombinantes p45 ( Leucogen, Virbac AG, Schweiz; unglykosyliertes Oberflächenprotein des FeLV-A in E.coli exprimiert), enthalten. Keines der derzeit zugelassenen FeLV-Vakzine ist jedoch zu 100% effektiv, was eine jährliche Auffrischungsimpfung der zu schützenden Tiere erfordert. Auch gegen das gp120 des HIV-1 sind breit neutralisierende Antikörper beschrieben, die erfolgreich im passiven Immuntransfer eingesetzt wurden. Alle bisher in klinischen Studien eingesetzten HIV-Impfstoffe enthalten das Oberflächenhüllprotein gp120. Trotz intensiver Arbeiten ist die Induktion einer schützendenden Immunantwort durch aktive Immunisierung mit dem Oberflächenhüllprotein bislang jedoch noch nicht gelungen.

Das Transmembranprotein als Antigen zur Induktion neutralisierender Antikö r per

Die transmembranen Hüllproteine der Retroviren sind deutlich konservierter als deren Oberflächenhüllproteine. Im Gegensatz von bis ca. 35% Sequenzvariabilität innerhalb der Proteinsequenz der Oberflächenproteine zwischen den einzelnen Subtypen des HIV-1, beträgt die Sequenzvariabilität der Ektodomäne des gp41 zwischen den Subtypen maximal 15% (Gaschen et al., 2002, Abb.4.1). Die notwendigen Konformationsänderungen der Ektodomäne des TM-Proteins während des Infektionsvorganges erfordert eine hohe Sequenzstabilität. Nur wenige Aminosäureaustausche innerhalb der Helixregionen stören den Klappmechanismus und führen zum Verlust der Funktionalität. Somit ist das TM-Proteine zumindest in Hinsicht der Sequenzstabilität ein geeignetes Ziel zur Induktion von neutralisierenden Antikörpern.

	Abb. IV.1: Vergleich der Nukleinsäure- (Abb. A) und Aminosäuresequenzvariation (Abb. B) zwischen verschiedenen Isolaten des Subtyps C aus Südafrika, Botswanna und Indien mit der Consensussequenz (der Subtypen B und C) und verschiedenen Impfstoffsequenzen (Gaschen et al., 2002).
	Die grünen Graphen zeigen die Sequenzähnlichkeiten der verschiedenen Isolate zur Consensussequenz des Subtyps C, der rote zur Consensussequenz des Subtyps B. Die blauen Graphen verdeutlichen die Variabilität der Sequenzen zu den potentiellen Impfstämmen BR025 (hellblau) und ZA003 (blau). Die Sequenzbereiche der Env-Proteine sind eingerahmt. Die Abbildung verdeutlicht die hohe Sequenzvariabilität innerhalb des Oberflächenproteins von HIV-1 (bei Isolaten eines Subtyps bis zu 20%, Subtypübergreifend bis zu 35%) und die deutlich stärkere Konservierung der Aminosäuresequenz in der Ektodomäne des Transmembranhüllproteins gp41.

Die Isolation der breit neutralisierenden, HIV-1-gp41-spezifischen Antikörper 2F5 und 4E10 scheint diese These zu unterstützen, obwohl eine Induktion solcher Antikörper durch aktive Immunisierung ebenfalls noch nicht gelungen ist.

Auch gegen die Transmembranhüllproteine verschiedener Gammaretroviren sind neutralisierende Antikörper beschrieben. Im Gegensatz zu den bislang erfolglosen Versuchen bei den Lentiviren, scheint hier die Induktion solcher Antikörper durch Immunisierung leichter möglich zu sein (Fiebig et al., 2003,. Langhammer et al., 2005).

Gammaretroviren sind als Pathogene in der Veterinärmedizin seit langem bekannt. In der Humanmedizin sind Gammaretroviren als Krankheitserreger bislang noch nicht beschrieben worden. Es scheint als gesichert, dass Gammaretroviren im Laufe der Evolution mehrmals die Speziesgrenzen überschritten haben (z.B. von Maus auf Katze bzw. auf das Schwein). In verschiedenen in vitro-Untersuchungen konnte eine Adaptation von PERV an humane Zellen beobachtet werden (Denner et al., 2003). Eine experimentelle in vivo-Übertragung von PERV in Tierversuchen oder in verschiedenen klinischen Studien zur Xenotransplantation wurde nicht beobachtet (Paradis et al.,1999; Specke et al., 2002). In Anbetracht der besonderen Situation während einer Xenotransplantation (Exposition porziner Organe im immunsupprimierten Organismus über mehrere Jahre), kann jedoch die Möglichkeit einer Adaptation an den Menschen mit daraus folgendem pathogenen Verlauf nicht sicher ausgeschlossen werden.

Induktion PERV-p15E-spezifischer Antikörper

Die Versuche zur Reaktivität der induzierten Ziegenseren (Ziege 16 und 20) zeigten, dass sowohl das rekombinante sowie das virale p15E detektiert werden. Damit wurde ein Ziel der Arbeiten, die Generation eines Kontrollserums gegen das PERV-TM-Protein für immunologische Nachweissysteme einer PERV-Infektion, erreicht. Unklar ist, inwieweit sich das zur Immunisierung eingesetzte rekombinante Konstrukt als Antigen in einem solchen Nachweissystem eignet, da nach dem derzeitigen Stand der Arbeiten nicht vorausgesagt werden kann, ob die während einer möglichen PERV-Infektion gebildeten p15E-spzifischen Antikörper (z.B. gegen die IDU-Domäne) das rekombinante Konstrukt binden können. Dies wäre jedoch mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit zu erwarten, da zum Nachweis von Infektionen eng verwandter Viren (HIV und FeLV) ähnliche Antigene bereits erfolgreich eingesetzt werden. Vorrangiges Ziel der Arbeiten war jedoch die Induktion neutralisierender Antikörper gegen das TM-Protein von Retroviren, daher wurden hierzu keine weiteren Untersuchungen durchgeführt.

Immunisierung durch die rekombinant generierte Ektodomäne von PERV-p15E

Durch Immunisierung mit der Ektodomäne des PERV-p15E konnte in zwei unterschiedlichen Spezies (neun Lewis-Ratten und zwei Ziegen) hohe Titer an bindenden Antikörpern induziert werden. In jedem durch rp15E erzeugten Immunserum konnte PERV-neutralisierende Aktivität nachgewiesen werden. Der Neutralisationstiter der induzierten Seren beträgt bei einer Serumsverdünnung von 1:10 zwischen 1x10^1,21 und 1x10^1,96. Untersuchungen zur schützenden Immunantwort vor FeLV-Infektionen belegen, dass Seren, die bei einer Verdünnung von 1:2 in vitro neutralisierend wirken, einen effektiven Schutz vor einer Infektion bieten können. Ob der induzierte Titer an neutralisierenden Antikörpern einen ausreichenden Schutz zukünftiger Transplantatrezipienten bietet, kann noch nicht sicher geklärt werden, da derzeit kein geeignetes Tiermodell für einen solchen Versuch zur Verfügung steht. Die Identifizierung des PERV-Rezeptors und die Herstellung transgener Mäuse, die einen solchen Rezeptor tragen und somit mit PERV infizierbar sein sollten, stellt jedoch ein solches Tiermodell in naher Zukunft in Aussicht.

