Die Transplantation von porzinen Organen könnte eine Lösung des akuten Mangels von Allotransplantaten in der Transplantationsmedizin darstellen. Bevor die Xenotransplantation klinische Realität werden kann, sind jedoch zahlreiche Hürden zu überwinden. Insbesondere die mögliche Übertragung porziner endogener Retroviren (PERVs), die integraler Bestandteil des porzinen Genoms sind, stellt ein mikrobiologisches Risiko dar. PERVs können humane Zellen in vitro produktiv infizieren. Mögliche Strategien zur Abwehr von Xenosen sind die Verwendung von PERV-knockout Tieren oder die Entwicklung eines effektiven Impfstoffes, durch den der Transplantatrezipient vor einer möglichen Übertragung geschützt werden kann. Dazu wurden Antiseren gegen die Hauptstrukturproteine von PERV generiert. Es konnte gezeigt werden, dass in Ziegen und Ratten durch Immunisierung mit der rekombinant generiereten Ektodomäne des transmembranen Hüllprotein p15E neutralisierende Antikörper induziert werden konnten. Die Epitopkartierung der induzierten Antikörper zeigt eine Bindung an eine Domäne im N-terminalen, nahe des Fusionspeptids (E1, GPQQLEK) und eine Domäne im C-terminalen, membranproximalen (E2, FEGWFN) Bereich der p15E-Ektodomäne. Diese Sequenzen sind in allen PERVs identisch und innerhalb der Gammaretroviren hochkonserviert.
Aus AIDS-Patienten isolierte neutralisierende Antikörper (mAb2F5: ELDKWA, mAb4E10: LWNWFN) binden ebenfalls an den C-terminalen Bereich der Ektodomäne des Transmembranproteins gp41. Der Bindungsmechannismus dieser Antikörper wurde in ELISA-Experimenten und in vitro-Inhibitionsassays analysiert. Die Ergebnisse legen die Bindung eines Konformationsepitopes nahe, das aus der E1 und der E2 Domäne gebildet wird. Die Aufklärung des Bindungsmechnismus breit neutralisierender Antikörper gegen Transmembranproteine von Retroviren könnte die Basis für neue Impfstoffansätze darstellen.
Porcine xenotransplants may offer a potential solution to the problem posed by the limited supply of allotransplants. However, xenotransplantation may be associated with the risk of transmission of microorganisms, in particular of porcine endogenous retroviruses (PERVs) that are an integral part of the porcine genome and able to infect human cells in vitro. Possible strategies to prevent virus transmission include the development of PERV knockout animals or of effective vaccines. When antisera prepared against the main structural proteins of PERV were screened, goat and rat antisera against the recombinant ectodomain of the transmembrane envelope protein p15E were found to neutralize PERV infectivity. Epitope mapping using overlapping peptides revealed two epitopes, one near the fusion peptide (E1, GPQQLEK) and the other near the transmembrane domain (E2, FEGWFN). These sequences are identical for all PERVs and are highly conserved among all gammaretroviruses.
Interestingly, neutralizing antibodies isolated from AIDS patients that recognize regions partially homologous with E2 (mAb4E10, LWNWFN) or located in close proximity to E2 (mAb2F5, ELDKWA) are known to neutralize a broad range of HIV-1 strains. The binding mechanisms of these HIV neutralizing antibodies were analyzed in ELISA experiments and in vitro inhibition assays. The results indicate that the two most broadly reactive HIV-1 envelope gp41 human mAbs are specific for a discontinuous epitope composed of the E1 and the E2 domain. If so, these two transmembrane protein domains in different retroviruses act as effective targets for neutralizing antibodies and may provide the basis for effective antiretroviral vaccines.
In den vergangenen Jahrhunderten waren es vor allem bakterielle Infektionen, wie Pest (Yersinia pestis), Cholera (Vibrio cholerae) oder Tuberkulose (Mycobakterium tuberculosis) die zu großen Pandemien mit hoher Letalität führten. Aber auch Virusinfektionen, durch Pocken-, Influenza-, Masern- oder Polioviren forderten viele Todesopfer.
Obwohl heute immer noch jährlich ca. zwei Millionen Menschen an den Folgen einer Tuberkuloseerkrankung sterben (Young, 2003), sind mit der Entdeckung der Antibiotika durch A. Fleming die meisten bakteriellen Infektionen therapierbar geworden. Pest, Cholera und Tuberkulose, die während großer Epidemien regional über 30% der Bevölkerung auslöschten, spielen heute in den Industrieländern nur noch eine untergeordnete Rolle.
Obwohl die Entdeckung der Viren und der wissenschaftliche Beweis für die mit ihnen assoziierten Krankheiten erst ca. 100 Jahre zurück liegt, sind sie seit Anbeginn Begleiter der Menschheit. Sie unterscheiden sich grundlegend von anderen Krankheitserregern, wie z.B. Bakterien oder Pilzen. Viren haben keinen eigenen Stoffwechsel, zur Replikation nutzen sie den Syntheseapparat der Wirtszelle. Diese enge Verbindung zwischen Virus und Wirtszelle macht eine Therapie oft sehr schwierig. Antivirale Medikamente sind meist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden, da sie in die Stoffwechselprozesse der Wirtszelle eingreifen. Breit wirkende Therapeutika, wie z.B. Antibiotika zur Therapie bakterieller Infektionen, stehen nicht zur Verfügung. Auch wenn die Entwicklung antiviraler Therapien in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht hat, kann so oft nur die Überlebenszeit der Patienten verlängert, jedoch keine Heilung erreicht werden. Des Weiteren sind mit der antiviralen Therapie meist hohe Kosten verbunden, die von den Gesundheitssystemen der Entwicklungsländer nicht aufgebracht werden können. Die HAAR-Therapie (highly active antiretroviral therapy) zur Behandlung von AIDS-Patienten verursacht Kosten von 13000-23000 US-$ pro Jahr und Patient (Freedberg et al., 2001). So steht der Mehrheit der HIV-Infizierten keine lebensverlängernde antivirale Therapie zur Verfügung.
Die optimale und kostengünstigste Strategie zur Bekämpfung von Virusepidemien ist nach wie vor die präventive Vakzinierung. Der Erfolg großer Impfkampagnen, wie z.B. gegen das Pocken- oder Poliovirus, zeigt die Effektivität solcher.
1970 machten D. Baltimore, H.M. Temin und S. Mituzami die Entdeckung, dass diese Viren in der Lage sind, RNA zurück in DNA zu übersetzen. Bis zu diesem Zeitpunkt war man davon ausgegangen, dass die Übersetzung von DNA in RNA nur in eine Richtung möglich ist. Diese reverse Transkription wird durch die reverse Transkriptase initiiert. Dieses Enzym ist der Namensgeber der Retroviren.
Bis 1971 waren Retroviren nur in der Tierwelt beschrieben worden. 1971 wurde erstmals ein humanes Retrovirus, das humane Spumaretrovirus (HSRV), aus menschlichem Gewebe isoliert. R. Gallo brachte 1980 erstmals ein humanes Retrovirus mit Tumorbildung beim Menschen in Zusammenhang. Das von ihm beschriebene HTL-Virus (Human T-Cell Leukemia Virus) gilt als Auslöser von T-Zell-Leukämien. 1983 identifizierten L. Montagnier und R. Gallo das humane Immundefizienzvirus HIV-1 als Retrovirus und Auslöser der Immunschwächekrankheit AIDS. Auch können häufig Tumorerkrankungen mit Retrovirusinfektionen in Verbindung gebracht werden. Für diese Entdeckung erhielten John Michael Bishop und Harold Eliot Varmus 1989 den Nobelpreis für Medizin.
Weiterhin wird zwischen exogenen und endogenen Retroviren unterschieden. Endogene Retroviren sind in das Genom aller Zellen des Organismus integriert und werden vertikal über Keimbahnzellen übertragen. Die Eliminierung endogener Retroviren durch Züchtung oder Haltung unter SPF-Bedingungen (Specified Pathogen Free) ist daher nicht möglich. Obwohl diese Viren nicht dem Evolutionsdruck unterliegen und daher viele genetisch verkrüppelt sind, kann es unter bestimmten Umständen zur Produktion exogener infektiöser Partikel kommen. Im Rahmen der Forschung zur Virussicherheit der Xenotransplantation konnte das z.B. für die porzinen endogen Retroviren (PERVs) gezeigt werden. Nach Stimulation von primären Schweinelymphozyten konnte eine Freisetzung von infektiösen Viruspartikeln beobachtet werden, die in vivo an humane 293 Zellen adaptierten und diese produktiv infizierten (Denner et al., 2003; Specke et al., 2002).
Im Unterschied zu den endogenen Retroviren erfolgt die Übertragung der exogenen Retroviren von Organismus zu Organismus. Durch spezifizierte pathogenfreie Haltung oder Züchtung kann das Virus meist leicht eliminiert werden.
Das Genom der Retroviren besteht aus zwei identischen, einzelsträngigen RNA-Molekülen, die an den Enden polyadenyliert sind. Die Länge variiert zwischen 8 - 11 kB.
Für das porzine endogene Retrovirus (PERV) konnte in vivo gezeigt werden, dass das repetitive Einfügen kurzer Sequenzen während serieller Passagen zur gesteigerten LTR-Promotoraktivität und damit zur deutlich erhöhten Virusreplikation führt. Diese Steigerung wird auf die Multimerisierung von Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors NF-Y zurückgeführt, die dem Virus zusätzliche Replikation in den infizierten Zellen sichert (Denner et al., 2003).
Komplexe Retroviren, wie HIV, besitzen zusätzlich Gene, die für regulatorische und akzessorische Proteine codieren (Rev, Nef, Tat, Vif, Vpr, Vpu). Regulatorische Proteine können z.B. als Transaktivatoren (Tat-Proteine = transactivator of transkription) oder als Expressionsregulatoren (Rev-Protein = regulator of gene expression of virion proteins) fungieren. Akzessorische Proteine , wie z.B. das Vif- (viral infectivity factor) oder das Nef-Protein (negative factor) steigern vor allem die Infektiosität der Virionen.
Retrovirale Partikel haben einen Durchmesser von 80-130nm und bestehen aus einem inneren Kapsid, umgeben von einer äußeren Hülle. Die Hüllmembran besteht aus einer Lipid-Doppelschicht und ist von der Zytoplasmamembran der Wirtszelle abgeleitet.
(http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/STRUCTURE/INDEX.HTML)
Das Oberflächenhüllprotein des HIV-1 hat ein Molekulargewicht von 120kDa, das des PERV vom 70kDa. Die Oberflächenhüllproteine der Retroviren weisen meist einen sehr hohen Glykosylierungsgrad und eine hohe Sequenzvariabilität auf. Mit bis zu 32 Glykolysierungsstellen zählt gp120 zu den am stärksten glykolysierten Proteinen. Bis zu 50% der Molekülmasse besteht aus Kohlehydraten (Leonard et al., 1990). Durch Oligomerisierung, Glykolysierung, Konformations- und Strukturänderungen können neutralisationsresistente Virusvarianten gebildet werden (Evans und Desrosiers, 2001). Das gp120 ist in eine äußere und eine innere Domäne gefaltet, die durch eine Brücke aus vier β-Faltblättern (β-Bridging Sheet) miteinander verbunden sind. Die äußere Domäne besteht aus fünf variablen Schleifen (Loops), V1-5, die durch Disulfidbrücken stabilisiert werden. Die CD4-Rezeptorbindungsstelle ist zwischen diesen Domänen in eine Vertiefung eingebettet.
Die Bindung des Rezeptors führt zu einer Konformati-onsänderung, in deren Folge die Chemokinrezeptorbindungsstelle freigelegt wird.
Im Gegensatz zu den Oberflächenhüllproteinen sind transmembrane Hüllproteine relativ schwach (HIV-1-gp41, drei Glykosylierungsstellen) oder gar nicht (PERV-p15E) glykosyliert. Im nativen Zustand sind sie nahezu vollständig vom Oberflächenprotein verdeckt und für das Immunsystem schwer zugänglich.
Das Transmembranhüllprotein untergliedert sich in einen extraviralen (Ektodomäne) und einen intraviralen (zytoplasmatischen) Bereich und ist über eine ca. 20 Aminosäurereste lange, zwischen diesen beiden Bereichen liegende, stark hydrophobe Sequen,z in der Membran verankert. Die Ektodomäne untergliedert sich in das Fusionspeptid (FP), die N-terminale Helixregion (NHR), eine Cysteinschleife (C-C Loop) mit immundominanter (IDO) und immunsuppressiver Domäne (ISU), eine C-terminale Helixregion (CHR) und in einen kurzen membranproximalen Bereich (Abb. I.4A). Von der ISU-Domäne abgeleitete Peptide wirken in vitro Proliferationshemmend (Denner et al., 1994, 1996) und modulieren die Cytokinproduktion (Denner, 1998). Der zytoplasmatische Teil kann je nach Virustyp unterschiedlich lang sein. Während er bei Gammaretroviren nur 30-40 Aminosäuren enthält, verfügen Lentiviren über einen relativ großen intraviralen Anteil (ca. 150 AS), der bei HIV zwei α-Helices enthält. Es ist unklar, welche Rolle der zytoplamatische Teil während der Infektion einnimmt. Versuche, in denen Teile des zytoplasmatischen Bereichs deletiert wurden, zeigen jedoch einen deutlich Rückgang der Infektiosität. Für Lenti- und Gammaretroviren sind gegen den intraviralen Teil gerichtete, neu-tralisierende Antikörper beschrieben worden (Cleveland et al., 2003, Nick et al., 1990), deren Wirkmechanismus allerdings völlig unklar ist.
Transmembran- und Oberflächenhüllprotein sind die einzigen, auf der Oberfläche von Retroviren exponierten viralen Proteine und damit die wichtigsten Angriffspunkte einer humoralen neutralisierenden Immunantwort. HIV-neutralisierende Antikörper gegen Gag-Proteine der Retroviren (Kageyama et al., 1996) sind zwar von einigen Gruppen beschrieben worden, spielen aber bei der Induktion einer virushemmenden Immunantwort eine untergeordnete Rolle. Im Laufe einer Infektion werden hohe Antikörpertiter gegen virale Proteine (wie Gag, SU und TM) gebildet, trotzdem kommt es im infizierten Wirt nicht zu einer effektiven Neutralisation. Nur wenige breit neutralisierende Antikörper konnten bisher aus HIV-Patienten isoliert werden (Tab. I.5), die Induktion solcher Antikörper ist trotz intensiver Bemühungen bisher noch nicht gelungen.
Zu den gruppenspezifischen Antigenen gehören die Matrix-, Kapsid- und Nukloekapsidproteine. Sie erfüllen verschiedene Funktionen, die z.B. zur Partikelbildung und -freisetzung, Struktur und Infektiosität der reifen Virionen beitragen. Alle Gag-Proteine werden als ein gemeinsames Vorläuferprotein translatiert, das im Verlauf der Virusmorphogenese von einer viralen Protease in die einzelnen Komponenten gespalten wird. Die sequentielle Abfolge der einzelnen Gag-Proteine im Vorläuferprotein ist bei allen Retroviren gleich, die Größe der einzelnen Komponenten kann dagegen sehr unterschiedlich sein. Das HIV-1 gag-Gen kodiert ein 55kDa großes Vorläuferprotein, das in ein 17kDa großes Matrixprotein, ein 24kDa großes Kapsidprotein, ein 7kDa großes Nukleokapsidprotein und in die Linkerproteine p6, p2 und p1 gespalten wird (Wiegers et al., 1998). Das Gag-Vorläuferprotein der porzinen endogenen Retroviren (60kDa) wird in das p27-Kapsidprotein (27kDa), das p15-Matrixprotein (15kDa), das p7-Nukleokapsidprotein (7kDa) sowie in das p12-Linkerprotein (12kDa) gespalten.
Das retrovirale Genom codiert die Enzyme Integrase, Protease und die reverse Transkriptase. Sie sind Produkte des pol-Gens und werden durch eine Leserasterverschiebung während der Gag-Polyprotein-Translation als gemeinsames Gag/Pol-Vorläuferpotein synthetisiert. Durch diese Leserasterverschiebung wird das gag-Stoppcodon überlesen und dem Gag-Polyprotein werden die Pol-Domänen angehängt. Dieses Ereignis findet etwa bei jedem zwanzigsten Translationsvorgang statt. Die Proteolyse in die aktiven Enzyme erfolgt während der Virusreifung im bereits freigesetzten Partikel.
Die Integrase wirkt als Endonuklease und Ligase. Sie schneidet die Enden der doppelsträngigen proviralen DNA und katalysiert die kovalente Integration in das Genom der Wirtszelle.
Die reverse Transkriptase kann als RNA- oder DNA-abhängige DNA-Polymerase oder auch als RNAase wirken. Sie katalysiert die Umschreibung der viralen RNA in provirale DNA und baut nach der Synthese der DNA/RNA-Hybriddoppelstränge den RNA-Anteil ab. Die reverse Transkriptase besitzt keine Mechanismen zur Kontrolle der Lesegenauigkeit und baut daher mit einer Wahrscheinlichkeit von 1:10-3-10-4 falsche Basen in den neusynthetisierten DNA-Strang ein. Diese hohe Fehlerrate sichert dem Virus eine hohe Sequenzvariabilität. Verschiedene Nukleosidanaloga, wie z.B. Azidothymidin (AZT) oder Didesoxycytidin, werden derzeit als Inhibitoren der reversen Transkriptase zur antiretroviralen Therapie eingesetzt. Der Einbau dieser chemisch veränderten Basenderivate in den neusynthetisierten DNA-Strang führt zum Kettenabbruch. Neben den Nuklosidanaloga werden auch Nicht-Nuklosidanaloga als RT-Inhibitoren eingesetzt.