Ebenfalls finden derzeit Studien zur Immunisierung mit FeLV-p15E statt. Das dabei zur Immunisierung verwendete Konstrukt wurde analog zu dem rekombinanten PERV-p15E generiert. Die erzeugten Seren zeigten in vitro ebenfalls neutralisierende Aktivität (Langhammer et al., 2005). Der dazu in Vorbereitung befindliche in vivo-Versuch wird erste Hinweise auf die Effektivität des eingesetzten Antigens und der Möglichkeit des Einsatzes als Impfstoff geben.

Immunisierung mit p15E-abgeleiteten Peptiden

Die Verwendung von Peptidvakzinen kann im Vergleich zu in E.coli rekombinant hergestellten Antigenen zahlreiche Vorteile mit sich bringen. So entfällt z.B. die oft aufwändige und teure Abtrennung unerwünschter Nebenprodukte. Besonders hydrophobe Proteine interagieren stark mit Bestandteilen der bakteriellen Zellwand (Lipopolysaccaride, LPS), die nur schwer vom gewünschten Produkt zu trennen sind. Die Abreicherung von LPS ist jedoch notwendig, da es im menschlichen Organismus zu schweren allergischen Reaktionen führen kann (Eisenbarth et al, 2002).

Ein weiterer Vorteil von Peptidvakzinen ist die Möglichkeit der gezielten Präsentation von neutralisierenden Strukturen. Dadurch kann die Induktion einer Immunantwort gegen für die Neutralisation nicht relevanter Bereiche des Antigens vermieden werden.

Auch die Inaktivierung der Funktionen des Antigens durch Deletion funktioneller Strukturen kann von Bedeutung sein. So sind die Schwierigkeiten bei der Entwicklung eines effektiven Impfstoffes gegen Botulismus (Clostridium botulinum) auf die außerordentlich hohe Toxizität des Botulinumtoxins zurückzuführen. Im Gegensatz zum strukturell eng verwandten Tetanustoxin (Clostridium tetani) führt die Applikation von formaldehydinaktivierten Antigen nicht oder nur zu sehr geringen Titern an neutralisierenden Antikörpern. In verschiedenen in vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass die TM-Proteine der Retroviren einen Einfluss auf das Immunsystem ausüben. In vitro konnte die Modulation der Zytokinexpressionsmuster (Denner et al., 1998) und eine Proliferationshemmung humaner Lymphozyten nachgewiesen werden (Denner et al ., 1994 und 1996). Peptide, die vom C-terminalen Bereich der N-Helix des Transmembranhüllproteins (immunsuppressive Domäne, ISU) abgeleitet wurden, zeigen einen ähnlichen Effekt. Dieser Effekt ist möglicherweise der Auslöser der oft mit einer retroviralen Infektion einhergehenden Immunsuppression des infizierten Organismus und wäre als Nebenwirkung einer Immunisierung natürlich unerwünscht.

Die hohen Titer an spezifischen Antikörpern, die durch die Immunisierung mit rp15E induziert wurden, lassen nicht auf eine signifikante Inhibition des Immunsystems bzw. der B-Zellproliferation schließen. Auch an den immunisierten Tieren wurden keine mit einer Immunsuppression korrelierbaren Symptome festgestellt. Diese Daten implizieren, dass durch die relativ geringe Menge und die geringe lokale bzw. zeitliche Begrenzung der Exposition des applizierten TM-Proteins im Organismus dieser Effekt vernachlässigt werden kann. Trotzdem wäre im Hinblick auf mögliche geringe Nebenwirkungen, die in den durchgeführten Versuchen nicht erfasst werden konnten, der Ausschluss der immunsuppressiven Domäne wünschenswert. Möglicherweise könnte dadurch auch eine noch effektivere Anregung der B-Zellproliferation erreicht werden, die zu Bildung höherer Titer an neutralisierenden Antikörpern führt.

Die von den Epitopen E1 und E2 abgeleiteten Peptide wurden in verschiedenen Formen Wistar-Ratten appliziert. Die Immunisierung mit freien 15mer-Peptiden führte, wahrscheinlich aufgrund der geringen Molekülgroße des Antigens, zu keiner bzw. zu einer sehr schwachen Immunantwort. Ebenso führte die Kopplung der Peptide PERV-E1/E2 an BSA bzw. KLH als Trägermolekül nicht zur Induktion PERV-spezifischer Antikörper. In diesen beiden Fällen dürfte die geringe Kopplungseffizenz (durch SDS-PAGE konnte eine durchschnittliche Bindung vom maximal fünf Peptidmolekülen/Trägermolekül ermittelt werden) für die ausbleibende Immunantwort verantwortlich sein. Die Veränderung der Strukturen durch die Vernetzung der Moleküle kann als Ursache ausgeschlossen werden, da in den generierten Immunseren auch keine bindenden Antikörper gegen das zur Immunisierung eingesetzte Konjugat detektiert werden konnten.

Spezifische Antikörper gegen PERV-E1 bzw. E2 konnten durch die Immunisierung mit Dextran-Peptid-Konjugaten (mit und ohne funktionalen Linker) und durch über Cysteine vernetzte 25mer-Peptide induziert werden. Um eine möglichst variable Konformation zu gewährleisten, wurden die Peptide neben der relativ unspezifischen Kopplung an aktiviertes Dextran, auch über an den Enden angefügte Cysteine gekoppelt. Da unklar ist, ob die Interaktion beider Peptide auf eine spontane Zusammenlagerung durch intermolekulare Kräfte in wässriger Lösung beruht oder ob es erst im Paratop des Antikörpern zu einer Zusammenlagerung kommt, sollte die Verwendung des PDPH-Linkers eine spontane Ausrichtung der Peptide ermöglichen. Auch hier konnten relativ hohe Titer an bindenden Antikörpern induziert werden.