Die Adsorption der Retroviren an die Zielzelle erfolgt über spezifische zelluläre Rezeptoren in Abhängigkeit vom jeweiligen Virustyp. Sie wird durch den externen Teil des Membranproteinkomplexes vermittelt. Am besten untersucht ist die Replikation der HI-Viren, daher soll der Infektionszyklus hier exemplarisch am HI-Virus erklärt werden.
Das Transmembranhüllprotein vermittelt die Fusion zwischen Virus und der Zytoplasmamembran der Zielzelle. Die Bindung des Oberflächenhüllproteins an den bzw. die Rezeptoren bewirkt Konformationsänderungen, durch die eine stark hydrophobe Sequenz am aminoterminalen Teil des TM-Hüllproteins freigelegt wird. Dieses ca. 25 Aminosäuren lange Fusionspeptid dient als hydrophober Anker, der sich während der Infektion in die Lipidmembran der Zielzelle einlagert und so die Verschmelzung mit der Virushülle vermittelt. Der Membranenverschmelzung geht die Ablösung von gp120 und das Zusammenklappen der beiden Helixes des Transmembranproteins voraus (Abb. I.5).
Nach der Aufnahme des Virus-Kapsids in das Zytoplasma der Zielzelle, folgt der Uncoating-Prozess, durch den die virale RNA in das Zytosol freigesetzt wird. Durch reverse Transkription des viralen RNA-Genoms wird das doppelsträngige DNA-Provirus synthetisiert. Im Zellkern katalysiert die virale Integrase die kovalente Integration des Provirus in das Wirtszellgenom.
Die späte Phase der Virusreplikation beginnt mit der Transkription der viralen Gene durch die zelluläre RNA-Polymerase II. Die viralen Proteine und das Virusgenom lagern sich an der Zytoplasmamembran an. In der Folge kommt es zur Knospung der unreifen Partikel von der Zelloberfläche. Erst nach der Spaltung der Gag- und Gag/Pol-Vorläuferproteine durch die virale Protease entstehen infektiöse Partikel.
Als Krankheiterreger spielten Gammaretroviren bislang nur in der Veterinärmedizin eine Rolle. Das feline Leukämievirus (FeLV) verursacht bei der Hauskatze Leukämien, Immunschwäche und opportunistische Infektionen, die oft tödlich verlaufen. Wie für die Lentiviren wurden auch für Gammaretroviren Transspeziesübertragungen unter natürlichen Bedingungen beschrieben (Denner, 2000). Die Übertragung eines endogenen Mausretrovirus (MuLV) auf Gibbonaffen ruft beim neuen Wirt als exogenes Retrovirus (Gibbon ape leukemia virus; GaLV) myeloische Leukämien und Lymphome hervor (Lieber et al., 1975).
Viele Transspeziesübertragungen führten im neuen Wirt zu ausgeprägten Krankheitsbildern. Aufgrund der besonderen Situation während der Xenotransplantation wird das Risiko der Übertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERV), besonders intensiv erforscht. Das Schwein gilt aus verschiedenen Gründen als favorisierte Spenderspezies (Tab. I.2), die potentielle Gefahr einer Transspeziesübertragung von PERVs auf Transplantatempfänger, kann derzeit nicht ausgeschlossen werden.
In Deutschland werden jährlich ca. 2300 Nieren, 550 Herzen und 720 Lebern transplantiert. Auf der Warteliste stehen jedoch 11000 Dialysepatienten, die eine Niere benötigen, und etwa 2000 Herz- und Leberpatienten. Ein Viertel dieser Patienten verstirbt, bevor sie ein Organ erhalten haben. Um diesen permanenten Mangel zu beheben, werden zurzeit verschiedene Lösungswege, wie z.B. das „Tissue-Engineering“ auf Basis von Stammzellen, bioartifizielle Systeme (z.B. ex vivo Perfusion) oder die Xenotransplantation diskutiert. Letztere ist von allen Alternativen zur Allotransplantation forschungsmäßig am weitesten fortgeschritten, alle Pro und Contras ihrer Anwendung werden in der Öffentlichkeit bereits intensiv diskutiert. Fortschritte bei der Erzeugung transgener Spendertiere machen die breite klinische Anwendung der Xenotransplantation immer wahrscheinlicher.
Als favorisierte Ausgangsspezies für die Xenotransplantation gilt derzeit das Schwein. Obwohl es phylogenetisch weiter vom Menschen entfernt ist als z.B. die nicht-humanen Primaten der Altwelt, weist es doch einige entscheidende Vorteile auf. Die Vor- und Nachteile verschiedener Spendertiere sind in der nachfolgender Tabelle gegenüber gestellt (nach Denner, 2000).
Bevor die Xenotransplantation klinische Realität werden kann, müssen drei Hauptprobleme gelöst werden. Neben der Überwindung der physiologischen und anatomischen Hindernisse, sind es vor allem immunologische Probleme, die eine erfolgreiche Xenotransplantation in der Vergangenheit verhindert haben. Nicht zuletzt muss das mikrobiologische Risiko, also die Gefahr von Xenosen, sowie mögliche Gegenmaßnahmen möglichst umfassend erforscht werden.
Die physiologischen und anatomischen Unterschiede bei xenogenen Transplantationen sind erheblich, besonders wenn sie nicht innerhalb einer zoologischen Familie oder gar Ordnung durchgeführt werden. Da nicht-humane Primaten aus verschiedenen Gründen als Spendertiere nicht in Betracht kommen (Tab. I.2), muss für die Xenotransplantation auf Spender einer anderen zoologischen Ordnung zurückgegriffen werden. Die Verwendung von Schweinen als potentielle Spenderspezies bringt für die Xenotransplantation gravierende physiologische und anatomische Probleme mit sich. Obwohl die Größe der Organe annähernd identisch ist, bringt das Verlagern der Organe von einer horizontalen, in eine vertikale Orientierung nachweislich eine Beeinträchtigung der Funktion mit sich (West et al., 1987). Auch die Frage nach unterschiedlicher Alterungsdynamik zwischen Spender und Empfänger könnte eine nicht unwesentliche Rolle spielen. Wichtigste physiologische Barriere ist jedoch die Hormon- und Enzymkompatibilität. Bisher sind nur wenige Stoffwechselabläufe in xenogenen Systemen untersucht. Klar ist, dass es neben analog ablaufender, wie z.B. die Insulinproduktion, auch völlig inkompatible Stoffwechselmechanismen gibt, die zwischen Empfänger und Transplantat keine Interaktion erlauben. Genauere Untersuchungen werden zeigen, welche Zellen, Gewebe oder sogar Organe sich für die Xenotransplantation eigenen. Trotz dieser physiologischen Hürden konnte in klinischen Studien bereits gezeigt werden, dass bestimmte xenogene Transplantate, wie z.B. Insulin-produzierende Langerhans-Inseln oder Dopamin-produzierende Neuronalzellen, im Menschen ihre Aufgabe erfüllen können.
Die bei der Xenotransplantation auftretenden immunologischen Reaktionen lassen sich in vier zeitliche Phasen einteilen:
Die hyperakute vaskuläre Abstoßungsreaktion (HAR)
Die Transplantation von xenogenen Gewebe führt zur Aktivierung des Komplementsystems und damit zu einer hyperakuten Abstoßung des Transplantates nach wenigen Minuten bis Stunden. Ursache für diese Komplementaktivierung ist die Bindung präformierter Antikörper an Kohlehydratepitope auf den Gefäßendothelien des Transplantates. Diese Gal-α-1,3-gal Epitope sind auf den Zellen aller Säuger, ausgenommen des Menschen und einiger nicht-humaner Primaten exponiert (Galili et al., 1993). In den letzten Jahren konnten mehrere wirksame Strategien zur Vermeidung der HAR entwickelt werden. Durch Immunabsorption xenoreaktiver Antikörper (Lucchiari et al. 1997) oder der Einsatz löslicher Komplementinhibitoren konnte die akute Organschädigung deutlich vermindert werden (Kroshus et al., 1995). Den größten Erfolg verspricht jedoch die Entwicklung transgener Schweine. Anfänglich war es jedoch nicht gelungen, die Gene der α-1,3-Galactosyltransferase durch das knock-out Verfahren aus dem Genom des Schweins zu entfernen. Daher wurden die Schweine mit Genen ausgestattet, die den Transfer humaner Komplementregulatoren auf die Oberfläche der Zellen des Xenotransplantats bewirken und somit den Angriff durch das Komplementsystem des Empfängers inhibieren (Cozzi und White, 1995). Inzwischen ist es gelungen, die kodierenden Gene der α-1,3-Galactosyltransferase aus dem Genom der Schweine zu entfernen (Dai et al., 2002; Lai et al., 2002).
Die verzögerte Xenotransplantatabstoßung
Neben der hyperakuten Abstoßungsreaktion bildet der Organismus noch weitere Immunbarrieren, wie z.B. die verzögerte bzw. die akut vaskuläre Abstoßungsreaktion. Die verzögerte Transplantatabstoßung ist charakterisiert durch die Bildung von Thromben, intravasale und interstitielle Fibrinablagerungen sowie der Infiltration des Transplantates mit Killerzellen und Makrophagen. Diese Reaktion ist bisher noch nicht vollständig verstanden. Man geht davon aus, dass sie ebenfalls durch präformierte Antikörper gegen Kohlehydratepitope auf der Oberfläche des Transplantates ausgelöst wird. Die Bindung dieser Antikörper führt zur Endothelzellaktivierung TypII, die zu einer Abstoßung des Transplantats innerhalb weniger Tage führt. Durch eine weitere genetische Humanisierung des Transplantats könnte auch hier, wie bei der hyperakuten Abstoßung, eine deutliche Reduktion der verzögerten Abstoßungsreaktion erreicht werden.
Die T-Zell-vermittelte Abstoßungsreaktion
Als vermutlich letzte Phase der akuten Abstoßungsreaktion tritt die T-Zell-vermittelte zelluläre Transplantatabstoßung auf. Diese Reaktion ist, im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Abstoßungsreaktionen, nicht durch Antikörper vermittelt. Die Erkennung des Fremdgewebes erfolgt über die Präsentation von Peptidantigenen durch antigenpräsentierende Zellen, wie z.B. dendritischen Zellen oder Makrophagen. Obwohl bei der Xenotransplantation die T-Zell-vermittelte Abstoßungsreaktion nicht so stark ist wie bei der Allotransplantation, stellt sie das Bindeglied zwischen akuter und chronischer Abstoßungsphase dar. Sie läst sich in zwei Phasen, der Induktionsphase und der darauf folgenden Effektorphase, einteilen. In der Induktionsphase werden an MHC-Klasse-II-Moleküle gebundene Peptidantigene von CD4+ T-Helferzellen erkannt. In der Effektorphase kommt es durch zytotoxische T-Lymphozyten sowie der massiven Ausschüttung von Zytokinen und TNFα/β (Satake et al., 1996, Yamada et al., 1995) zur Schädigung des Transplantats. Zur Unterdrückung dieser Reaktion werden derzeit herkömmliche Immunsuppressiva (z.B. Cyclosporin A, Rapamycin) appliziert. Im Vergleich zur Allotransplantation ist jedoch eine höhere Medikation notwendig, die zur Entwicklung von Tumoren oder Lymphomen in den Rezipienten führen könnte. Eine Lösung des Problems könnte die Entwicklung neuer, speziell auf die Xenotransplantation zugeschnittener Medikamente sein.
Die chronische Transplantatabstoßung
Die chronische Transplantatabstoßung tritt binnen Monaten bis Jahren auf. Aufgrund von Verengungen durch Gewebeproliferation kommt es zum Verschluss von Gefäßen und zur interstitiellen Gewebsfibrose. Der Verschluss der Gefäße führt zu Nekrosen und letztlich zum Versagen des Transplantats. Die Auslöser dieser Prozesse sind bislang weitgehend unbekannt. Dieser Prozess kann nicht durch den Einsatz von Immunsuppressiva aufgehalten werden.
Die potentielle Verwendung von Schweinen als Spender für Xenotransplantate bringt hinsichtlich der mikrobiologischen Risiken einige Vorteile gegenüber den uns näher verwandten humanen und nicht-humanen Primaten. Die phylogenetische Nähe von Menschen und Primaten könnte eine Vermehrung von pathogenen Erregern im Menschen begünstigen. Ein weiterer großer Vorteil des Schweins ist, dass die meisten Erreger bekannt sind und mittels SPF-Haltung, Antibiotikabehandlung und präventiver Vakzinierung als Infektionsrisiko ausgeschlossen werden können.
Das größte Risiko geht daher von den endogenen Retroviren des Schweins aus, da diese in der Keimbahn verankert und nicht durch Züchtung oder Therapien zu eliminieren sind. Bei bislang durchgeführten Xenotransplantationen, wie der Übertragung von Neuronalzellen auf Parkinsonpatienten, Langerhans´schen Inselzellen auf Diabetespatienten oder extrakorporaler Perfusion von Schweinenieren konnten keine PERV-Infektion nachgewiesen werden (Heneine et al., 1998; Patience et al., 1998; Tacke et al., 2002; Irgang et al., 2003). Ein weiteres Risiko könnten unerkannte Erreger darstellen, die durch allgemeine Hygienemaßnahmen nur teilweise zu eliminieren sind (Denner, 2000).
In Deutschland sind derzeit verschiedene FeLV-Impfstoffe zugelassen (Tab. I.3). Obwohl neutralisierende Antikörper auch gegen das Transmembranhüllprotein beschrieben sind, kommen bevorzugt gp70-Antigene zur Anwendung (Kleiser et al., 1986; Elder et al. 1987; Nick et al., 1990). Das Transmembranhüllprotein ist weniger sequenzvariabel als das Oberflächenhüllprotein, so binden monoklonale Antikörper gegen p15E aller drei FeLV-Subtypen sowie verschiedene MuLV-Isolate (Youngren et al., 1984). Besonders neutralisierende Epitope im membranproximalen Bereich der C-Helix sind bei den Retroviren stark konserviert. In verschiedenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Immunisierung mit Vorläuferprotein (gp85) zu einem gesteigerten Titer von virusneutralisierenden Antikörpern führt (Kleiser et al., 1986, Elder et al., 1987; Nick et al., 1990). Keines der zugelassenenen Präparate bietet einen 100% Schutz (Sparkes, 1997), von den Herstellern wird eine jährlich Auffrischungsimpfung (30-45€) empfohlen.
Auch ist eine hohe Akzeptanz bei Betroffenen, ihren Angehörigen sowie in der Bevölkerung, in Anbetracht einer möglichen Lebensrettung und Leidensverminderung, festzustellen. Die Frage, ob die Transplantation von xenogenen Material auf den Menschen die Schöpfungsordnung durchbricht oder ob Identitätsprobleme aufgeworfen werden könnten, spielt wohl primär in den Überlegungen von Theologen, Ethikern und Philosophen, jedoch weniger bei den Betroffenen und deren Angehörigen eine Rolle.
Natürlich muss die Entscheidung des potentiellen Rezipienten, eine mögliche Xenotransplantation nicht zu nutzen, in jedem Fall respektiert werden.
Das mit einer HIV-Infektion assoziierte Krankheitsbild wurde erstmals um 1980 in den USA beobachtet. Es ist durch das Auftreten opportunistischer Infektionen und seltener maligner Tumore gekennzeichnet, ausgelöst durch eine ausgeprägte Schwächung des Immunsystems. Inzwischen gilt es als gesichert, dass HIV-1 und HIV-2 das Ergebnis von Transspeziesübertragungen simianer Lentiviren ist. Für HIV-1 konnte das simiane Immundefizienzvirus der Schimpansen (SIVcpz), für HIV-2 das der rauchgrauen Mangabe (SIVsm) als Ursprungsvirus identifiziert werden. Diese Viren sind in ihren natürlichen Wirten apathogen, können jedoch in anderen Spezies AIDS auslösen. Die Mechanismen, die der Apathogenität der Viren im natürlichen Wirt zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig verstanden, könnten jedoch hilfreich für die Entwicklung antiretroviraler Therapien sein.
1986 wurde in Westafrika erstmals eine neue Virusvariante, HIV-2, isoliert. Derzeit sind sechs Genotypen (A-F), die vermutlich unabhängig voneinander entstanden sind, bekannt. Die HIV-2-Infektion hat sich nicht so rasant wie die HIV-1-Infektion ausgebreitet und blieb anfänglich vor allem auf Westafrika beschränkt. Heute hat auch HIV-2 die Kontinentgrenzen überschritten und ist in vielen anderen Regionen, besonders in Indien, nachzuweisen.
Das HI-Virus kann über Verletzungen der Schleimhaut, durch Samen- oder Vaginalflüssigkeit, beim Stillen durch infizierte Frauen oder direkten Blut-Blutkontakt übertragen werden. Die Infektion verläuft in drei Phasen: der Primärinfektion, inapparent oder mit leichten, grippeähnlichen Symptomen; dem symptomfreien Latenzstadium, in dem nur wenig Virus im peripheren Blut des Infizierten nachgewiesen werden kann und der klinischen Phase, mit der Ausprägung einer akuten Immundefizienz. Die Mechanismen, mit denen HIV eine Immundefizienz hervorruft, sind noch nicht vollständig aufgeklärt.
Bei einigen Virusvarianten (z.B. HIV-1 IIIB) kann in Zellkulturen die Bildung von Syncytien und die Lyse infizierter Zellen beobachtet werden. Da aber nur wenige Zellen im Patienten infiziert sind, werden als Ursache für die Abnahme dieser Zellen indirekte Mechanismen wie Apoptose, Lyse durch zytotoxische T-Zellen oder die Hemmung der Neubildung aus Vorläuferzellen angenommen.
In den letzten Jahren konnte die antiretrovirale Therapie deutlich verbessert werden. Derzeit stehen zur Therapie HIV-infizierter Patienten verschiedene Therapeutika zur Verfügung, die zur klinischen Behandlung der Patienten miteinander kombiniert werden. Sie lassen sich in verschiedene Wirkstoffgruppen einteilen (Tab. I.4).
Obwohl durch die HAAR-Therapie die Viruskonzentration im peripheren Blut bis unter die Nachweisgrenze gesenkt werden kann, erfolgt keine Eliminierung der Proviren aus den Zellen des Organismus und damit keine Heilung. Das Virus verfügt im Organismus über Reservoire, die durch die HAART nicht getroffen werden. Das Auftreten resistenter Viren während der Therapie führt daher langfristig zum Therapieversagen.
Ein weiterer, noch im klinischen Test befindlicher Ansatz, ist die passive Immunisierung HIV-Infizierter mit einer Kombination aus den breitneutralisierenden Antikörper 2F5, 4E10 und 2G12 (Tab. I.5). Durch die Applikation großer Mengen gereinigter, monoklonaler Antikörper, konnte die Viruslast im peripheren Blut deutlich gesenkt werden (Stiegler et al., 2002). Eine Klärung des Virus aus dem Organismus kann auch mit dieser Therapie nicht erreicht werden. Auch hier dürften die hohen Kosten der Therapie einer breiten klinischen Anwendung entgegenstehen. Alle derzeit in klinischer Anwendung oder Erprobung befindlichen Therapieansätze haben die Bildung resistenter Virusstämme gemeinsam, die früher oder später zum Therapieversagen und zur Entwicklung von AIDS führen.
Die Induktion von Antikörpern mit einem breiten Neutralisationsspektrum scheint derzeit als ein möglicher Ansatz zu einer effektiven HIV-Prophylaxe. Verschiedene solcher Antikörper konnten in den letzten Jahren aus infizierten Patienten isoliert werden (Tab. I.5)
Alle bekannten breit neutralisierenden Antikörper wurden aus HIV-infizierten Patienten isoliert. Trotz zahlreicher Versuche in Tiermodellen und klinischen Studien ist es bisher jedoch noch nicht gelungen, eine gegen unterschiedliche Subtypen gerichtete schützende Immunantwort im Patienten zu induzieren. Die genaue Aufklärung des Wirkmechanismus dieser Antikörper könnte wichtige Hinweise auf die Beschaffenheit geeigneter Antigene geben.
Die krankheitsauslösenden Mechanismen können sehr unterschiedlich sein. Am häufigsten kommt es durch die Integration des Provirus in das zelluläre Genom des Wirtsorganismus zur Inaktivierung essentieller Gene oder zu einer veränderten Regulation durch die viralen LTR-Elemente. Kommt es dadurch zu einer Aktivierung von Protoonkogenen oder zur Schädigung von Tumorsuppressorgenen, kann das zur Tumorentwicklung führen. Zusätzlich können Retroviren Onkogene tragen, deren Genprodukte in die Regulationsmechanismen infizierter Zellen eingreifen und so eine Tumorbildung auslösen.
Des Weiteren kann eine Infektion durch Retroviren zur Ausprägung einer Immunsuppression und damit zur Immunschwäche führen. Dafür verantwortlich sind vermutlich konservierte Domänen innerhalb der Hüllproteine, besonders innerhalb der Transmembranhüllproteine. So konnte z.B. für das murine Leukämievirus (MuLV) oder das humane Immunschwächevirus (HIV) gezeigt werden, dass deren Transmembranhüllproteine p15E bzw. gp41 in der Lage sind, die Lymphozytenproliferation zu hemmen und eine umfangreiche Modulation der Zytokinexpression zu bewirken. Auch wenn der genaue Mechanismus, wie Retroviren Immunsuppression auslösen noch unklar ist, zeigt das Beispiel der HIV-Infektion, zu welchen fatalen Folgen eine Infektion führen kann.
Auch die Übertragung von PERV auf Xenotransplantatempfänger könnte fatale Folgen haben. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Transmembranhüllproteine der Gammaretroviren, ähnlich wie das Transmembranhüllprotein von HIV, Zytokinmodulation hervorrufen können. Eine dadurch ausgelöste Immunsuppression könnte zu einem ähnlichen Krankheitsbild wie während einer HIV-Infektion führen.
In dieser Arbeit sollte ein effektives Antigen entwickelt werden, das geeignet ist, mögliche Transplantatempfänger durch eine präventive Vakzinierung vor einer möglichen Infektion durch PERVs zu schützen. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Induktion eines Impfschutzes gegen verwandte Gammaretroviren (FeLV und MuLV) durch Immunisierung mit dem Oberflächenprotein (gp70) möglich ist. Alle in Deutschland derzeit zugelassenen FeLV-Impfstoffe, basieren auf dem Oberflächenprotein gp70. Keiner dieser Impfstoffe zeigt jedoch eine 100%ige Effektivität und von den Herstellern wird eine jährliche Auffrischungsimpfung empfohlen. Die Induktion neutralisierender Antikörper gegen das TM-Protein der Gammaretroviren ist für FeLV und MuLV beschrieben worden, hat aber bei der Entwicklung effektiverer Impfstoffe bislang keine Beachtung gefunden. In dieser Arbeit wurde daher als Basis für einen PERV-Impfstoff das unglykosylierte, weniger sequenzvariable Transmembranprotein gewählt. Die Eignung eines rekombinant generierten PERV-p15 zur Induktion einer neutralisierenden Immunantwort sollte untersucht werden. Die Reproduzierbarkeit und statistische Absicherung der Daten sollte in unterschiedliche Spezies erfolgen.
Die Charakterisierung der induzierten Antikörper soll wichtige Hinweise auf den Bindungs- und Neutralisationsmechanismus neutralisierender Antikörper gegen Hüllproteine anderer Retroviren, besonders HIV-1 geben. Durch diese Daten sollte die Grundlage für die Entwicklung geeigneter Peptidantigene gelegt werden.
In dieser Arbeit sollte der monoklonale Antikörper 2F5 durch Bindungsstudien und in vivo-Neutralisationsassays charakterisiert werden. 2F5 bindet an ein hochkonserviertes Epitop im membranproximalen Bereich der gp41-Ektodomäne des HIV-1 und wurde erfolgreich in Studien zum passiven Immuntransfer eingesetzt. Zahlreiche fehlgeschlagene Versuche zur Induktion neutralisierender Antikörper gegen diese Region weisen auf eine weitaus komplexere Beschaffenheit des Epitops hin, als bisher bekannt. Auf der Grundlage der Untersuchungen des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus von 2F5 und PERV-neutralisierender Antikörpern, sollten neue rekombinante und synthetische Antigene entwickelt und in Immunisierungsstudien eingesetzt werden.
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Chemikalien von Sigma-Aldrich (Taufenkirchen, Deutschland) bezogen.
Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide (Sonden) zur Quantifizierung der Provirusintegration mittels Realtime-PCR wurden von der Firma TIB MOLBIOL (Berlin, Deutschland) synthetisiert. Als Donorfluorophor wurde am 5´- Ende FAM (6-Carboxyfluoreszein), als Akzeptorfluorophor am 3`-Ende DDQ (Dabcyl- Dark Quencher) gekoppelt.
Die Sequenzen der verwendeten Primer und Sonden sind im Folgenden aufgeführt:
Für die Durchführung gentechnischer Arbeiten (Klonierung, Expression von Proteinen und Mutagenese) wurden die kommerziell erhältlichen Escherichia coli Stämme Top10 und BL21-CodonPlus verwendet.
Bakterien:
BL21-CodonPlus(DE3)-RP (Stratagene, Amsterdam, Niederlande): E. coli B F- ompThsdS (rB- mB) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU proL Camr)
Plasmide:
Der pCal-n-Flag-Vektor ist mit einem Markergen ausgestattet, welches die Ampicillinresistenz (AmpR) codiert und die Selektion von positiven Transformanden ermöglicht.
Die Bakterienzellen wurden auf Luria-Bertani-Agarplatten bzw. als Schüttelkultur in Luria-Bertani-Medium bei 37°C/225rpm kultiviert. Zur Selektion plasmidtragender Transformanden wurde ein entsprechendes Antibiotikum zugegeben (Ampicillin 100µg/ml). Im Folgenden wird Luria-Bertani mit LB und Ampicillin mit Amp abgekürzt.
Das Medium wurde autoklaviert, die LB-Platten unter sterilen Bedingungen gegossen und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Um Ampicillin-Stammlösungen herzustellen, wurden 100mg/ml Ampicillin in bidestilierten Wasser gelöst, sterilfiltriert, aliquotiert und lichtgeschützt bei –20 °C gelagert.
Um chemokompetente Zellen herzustellen, wurden die Bakterien aus der logarithmischen Wachstumsphase einer Behandlung mit speziellen Transformationspuffern unterzogen. Der hohe Gehalt an Calcium-Ionen (Ca2+) in diesen Puffern führt dazu, dass die bakterielle Plasmamembran für fremde DNA durchlässig wird (Darnel et al., 1994).
Die Herstellung chemokompetenter Bakterien erfolgte nach den Angaben im QIAexpressionist (Qiagen, 3.Auflage, 1997, S.30). Die Zellsuspension wurde in 1,5ml Reaktionsgefäße aliquotiert (je 200µl). Die Lagerung der in flüssigem Stickstoff schockgefrorenen Aliquote erfolgte bei –80°C.
Für eine Vorkultur wurden 6ml LB+Amp mit einer Bakterienkolonie oder 4µl einer Glycerindauerkultur angeimpft und bei 37°C in einem Inkubationsschüttler bei 37°C über Nacht geschüttelt.
Um E. coli-Stämme bzw. Bakterienzellen eines Klones zu konservieren, wurden Glycerindauerkulturen angelegt. Dafür wurden in einem 1,5ml Eppendorfreaktionsgefäß 450µl einer Vorkultur mit 900µl Glycerin vermischt und bei –20°C gelagert.
Die Expression erfolgte in dem E. coli-Stamm BL21-CodonPlus(DE3). Dazu wurde in 500ml vorgewärmtes LB+Amp-Medium (37°C) 1ml einer frischen Vorkultur (siehe 2.10.) überführt und bei 37°C schüttelnd inkubiert. Die Proteinexpression wurde durch Zugabe 1mM IPTG (Endkonzentration) bei einer optischen Dichte(OD) von 0,5 bei 550nm induziert. Die Expressionskultur wurde weitere 3h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Im Anschluss wurden die Bakterien bei 6000xg pelletiert und der Überstand wurde dekantiert. Das Bakterienpellet wurde bei -20°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
Zum Aufschluss der relativ stabilen E.coli-Zellwände wurde das Zellsediment in 30ml Lysepuffer (50mM Tris, 150mM NaCl, 10mM 2-Mecaptoethanol, 1mM Mg-acetat, 1mM Imidazol, 2mM CaCl2/ pH8) fein resuspendiert, 30mg Lysozym wurden zugegeben und 30min auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden die Bakterienzellen durch fünf Ultraschallimpulse à 30s endgültig lysiert. Um eine zu starke Erwärmung zu vermeiden, wurde die Suspension zwischen den Ultraschallimpulsen auf Eis gekühlt. Die Zelltrümmer wurden 20min bei 104xg / 4°C sedimentiert. Im Überstand gelöste Expressionsprodukte (CBP-Fusionsproteine) wurden anschließend durch Calmodulin-Affinitätschromatographie extrahiert.
Die Extraktion des löslichen, rekombinant exprimierten CBP-rp15E aus dem E.coli-Zelllysat erfolgte durch Calmodulin-Affinitätschromatographie. Diese Methode basiert auf der Bindung des mit dem Zielprotein fusionierten Calmodulinbindeproteins (CBP) an eine Calmodulin-Affinitätsmatrix (Calmodulin Affinity Resin). Durch Zugabe von EGTA kann die CBP-Calmodulinbindung gelöst und das Zielprotein eluiert werden. Es wurde das Affinity LIC Cloning and Protein Purification Kit (#214405) der Firma Stratagene (Amsterdam, Niederlande) verwendet.
Das Lysat von 250ml einer IPTG-induzierten Kultur wurde 16h bei Raumtemperatur über 7,5ml des Säulenmaterials rezirkuliert (Flußrate 1,5ml/min). Das Waschen des Säulenmaterials sowie die Elution des gebundenen Proteins erfolgte nach Herstellerprotokoll.
Für eine Plasmid-Präparation wurden 1,5ml einer Vorkultur bei 104xg sedimentiert, der Überstand dekantiert und die Zellen unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits der Firma QIAGEN nach Herstellerangaben bearbeitet. Die Plasmid-DNA wurde mit 50µl Wasser (bidest.) eluiert.
Zur Reinigung von DNA-Fragmenten wurden zwei verschiedene Verfahren eingesetzt:
Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Dieses Verfahren wurde zur Trennung und Isolierung von spezifischen DNA-Fragmenten bestimmter Größe, z.B. nach Restriktion oder zur Trennung zirkulärer von linearer DNA angewandt. Die Isolierung der DNA aus Agarosegelen erfolgte unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits der Firma QIAGEN gemäß den Herstellerangaben.
Isolation und Reinigung der DNA aus Reaktionsgemischen
Zur Abtrennung von Salzen, Enzymen, Proteinen und einzelner Nukleotide sowie zur Vo-lumeneinengung bis auf 30µl, wie z.B. nach einer PCR oder Ligation, wurde der PCR Purifikation Kit der Firma QIAGEN eingesetzt. Die Reinigung erfolgte nach Herstellerangaben.
Die Isolierung genomischer DNA aus Zelllysat, Gewebe oder Vollblut erfolgte unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach Angaben des Herstellers (QIAamp DNA Blood Mini Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland).
Die Trennung von DNA-Fragmenten nach einer PCR oder einem Restriktionsverdau erfolgte nach ihrem Molekulargewicht mittels horizontaler Flachgel-Elektrophorese (Sambrooke et al., 1989), die zur Identifizierung und Reinigung eingesetzt wurde. Je nach zu erwartender Größe der zu trennenden DNA-Fragmente wurde die Agarose-Konzentration zwischen 1 – 2 % variiert. Die Markierung der DNA erfolgte durch anschließende Inkubation in einem Ethidiumbromidbad. Das in die DNA interkalierende Ethidiumbromid macht eine Visualisierung durch UV-Licht möglich (Walker et al., 1993). Die Auftrennung erfolgte bei einer Spannung von 5 -15 V/cm in einem TBE-Puffersystem. Dazu wurde die Probe mit ca. 1/10 (v/v) Ladungspuffer versetzt. Die ethidiumbromidgefärbten Banden wurden mittels UV-Licht (λ=312nm) in einem Gel-Dokumentationsgerät der Firma Biorad sichtbar gemacht und quantitativ ausgewertet. Zur Bestimmung des Molekulargewichtes bzw. der Anzahl der Basenpaare linearer, doppelsträngiger DNA wurden komerziell erhältliche DNA-Standards (Invitrogen, Leek, Niederlande) eingesetzt.
Um eine quantitative Hydrolyse der DNA zu erreichen, wurden 5-10U/µg DNA eingesetzt. Dem Ansatz wurden nach einer Inkubationszeit von einer Stunde nochmals 5U/µg DNA zugefügt. Es wurde eine weitere Stunde inkubiert.
In der vorliegenden Arbeit wurden Restriktionsendonukleasen der Firma NEB (Frankfurt a.M., Deutschland) eingesetzt.
In den Ligationsansätzen wurde das molare Verhältnis von Vektor zu Insert so gewählt, dass das Insert im deutlichen Überschuss (ca. 1:5) vorlag. Je Ansatz wurden ca. 100ng des Vektorfragmentes eingesetzt. Das Reaktionsvolumen betrug 20 µl.
Um die Rezirkularisierung linearisierter Vektorfragmente zu vermeiden, wurden die 5´-Enden des Vektormoleküles durch alkalische Phosphatase (SAP, NEB, Frankfurt a.M., Deutschland) dephosphoryliert. Durch die T4-DNA-Ligase können dephosphorylierte Enden nicht durch die Bildung von Phosphordiesterbrücken kovalent verknüpft werden.
Die PCR ist ein geeignetes in vitro-Verfahren zur selektiven Vermehrung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und Sequenz (Mullis et al., 1986). In dieser Arbeit wurde die PCR zur gezielten Amplifizierung (spezifischer Nachweis von Genfragmenten) und zellfreien Klonierung von DNA-Fragmenten verwendet. Die Reaktion wurde in 25 µl-Ansätzen in einem Perkin Elmer 2400 oder MJ Research PTC-200 Thermocycler durchgeführt.