Keines der Immunseren zeigte jedoch virusneutralisierende Aktivität. Die Ursachen dafür sind unklar, wahrscheinlich ist aber, dass durch die verwendeten Kopplungsmethoden nicht die Konformation erzeugt werden konnte, wie sie im rekombinanten p15E vorliegt. In diesem Versuch wurde einer von vielen kommerziell angebotenen Linkern bzw. Kopplungsmethoden getestet. Möglicherweise verhindert der Abstand der Kopplungsstellen des aktivierten Dextrans die Bildung einer geeigneten Konformation. Durch die Verwendung alternativer Kopplungsmethoden, z.B. die gezielte Kopplung an trifunktionale Linker, könnte möglicherweise eine solche Konformation erzeugt werden.

Untersuchung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus PERV-neutralisierender Antikörper

Zur Untersuchung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus wurden verschiedene Versuche durchgeführt. Aus der Summe der durch diese Experimente gesammelten Daten wurde ein Bindungs- und Neutralisationsmodell erstellt.

Die Epitopkartierung des Ziegenserums 20 zeigte zwei Antikörperbindungsstellen innerhalb der Ektodomäne von p15E. Von diesen identifizierten Epitopen wurden synthetische Peptide abgeleitet (PERV E1/E2). In den durchgeführten ELISA-Bindungsstudien wurden die Einzelpeptide, die Kombination beider Peptide und das zur Immunisierung eingesetzte rp15E adsorbiert. Geht man von der Induktion zweier getrennter Antikörperpopulationen aus, wäre durch Adsorption beider Peptide maximal ein additiver Effekt zu erwarten. In Anbetracht der Konkurrenz beider Antigene im gesättigtem Bereich, könnte der zu erwartende Effekt sogar deutlich unter der Addition der Einzelwerte liegen. Beobachtet wurde jedoch eine deutlich synergistisch gesteigerte Bindung der im Serum enthaltenen Antikörper an die Kombination beider Peptide. Noch deutlicher kann dieser Effekt in Anwesenheit verschiedener Harnstoffkonzentrationen dargestellt werden. Aus diesen Daten wurde der Schluss gezogen, dass die Peptide PERV E1 und E2 miteinander interagieren und die Bindungsstärke zumindest einer im Serum enthaltenen Antikörperpopulation deutlich steigern. Ob neben dieser Population noch weitere, gegen die linearen Epitope gerichtete Antikörper im Serum enthalten sind, kann anhand dieses Versuches nicht ausgesagt werden.

Der im ELISA beobachtete Effekt weist auf eine Interaktion der identifizierten Sequenzen im N- bzw. im C-terminalen Bereich der Ektodomäne hin. Um zu untersuchen, ob die Antikörper, die mit der Kombination beider Peptide reagieren, an der Neutralisation beteiligt sind, wurde ein in vitro-Neutralisationsassay durchgeführt. Dieser Versuch zeigt, dass die Neutralisation nicht signifikant durch die Einzelpeptide gehemmt werden kann. Die Kombination beider Peptide führt dagegen zu einer Hemmung der Neutralisation, die der durch das rekombinante p15E annähernd entspricht. Aus diesem Versuch wird geschlossen, dass möglicherweise im Serum enthaltene Antikörper gegen lineare Epitope nicht virusneutralisierend wirken. Die Neutralisation beruht dagegen auf Antikörper, die mit hoher Affinität an die Kombination beider Peptide binden.

Durch Affinitätschromatographie konnten keine E1- bzw. E2-spezifischen Antikörper isoliert werden. Die eluierten Antikörper von beiden Säulen glichen in der Reaktivität dem Ausgangsmaterial. Eine Anreicherung von Antikörpern gegen eines der beiden Epitope wurde nicht beobachtet. Da der Versuch unter nativen Bedingungen durchgeführt wurde, wäre eine Anreicherung auch schwach affiner Antikörper zu erwarten gewesen. Aus diesem Versuch wird geschlossen, dass durch die Immunisierung mit rp15E nur eine, die Kombination beider Peptide bindende, Antikörperpopulation induziert wurde.

Durch die Immunisierung mit freien bzw. an Dextran gekoppelten Peptiden wurden E1- bzw. E2-spezifische Seren induziert. Obwohl auch mit der Kombination beider Peptide immunisiert wurde, konnten ausschließlich Antikörper gegen lineare Epitope induziert werden. In keinem der induzierten Seren konnte neutralisierende Aktivität nachgewiesen werden. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass gegen die linearen Epitope E1 bzw. E2 gerichteten Antiköper nicht neutralisierend wirken.

Durch einen in vitro-Neutralisationsassay konnte gezeigt werden, dass die Vorinkubation von PERV mit dem neutralisierenden Ziegenserum 20 nicht zu einer Steigerung der Neutralisation führt. Der zu beobachtende leichte Abfall der Provirusintegration mit steigender Zeit der Vorinkubation ist nicht auf die gesteigerte Wirkung neutralisierender Antikörper zurückzuführen, da dieser auch im gleichen Maße in Anwesenheit des Präimmunserums zu beobachten ist. Mittels Immunfluoreszenz und FACS-Analyse konnte gezeigt werden, dass die Ziegenseren 16 und 20 PERV-infizierte 293-Zellen detektieren. Dieser Befund legt nahe, dass die Epitope im sich abschnürenden Virus zugänglich sind und durch die induzierten Antikörper gebunden werden können. Warum eine Vorinkubation von Virus mit neutralisierenden Seren nicht, wie in den Versuchen mit 2F5 beobachtet, zu einer gesteigerten neutralisierenden Wirkung der Seren führt, ist unklar. Möglicherweise liegt der Grund hierfür in der äußerst schwach affinen Bindung der Antikörper an die Einzelepitope.

Die Sequenz des Epitops E2 ist bei den Gammaretroviren besonders stark konserviert. In diesem Bereich besteht eine 100%ige Übereinstimmung zu dem felinen Leukämievirus (FeLV A). Das murine Leukämievirus (F-MuLV) zeigt einen Aminosäurenaustausch. Selbst das phylogenetisch weiter entfernte Lentivirus HIV-1 (IIIB) zeigt noch eine 50%ige Homologie zum Epitop PERV-E2. Dagegen zeigt die Sequenz im E1-Bereich dieser Viren deutliche Abweichungen zur Sequenz des PERV (Tab. IV.1).

Obwohl das FeLV-p15E in der Western Blot Analyse durch das Ziegenserum detektiert werden kann, wurde keines dieser Viren durch das PERV-neutralisierende Ziegenserum 20 neutralisiert. Der Versuch zeigt, dass die Präsenz der Sequenz des E2-Epitopes allein nicht für eine Neutralisation ausreicht und die Stärke der Bindung einen entscheidenden Einfluss auf das neutralisierende Potential des Antikörpers hat.

Interessanterweise liegen die beschriebenen Epitope von 2F5 und 4E10 im membranproximalen Bereich der Ektodomäne, dem Bereich, in dem das PERV-E2-Epitop lokalisiert werden konnte (Abb. III.5). Das für mAb 4E10 beschriebene Epitop weist sogar eine 50%ige Sequenzhomologie zu dem PERV-E2 auf (Tab. IV.1).

Tab. IV.1: Sequenzhomologie der Epitope E1 und E2 in verschiedenen Retroviren.

Bei den Gammaretroviren ist das Epitop E2 stark konserviert. Selbst das phylogenetisch weiter entfernte Lentivirus HIV-1 zeigt noch eine 50% Sequenzübereinstimmung. Obwohl der Bereich um Epitop E1 bei den verschiedenen HIV-Subtypen ebenfalls stark konserviert ist, besteht in diesem Bereich kaum Sequenzübereinstimmung zu anderen Retroviren. Die Epitope der HIV-neutralisierenden Antikörper 2F5 (ELDKWA) und 4E10 (NWFNIT) sind unterstrichen. Sequenzübereinstimmungen mit den Epitopen PERV-E1/E2 sind grau unterlegt.

Obwohl die Bindungsstellen dieser Antikörper scheinbar sehr gut charakterisiert sind, ist eine Induktion neutralisierender Antikörper gegen den membranproximalen Bereich der Ektodomäne bis heute nicht gelungen. Die Tatsache, dass durch Immunisierung mit Peptiden, die den Epitopen 2F5 und 4E10 entsprechen, keine neutralisierenden Antikörper induziert werden können, legt die Vermutung nahe, dass möglicherweise auch diese Antikörper Konformationsepitope bzw. konformationsabhängige Strukturen binden. Der für das Transmembranprotein von Retroviren beschriebene Klappmechanismus während des Infektionsvorganges führt zu einer räumlichen Annäherung der Sequenzen PERV-E1 und PERV-E2. Die Bildung eines metastabilen Konformationsepitopes durch die identifizierten Bereiche E1 und E2 innerhalb der Sechs-Helix-Konformation ist daher denkbar.

Da ein endgültiger Beweis für die Bildung eines neutralisierenden Konformationsepitops noch nicht erbracht ist, sollen die durch die durchgeführten Experimente gesammelten Hinweise im Folgenden zusammengefasst werden:

• Synergistische Bindung PERV-spezifischer Antikörper an die Kombination der Peptide PERV E1/E2 im ELISA.
• Hemmung der neutralisierenden Aktivität des Ziegenserums 20 durch die Kombination der Peptide PERV E1/E2, jedoch nicht durch die Einzelpeptide.
• Keine Trennung von Antikörperpopulationen durch Affinitätschromatographie gegen die synthetischen Peptide PERV E1 bzw. E2 möglich.
• Seren, die bindende Antikörper gegen die Peptide PERV E1 oder PERV E2 enthalten, sind nicht neutralisierend.
• FeLV-A, das zu 100% das PERV-E2 (FEGWFN) enthält, in der E1-Sequenz jedoch keine Homologien aufweist, kann durch das Ziegenserum 20 nicht neutralisiert werden.

Aus diesen Daten wurde ein Bindungs- und Neutralisationsmodell für die durch rp15E induzierten neutralisierenden Antikörper erstellt. Da für den Infektionsvorgang des porzinen endogenen Retrovirus keine Daten veröffentlicht sind, werden Daten gängiger HIV-Modelle zugrunde gelegt (Abb. I.5 und Abb. IV.2)

	Abb. IV.2: Bindungs- und Neutralisationsmodell für PERV-neutralisierende Antikörper.
	Den während der Infektion ablaufenden Konformationsänderungen des Oberflächenkomplexes wurden HIV-Daten zugrunde gelegt (Sackett et al., 2003). Das Bindungsmodell wurde auf Grundlage der experimentellen Daten erstellt. In den Abbildungen C und D ist das p15E (das in dieser Phase als Sechs-Helix-Bündel vorliegt) aus Gründen der Übersichtlichkeit als Monomer dargestellt.

Präventive Vakzinierung zukünftiger Transplantatempfänger mit rp15E?

Die in diesem Projekt durchgeführten Arbeiten zur Induktion PERV-neutralisierender Antikörper zeigten, dass Induktion eines Impfschutzes gegen PERV auf Basis des TM-Proteins möglich ist.

Ob jedoch die allgemeinen Anforderungen an einen effektiven Impfstoff erfüllt werden ist noch unklar. Nach derzeitigem Stand der Experimente erfüllt das zur Immunisierung eingesetzte rp15E-Konstrukt einige der grundlegenden Anforderungen an einen Impfstoff.

Bei 100% der Versuchstiere konnten Seren mit neutralisierender Aktivität induziert werden. Dieser Versuch wurde jedoch in einem artifiziellen System durchgeführt. Da ein geeignetes Tiermodell nicht zur Verfügung steht, kann durch diese Versuche keine Aussage getroffen werden, ob die induzierten Antikörper einen effektiven Schutz vor einer Infektion des Organismus bieten.

Die Blutentnahmen eines Versuchstieres (Ziege 20) erfolgten regelmäßig über einen Zeitraum von 24 Monaten. Es erfolgte keine zwischenzeitliche Auffrischung der Immunisierung. In diesem Zeitraum wurde kein signifikanter Abfall des Neutralistionstiters im Serum beobachtet. Obwohl sich anhand eines Tieres keine allgemeine Aussage treffen lässt, kann festgestellt werden, dass in diesem Tier ein konstant hoher Titer an neutralisierenden Antikörpern über einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten wurde.

Bei keinem der Versuchstiere wurden Nebenwirkungen beobachtet. Obwohl die Tiere unter ständiger Beobachtung standen, kann selbstverständlich über die klassischen leichten Nebenwirkungen einer Impfung (Gliederschmerzen, Unwohlsein usw.) keine Aussage getroffen werden. In Anbetracht der durch die Xenotransplantation notwendigen Immunsuppression und der damit verbundenen schweren Nebenwirkungen sind eventuelle leichte Nebenwirkungen einer Impfung wohl zu vernachlässigen. Auch die Frage der Kosten einer Immunisierung sowie der Lagerung und des Transportes eines PERV-Impfstoffes dürfte angesichts des enormen technischen und finanziellen Aufwandes einer Xenotransplantation eine untergeordnete Rolle spielen.

PERVs sind integraler Bestandteil des Genoms aller porziner Zellen. In den Seren der Schweine konnten bislang keine PERV-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Obwohl PERVs unter natürlichen Bedingungen nicht oder nur sehr schwach exprimiert werden, könnte eine Immunisierung gegen porzine Proteine möglicherweise zu unerwünschten Abstoßungsreaktionen des Transplantats führen. Die durchgeführten Versuche weisen jedoch darauf hin, dass die induzierten Antikörper gegen ein Epitop gerichtet sind, das vornehmlich während des Infektionszyklus präsent ist. Ob die schwachaffine Bindung der Antikörper zur Schädigung des Transplantats führen könnte, muss in weiteren Versuchen untersucht werden.