Die geeignete Hybridisierungstemperatur (TS) für die eingesetzten Primer wurde mittels folgender Gleichung bestimmt:
% GC = prozentualer Anteil von Guanin und Cytosin im Primer
N = Primerlänge in Basen
add 25μl ddH2O
Zur Quantifizierung der Provirusintegration von PERV bzw. HIV in das Genom der Wirtszellen wurden Realtime-PCR Systeme nach dem Taqman-Prinzip etabliert. Diese Methode erlaubt die spezifische Quantifizierung des Amplifikats während der einzelnen Reaktionszyklen. Dabei wurden amplifikatspezifische, fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt, die eine höhere Signalspezifität sowie eine gesteigerte Sensitivität im Vergleich zur klassischen SYBR-Green-Methode gewährleisten.
Als Template wurde Proteinase K behandeltes Zelllysat eingesetzt (2.16.4.). Die optimale Konzentration der Primer, Sonde, Magnesiumchlorid und des Templates wurde experimentell ermittelt.
add 25μl ddH2O
Um die neutralisierende Wirkung eines Serums bzw. von Antikörpern zu quantifizieren, wurde die Differenz der ct-Werte (Zyklus bei dem das Fluoreszensignal einen festgelegten Schwellenwert übersteigt) zwischen Immun- und Präimmunserum bzw. zu infizierten Zellen (ohne Probenzugabe) berechnet. Aus diesem Wert (Δct) wurde wie folgt die Hemmung der Provirusintegration berechnet:
Die Sequenzierung doppelsträngiger DNA erfolgte nach der Kettenabbruchmethode (Di-desoxymethode nach F. Sanger).
Die Sequenzanalysen erfolgten mit Hilfe des DNA-Sequencer LI-COR-3200 (LI-COR Biotechnology, Lincoln, USA). Zur Erfassung und Auswertung der durch das Lasererfassungssystem detektierten Daten wurde die Software (Data Collection V2.21 DEV7 / Base ImageIR V2.20 Analysis) der Firma LI-COR eingesetzt.
Die Bestimmung der Proteinkonzentration von Lösungen erfolgte nach der klassischen Bradfordmethode oder durch eine Biuretreaktion (BCA Protein Assay, Pierce, Bonn, Deutschland). Während die Bradfordreaktion auf der Komplexierung der Proteine mit einen Farbstoff (Coomassie Blue R250, BioRad, München, Deutschland) und der damit verbundenen Verschiebung des Absorptionsspektrums basiert, nutzt der BCA-Assay das Reduktionpotential der Aminosäuren Cystein, Cystin, Tyrosin und Tryptophan. Durch die Chelatisierung einwertiger Kupferionen mit je 2 Molekülen Bichinoninsäure (BCA) kommt es zu einer Biuretreaktion. Der Komplex hat sein Absorptionsmaximum bei 562nm. Das Ansetzen der Lösungen sowie die Durchführung des Tests erfolgte nach Angaben des Herstellers.
Die Bestimmung der Absorption zur Erstellung einer Eichgeraden sowie des Proteingehaltes einer Probe erfolgte durch dreifache Bestimmungen.
Die Zusammensetzung der Gele und verwendeten Puffer ist im Folgenden dargestellt:
Zur immunologischen Analyse (Western Blot/ ELISA/ FACS/ Immunfluoreszenz/ Epitopkartierung) p15E-spezifischer Antikörper wurden neben dem entsprechenden Immunserum auch aus dem Serum isolierte spezifische Antikörper eingesetzt. Bei besonders sensitiven Analyseverfahren, wie FACS, Epitopkartierung und Immunfluoreszenz können so störende Kreuzreaktionen vermieden und besser interpretierbare Ergebnisse erzielt werden. Durch den Einsatz isolierter Antikörper im Neutralisationsassay wurde der Beweis der antikörperabhängigen Neutralisation erbracht und antivirale Wirkung der Seren durch Cytokine oder Chemokine ausgeschlossen. Die p15E-spezifischen Antikörper wurden durch Isolierung aus Ziegenserum (Ziege20) mittels Affinitätschromatographie gewonnen.
Zur Herstellung der Affinitätssäule wurde CH-Sepharose 4B der Firma Pharmacia verwandt. Die Aktivierung der Sepharose, die Kopplung mit gereinigten p15E sowie das Blockieren, Waschen und die Lagerung der Säule erfolgte nach Herstellerangaben. Das Säulenvolumen betrug 6ml.
Die Säule wurde gegen Chromatographiepuffer äquilibriert und dann wurde die Proteinlösung (ca. 10ml) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5ml/h aufgetragen. Nach Auftrag des Serums wurde die Säule mit Chromatographiepuffer solange gewaschen bis die Proteinkonzentration im Durchfluss unter 5µg/ml lag. Danach erfolgte die Elution mit 15ml 0,1M Glycin/HCl (pH 2,7) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10ml/h. Das Eluat wurde in 10 Fraktionen á 2ml gesammelt, wobei in die Reagenzgläser je 200µl einer 300mM Tris (pH 9,0)-Lösung vorgelegt wurde, um das Eluat sofort zu neutralisieren.
Die einzelnen Fraktionen wurden im Bradford-Proteinbestimmungsassay und im ELISA getestet.
Gegen das Transmembranprotein von HIV-1 (gp41) gerichtete Antikörper konnten nicht über eine spezifische Antigen-Affinitätschromatographie aus Seren isoliert werden, da das gp41 in wässrigen Lösungen präzipitierte, was eine Kopplung an Sepharose unmöglich macht. Um IgG´s von restlichen Serumsbestandteilen abzutrennen wurde ein Montage® Antibody Purification Kit (Millipore, Billerica, USA) verwendet. Die Aufreinigung erfolgte nach Herstellerprotokoll. Diese Methode erlaubt eine schnelle und einfache Isolation von Immunglobulinen der Klasse G, wobei allerdings speziesabhängig nicht alle Subklassen isoliert werden können. Bei Anwendung dieser Methode muss damit gerechnet werden, dass neben anderen Immunglobulinen (wie z.B. IgM oder IgA) auch antigenspezifische IgG verloren gehen.
In der vorliegenden Arbeit wurden Membranen verwendet, die die Aminosäuresequenz der Transmembranproteine des HIV-1 IIIB (gp41) und PERV A (p15E) repräsentieren. Die Inkubation der zu untersuchenden Seren bzw. Antikörper erfolgte nach Herstellerangaben. Die Seren wurden 1:500 in Blockierungspuffer verdünnt, als Kontrolle wurde das jeweilige Präimmunserum verwendet.
Die immunologische Analyse der durch SDS-PAA-Gelelektrophorese massenabhängig aufgetrennten Proteine erfolgte mittels Western Blot (Towbin et al., 1989). Durch diese Technik können sehr spezifisch geringe Mengen (< 2 ng) eines bestimmten Proteins nachgewiesen werden.
Der enzyme linked immuno sorbet assays (ELISA) wurde neben der Western Blot Analyse zur spezifischen Detektion von Antikörpern genutzt. Der Nachweis beruht, wie der Western Blot, auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion, die durch ein Primärantikörper-spezifisches Antikörper-Enzym-Konjugat quantifiziert werden kann.
Im Vergleich zur Western Blot Analyse ermöglicht der ELISA die Titerbestimmung der im Serum enthaltenen bindenden Antikörper sowie die Bestimmung der Avidität (Bindungsenergie eines Antikörpers/Antiserum zu seinem Antigen) monoklonaler Antikörper oder Antiseren zu ihrem Antigen.
Zur Bestimmung der Titer spezifischer Antikörper in Seren nach einer Immunisierung wurden die Seren gegen die entsprechenden Präimmunseren ausverdünnt. Der Titer eines Serums entspricht der letzten Verdünnungsstufe, bei der die Absorption signifikant über dem Hintergrund durch das Präimmunserum liegt.
Zur spezifischen Detektion viraler Proteine auf der Zelloberfläche oder im Zellinneren wurde die Immunfluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Dazu wurden Zielprotein-spezifische Antikörper mit infizierten und uninfizierten Zellen inkubiert. Um intrazellulär vorliegende Proteine zu detektieren, wurde die Membran mittels Detergenz (Inkubation mit 0,5% Triton in PBS für 15min bei RT) permeabilisiert. Die spezifische Bindung dieser Antikörper wurde mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern (0,5µg/ml FITC-Konjugat, Sigma-Aldrich, Taufenkirchen, Deutschland) detektiert. Wird der Fluoreszenzfarbstoff über eine UV-Lichquelle angeregt, wird Licht einer farbstoffspezifischen Wellenlänge vom Fluorophor-Antikörperkonjugat emittiert, das durch den Einsatz abgestimmter Filter, die die interferierende Wellenlängen ausblenden, sichtbar wird.
Um den Fluoreszenzfarbstoff zu stabilisieren, wurden die Zellen mit einem Eindeckmittel (Pro Long, Molecular Probes, Leiden, Niederlande) behandelt. Die Fluoreszenzaufnahmen wurden mit einen Nikon Eclipse 300 Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Düsseldorf, Deutschland) gemacht.
Zur immunologischen Analyse von Zellen wurde die Durchflusszytometrie (Flow Cytometrie/FACS, fluorescence activated cell sorting) eingesetzt. Die Zellen wurden zuvor mit Fluoreszenz-Farbstoffen spezifisch, über Antikörper-Konjugate markiert, die nach Anregung Licht einer bestimmten Wellenlänge emittieren. Für die in dieser Arbeit durchgeführten FACS-Analysen wurde das FACSCalibur (BD Biosciences, USA) eingesetzt, die Auswertung der Fluoreszenzmessung erfolgte über die mitgelieferte Software.
Um eine gesteigerte Immunogenität durch Multimerisierung von synthetischen Peptiden zu erreichen, wurden verschiedene Kopplungsmethoden eingesetzt:
Kopplung an KLH und BSA
Die Kopplung von Peptiden an Trägerproteine wie BSA oder KLH erfolgte unter Verwendung eines reaktiven Carbodiimd-Linkers (EDC, 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid, Pierce, Bonn, Deutschland). Durch die Reaktion mit den Carboxylgruppen der Peptide bildet EDC ein reaktives Zwischenprodukt, das mit den primären Aminen eine kovalente Amidbindung eingehen kann.Die Kopplung erfolgte nach Angaben des Herstellers. Es wurden 2mg der synthetischen Peptide (4mg/ml) mit 1mg des Trägerproteins (5mg/ml) gekoppelt, was etwa einem 30fachen molaren Überschuss an synthetischen Peptiden darstellt.
Kopplung an Dextran
Neben BSA oder KLH wurde als Trägermolekül ein Polysaccharid (Dextran6, Sigma, Taufenkirchen, Deutschland) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6kDa verwendet. Vorteil von Polysacchariden als Trägermolekülen, ist dass diese alleine nicht immunogen sind und sich dadurch die Immunantwort hauptsächlich gegen das gekoppelte Peptid richtet. Die Konjugation erfolgte über die α- oder ε-Aminogruppen der Peptide an durch NaIO4-Behandlung aktiviertes Dextran6. Die Kopplung von 4mg Dextran mit 8mg Peptid erfolgte nach Böcher et al. (1992).
Die Kopplung von Peptiden über primäre Aminogruppen ist zwar eine relativ einfache und effektive Methode zur Herstellung von Peptid-Dextran-Konjugaten, jedoch kann so nur ein heterogenes Kopplungsprodukt erhalten werden. Je nach Anzahl der im Peptid enthaltenen primären Aminogruppen vergrößert sich die Anzahl der möglichen Produkte und die Wahrscheinlichkeit von Quervernetzungen zwischen den Molekülen. Eine zielgerichtete und definierte Bindung des Peptids an das Trägermolekül ermöglicht der Einsatz von bifunktionalen Linkern, wie 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid (PDPH). Dieser verbindet eine Sulfohydrylgruppen (die z.B. durch Cystein in das Peptid eingefügt wurde) des Peptids mit einer Carbonylgruppe des Dextrans (Hermanson et al., 1996). Vorausgesetzt, es ist nur eine schwefelhaltige Aminosäure vorhanden, kann so nur ein einziges Produkt entstehen. Die Vernetzung von Dextranmolekülen ist nicht möglich. Die Kopplung von 4mg Dextran mit 8mg Peptid erfolgte nach Zara et al. (1991).
Vernetzung von Cystein-flankierten Peptiden zu Di- und Trimeren
Die Peptide sollten über die endständigen Cysteine unter Ausbildung einer Disulfidbrücke oxidiert werden und damit Di-bzw. Trimere ausbilden. Die Ausbildung von Trimeren sollte durch das Einfügen eines zweiten endständigen Cysteins in eines der beiden zu koppelnden Peptide ermöglicht werden. Die Peptide wurden in bidestillierten Wasser in einem Glasgefäß gelöst und durch Zugabe von reinem Ammoniak auf einen pH 8.5 eingestellt. Im basischen Milieu dissoziieren Protonen von den Sulhydrylgruppen, dadurch wird der Schwefel reaktiv. Mit Hilfe einer Pipette wurde Luft (gasförmiger Sauerstoff) in die Lösung eingeblasen. Die Oxidation wurde über SDS-PAGE und Western Blot Analyse kontrolliert.
Die für immunchemische Analysen verwendeten Seren enthalten neben spezifischen Antikörpern auch Immunglobuline, die eine Affinität zu verschiedenen E. coli-Proteinen besitzen. Um dadurch bedingte unspezifische Signale zu unterbinden, wurden diese Immunglobuline vor der Primärantikörperinkubation durch Bindung und Ausfällung an E. coli-Proteine in Form von Acetonpuder entfernt.
Zur Herstellung des Acetonpuders wurden 200ml einer induzierten und mit dem Leervector transformierten BL 21 E. coli-Kultur mit 3000xg abzentrifugiert und das Zellsediment in 3ml PBS resuspendiert. Danach wurden die Bakterien durch 5 Ultraschallimpulse (á 15s) auf Eis lysiert und die Proteine durch Zugabe von 12ml Aceton (-20°C) für 30 min präzipitiert. Das Präzipitat wurde abzentrifugiert (10min/3000 x g) und in 3ml frischem Aceton resuspendiert. Es wurde erneut zentrifugiert (w.o.) und der Überstand dekantiert. Das Proteinpellet wurde getrocknet und fein zermahlen.
Um Viren aus Zellkulturüberständen zu konzentrieren und von Zell- und Mediumbestandteilen zu separieren, wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Zur Vorreinigung und Konzentration wurden die Zellkulturüberstände 3h bei 106xg durch ein 22%iges Saccharosekissen zentrifugiert (Rotor SW28, Beckman-Coulter CU-L8-70 Ultrazentrifuge). Dazu wurde 4ml einer 22%igen Saccharoselösung in ein Zentrifugenröhrchen (Beckman Ultra-Clear 25x89mm) vorgelegt und vorsichtig mit 28ml Virusüberstand überschichtet. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und das Viruspellet ü.N. in 0,5ml TSE bei 4°C gelöst. Die gelösten Pellets von 6 Röhrchen wurden vereinigt und auf einen vorbereiteten Saccharosegradienten (15-65% in einem Beckman Ultra-Clear 10x89mm-Zentrifugenröhrchen) geschichtet. Der Gradient wurde aus einer 15%igen und einer 65%igen Saccharoselösung mit Hilfe eines Gradientenmischers (Biorad, Hercules, USA) hergestellt. Retroviren banden bei einer Dichte von 1,1663 g/cm3 (38% Sucrose). Nach 4stündiger Zentrifugation bei 106xg (Rotor SW41, Beckman-Coulter) bildet sich bei dieser Dichte ein weißer Ring, der vorsichtig mit einer Kanüle durch seitliches Einstechen abgenommen wurde. Die Dichte der entnommenen Fraktionen wurde in einem Refraktometer bestimmt. Der Virusgehalt wurde durch Bestimmung der Aktivität der reversen Transkriptase und durch Western Blot Analyse bestimmt.
Durch Bestimmung der RT-Aktivität (reverse Transkriptase) einer Probe kann die produktive Infektion einer Zellkultur oder eines Organismus durch Retroviren nachgewiesen und quantifiziert werden. Die RT ist ein nur in Retroviren vorkommendes Enzym, das die Synthese der proviralen DNA katalysiert
Die RT-Aktivität von Überständen infizierter Zelllinien wurde immer mit der von Überständen der naiven Zellen verglichen, da diese oft mit Segementen eines retroviralen Genoms transformiert sind (z.B. C8166 mit einem defektem HTLV-II-Genom), was zu einem falschpositiven Ergebnis führen kann.
Zur Immunisierung wurden 8-12 Wochen alte, weibliche Wistar-Ratten vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR, Berlin, Deutschland) verwendet. Die Tiere wurden in der Tierversuchsabteilung des Robert Koch Instituts gehalten. Die Ziegen wurden in der Tierversuchsanstalt des BfR, Berlin-Marienfelde gehalten.
Die Immunisierung der Ratten erfolgte intramuskulär (je 250µl in die Muskulatur der Hinterläufe) und subcutan (500µl unter das Nackenfell), die Immunisierung der Ziegen intramuskulär (je 500µl in die Muskulatur der Hinterläufe) mit 0,5mg Antigen in 1ml Emulsion. Der Boost erfolgte nach 21 Tagen nach gleichem Applikationsschema.