Die Notwendigkeit der Entwicklung eines präventiven HIV-Impfstoffes ist angesichts von 40 Millionen Infizierten, 15000 Neuinfektionen und 8000 Toten pro Tag unbestritten. Die unter 4.1. diskutierten allgemeinen Anforderungen an einen Impfstoff sind nach über zwanzig Jahren intensiver, aber weitestgehend erfolglosen Bemühungen zur Entwicklung eines effektiven Impfstoffs und der verheerenden Folgen für die soziale und ökonomische Infrastruktur der betroffenen Regionen differenzierter zu sehen. Der Schutz eines Teiles der Bevölkerung vor dem regional vorherrschenden Subtyp wäre ein großer Erfolg. In Anbetracht der enormen Kosten von Aufklärungskampagnen, der Belastung der Gesundheitssysteme durch die hohe Zahl der Kranken sowie des extremen Rückgangs des Bruttosozialprodukts stark durchseuchter Gebiete, dürfen die Kosten einer Impfung nicht im Vordergrund stehen. Es ist im Interesse der gesamten Weltgemeinschaft, die dafür erforderlichen finanziellen Mittel bereitzustellen.

Untersuchung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus von 2F5

Der breitneutralisierende, gegen das TM-Protein von HIV-1 gerichtete Antikörper 2F5, wurde 1993 aus einem HIV-1-infizierten Patienten isoliert (Zwick et al. 1993). Dieser Antikörper bindet eine Sequenz (ELDKWA) nahe des Transmembrandurchgangs im C-terminalen Bereich der gp41-Ektodomäne. Im in vitro-Neutralisationsassay inhibiert 2F5 die Replikation verschiedener HIV-1-Subtypen in sehr geringen Konzentrationen. Neben 2F5 konnte mit dem monoklonalen Antikörper 4E10 ein weiterer, gegen diesen Bereich gerichteter Antikörper mit ähnlichem Neutralisationsspektrum aus einem infizierten Patienten isoliert werden (Zwick et al. 2001, Stiegler et al., 2001). Untersuchungen belegen, dass Seren HIV-positiver Patienten, die Antikörper gegen den membranproximalen Bereich der Ektodomäne enthalten, einen höheren Neutralisationstiter zeigen als Seren, die diesen Bereich nicht erkennen (Calarota et al. 1996; Geffin et al., 1998). Auch die guten Ergebnisse in Studien zum passiven Immuntransfer mit 2F5 deuten auf das hohe Potential dieses Antikörpers hin (Stiegler 2002).

Eine Induktion solcher Antikörper durch aktive Immunisierung ist trotz zahlreicher Versuche jedoch noch nicht gelungen (Lu et al. 2000; Joyce et al., 2002; Coëffier et al., 2001). Der Grund dafür könnte im bisher noch nicht vollständig verstandenen Bindungs- und Neutralisationsmechanismus liegen, der wichtige Hinweise auf die notwendige Beschaffenheit geeigneter Antigene geben könnte.

In der Western Blot Analyse und im ELISA wurde beobachtet, dass 2F5 geringe Mengen der gp41-Ektodomäne deutlich besser bindet als an größere Mengen des linearen Peptides DP178. Verschiedene Studien zeigen, dass die an ELDKWA angrenzenden Aminosäuren einen Einfluss auf die Bindungsstärke haben (Ernst et al., 1998; Coëffier et al., 2001). In den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wurde dieser bindungssteigernde Effekt jedoch auch bei Verwendung des längeren Peptids DP178 (35mer) und dem ELDWA-enthaltenen Peptid NIH-6373 (15mer) beobachtet. Daher wird ein Einfluss der im DP178 enthaltene Aminosäuren auf die Konformation des 2F5-Epitops als Ursache für die Bindungssteigerung ausgeschlossen (Ernst et al. 1998).

Das anhand der Untersuchungen PERV-neutralisierender Antikörper erstellte Bindungs- und Neutralisationsmodell suggeriert die Existenz einer zweiten, am 2F5-Epitop beteiligten Sequenz im N-terminalen Bereich der Ektodomäne. In den hier durchgeführten Bindungsstudien mit überlappenden Peptiden, die den gesamten Env-Komplex umfassen, konnte erstmals eine Sequenz identifiziert werden, die die Bindung von 2F5 an das ELDKWA-Epitop deutlich steigert und nicht in direkter Nachbarschaft dieser Bindungsstelle liegt. Die identifizierte Sequenz ist, wie anhand des PERV-Modells vorausgesagt, im N-terminalen Bereich der Ektodomäne lokalisiert. Im Unterschied zu dem untersuchten PERV-p15E-spezifischen Antikörpern, binden 2F5 und 4E10 das vom HIV-E1-Bereich abgeleitete Peptid nicht im ELISA oder auf der Pepspot-Membran. Das legt die Vermutung nahe, dass die identifizierte Sequenz nicht direkt oder nur schwach an der Bildung eines Konformationsepitopes beteiligt ist, sondern durch Wechselwirkungen mit der ELDKWA-Sequenz entscheidenden Einfluss auf die Konformation des 2F5-Epitopes nimmt.

Diese These konnte durch die Versuche zum optimalen stöchiometrischen Verhältnis gestützt werden. Das ermittelte optimale Verhältnis der Peptide HIV-E1 zu HIV-E2 beträgt 2:1. Dieses Verhältnis kann mit der bereits beschrieben trimeren Struktur des Oberflächenkomplexes sehr gut erklärt werden.

	Abb. IV.3: Schematische Darstellung der gp41-Ektodomäne in der für die Neutralisation durch 2F5 relevanten Struktur.
	Dargestellt ist die Sechs-Helix-Konformation, die nach dem Eindringen des Fusionspeptids in die Zielzelle und der darauf folgenden Ausbildung der CHR-Helix entsteht. In die von den N-terminalen Helices (graue Zylinder) gebildete Furchen lagern sich die C-terminalen Helices (weißer Zylinder) ein. Die Lage des 2F5-Epitops ist rot, die der interagierenden „E1-Bereiche“ gelb gekennzeichnet. Durch einen mit der viralen Membran interagierenden tryptophanreichen Bereich wird das 2F5-Epitop in eine Typ I β-Turn-Konformation gefaltet.

Einfluss der Vorinkubation von HIV und 2F5

Der Komplex aus Oberflächen- und Hüllprotein durchläuft während des Infektionsvorgangs mehrere Konformationsänderungen. Das Hüllprotein ist im nativen Virus zum großen Teil vom Oberflächenprotein maskiert und wird erst nach der Anlagerung des Fusionspeptides in die Zielzellmembran, durch Ablösung des Oberflächenproteins, freigelegt. Der tryptophanreiche Bereich in unmittelbarer Nähe des 2F5-Epitops ist für die Fusion unerläßlich (Munoz-Barroso et al., 1999; Salzwedel et al., 1999) und unterliegt während des Fusionsprozesses mehreren Konformationsänderungen. Sattentau et al. (1999) konnten zeigen, dass 2F5 sein Epitop bereits vor der Bindung des CD4-Rezeptors bindet. Diese Daten werden durch die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche zum Einfluss der Vorinkubation gestützt. Die Vorinkubation bis zu ca. 45min führt zu deutlich gesteigerten virusneutralisierenden Wirkung von 2F5. Dieses Ergebnis lässt den Schluss zu, dass bereits im nativen Virus das 2F5-Epitop zugänglich ist und durch den Antikörper gebunden werden kann. Ob die identifizierte stabilisierende Sequenz im N-terminalen Bereich bereits in dieser Phase in räumlicher Nähe zum 2F5-Epitop vorliegt oder ob die Bindung des Antikörpers nach der Ausbildung der C-Helices stabilisiert wird, kann durch diesen Versuch nicht beantwortet werden. Sicher scheint, dass 2F5 nicht die Anlagerung von gp120 an den CD4-Rezeptor unterbindet (Ugolini et al., 1997; Nyambi et al., 2000; Barbato et al., 2003).

Ein anlog durchgeführter Versuch zur Vorinkubation PERV-neutralisierender Antikörper mit Virus führte zu keiner messbaren gesteigerten Neutralisation. Durch Immunfluoreszenz und FACS-Analse konnte jedoch auch hier die Zugänglichkeit der membranproximalen Bereiche vor der Rezeptorbindung gezeigt werden.

Bindungs- und Neutralisationsmodell für 2F5

Durch Bindungsstudien mit 2F5 konnte eine Sequenz im N-terminalen Bereich der Ektodomäne identifiziert werden, die an der Bindung von 2F5 an gp41 beteiligt ist. Dieses Ergebnis unterstützt das anhand PERV-neutralisierender Antikörper erstellte Bindungs- und Neutralisationsmodell.

Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass es sich beim HIV-1-Bereich um eine bindungsunterstützende Sequenz handelt, die durch den Antikörper nicht direkt gebunden werden kann, die Avidität des Antikörpers an das ELDKWA-Epitop jedoch deutlich erhöht. Für die Bindung eines Konformationsepitopes durch die Bereiche E1 und E2 konnte kein experimenteller Beweis erbracht werden.

Da über Konformation des gp41 vor der Ablösung des Oberflächenproteins keine gesicherten Daten vorliegen, ist die Ausrichtung beider Bereiche im nativen Virus jedoch unklar. Sicher ist jedoch, dass gp41 im nativen Virus in einer „geöffneten“ Form vorliegt. Wild et al., (1995) konnte die Fusionshemmung durch von der CHR-Helix abgeleiteten Peptiden (T20, DP178, C36) zeigen, die durch Anlagerung an die NHR-Helix die Ausbildung der Sechs-Helix-Struktur stören. Diese Daten legen nahe, dass es erst durch Konformationsänderungen während des Infektionszyklus zur Annäherung der beiden Bereiche kommt.

	Abb. IV.4: Schematische Darstellung der Bindung von 2F5 in zwei Stufen.
	2F5 kann das native Virus binden, verhindert aber nicht die Bindung des CD4- und des Korezeptors. Die Bindung ist jedoch von relativ geringer Affinität. Erst nach dem Eindringen des Fusionspeptides und der Ausbildung der Sechs-Helix-Konformation kommt es zur räumlichen Annäherung der E1-Sequenz. Die mit den Vorgängen verbundenen Konformationsänderungen ermöglichen die hochaffine Bindung des Antikörpers. Weitere, für die Membranverschmelzung notwendige Konformationsänderungen werden somit unterbundenen.

Auf Basis der vorliegenden Daten wurde ein zweistufiges Bindungsmodell für 2F5 aufgestellt. Das 2F5-Epitop ist danach bereits im nativen Virus frei zugänglich und wird durch den Antikörper gebunden. Die Bindung des CD4-Rezeptors durch gp120 sowie der Klappmechanismus des gp41 wird durch die Antikörperbindung nicht unterbunden (Suttentau et al., 1999; Ugolini et al., 1997; Golding et al., 2002). Da nur selten neutralisierende Antikörper gegen dieses Epitop in HIV-infizierten Patienten detektiert werden können (Calarota et al., 1996), scheint die Exposition eines neutralisationskompetenten Epitops in freien Viruspartikeln unwahrscheinlich. Diese Daten sprechen für einen Bindungsmechnismus, wie er für PERV-neutralisierende Antikörper aufgestellt wurde. Die teilweise unterschiedlichen experimentellen Daten könnten auf die unterschiedliche Beschaffenheit der Paratope neutralisierender Antikörper zurückzuführen sein. Während die PERV-neutralisierenden Antikörper der Ziege 20 direkt an ein Konformationsepitop binden, bindet 2F5 lediglich an das ELDKWA-Epitop, das jedoch in seiner Konformation entscheidend von der E1-Sequenz beeinflusst wird.

Immunisierung mit rekombinanten gp41

Analog zu den Immunisierungsversuchen mit dem transmembranen Hüllprotein von PERV wurde die gp41-Ektodomäne rekombinant als CBP-Fusionsprotein generiert und zur Immunisierung eingesetzt. Die Epitopkartierung der gp41-spezifischen Antikörper zeigt, ähnlich wie im Fall die PERV-spezifischen Seren, ein relativ homogenes Bild in der Lokalisation der Antikörperbindungsstellen (Abb. III.18), abhängig vom eingesetzten Antigen. Durch diese Immunisierung konnten zwar hohe Titer an gp41-bindenden, jedoch keine neutralisierenden Antikörper induziert werden. Der Grund hierfür könnte in der abweichenden Lokalisation der immunreaktiven Regionen im rgp41 im Vergleich zum rp15E liegen (Abb. IV.5). Die Epitopkartierung der Immunseren zeigt, dass in allen Seren Antikörper gegen den N-terminalen E1-Bereich induziert wurden. Es konnten auch Antikörper gegen den CHR-Bereich nachgewiesen werden, wobei die Bindungsstellen dieser Antikörper deutlich weiter N-terminal, in der Helixregion gelegen sind. Gegen die Regionen um das 2F5- oder das 4E10-Epitop (E2-Bereich) konnten keine Antikörper induziert werden. In Bindungsstudien konnte zwischen diesen beiden detektierten Epitopen keine Interaktion nachgewiesen werden.