Die Blutentnahme bei Ratten (ca. 1,5ml) erfolgte durch retrobulbäre Punktion unter Inhalationsnarkose durch Isofluran (Cuarmed, Karlsruhe, Deutschland), bei Ziegen (ca. 50ml) aus der Halsvene. Nach einwöchiger Akklimatisierungsphase wurde Präimmunblut, 21 Tage nach der Boostimmunisierung Immunblut entnommen. Weitere Blutungen erfolgten je nach Bedarf, aber maximal im 14-tägigen Abstand.
Zellen:
Die langfristige Lagerung von Zellen erfolgte in flüssigem Stickstoff bei -196°C. Um die Zerstörung der Zellen durch Bildung von Eiskristallen zu minimieren, wurden diese in speziellen Einfriermedium (90% FKS, 10% DMSO) inkubiert.
Um eine gute Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der verschiedenen Versuche gewährleisten zu können, wurden in allen Infektionsversuchen einheitliche Virusstocks eingesetzt. Titrierte Virusüberstände wurden in Kryoröhrchen in 1ml Aliquots in flüssigem Stickstoff bis zu ihrer Verwendung gelagert.
Die Berechnung der TCID50/ml wurde nach folgender Formel durchgeführt:
HIV-1 IIIB Stocks:
Zum Anlegen von HIV-Überständen wurde eine frisch passagierte C8166-Kultur (1:5 aus einer dicht gewachsenen Kultur) in einer T175-Zellkulturflasche (TPP, Midwest Scientific St. Louis, MO, USA) mit 1x104 TCID50 HIV-IIIB infiziert und bei 37°C, 95% Luftfeuchte und 5%CO2 inkubiert. Nach 72h wurde die Kultur in 50ml Röhrchen überführt und bei 750xg pelletiert. Der Überstand wurde filtriert (0,45µm) und in 1ml Portionen bei -196°C bis zur Verwendung gelagert. Zur Bestimmung der im Überstand enthaltenen infektiösen Partikel (TCID50) wurde ein Aliquot aufgetaut und auf C8166 titriert. Nach 72h Inkubation wurde die HIV-Provirusintegration über eine Pol-spezifische PCR nachgewiesen (siehe 2.13.7.).
PERV-5°-Überstände wurden von einer konvluenten gewachsenen, infizierten 293-Kultur entnommen. Aufbereitung und Lagerung erfolgte analog zur Behandlung der HIV-Überstände (siehe oben). Die Titration der Überstände zur Bestimmung der TCID50 erfolgte auf uninfizierten 293-Zellen. Der Nachweis der Provirusintegration erfolgte wie unter 2.13.7. beschrieben.
Zum Nachweis der PERV-neutralisierenden Aktivität induzierter Seren wurde ein in-vitro-Neutralisationstest etabliert. Dieser Test basiert auf dem Nachweis der PERV-Provirusintegration nach 9-tägiger Inkubation uninfizierter 293-Zellen mit PERV-Überständen in Anwesenheit von Medium, Präimmunserum und Immunserum, durch PCR mit PERV-Pol-spezifischen Primern (PK1/6, siehe 2.5.).
Im Verlauf dieser Arbeit wurde zum Nachweis der Provirusintegration ein Realtime Assay etabliert. Spätere Messungen zur Quantifizierung der Provirusintegration erfolgten mit Hilfe dieses Assays. Die Durchführung erfolgte wie oben beschrieben. Durch die hohe Sensitivität und dem Wegfall einer Endpunktbestimmung bei diesem Assay konnte jedoch das Splitten der Zellen und das Ausverdünnen des Virusstocks wegfallen. Die Zellen wurden mit einer TCID50 von 1x102,43 /ml inkubiert, die Lyse erfolgte nach 72h. Alle Proben wurden als Triplikate gemessen
Der Nachweis HIV-neutralisierender Aktivität induzierter Seren erfolgte im Wesentlichen analog zum PERV-Neutralisationsassay (2.16.4.). Seren und monoklonale Antikörper wurden mit einer TCID50 von 1x103 vorinkubiert (w.o.) und dann 72h mit 5x104 C8166 Zellen (Gesamtvolumen 200µl/well) inkubiert. Die Quantifizierung der Provirusintegration erfolgte durch Realtime PCR.
Zur Immunisierung von zwei Ziegen (Ziege 16 und 20) wurde die Ektodomäne des transmembranen Hüllproteins p15E rekombinant generiert. Dazu wurde aus PK15-Zellen, einer porzinen Nierenzelllinie, die kodierende Sequenz amplifiziert, in einen Expressionsvektor kloniert und als CBP-Fusionsprotein exprimiert. Durch Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem klonierten Konstrukt um die Sequenz des Hüllproteins von PERV-A handelt. Die Sequenz des rekombinanten p15E ist 100% homolog zu dem in späteren Neutralisationstest eingesetzten PERV-5°-Klon.
Western Blot Analyse und ELISA
Im ELISA wurden in beiden Seren hohe Titer an p15E-spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Eine spezifische Bindung war für beide Immunseren bis zu einer Verdünnung von 1x106 detektierbar (Abb. III.3 B). Damit eigneten sich die induzierten Seren sowie das rekombinante p15E auch sehr gut als Kontrollseren bzw. Antigen für die Entwicklung immunologischer Nachweissysteme, analog zu den derzeit in der klinischen Praxis verbreiteten HIV-Testsystemen.
Zusätzlich wurde die Reaktivität der generierten Seren gegen PERV-5°-infizierte 293-Zellen in der Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) analysiert. Um möglichst native Strukturen zu erhalten, wurden für die Untersuchungen nicht permeabilisierte Zellen verwendet. In beiden Versuchen konnte eine spezifische Bindung der Immunseren an PERV-5°-infizierte Zellen gezeigt werden (Abb. III.4). Die FACS-Analyse zeigte für beide Immunseren eine Bindung p15E-spezifischer Antikörper an ca. 65% der eingesetzten Zellen.
Als Kontrolle wurden die entsprechenden Präimmunseren sowie ein nach gleichem Protokoll generiertes Anti-PERV-Gag-Serum eingesetzt (Ziegenserum 14). Da sich Gag-Proteine ausschließlich im Inneren der Partikel befinden und nicht auf der Virusoberfläche präsentiert werden, sind diese Proteine in nicht permeabilisierten Proben für die Antikörper nicht zugänglich. Folgerichtig konnte hier keine Bindung der anti-Gag-Antikörper an infizierte Zellen detektiert werden. In der FACS-Analyse wurde als zusätzliche Kontrolle ein gegen das TM-Protein von HIV-1 (gp41) induziertes Serum (Ziegenserum 23) eingesetzt. Die Befunde der Immunfluoreszenz konnten in der Durchflusszytometrie zu 100% bestätigt werden. Die Immunseren der Ziegen 16 und 20 binden ca. 65% der infizierten Zellen (Abb. III.4 B).
Durch diesen Versuch konnte gezeigt werden, dass die Bindungsstellen der induzierten Antikörper auf der Oberfläche sich abschnürender Viruspartikel zugänglich und nicht durch das Oberflächenprotein maskiert sind.
Epitopkartierung der Ziegenseren 16 und 20
Die Epitopkartierung erfolgte mit Hilfe einer PepSpot-Membran™. Durch die Anwendung dieser Methode war es möglich, antigene Strukturen bis auf zwei Aminosäuren genau einzugrenzen.
Gegen die immundominante Schleife (IDO), gegen die im Verlauf retroviraler Infektionen (z.B. HIV, FeLV) in der Regel hohe Antikörpertiter gebildet werden, wurden keine Antikörper detektiert.
Ziel der Immunisierungsversuche war die Induktion PERV-neutralisierender Antikörper. Um zu testen, ob die Immunisierung zweier Ziegen mit rekombinanten p15E zur Induktion PERV-neutralisierender Antikörper geführt hat, wurde ein in vitro Neutralisationsassay auf Basis des Nachweises der Provirusintegration durch PCR angewendet.
Ziel der weiteren Versuche war die genauere Charakterisierung der im Ziegenserum 20 enthaltenen neutralisierenden Antikörper. Dieses Serum zeigte von allen generierten Seren den höchsten Neutralisationstiter (Tab. III.1), die Blutentnahmen erfolgten regelmäßig über einen Zeitraum von zwei Jahren. Das Serum zeigte über den gesamten Zeitraum einen konstant hohen Neutralisationstiter. Ein möglichst hoher Titer von neutralisierenden Antikörpern im Serum über einen langen Zeitraum ist ein wichtiges Kriterium für die Induktion eines effektiven Impfschutzes (Kapitel 4.1).
Die Bindungsuntersuchungen im ELISA zeigten, dass die im Serum enthaltenen Antikörper nur relativ schwach an die Einzelpeptide E1 und E2 binden. Auffällig ist die synergistisch gesteigerte Bindung der Antikörper an die Kombination beider Peptide, deutlich über den erwarteten additiven Effekt der Bindung an die beiden Einzelpeptide hinaus (Abb. III.7). Nur durch die kombinierte Adsorption der Peptide E1 und E2 konnte eine ähnlich hohe Absorption wie an rp15E beobachtet werden. Dieser Effekt ließ sich durch die Inkubation in Anwesenheit von Harnstoff noch deutlicher darstellen. Wurde das Serum in Anwesenheit von 2M Harnstoff inkubiert, kann an die einzeln adsorbierten Peptide keine spezifische Bindung mehr detektiert werden, wogegen die Bindung an die Kombination beider Peptide nur um ca. 35% abnimmt.
Durch die Affintätschromatographie des Immunserums der Ziege 20 konnte keine Trennung möglicher Antikörperpopulationen erreicht werden. Von beiden Säulen konnten nur relativ geringe Antikörpermengen eluiert werden. Die eluierte Proteinmenge aller Fraktionen betrug jeweils ca. 400µg. Aus dem gleichen Volumen konnten in vorhergehenden Versuchen ca. 7mg p15E-spezifische Antikörper isoliert werden. Die Eluate beider Säulen unterschieden sich nicht in ihrer Reaktivität untereinander und zum Ausgangsmaterial (Abb. III.8). Der Versuch zeigt, dass durch Affinitätschromatographie keine Trennung verschiedener Antikörperpopulationen erreicht werden konnte.
Die schwach affine Bindung E1/E2-spezifischer Antikörper an die Einzelpeptide wurde bereits in den ELISA-Bindungsstudien beobachtet. Die Daten dieses Versuches bestätigen die in Abb. 3.7 dargestellten Daten der Bindungsstudien.
In ELISA-Bindungsstudien konnte eine Interaktion zwischen den synthetischen Peptide E1 und E2 gezeigt werden. Im Vergleich zu den Einzelpeptiden führte die kombinierte Adsorption beider Peptide an die polymere Matrix der ELISA-Platten zu einer synergistischen Bindung des Ziegenserums 20 (Abb. III.7). Die Interaktion beider Peptide ist ein Hinweis auf die Bildung eines Konformationsepitops.
Durch diesen Versuch sollte untersucht werden, ob sich der im ELISA beobachtete Effekt auch in einem in vitro-Neutralisationsassay darstellen lässt. Je nach Neutralisationskompetenz der identifizierten Epitope, sollte die neutralisierende Aktivität der im Serum enthaltenen Antikörper durch die Zugabe von rp15E, Peptid E1, Peptid E2 sowie durch die Kombination beider Peptide verschieden stark gehemmt werden.
Die Hemmung der PERV-Neutralisation durch rp15E und von den identifizierten Epitopen abgeleitete Peptide sollte sicherstellen, dass die Neutralisation auf p15E-spezifische Antikörper zurückzuführen ist. Die Hemmung der Provirusintegration wurde in vorhergehenden Versuchen für dekomplementiertes Immunserum sowie für affinitätschromatographisch gereinigte Antikörper gezeigt. Lässt sich dieser Effekt durch die Zugabe des zur Immunisierung eingesetzten Antigens (rp15E) bzw. durch die von den Epitopen abgeleiteten Peptide, (E1/E2) aufheben, kann die Anwesenheit unspezifischer virusinhibierender Faktoren, wie z.B. Zytokine, ausgeschlossen werden.
Wie viele Antikörperpopulationen wurden durch die Immunisierung mit rp15E induziert und kann die neutralisierende Aktivität einem E1- bzw. E2-spezifischen Antikörper zugewiesen werden? Können durch die Epitopkartierung die Bindungsstellen aller im Serum enthaltenen Antikörper dargestellt werden? Ist die Neutralisation ausschließlich auf die Bindung an die den N-terminalen (E1) bzw. an den C-terminalen (E2) Bereich zurückzuführen, sollte die gehemmte TCID50 durch die Peptide der durch rp15E entsprechen.
Lässt sich der im ELISA beobachtete synergistische Effekt auch in einem in vitro Neutralisationsassay darstellen? Aus einer synergistischen Bindung der Peptide an die im Serum enthaltenen Antikörper sollte eine synergistisch gesteigerte Hemmung der PERV-neutralisierenden Wirkung des Immunserums resultieren.
Durch die Zugabe der Einzelpeptide wurde keine signifikante Hemmung der Neutralisation beobachtet. Bei Kombination beider Peptide konnte, korrelierend zu den Befunden der ELISA-Bindungsstudien, eine synergistische Hemmung festgestellt werden. Die Hemmung der PERV-Neutralisation des Serums durch die Kombination der Peptide E1/E2, entspricht annähernd der Hemmung durch rp15. Die TCID50-Werte sind mit Standartabweichung in Abb. 3.9 dargestellt.
Die Daten der ELISA-Bindungsstudien (Abb. III.7) und des in vitro Neutralisationsassays (Abb. III.9) suggerieren die Bildung eines Konformationsepitops. Strukturmodelle des transmembranen Hüllprotein von HIV-1 (gp41) postulierten während des Infektionsvorgangs ein Klappmechanismus, durch den sich die beiden Helices zusammenlagern (Binley und Moore, 1997) und so die Annäherung der Wirtszellmembran zur viralen Membran vermitteln. Die an diesem Vorgang beteiligten Bereiche wiesen große strukturelle Homologien zu den transmembranen Hüllproteinen anderer Retroviren auf (z.B. FeLV, MuLV, PERV), so dass auch für das Transmembranhüllprotein von PERV eine offene Konformation im nativen Zustand angenommen wurde, die sich während des Infektionsvorganges zu einem Sechs-Helix-Bündel ausbildet. Von diesem Modell ausgehend, ist die Interaktion der Bereiche E1 und E2 zu einem Konformationsepitop erst während des Infektionsvorgangs möglich.
Der Versuch zeigte, dass die Vorinkubation keinen Einfluss auf das neutralisierende Potential des Ziegenserums 20 hatte. Der leichte Abfall der Provirusintegration mit länger andauernder Vorinkubation ist auch im Kontrollansatz (Vorinkubation mit Präimmunserum) zu beobachten und war damit nicht auf mehr spezifische Bindungen neutralisierender Antikörper an p15E zurückzuführen. Möglicherweise lag die Ursache hierfür in der äußerst schwachen affinen Bindung der Antikörper an die Einzelepitope.
Um diese Daten in einem anderen Tiermodell zu reproduzieren, wurden neun Wistar-Ratten mit dem gleichen Antigen immunisiert. Alle Tiere bildeten bereits nach der ersten Immunisierung hohe Titer an bindenden Antikörpern, die sich durch die Auffrischung (Boost) nach drei Wochen nur wenig erhöhten (Abb. III.11).
Ein effektiver Schutz vor einer möglichen Infektion setzt eine möglichst 100%ige Effektivität des eingesetzten Impfstoffes voraus. Alle gegen rp15E immunisierten Ratten bildeten hohe Titer an p15E-spezifischen Antikörpern. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die Seren ebenfalls PERV-neutralisierende Aktivität besitzen.
Analog zu den Immunseren der Ziegen sollte auch für die generierten Rattenseren eine Epitopkartierung durchgeführt werden. Für beide Ziegenseren konnten annähernd identische Antikörperbindungsstellen in der p15E-Ektodomäne identifiziert werden.
Die Verwendung von Peptidvakzinen kann entscheidende Vorteile haben. Besonders bei in Bakterien produzierten Proteinen kann die Abreicherung von unerwünschten Nebenprodukten, wie z.B. Lipopolysacchariden, aufwändig und teuer sein. Durch das Angebot einzelner, neutralisierender Sequenzen könnte die Effektivität einer Immunisierung erhöht werden. In den ELISA-Studien und im in vitro-Neutralisationsassay konnte eine Interaktion der Peptide PERV-E1 und -E2 mit den neutralisierenden Antikörpern aus dem Ziegenserum 20 gezeigt werden. Auch der Versuch der affinitätschromatographischen Trennung möglicher Antikörperpopulationen wies auf die Bildung eines Konformationsepitops hin.