	Abb. IV.5: Vergleich der Lokalisation der Epitope neutralisierender und induzierter Antikörper innerhalb der HIV-gp41- und PERV-p15E-Ektodomäne
	Die Bindungsstellen der induzierten Antikörper sind durch graue Rechtecke markiert, die Bindungsstellen der HIV-neutralisierenden, monoklonalen Antikörper 2F5 und 4E10 sind unterstrichen. Der Cysteinloop ist durch einen schwarzen Bogen gekennzeichnet.

Durch diesen Versuch konnte gezeigt werden, dass die Ektodomäne von gp41 in dieser Form nicht zur Induktion neutralisierender Antikörper geeignet ist. Die einfache Ableitung eines gp41-Konstruktes zur Induktion neutralisierender Antikörper vom rekombinanten PERV-p15E ist also nicht möglich.

Auch durch die Immunisierung mit dem gp41 der Firma Roche konnten keine neutralisierenden Antikörper induziert werden. Wie bei der Immunisierung mit CBP-gp41, wurden durch das Roche-gp41 Antikörper gegen den E1-, jedoch nicht gegen den E2-Bereich induziert.

Immunisierung mit von HIV-E1/E2 abgeleiteten Peptiden

Da eine Induktion gegen E1/E2-gerichteter Antikörper durch die rekombinant hergestellte Ektodomäne von gp41 nicht gelungen ist, wurde ein Ansatz mit synthetischen Peptiden gewählt.

Um die membranproximale Region (2F5 und 4E10-Epitop) zu der bindungssteigernden E1-Sequenz in räumliche Nähe zu bringen, wurden verschiedene Ansätze gewählt. Alle Versuche basieren auf von E1 und E2-abgeleiteten synthetischen Peptiden. Die Ergebnisse der Versuche deuten auf eine Interaktion beider Peptide in wässrigen Lösungen hin. Da eine für die Induktion neutralisierender Antikörper korrekte Ausrichtung der Peptide zueinander schwierig durch eine starre Kopplung zu erreichen ist, wurde bewusst auf die Abtrennung ungekoppelter Peptide verzichtet. Dadurch sollte die Anlagerung freier Peptide an bereits gekoppelte Peptide ermöglicht werden. Durch diesen Versuchsaufbau ist eine präzise Analyse des zur Immunisierung eingesetzten Konstrukts jedoch nicht möglich.

Es konnte in zwei Seren HIV-neutralisierende Aktivität nach den festgelegten Kriterien (∆ct>2) nachgewiesen werden. Die Hemmung der HIV-Replikation lag bei einer Serumsverdünnung von 1:16 zwischen 95% (Rattenserum Q3) bis 99% (Rattenserum S3). Damit entspricht die neutralisierende Aktivität dieser Seren etwa der des mAb2F5 in einer Konzentration von 10µg/ml. Ratte Q3 ist eins von drei mit den freien Peptiden (HIV-E1/E2), Ratte S3 eins von drei mit E1/E2-PDPH-Dex6 immunisierten Versuchstieren. Da freie Peptide nicht abgetrennt wurden, können die induzierten Antikörper im S3-Serum nicht auf das E1/E2-PDPH-Dex6-Antigen zurückgeführt werden. Die Hemmung der Provirusintegration durch die Immunseren aller anderen Versuchstiere kann nicht als signifikant eingestuft werden.

Das verwendete Testsystem zur Detektion neutralisierender Antikörper erwies sich im Laufe der Experimente als stabil. Trotzdem kann die Hemmung der Virusreplikation in einem in vitro-Neutralisationsassay auf vielfältige Ursachen zurückgehen. Zum Beispiel wird durch eine Immunisierung auch die Bildung von Chemokinen und Cytokinen induziert, die eine unspezifische Hemmung der Infektion als Folge haben können. Auch geringe Kontaminationen mit bakteriellen Bestandteilen (z.B. LPS) kann zur Proliferationshemmung oder sogar zu zytotoxischen Effekten führen. Die unvollständige Inhibition des Komplementsystems kann ebenfalls falsch positive Ergebnisse hervorrufen.

Da neben den aufgezählten noch eine Reihe weiterer Störungen des Systems denkbar wären, wurden zur Absicherung der Daten umfangreiche Kontrollexperimente durchgeführt:

• Nur aus den Immunseren isolierte IgG´s hemmen die VirusreplikationAus Präimmunserum und Immunserum wurden affinitätschromatographisch Immunglobuline der Klasse G bzw. TM-Protein-bindende Antikörper isoliert. Erwartungsgemäß konnten aus dem Präimmunserum keine virusspezifischen Antikörper isoliert werden. Die Virusreplikation wurde nur durch aus den Immunseren isolierte Antikörper gehemmt.
• Die neutralisierende Aktivität der Immunseren kann durch E1/E2 abgeleitete Peptide gehemmt werden. Dieses Ergebnis weist auf die Hemmung der Virusreplikation durch E1/E2-spezifische Antikörper hin.
• Die HIV-spezifischen Seren der Ratten S3 und Q3 hemmen die HIV-Replikation, jedoch nicht die Replikation des eng verwandten porzinen endogenen Retrovirus. Mit diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass die neutralisierende Wirkung der Seren HIV-spezifisch ist. Ein unspezifischer Effekt durch Chemokine oder Zytokine ist daher unwahrscheinlich.

Unklar ist, warum eine solche neutralisierende Immunantwort nur in wenigen Versuchstieren induziert werden konnte. Möglicherweise liegt der Grund hierfür in dem zur Immunisierung eingesetzten, relativ heterogenen Gemisch von freien, zusammengelagerten und gekoppelten Peptiden. In diesem Gemisch könnte eine Vielzahl verschiedener Konformationen zur Induktion von Antikörpern unterschiedlicher Spezifität führen.

In Versuchen zur Bestätigung der Ergebnisse wurden zehn Wistar-Ratten nach gleichen Immunisierungsschema mit freien Peptiden immunisiert. In keinem der induzierten Seren konnte HIV-neutralisierende Aktivität nachgewiesen werden. Trotz analoger Versuchsdurchführung zeigen die in den Folgeversuchen generierten Seren deutliche Unterschiede in der Verteilung der Antikörperbindungsstellen (analysiert durch Epitopkartierung) und demzufolge auch keine virusneutralisierende Aktivität. Auch der Titer an bindenden Antikörpern war im Vergleich zum ersten Immunisierungsversuch deutlich geringer. Die Ursachen der unterschiedlichen Versuchsergebnisse ist noch unklar.

Veröffentlichungen zeigen, dass 2F5 über eine besonders lange CDR3-Scheife (22 Aminosäuren) verfügt. Die durchschnittliche Länge der CDR3-Schleife humaner IgGs beträgt etwa 13 Aminosäurereste, die muriner IgGs 9-10 und die von Kaninchen 11-12 Aminosäurenreste (Wu et al., 1993). Eine lange CDR3-Schleife weist auf eine Antikörperreifung im Patienten hin (Kunert et al., 1998), wobei der Zeitpunkt des Auftretens solcher Antikörper wahrscheinlich der statistischen Zufälligkeit unterliegt. Die Bedeutung dieser langen CDR3-Schleife für die neutralisierende Aktivität von 2F5 wurde durch Untersuchungen von Zwick et al. (2004) belegt. In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, das Aminosäurenaustausche innerhalb der CDR3-Schleife von 2F5 zu einer Verringerung der neutralisierenden Aktivität der Antikörper bis zu 90% führt.

Aus diesen Studien muss geschlussfolgert werden, dass das hier verwendete Rattenmodell für die Induktion 2F5-ähnlicher Antikörper möglicherweise nur bedingt geeignet ist. Die Induktion von Antikörpern mit besonders langen CDR3-Schleifen in Ratten ist relativ selten, was auch die geringe Anzahl neutralisierender Immunseren innerhalb der einzelnen Immunisierungsgruppen erklären könnte. Die Verwendung eines Kaninchenmodells könnte so möglicherweise zu deutlich besseren Ergebnissen führen.

Kann durch aktive Immunisierung Schutz vor einer HIV-Infektion induziert werden?

Die Isolation breitneutralisierender Antikörper (2F5/4E10) aus infizierten Patienten zeigt, dass die Induktion neutralisierender Antikörper gegen den membranproximalen Bereich der gp41-Ektodomäne generell möglich ist. Diese These konnte durch die bisher durchgeführten Arbeiten grundsätzlich bestätigt werden. Auf Basis des Wirkmechanismus von 2F5 wurden Immunisierungsstudien durchgeführt, die zur Induktion neutralisierender Seren geführt haben. Obwohl nur in einem sehr geringen Teil der Versuchstiere neutralisierende Antikörper induziert wurden, die Reproduktion der Ergebnisse und der Test gegen Primär-isolate noch aussteht, ist es erstmals gelungen, neutralisierende Antikörper gegen diesen Bereich zu induzieren. Die Daten lassen hoffen, dass durch weitere intensive Forschungsarbeiten die Konstruktion von Antigen gelingt, die eine verlässliche Induktion solcher Antikörper gewährleisten. Die Ergebnisse der Studien zum passiven Immuntransfer im Menschen, SCID-Mäusen (severe combined immune deficiency) und Rhesusaffen zeigen die Effizienz solcher Antikörper (Stiegler et al., 2002; Gauduin et al., 1997). Wenn auch nach dem derzeitigen Kenntnisstand nicht sicher ist, dass so eine sterile Immunität im Menschen induziert werden kann, stellt die Induktion neutralisierender Antikörper auf Basis des hier erstellten Bindungsmodells einen viel versprechenden Ansatz dar.

In Fortführung der bereits begonnenen Untersuchungen zur Entwicklung eines präventiven Impfstoffes zur Vakzinierung zukünftiger Xenotransplantatempfänger mit PERV-rp15E, wird derzeit die Etablierung eines geeigneten Tiermodells zur Prüfung des Impfstoffes in vivo vorangetrieben. In Zusammenarbeit mit dem Scripps Research Institute, La Jolla, werden transgene Mäuse, die den Rezeptor von PERV exprimieren, auf ihre Infizierbarkeit mit PERV getestet. Mauszellen haben diesen Rezeptor nicht und können deshalb nicht mit PERV infiziert werden. Wenn die transgenen Tiere infizierbar sind, könnte in diesen Tieren die Effektivität einer Immunisierung mit p15E von PERV getestet werden. Erste Hinweise auf die Effektivität einer Imunisierung mit der rekombinant generierten Ektodomäne des TM-Proteins der Gammaretroviren sind auch schon von einem derzeit anlaufenden in vivo-Infektionsversuch mit Katzen und FeLV zu erwarten.

Sollten sich in diesen Versuchen die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten bestätigen, ist davon auszugehen, dass eine präventive Immunisierung zukünftiger Transplantatempfänger durch rp15E möglich ist.

Derzeit gibt keine weiteren Hinweise auf eine Übertragung von PERV auf den Menschen. Auch die Xenotransplantation kann noch nicht im großen Umfang in die klinische Praxis eingeführt werden. Trotz vieler kleiner und großer Fortschritte wird die Lösung gravierender physiologischer, anatomischer und immunologischer Probleme noch mehrere Jahre oder sogar Jahrzehnte in Anspruch nehmen. Eine Einführung eines PERV-Impfstoffes in die klinischen Phasen scheint daher zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht sinnvoll. Die erfolgreichen in vivo-Versuche im Maus- und Katzenmodell vorausgesetzt, kann dieses Projekt somit als abgeschlossen betrachtet werden.

Die Aufklärung des Bindungsmechanismus von 2F5 könnte die Basis für neue Impfstoffansätze sein. Interessant wäre in diesem Zusammenhang die Analyse des monoklonalen Antikörpers 4E10. Da das Epitop dieses ebenfalls breitneutralisierenden Antikörpers in direkter Nachbarschaft zum 2F5-Epitop lokalisiert ist, könnte die Analyse die hier gesammelten Daten bestätigen oder sogar noch weitere Erkenntnisse zum Neutralisationsmechanismus oder zur „korrekten“ Konformation des membranproximalen E2-Bereiches betragen.

Obwohl gezeigt werden konnte, dass die Induktion HIV-neutralisierender Antikörper durch den gewählten Ansatz generell möglich ist, sind die Ergebnisse der Immunisierungsstudien unbefriedigend. Wie unter 4.3. bereits diskutiert, könnte ein Grund dafür in dem für die Versuche nur bedingt geeigneten Rattenmodell liegen. Die Wiederholung der Versuche im Kaninchenmodell ist bereits angelaufen.

Eingehende Strukturuntersuchungen zur Interaktion der identifizierten E1-Sequenz mit dem 2F5-Epitop durch spektroskopische Methoden sind notwendig. Die Kenntnis über die genaue Sekundär- bzw. Tertiärstruktur der beiden Peptide während der Bildung eines neu-tralisierenden Epitopes, könnte beim Design eines effektiven Antigens von entscheidender Bedeutung sein.

Ziel der unmittelbar bevorstehenden Arbeiten muss die Reproduktion der bisherigen Ergebnisse sowie die Optimierung des Antigens sein. Ein effektiver HIV-Impfstoff muss neutralisierende Antikörper gegen Primärisolate verschiedener Subtypen induzieren. In den weiteren Versuchen muss untersucht werden, ob durch den hier gewählten Ansatz solche Antikörper induziert werden können.