Ziel des Versuches war die Nachbildung dieses diskontinuierlichen Epitops durch abgeleitete Peptide. Dazu wurden die Peptide an verschiedene Träger wie BSA, KLH oder Dextran gekoppelt. Um eine möglichst variable Ausrichtungen der Peptide zu ermöglichen, wurden verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Alternativ zur Kopplung an Trägermoleküle wurde mit über Cysteinbrücken gebildeten Di- bzw. Trimeren immunisiert. Für diese Versuche wurden 15mere bzw. 25mere Peptide eingesetzt (Tab. III.2)
An ein effektives Vakzin wird die Anforderung gestellt, Schutz gegen möglichst alle Subtypen des Erregers zu induzieren. Derzeit sind drei Subtypen (PERV A, B und C) des porzinen endogen Retrovirus beschrieben. Nur die Subtypen A und B können humane Zellen infizieren. Die identifizierten Epitope E1 und E2 sind bei allen drei PERV-Subtypen stark konserviert (Tab. IV.1). Im in vivo-Neutralisationsassay konnte gezeigt werden, dass alle PERV-A neutralisierenden Seren auch den Subtyp B neutralisieren (Tab. III.3).
Besonders der membranproximale E2-Bereich ist bei allen Retroviren relativ stark konserviert, dagegen gibt es im E1-Bereich starke Abweichungen (Tab. IV.1). In vorangegangenen Versuchen konnte eine Interaktion zwischen dem E1 und E2-Bereich gezeigt werden. Seren, die ausschließlich gegen den E2-Bereich induziert wurden, sind nicht neutralisierend. Erwartungsgemäß wurden verwandte, in der E1-Sequenz stark abweichende Retroviren durch PERV-p15E spezifische Seren nicht neutralisiert.
Für den Nachweis der PERV-Provirusintegration wurde ein Neutralisationsassay auf Basis einer Endpunktbestimmung etabliert. Der Nachweis proviraler DNA erfolgte durch PCR. Dazu wurden die Zellen nach der Infektion mehrmals passagiert um eine ausreichende Anreicherung proviraler DNA zu gewährleisten. Zur Quantifizierung der hemmenden Wirkung der Immunseren wurden in Anwesenheit konstanter Serummengen die Virusüberstände titriert. Dieses Verfahren erforderte große Mengen an Probenmaterial und aufwändige Zellkulturarbeiten.
Die Detektion erfolgte durch PCR, wobei Triplikat-Messungen 36 Reaktionsansätze pro Serumprobe erforderten. Dieses Verfahren erwies sich, aufgrund der aufwändigen Zellkulturarbeiten als sehr zeit- und kostenintensiv und verhindert so einen hohen Probendurchsatz. Deshalb wurde zur Vereinfachung des Verfahrens ein Realtime-PCR-Assay etabliert. Die Quantifizierung proviraler DNA ist damit bereits 72 Stunden nach der Infektion möglich, das Passagieren der Zellen entfällt und pro Serumsprobe sind nur noch drei Reaktionsansätze notwendig. Grundlage der Quantifizierung der neutralisierenden Wirkung eines Immunserums im Vergleich zum entsprechenden Präimmunserum, ist die Verschiebung des ct-Wertes.
Die Versuche zur Induktion PERV-neutralisierender Antikörper zeigen, dass das transmembrane Hüllprotein von Retroviren generell zur Induktion neutralisierender Antikörper geeignet ist. Besonders die Isolation breitneutralisierender, gp41-spezifischer Antikörper aus HIV-Patienten (2F5 und 4E10) stützt diese These. Diese Antikörper binden den gleichen membranproximalen Bereich der Ektodomäne wie die durch rp15E induzierten PERV-neutralisierenden Antikörper. Die Übertragung der Erkenntnisse zum Neutralisationsmechanismus PERV-neutralisierender Antikörper, sowie die genaue Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 2F5 könnte die Basis für die Generation neuer Impfkonstrukte sein.
Parallel zu diesem Versuch wurde ein von der Firma Roche erhaltenes gp41 eingesetzt, das hier im Folgenden als Roche-gp41 bezeichnet wird. Dieses ebenfalls rekombinant hergestellte gp41 ist mit einem ca. 60kDa großen Fusionsprotein versehen, durch das die Löslichkeit in wässriger Umgebung deutlich erhöht wird (Scholz et al., 2005). Wie das CBP-gp41-Konstrukt enthält es die Ektodomäne ohne Fusionspeptid, abgeleitet von HIV-1 (NL 4-3). Eine schematische Darstellung der Konstrukte ist in Abb. III.14 dargestellt.
Vier Wistar-Ratten wurden mit CBP-rgp41, sieben mit dem Roche-gp41 nach dem Standartprotokoll immunisiert. Getestet wurden die Seren 21 Tage nach der zweiten Immunisierung (Boost). In allen Seren konnten spezifische Antikörper gegen gp41 detektiert werden (Abb. III.17). Um eine möglichst genaue Titerbestimmung der im Serum enthaltenen gp41-spezifischen Antikörper zu erhalten, wurde die Ausverdünnung der Seren auf dem jeweils anderen Antigen im ELISA durchgeführt. Dadurch sollte eine Abschätzung ermöglicht werden, in welchem Maß Antikörper gegen als Verunreinigung im Immunisierungsmaterial enthaltene E.coli-Proteine bzw. die angefügten Fusionsproteine induziert wurden.
Durch die Immunisierung mit dem Roche-gp41 konnten ebenfalls hohe Titer an gp41-spezifischen Antikörpern induziert werden. Die deutlich geringere Bindung der anti-Roche-gp41-Seren an das CBP-gp41 deutet jedoch auch auf die Induktion von Antikörper gegen den Fusionsanteil hin (s.Abb. III.16). Diese Antikörper binden zwar das zur Immunisierung eingesetzte Roche-gp41, jedoch nicht das CBP-gp41 (Abb. III.16B). Der Unterschied in der Bindung an CBP-gp41 zwischen den beiden Gruppen (Abb. III.16A), weist auf geringere Titer an gp41-spezifischen Antikörper in den anti-Roche-gp41-Seren hin.
Für die generierten Seren wurde eine Epitopkartierung durchgeführt. In allen Seren konnten Antikörper gegen den N-terminalen Bereich (E1-Bereich) der Ektodomäne nachgewiesen werden. In Anhängigkeit von dem zur Immunisierung eingesetzten Konstrukt wurde ca. 15 bis 55 Aminosäuren C-terminal vom Cysteinloop gelegen ein zweites Epitop im CHR-Bereich detektiert, wobei die Seren der Tiere J1, L2, L3 und M3 (gegen Roche-gp41 immunisiert) keine Antikörper gegen den CHR-Bereich enthielten. In keinem Serum konnten bindende Antikörper gegen den membranproximalen Bereich der Ektodomäne (E2-Bereich/2F5- oder 4E10-Epitop) nachgewiesen werden.
Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des Neutralisations- und Bindungsmechanismus von 2F5. Die Erkenntnisse, die bei der Untersuchung des Wirkmechanismus der PERV-neutralisierenden Antikörper gesammelt wurden, wurden in die Versuchsplanung mit einbezogen werden.
Für 2F5 wurde eine Bindung an das lineare Epitop ELDKWA im membranproximalen Bereich der Ektodomäne von gp41 beschrieben (Muster et al., 1995). Diese Sequenz konnte von verschiedenen Arbeitsgruppen durch ELISA und Western Blot Analysen mit überlappenden Peptiden bestätigt werden.
Um diese Beobachtung genauer zu untersuchen, wurde, wie schon bei der Kartierung von Epitopen bei PERV-p15E, eine PepSpot-Membran zur genauen Epitopkartierung verwendet. Durch fraktioniertes Blotten erlaubt diese Methode bedingt auch die Identifizierung von diskontinuierlichen Epitopen. Des Weiteren verfügen die auf der PepSpot-Membran am C-Terminus über einen Acetyl-Linker immobilisierten Peptide über eine höhere Beweglichkeit als die an ELISA-Platten adsorbierten Peptide, was zu einer bessern Ausbildung von schwachen Bindungen führen kann.
Die im Kapitel 3.4.1. gezeigten Daten implizieren, dass neben dem bereits identifizierten Epitop (ELDKWA) weitere Sequenzabschnitte innerhalb der gp41-Ektodomäne zur Bindung von 2F5 beitragen. Durch die Epitopkartierung konnte eine solche Sequenz jedoch nicht identifiziert werden. Durch ELISA-Bindungsstudien mit überlappenden Peptiden sollte untersucht werden, ob bindungssteigernde Sequenzen im Env- oder Gag-Protein identifiziert werden können.
Zunächst wurde mit einer Peptidbibliothek eine Epitopkartierung mittels ELISA durchgeführt. Die Peptidbibliothek besteht aus sich um jeweils 11 Aminosäuren überlappenden 15meren Peptiden und umfasst die komplette Sequenz des Env-Komplexes sowie des Gag-Proteins. Die Durchmusterung dieser Peptidbibliothek zeigte erwartungsgemäß ausschließlich eine Bindung an ELDKWA-enthaltende Peptide (Daten nicht gezeigt). Die stärkste Bindung von 2F5 wurde an das Peptid NIH-6373 detektiert. In diesem Peptid liegt die ELDKWA-Sequenz mittig. Mit Verlagerung der Sequenz zum N- bzw. C-terminus der Peptide nimmt die Bindung von 2F5 ab. Dies entspricht den bereits veröffentlichten Daten.
Um mögliche bindungsunterstützende Sequenzen zu identifizieren, wurde das Peptid mit der höchsten Affinität zu 2F5 (Peptid NIH-6373) in Kombination mit jedem weiteren Peptid des Peptidsets eingesetzt. Durch eine ähnliche Versuchsanordnung konnte die synergistisch gesteigerte Bindung von PERV-neutralisierenden Antikörper an die Peptide PERV-E1/E2 nachgewiesen werden. Um eine mögliche Steigerung der Bindungsstärke von mAb2F5 an das ELDKWA-Epitop durch die Kombination mit anderen Peptiden detektieren zu können, wurde der Versuch in Anwesenheit verschiedener Harnstoffkonzentrationen durchgeführt.
In diesem Experiment wurden insgesamt 334 Peptide auf eine Interaktion mit dem Peptid NIH-6373 untersucht. Es konnte ein Peptid (Peptid NIH-6342) identifiziert werden, das in Kombination mit Peptid NIH-6373 zu einer deutlichen Steigerung der Bindung von 2F5 führt. Die aktive Sequenz konnte nicht weiter eingegrenzt werden, da die benachbarten Peptide keine Auswirkung auf die Bindung von 2F5 zeigten. Eine Bindung von 2F5 an das Einzelpeptid NIH-6342 wurde nicht detektiert. Der Versuch wurde unter verschiedenen Harnstoffkonzentrationen durchgeführt. Mit steigender Harnstoffkonzentration kann die gesteigerte Bindung von 2F5 noch deutlicher dargestellt werden (Tab. III.4,Abb. III.20).
Um zu untersuchen, ob verschiedene stöchiometrische Verhältnisse der Peptide 6342 zu 6373 Einfluss auf die Bindung von 2F5 haben, wurden im ELISA die Peptide in verschiedenen molaren Verhältnissen miteinander kombiniert.
In diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis beider Peptide einen deutlichen Einfluss auf die Bindung von 2F5 hat. Ab einem Verhältnis von 2:1 war eine Steigerung der Avidität von 2F5 auf das Doppelte zu beobachten. Der Versuch zeigt, dass die Bindung von 2F5 an die Peptide 6342/6373 ein Optimum erreicht (Abb. III.21). Die weitere Erhöhung des Anteils des Peptides 6342 führte zu keiner weiteren Steigerung der Bindung.
Durch Kombination des Peptides 6373 mit dem Peptid 6342 konnte eine deutliche Steigerung der Avidität des Antikörpers 2F5 zur ELDKWA-Sequenz beobachtet werden. Die überlappenden Peptide NIH-6341 und NIH-6343 führten nicht zu diesem Effekt. Um die bindungsunterstützenden Sequenzen genauer eingrenzen zu können, wurden im Peptid 6342 Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Dazu wurden die Peptide 6342mut1-5 synthetisiert und in ELISA-Bindungsstudien eingesetzt. Die Peptide wurden im optimalen stöchiometrischen Verhältnis (2:1, siehe 3.4.3) eingesetzt.
Durch diesen Versuch gelang keine genaue Eingrenzung von aktiv an der Bindung beteiligten Aminosäuren. Jedes der eingesetzten Peptide führte zu einer gesteigerten Bindung von 2F5, keines jedoch so stark wie das Wildtyppeptid (6342wt). Am stärksten wurde die Bindung durch die Aminosäureaustausche in 6342mut2 und 6342mut5 beeinflusst. Diese beiden Austausche sind etwa sieben Aminosäurereste voneinander entfernt, was zwei Drehungen einer α-Helix entspricht. Da dieser Bereich im viralen gp41 als α-Helix vorliegt, kann man jedoch davon ausgehen, dass Threonin, Leucin sowie Arginin aktiv die Bindung von 2F5 an ELDKWA beeinflussen.
Durch die von den innerhalb PERV-p15E identifizierten Epitopen abgeleiteten Peptide konnte die neutralisierende Aktivität der Seren deutlich gehemmt werden (Abb. III.9). In diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass die Kombination beider Peptide eine deutlich effektivere Hemmung zurfolge hatte. Dieser Effekt wurde auf die Bildung eines Konformationsepitops zurückgeführt. Durch Kombination beider Peptide konnte die Bindung des neutralisierenden Antikörpers an sein Antigen deutlich verstärkt werden, was eine stärkere Hemmung zur Folge hat.
Sollte der Wirkmechanismus der PERV-neutralisierenden Antikörper ähnlich dem Wirkmechanismus von 2F5 sein, wäre eine gesteigerte Hemmung von 2F5 zu erwarten. Die Daten der ELISA-Bindungsstudien (Kapitel 3.4.2-4.) deuten auf eine gesteigerte Affinität von 2F5 an die ELDKWA-Sequenz durch die Zugabe des Peptides 6342 hin. Da die Bindungsstärke eines Antikörpers an sein Epitop maßgeblichen Einfluss auf sein neutralisierendes Potential hat, könnte die Zugabe des Peptides 6342 eine gesteigerte Hemmung der Neutralisation durch 2F5 zur Folge haben. Im in vitro-Neutralisationsassay sollte untersucht werden, ob durch die Kombination beider Peptide die neutralisierende Aktivität von 2F5 stärker gehemmt werden kann als durch die Einzelpeptide.
In ELISA-Bindungsstudien und im vitro-Neutralisationsassay konnte eine gesteigerte Bindung von 2F5 an die Kombination der Peptide NIH-6342) und NIH6373 gezeigt werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Sequenz des N-terminalen Bereiches der gp41 Ektodomäne die Bindung von 2F5 an das ELDKWA-Epitop unterstützte. Zahlreiche, in der Literatur beschriebene Versuche zeigen, dass durch ELDKWA-enthaltende Peptide lediglich bindende, jedoch keine neutralisierenden Antikörper induziert werden konnten.
Die Kopplung an Dextran (MW: 6kDa, im Folgenden Dextran6 oder Dex6 genannt) erfolgte ungerichtet über die Verknüpfung freier Aminogruppen mit den aktivierten Carbonylgruppen des Dextrans oder gerichtet über den bifunktionalen PDPH-Spacer (Pierce, Rockford, USA). Ausgehend von den Versuchen zum optimalen stöchiometrischen Verhältnis der Peptide NIH-6342/-6373 (Kapitel 3.4.3), wurde für die Immunisierung mit freien Peptiden sowie für die Kopplungen ein molares Verhältnis von 2:1 gewählt. Ungekoppelte Peptide wurden nicht aus dem Reaktionsansatz entfernt, um die Bildung von Komplexen mit gekoppelten Peptiden zu ermöglichen. Die Kopplungseffizenz wurde durch Gelelektrophorese und Western Blot Analyse überprüft (Abb. III.24).
Mit diesen Konstrukten wurden jeweils drei Wistar-Ratten immunisiert. Die Immunisierung erfolgte nach Standardprotokoll. Getestet wurde das Serum der Abnahme drei Wochen nach der Boost-Immunisierung.
Alle Tiere bildeten Antikörper gegen die zur Immunisierung eingesetzten Antigene (Abb. III.25). Keines der Seren zeigte, wie der monoklonale Antikörper 2F5, eine gesteigerte Bindung an die Kombination beider Peptide. Der ELISA zeigte, dass auch gegen die linearen Einzelpeptide Antikörper gebildet wurden. Möglicherweise verhindert die Überlagerung der Effekte verschiedener Antikörperpopulation die Darstellung einer solchen gesteigerten Bindung
Die getesteten Immunseren zeigten eine Hemmung der Provirusintegration von 0-99,5%. Den festgelegten Schwellenwert von ∆ct<2 überschritten die Seren der Tiere Q3 (immunisiert mit den freien Peptiden HIV-E1 und E2) und S3 (immunisiert mit den Peptiden HIV-E1 und E2 über PDPH-Spacer an Dextran gekoppelt). Für diese Seren konnte bei einer eingesetzten TCID50 eine Hemmung der Provirusintegration gegenüber der jeweiligen Präimmunseren von 99,53 bzw. 95,46% gemessen werden. Die Seren der Tiere, die nur gegen HIV-E2 bzw. mit PERV-ISU-Dextran immunisiert wurden, zeigten erwartungsgemäß keine HIV-neutralisierende Aktivität.
Test der Anti-HIV-Seren Q3 und S3 im in vitro PERV-Neutralisationsassay
Durch diesen Versuch sollte sichergestellt werden, dass in den Immunseren keine unspezifischen Faktoren mit unspezifischer antiviraler Wirkung, wie zum Beispiel Komplement, Zytokine oder Chemokine enthalten sind. Als Kontrolle wurde ein PERV-neutralisierendes Serum eingesetzt (Ratte B1, Abb. III.12). Eine Hemmung der PERV-Replikation durch die Immunseren Q3 und S3 konnte nicht beobachtet werden. Das PERV-spezifische Kontrollserum der Ratte B1 zeigte keine Wirkung auf die Replikation von HIV-1 IIIB (Abb. III.27).
Hemmung der HIV-neutralisierenden Aktivität durch die synthetischen Peptide HIV-E1/E2
Ist die detektierte neutralisierende Aktivität der Immunseren Q3 und S3 auf die Induktion spezifischer Antikörper gegen die Peptide HIV-E1/E2 zurückzuführen, sollte sich die hemmende Wirkung der Seren durch Zugabe der Peptide HIV-E1/E2 im in vitro Neutralisationsassay wieder aufheben lassen. Dafür wurden die Petide in einer Konzentration von je 2µg/ml zugesetzt. Beide Seren konnten durch die Peptide HIV-E1/E2 gehemmt werden. Die HIV-hemmende Wirkung ging durch Zugabe von 2µg/ml Peptid auf ca. 30% zurück, während das Kontrollpeptid keine Auswirkungen auf die HIV-Replikation zeigte. Auf die PERV-Replikation hat die Zugabe der Peptide keinen Einfluss (Abb. III.28).
Virusneutralisation durch isolierte IgGs
In einem weiteren Versuch zum Ausschluss einer antikörperunabhängigen Virusinhibition wurden IgG´s aus dem Serum der Ratte S3 und Q3 sowie dem PERV-p15E-spezifischem Serum der Ratte B1 durch ProteinG-Affinitätschromatographie isoliert.
Aus 2ml Serum konnten insgesamt 0,7mg Immunglobulin G isoliert werden. Die Elutionsfraktionen wurden gegen PBS dialysiert und in einer Konzentration von 100µg/ml im PERV bzw. im HIV in vitro Neutralisationsassay eingesetzt.
Zur Kontrolle wurde parallel das gleichbehandelte PERV-neutralisierende Serum der Ratte B1 verwendet. Der Versuch zeigt, dass die HIV-Neutralisation durch das Rattenserum S3 und Q3 auf Immunglobuline der Klasse G zurückgeführt werden kann. Die Hemmung der Provirusintegration durch isolierte IgGs ist mit der Hemmung durch das Immunserum vergleichbar. Das Serum der Ratte B1 sowie die daraus isolierten IgGs zeigten keinen Einfluss auf die HIV-Replikation (Abb. III.27).
Die Versuche zeigten, dass durch die Immunisierung mit synthetischen Peptiden HIV-E1/E2 neutralisierende Antikörper induziert werden konnten. Eine Induktion virushemmender Faktoren, wie Zytokine oder Chemokine, wird ausgeschlossen. Die Bestätigung der Daten durch ein unabhängiges Labor mit alternativen Methoden konnte für die Seren der Tiere S3 und Q3 leider nicht durchgeführt werden, da für diese Versuche in der Lebenszeit der Tiere nicht ausreichend Immunserum gesammelt werden konnte.
Zur Reproduktion der Daten wurde die Immunisierung durch die freien Peptide HIV-E1/E2 nach gleichem Protokoll in einer größeren Gruppe (10 Wistar-Ratten) durchgeführt. Um die Daten in einem unabhängigen Labor durch einen alternativen Neutralisationsassay bestätigen zu lassen, wurde die Immunseren parallel im Labor von Dr. S. Norley mittels p24-Capture-ELISA getestet.
Wie im ersten Versuch konnte in allen Seren bindende Antikörper gegen die zur Immunisierung eingesetzten Peptide nachgewiesen werden. Allgemein wurde ein deutlich geringerer Titer an bindenden Antikörpern in den Immunseren detektiert. Auffällig ist die Dominanz E1-spezifischer Antikörper, währenddessen gegen das E2-Epitop nur geringe Mengen an Antikörpern gebildet wurden.
Die Boost-Seren wurden unabhängig mittels Realtime-PCR und p24-Capture-ELISA auf Hemmung der HIV-Neutralisation getestet. In keinem der Seren konnte HIV-neutralisierende Aktivität nachgewiesen werden.
Die nach der Infektion durch einen pathogenen Erreger im Organismus ablaufenden Abwehrmechanismen basieren, neben der unspezifischen Abwehr durch das Komplementsystem und der angeboren Immunität, auf der Aktivierung des humoralen und zellulären Immunsystems. Die Induktion neu-tralisierender Antikörper und zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs) führt im günstigen Fall zur raschen Klärung der Infektion und zu einem dauerhaften Schutz des Organismus vor einer erneuten Infektion durch den gleichen Erreger. Ziel der Impfstoffforschung ist die Entwicklung von Vakzinen und Impfstrategien, die einen solchen Effekt im gesunden Organismus induzieren und so den Impfling präventiv vor einer Infektion schützen.
Ziel der Forschungen muss deshalb die Entwicklung eines präventiven Impfstoffes sein, der das Eindringen des Virus in die Zielzellen und dessen Ausbreitung im Wirtsorganismus verhindert. Die allgemeinen Anforderungen an einen effektiven Impfstoff sind im Folgenden aufgeführt (Janeway et al., 2002), wobei nicht jeder derzeit in breiter klinischer Anwendung befindliche Impfstoff alle diese Anforderungen erfüllt.
Induktion eines nahezu 100%iger Schutzes der Impflinge vor der Infektion durch möglichst alle Varianten des Erregers.
Die Impfung sollte mehrjährigen, im Idealfall lebenslangen Schutz induzieren und keine bzw. minimale Nebenwirkungen erzeugen.
Besonders für die Anwendung in Ländern der dritten Welt sollte der Impfstoff kostengünstig produzierbar, leicht zu transportieren, zu lagern und zu applizieren sein.
Da ein optimales HIV-Vakzin beide, die humorale und zelluläre Immunantwort stimulieren sollte, verspricht die Kombination beider Ansätze derzeit den größten Erfolg. Auch die Induktion einer effektiven Schleimhautimmunität könnte in diesem Zusammenhang zur Optimierung eines HIV-Vakzins beitragen.
Geeignete Antigene zur Induktion neutralisierender Antikörper
Das Oberflächenprotein als Antigen zur Induktion neutralisierender Antikörper
Das Oberflächenhüllprotein der Retroviren, insbesondere von HIV, ist genetisch sehr variabel. Durch starke Glykosylierung, Konformation und Sequenzvariabilität bietet es nur wenige Angriffspunkte für neutralisierende Antikörper. Das SU-Protein des HIV-1, gp120, besteht bis zu 50% aus Zuckerresten und zählt damit zu den am stärksten bekannten glykolysierten Proteinen. Im Laufe einer Infektion werden hohe Titer an spezifischen Antikörpern gebildet, die jedoch nicht zur Neutralisation des Virus führen. Die hohe Sequenzvariabilität in den äußeren, dem Immunsystem zugänglichen Bereichen der Oberflächenproteine, führt zu einer raschen Bildung von Fluchtmutanten.
Das Transmembranprotein als Antigen zur Induktion neutralisierender Antikö r per
Die transmembranen Hüllproteine der Retroviren sind deutlich konservierter als deren Oberflächenhüllproteine. Im Gegensatz von bis ca. 35% Sequenzvariabilität innerhalb der Proteinsequenz der Oberflächenproteine zwischen den einzelnen Subtypen des HIV-1, beträgt die Sequenzvariabilität der Ektodomäne des gp41 zwischen den Subtypen maximal 15% (Gaschen et al., 2002, Abb.4.1). Die notwendigen Konformationsänderungen der Ektodomäne des TM-Proteins während des Infektionsvorganges erfordert eine hohe Sequenzstabilität. Nur wenige Aminosäureaustausche innerhalb der Helixregionen stören den Klappmechanismus und führen zum Verlust der Funktionalität. Somit ist das TM-Proteine zumindest in Hinsicht der Sequenzstabilität ein geeignetes Ziel zur Induktion von neutralisierenden Antikörpern.
Die Isolation der breit neutralisierenden, HIV-1-gp41-spezifischen Antikörper 2F5 und 4E10 scheint diese These zu unterstützen, obwohl eine Induktion solcher Antikörper durch aktive Immunisierung ebenfalls noch nicht gelungen ist.
Auch gegen die Transmembranhüllproteine verschiedener Gammaretroviren sind neutralisierende Antikörper beschrieben. Im Gegensatz zu den bislang erfolglosen Versuchen bei den Lentiviren, scheint hier die Induktion solcher Antikörper durch Immunisierung leichter möglich zu sein (Fiebig et al., 2003,. Langhammer et al., 2005).
Induktion PERV-p15E-spezifischer Antikörper
Die Versuche zur Reaktivität der induzierten Ziegenseren (Ziege 16 und 20) zeigten, dass sowohl das rekombinante sowie das virale p15E detektiert werden. Damit wurde ein Ziel der Arbeiten, die Generation eines Kontrollserums gegen das PERV-TM-Protein für immunologische Nachweissysteme einer PERV-Infektion, erreicht. Unklar ist, inwieweit sich das zur Immunisierung eingesetzte rekombinante Konstrukt als Antigen in einem solchen Nachweissystem eignet, da nach dem derzeitigen Stand der Arbeiten nicht vorausgesagt werden kann, ob die während einer möglichen PERV-Infektion gebildeten p15E-spzifischen Antikörper (z.B. gegen die IDU-Domäne) das rekombinante Konstrukt binden können. Dies wäre jedoch mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit zu erwarten, da zum Nachweis von Infektionen eng verwandter Viren (HIV und FeLV) ähnliche Antigene bereits erfolgreich eingesetzt werden. Vorrangiges Ziel der Arbeiten war jedoch die Induktion neutralisierender Antikörper gegen das TM-Protein von Retroviren, daher wurden hierzu keine weiteren Untersuchungen durchgeführt.
Durch Immunisierung mit der Ektodomäne des PERV-p15E konnte in zwei unterschiedlichen Spezies (neun Lewis-Ratten und zwei Ziegen) hohe Titer an bindenden Antikörpern induziert werden. In jedem durch rp15E erzeugten Immunserum konnte PERV-neutralisierende Aktivität nachgewiesen werden. Der Neutralisationstiter der induzierten Seren beträgt bei einer Serumsverdünnung von 1:10 zwischen 1x101,21 und 1x101,96. Untersuchungen zur schützenden Immunantwort vor FeLV-Infektionen belegen, dass Seren, die bei einer Verdünnung von 1:2 in vitro neutralisierend wirken, einen effektiven Schutz vor einer Infektion bieten können. Ob der induzierte Titer an neutralisierenden Antikörpern einen ausreichenden Schutz zukünftiger Transplantatrezipienten bietet, kann noch nicht sicher geklärt werden, da derzeit kein geeignetes Tiermodell für einen solchen Versuch zur Verfügung steht. Die Identifizierung des PERV-Rezeptors und die Herstellung transgener Mäuse, die einen solchen Rezeptor tragen und somit mit PERV infizierbar sein sollten, stellt jedoch ein solches Tiermodell in naher Zukunft in Aussicht.
Ebenfalls finden derzeit Studien zur Immunisierung mit FeLV-p15E statt. Das dabei zur Immunisierung verwendete Konstrukt wurde analog zu dem rekombinanten PERV-p15E generiert. Die erzeugten Seren zeigten in vitro ebenfalls neutralisierende Aktivität (Langhammer et al., 2005). Der dazu in Vorbereitung befindliche in vivo-Versuch wird erste Hinweise auf die Effektivität des eingesetzten Antigens und der Möglichkeit des Einsatzes als Impfstoff geben.
Die Verwendung von Peptidvakzinen kann im Vergleich zu in E.coli rekombinant hergestellten Antigenen zahlreiche Vorteile mit sich bringen. So entfällt z.B. die oft aufwändige und teure Abtrennung unerwünschter Nebenprodukte. Besonders hydrophobe Proteine interagieren stark mit Bestandteilen der bakteriellen Zellwand (Lipopolysaccaride, LPS), die nur schwer vom gewünschten Produkt zu trennen sind. Die Abreicherung von LPS ist jedoch notwendig, da es im menschlichen Organismus zu schweren allergischen Reaktionen führen kann (Eisenbarth et al, 2002).
Ein weiterer Vorteil von Peptidvakzinen ist die Möglichkeit der gezielten Präsentation von neutralisierenden Strukturen. Dadurch kann die Induktion einer Immunantwort gegen für die Neutralisation nicht relevanter Bereiche des Antigens vermieden werden.
Die hohen Titer an spezifischen Antikörpern, die durch die Immunisierung mit rp15E induziert wurden, lassen nicht auf eine signifikante Inhibition des Immunsystems bzw. der B-Zellproliferation schließen. Auch an den immunisierten Tieren wurden keine mit einer Immunsuppression korrelierbaren Symptome festgestellt. Diese Daten implizieren, dass durch die relativ geringe Menge und die geringe lokale bzw. zeitliche Begrenzung der Exposition des applizierten TM-Proteins im Organismus dieser Effekt vernachlässigt werden kann. Trotzdem wäre im Hinblick auf mögliche geringe Nebenwirkungen, die in den durchgeführten Versuchen nicht erfasst werden konnten, der Ausschluss der immunsuppressiven Domäne wünschenswert. Möglicherweise könnte dadurch auch eine noch effektivere Anregung der B-Zellproliferation erreicht werden, die zu Bildung höherer Titer an neutralisierenden Antikörpern führt.
Die von den Epitopen E1 und E2 abgeleiteten Peptide wurden in verschiedenen Formen Wistar-Ratten appliziert. Die Immunisierung mit freien 15mer-Peptiden führte, wahrscheinlich aufgrund der geringen Molekülgroße des Antigens, zu keiner bzw. zu einer sehr schwachen Immunantwort. Ebenso führte die Kopplung der Peptide PERV-E1/E2 an BSA bzw. KLH als Trägermolekül nicht zur Induktion PERV-spezifischer Antikörper. In diesen beiden Fällen dürfte die geringe Kopplungseffizenz (durch SDS-PAGE konnte eine durchschnittliche Bindung vom maximal fünf Peptidmolekülen/Trägermolekül ermittelt werden) für die ausbleibende Immunantwort verantwortlich sein. Die Veränderung der Strukturen durch die Vernetzung der Moleküle kann als Ursache ausgeschlossen werden, da in den generierten Immunseren auch keine bindenden Antikörper gegen das zur Immunisierung eingesetzte Konjugat detektiert werden konnten.
Keines der Immunseren zeigte jedoch virusneutralisierende Aktivität. Die Ursachen dafür sind unklar, wahrscheinlich ist aber, dass durch die verwendeten Kopplungsmethoden nicht die Konformation erzeugt werden konnte, wie sie im rekombinanten p15E vorliegt. In diesem Versuch wurde einer von vielen kommerziell angebotenen Linkern bzw. Kopplungsmethoden getestet. Möglicherweise verhindert der Abstand der Kopplungsstellen des aktivierten Dextrans die Bildung einer geeigneten Konformation. Durch die Verwendung alternativer Kopplungsmethoden, z.B. die gezielte Kopplung an trifunktionale Linker, könnte möglicherweise eine solche Konformation erzeugt werden.
Untersuchung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus PERV-neutralisierender Antikörper
Die Epitopkartierung des Ziegenserums 20 zeigte zwei Antikörperbindungsstellen innerhalb der Ektodomäne von p15E. Von diesen identifizierten Epitopen wurden synthetische Peptide abgeleitet (PERV E1/E2). In den durchgeführten ELISA-Bindungsstudien wurden die Einzelpeptide, die Kombination beider Peptide und das zur Immunisierung eingesetzte rp15E adsorbiert. Geht man von der Induktion zweier getrennter Antikörperpopulationen aus, wäre durch Adsorption beider Peptide maximal ein additiver Effekt zu erwarten. In Anbetracht der Konkurrenz beider Antigene im gesättigtem Bereich, könnte der zu erwartende Effekt sogar deutlich unter der Addition der Einzelwerte liegen. Beobachtet wurde jedoch eine deutlich synergistisch gesteigerte Bindung der im Serum enthaltenen Antikörper an die Kombination beider Peptide. Noch deutlicher kann dieser Effekt in Anwesenheit verschiedener Harnstoffkonzentrationen dargestellt werden. Aus diesen Daten wurde der Schluss gezogen, dass die Peptide PERV E1 und E2 miteinander interagieren und die Bindungsstärke zumindest einer im Serum enthaltenen Antikörperpopulation deutlich steigern. Ob neben dieser Population noch weitere, gegen die linearen Epitope gerichtete Antikörper im Serum enthalten sind, kann anhand dieses Versuches nicht ausgesagt werden.
Der im ELISA beobachtete Effekt weist auf eine Interaktion der identifizierten Sequenzen im N- bzw. im C-terminalen Bereich der Ektodomäne hin. Um zu untersuchen, ob die Antikörper, die mit der Kombination beider Peptide reagieren, an der Neutralisation beteiligt sind, wurde ein in vitro-Neutralisationsassay durchgeführt. Dieser Versuch zeigt, dass die Neutralisation nicht signifikant durch die Einzelpeptide gehemmt werden kann. Die Kombination beider Peptide führt dagegen zu einer Hemmung der Neutralisation, die der durch das rekombinante p15E annähernd entspricht. Aus diesem Versuch wird geschlossen, dass möglicherweise im Serum enthaltene Antikörper gegen lineare Epitope nicht virusneutralisierend wirken. Die Neutralisation beruht dagegen auf Antikörper, die mit hoher Affinität an die Kombination beider Peptide binden.
Durch die Immunisierung mit freien bzw. an Dextran gekoppelten Peptiden wurden E1- bzw. E2-spezifische Seren induziert. Obwohl auch mit der Kombination beider Peptide immunisiert wurde, konnten ausschließlich Antikörper gegen lineare Epitope induziert werden. In keinem der induzierten Seren konnte neutralisierende Aktivität nachgewiesen werden. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass gegen die linearen Epitope E1 bzw. E2 gerichteten Antiköper nicht neutralisierend wirken.
Durch einen in vitro-Neutralisationsassay konnte gezeigt werden, dass die Vorinkubation von PERV mit dem neutralisierenden Ziegenserum 20 nicht zu einer Steigerung der Neutralisation führt. Der zu beobachtende leichte Abfall der Provirusintegration mit steigender Zeit der Vorinkubation ist nicht auf die gesteigerte Wirkung neutralisierender Antikörper zurückzuführen, da dieser auch im gleichen Maße in Anwesenheit des Präimmunserums zu beobachten ist. Mittels Immunfluoreszenz und FACS-Analyse konnte gezeigt werden, dass die Ziegenseren 16 und 20 PERV-infizierte 293-Zellen detektieren. Dieser Befund legt nahe, dass die Epitope im sich abschnürenden Virus zugänglich sind und durch die induzierten Antikörper gebunden werden können. Warum eine Vorinkubation von Virus mit neutralisierenden Seren nicht, wie in den Versuchen mit 2F5 beobachtet, zu einer gesteigerten neutralisierenden Wirkung der Seren führt, ist unklar. Möglicherweise liegt der Grund hierfür in der äußerst schwach affinen Bindung der Antikörper an die Einzelepitope.
Obwohl das FeLV-p15E in der Western Blot Analyse durch das Ziegenserum detektiert werden kann, wurde keines dieser Viren durch das PERV-neutralisierende Ziegenserum 20 neutralisiert. Der Versuch zeigt, dass die Präsenz der Sequenz des E2-Epitopes allein nicht für eine Neutralisation ausreicht und die Stärke der Bindung einen entscheidenden Einfluss auf das neutralisierende Potential des Antikörpers hat.
Interessanterweise liegen die beschriebenen Epitope von 2F5 und 4E10 im membranproximalen Bereich der Ektodomäne, dem Bereich, in dem das PERV-E2-Epitop lokalisiert werden konnte (Abb. III.5). Das für mAb 4E10 beschriebene Epitop weist sogar eine 50%ige Sequenzhomologie zu dem PERV-E2 auf (Tab. IV.1).
Obwohl die Bindungsstellen dieser Antikörper scheinbar sehr gut charakterisiert sind, ist eine Induktion neutralisierender Antikörper gegen den membranproximalen Bereich der Ektodomäne bis heute nicht gelungen. Die Tatsache, dass durch Immunisierung mit Peptiden, die den Epitopen 2F5 und 4E10 entsprechen, keine neutralisierenden Antikörper induziert werden können, legt die Vermutung nahe, dass möglicherweise auch diese Antikörper Konformationsepitope bzw. konformationsabhängige Strukturen binden. Der für das Transmembranprotein von Retroviren beschriebene Klappmechanismus während des Infektionsvorganges führt zu einer räumlichen Annäherung der Sequenzen PERV-E1 und PERV-E2. Die Bildung eines metastabilen Konformationsepitopes durch die identifizierten Bereiche E1 und E2 innerhalb der Sechs-Helix-Konformation ist daher denkbar.
Da ein endgültiger Beweis für die Bildung eines neutralisierenden Konformationsepitops noch nicht erbracht ist, sollen die durch die durchgeführten Experimente gesammelten Hinweise im Folgenden zusammengefasst werden:
Synergistische Bindung PERV-spezifischer Antikörper an die Kombination der Peptide PERV E1/E2 im ELISA.
Hemmung der neutralisierenden Aktivität des Ziegenserums 20 durch die Kombination der Peptide PERV E1/E2, jedoch nicht durch die Einzelpeptide.
Keine Trennung von Antikörperpopulationen durch Affinitätschromatographie gegen die synthetischen Peptide PERV E1 bzw. E2 möglich.
Seren, die bindende Antikörper gegen die Peptide PERV E1 oder PERV E2 enthalten, sind nicht neutralisierend.
FeLV-A, das zu 100% das PERV-E2 (FEGWFN) enthält, in der E1-Sequenz jedoch keine Homologien aufweist, kann durch das Ziegenserum 20 nicht neutralisiert werden.
Aus diesen Daten wurde ein Bindungs- und Neutralisationsmodell für die durch rp15E induzierten neutralisierenden Antikörper erstellt. Da für den Infektionsvorgang des porzinen endogenen Retrovirus keine Daten veröffentlicht sind, werden Daten gängiger HIV-Modelle zugrunde gelegt (Abb. I.5 und Abb. IV.2)
Die in diesem Projekt durchgeführten Arbeiten zur Induktion PERV-neutralisierender Antikörper zeigten, dass Induktion eines Impfschutzes gegen PERV auf Basis des TM-Proteins möglich ist.
Ob jedoch die allgemeinen Anforderungen an einen effektiven Impfstoff erfüllt werden ist noch unklar. Nach derzeitigem Stand der Experimente erfüllt das zur Immunisierung eingesetzte rp15E-Konstrukt einige der grundlegenden Anforderungen an einen Impfstoff.
Die Blutentnahmen eines Versuchstieres (Ziege 20) erfolgten regelmäßig über einen Zeitraum von 24 Monaten. Es erfolgte keine zwischenzeitliche Auffrischung der Immunisierung. In diesem Zeitraum wurde kein signifikanter Abfall des Neutralistionstiters im Serum beobachtet. Obwohl sich anhand eines Tieres keine allgemeine Aussage treffen lässt, kann festgestellt werden, dass in diesem Tier ein konstant hoher Titer an neutralisierenden Antikörpern über einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten wurde.
Bei keinem der Versuchstiere wurden Nebenwirkungen beobachtet. Obwohl die Tiere unter ständiger Beobachtung standen, kann selbstverständlich über die klassischen leichten Nebenwirkungen einer Impfung (Gliederschmerzen, Unwohlsein usw.) keine Aussage getroffen werden. In Anbetracht der durch die Xenotransplantation notwendigen Immunsuppression und der damit verbundenen schweren Nebenwirkungen sind eventuelle leichte Nebenwirkungen einer Impfung wohl zu vernachlässigen. Auch die Frage der Kosten einer Immunisierung sowie der Lagerung und des Transportes eines PERV-Impfstoffes dürfte angesichts des enormen technischen und finanziellen Aufwandes einer Xenotransplantation eine untergeordnete Rolle spielen.
Die Notwendigkeit der Entwicklung eines präventiven HIV-Impfstoffes ist angesichts von 40 Millionen Infizierten, 15000 Neuinfektionen und 8000 Toten pro Tag unbestritten. Die unter 4.1. diskutierten allgemeinen Anforderungen an einen Impfstoff sind nach über zwanzig Jahren intensiver, aber weitestgehend erfolglosen Bemühungen zur Entwicklung eines effektiven Impfstoffs und der verheerenden Folgen für die soziale und ökonomische Infrastruktur der betroffenen Regionen differenzierter zu sehen. Der Schutz eines Teiles der Bevölkerung vor dem regional vorherrschenden Subtyp wäre ein großer Erfolg. In Anbetracht der enormen Kosten von Aufklärungskampagnen, der Belastung der Gesundheitssysteme durch die hohe Zahl der Kranken sowie des extremen Rückgangs des Bruttosozialprodukts stark durchseuchter Gebiete, dürfen die Kosten einer Impfung nicht im Vordergrund stehen. Es ist im Interesse der gesamten Weltgemeinschaft, die dafür erforderlichen finanziellen Mittel bereitzustellen.
Untersuchung des Bindungs- und Neutralisationsmechanismus von 2F5
Eine Induktion solcher Antikörper durch aktive Immunisierung ist trotz zahlreicher Versuche jedoch noch nicht gelungen (Lu et al. 2000; Joyce et al., 2002; Coëffier et al., 2001). Der Grund dafür könnte im bisher noch nicht vollständig verstandenen Bindungs- und Neutralisationsmechanismus liegen, der wichtige Hinweise auf die notwendige Beschaffenheit geeigneter Antigene geben könnte.
In der Western Blot Analyse und im ELISA wurde beobachtet, dass 2F5 geringe Mengen der gp41-Ektodomäne deutlich besser bindet als an größere Mengen des linearen Peptides DP178. Verschiedene Studien zeigen, dass die an ELDKWA angrenzenden Aminosäuren einen Einfluss auf die Bindungsstärke haben (Ernst et al., 1998; Coëffier et al., 2001). In den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wurde dieser bindungssteigernde Effekt jedoch auch bei Verwendung des längeren Peptids DP178 (35mer) und dem ELDWA-enthaltenen Peptid NIH-6373 (15mer) beobachtet. Daher wird ein Einfluss der im DP178 enthaltene Aminosäuren auf die Konformation des 2F5-Epitops als Ursache für die Bindungssteigerung ausgeschlossen (Ernst et al. 1998).
Diese These konnte durch die Versuche zum optimalen stöchiometrischen Verhältnis gestützt werden. Das ermittelte optimale Verhältnis der Peptide HIV-E1 zu HIV-E2 beträgt 2:1. Dieses Verhältnis kann mit der bereits beschrieben trimeren Struktur des Oberflächenkomplexes sehr gut erklärt werden.
Der Komplex aus Oberflächen- und Hüllprotein durchläuft während des Infektionsvorgangs mehrere Konformationsänderungen. Das Hüllprotein ist im nativen Virus zum großen Teil vom Oberflächenprotein maskiert und wird erst nach der Anlagerung des Fusionspeptides in die Zielzellmembran, durch Ablösung des Oberflächenproteins, freigelegt. Der tryptophanreiche Bereich in unmittelbarer Nähe des 2F5-Epitops ist für die Fusion unerläßlich (Munoz-Barroso et al., 1999; Salzwedel et al., 1999) und unterliegt während des Fusionsprozesses mehreren Konformationsänderungen. Sattentau et al. (1999) konnten zeigen, dass 2F5 sein Epitop bereits vor der Bindung des CD4-Rezeptors bindet. Diese Daten werden durch die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche zum Einfluss der Vorinkubation gestützt. Die Vorinkubation bis zu ca. 45min führt zu deutlich gesteigerten virusneutralisierenden Wirkung von 2F5. Dieses Ergebnis lässt den Schluss zu, dass bereits im nativen Virus das 2F5-Epitop zugänglich ist und durch den Antikörper gebunden werden kann. Ob die identifizierte stabilisierende Sequenz im N-terminalen Bereich bereits in dieser Phase in räumlicher Nähe zum 2F5-Epitop vorliegt oder ob die Bindung des Antikörpers nach der Ausbildung der C-Helices stabilisiert wird, kann durch diesen Versuch nicht beantwortet werden. Sicher scheint, dass 2F5 nicht die Anlagerung von gp120 an den CD4-Rezeptor unterbindet (Ugolini et al., 1997; Nyambi et al., 2000; Barbato et al., 2003).
Ein anlog durchgeführter Versuch zur Vorinkubation PERV-neutralisierender Antikörper mit Virus führte zu keiner messbaren gesteigerten Neutralisation. Durch Immunfluoreszenz und FACS-Analse konnte jedoch auch hier die Zugänglichkeit der membranproximalen Bereiche vor der Rezeptorbindung gezeigt werden.
Durch Bindungsstudien mit 2F5 konnte eine Sequenz im N-terminalen Bereich der Ektodomäne identifiziert werden, die an der Bindung von 2F5 an gp41 beteiligt ist. Dieses Ergebnis unterstützt das anhand PERV-neutralisierender Antikörper erstellte Bindungs- und Neutralisationsmodell.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass es sich beim HIV-1-Bereich um eine bindungsunterstützende Sequenz handelt, die durch den Antikörper nicht direkt gebunden werden kann, die Avidität des Antikörpers an das ELDKWA-Epitop jedoch deutlich erhöht. Für die Bindung eines Konformationsepitopes durch die Bereiche E1 und E2 konnte kein experimenteller Beweis erbracht werden.
Auf Basis der vorliegenden Daten wurde ein zweistufiges Bindungsmodell für 2F5 aufgestellt. Das 2F5-Epitop ist danach bereits im nativen Virus frei zugänglich und wird durch den Antikörper gebunden. Die Bindung des CD4-Rezeptors durch gp120 sowie der Klappmechanismus des gp41 wird durch die Antikörperbindung nicht unterbunden (Suttentau et al., 1999; Ugolini et al., 1997; Golding et al., 2002). Da nur selten neutralisierende Antikörper gegen dieses Epitop in HIV-infizierten Patienten detektiert werden können (Calarota et al., 1996), scheint die Exposition eines neutralisationskompetenten Epitops in freien Viruspartikeln unwahrscheinlich. Diese Daten sprechen für einen Bindungsmechnismus, wie er für PERV-neutralisierende Antikörper aufgestellt wurde. Die teilweise unterschiedlichen experimentellen Daten könnten auf die unterschiedliche Beschaffenheit der Paratope neutralisierender Antikörper zurückzuführen sein. Während die PERV-neutralisierenden Antikörper der Ziege 20 direkt an ein Konformationsepitop binden, bindet 2F5 lediglich an das ELDKWA-Epitop, das jedoch in seiner Konformation entscheidend von der E1-Sequenz beeinflusst wird.
Analog zu den Immunisierungsversuchen mit dem transmembranen Hüllprotein von PERV wurde die gp41-Ektodomäne rekombinant als CBP-Fusionsprotein generiert und zur Immunisierung eingesetzt. Die Epitopkartierung der gp41-spezifischen Antikörper zeigt, ähnlich wie im Fall die PERV-spezifischen Seren, ein relativ homogenes Bild in der Lokalisation der Antikörperbindungsstellen (Abb. III.18), abhängig vom eingesetzten Antigen. Durch diese Immunisierung konnten zwar hohe Titer an gp41-bindenden, jedoch keine neutralisierenden Antikörper induziert werden. Der Grund hierfür könnte in der abweichenden Lokalisation der immunreaktiven Regionen im rgp41 im Vergleich zum rp15E liegen (Abb. IV.5). Die Epitopkartierung der Immunseren zeigt, dass in allen Seren Antikörper gegen den N-terminalen E1-Bereich induziert wurden. Es konnten auch Antikörper gegen den CHR-Bereich nachgewiesen werden, wobei die Bindungsstellen dieser Antikörper deutlich weiter N-terminal, in der Helixregion gelegen sind. Gegen die Regionen um das 2F5- oder das 4E10-Epitop (E2-Bereich) konnten keine Antikörper induziert werden. In Bindungsstudien konnte zwischen diesen beiden detektierten Epitopen keine Interaktion nachgewiesen werden.
Auch durch die Immunisierung mit dem gp41 der Firma Roche konnten keine neutralisierenden Antikörper induziert werden. Wie bei der Immunisierung mit CBP-gp41, wurden durch das Roche-gp41 Antikörper gegen den E1-, jedoch nicht gegen den E2-Bereich induziert.
Immunisierung mit von HIV-E1/E2 abgeleiteten Peptiden
Um die membranproximale Region (2F5 und 4E10-Epitop) zu der bindungssteigernden E1-Sequenz in räumliche Nähe zu bringen, wurden verschiedene Ansätze gewählt. Alle Versuche basieren auf von E1 und E2-abgeleiteten synthetischen Peptiden. Die Ergebnisse der Versuche deuten auf eine Interaktion beider Peptide in wässrigen Lösungen hin. Da eine für die Induktion neutralisierender Antikörper korrekte Ausrichtung der Peptide zueinander schwierig durch eine starre Kopplung zu erreichen ist, wurde bewusst auf die Abtrennung ungekoppelter Peptide verzichtet. Dadurch sollte die Anlagerung freier Peptide an bereits gekoppelte Peptide ermöglicht werden. Durch diesen Versuchsaufbau ist eine präzise Analyse des zur Immunisierung eingesetzten Konstrukts jedoch nicht möglich.
Es konnte in zwei Seren HIV-neutralisierende Aktivität nach den festgelegten Kriterien (∆ct>2) nachgewiesen werden. Die Hemmung der HIV-Replikation lag bei einer Serumsverdünnung von 1:16 zwischen 95% (Rattenserum Q3) bis 99% (Rattenserum S3). Damit entspricht die neutralisierende Aktivität dieser Seren etwa der des mAb2F5 in einer Konzentration von 10µg/ml. Ratte Q3 ist eins von drei mit den freien Peptiden (HIV-E1/E2), Ratte S3 eins von drei mit E1/E2-PDPH-Dex6 immunisierten Versuchstieren. Da freie Peptide nicht abgetrennt wurden, können die induzierten Antikörper im S3-Serum nicht auf das E1/E2-PDPH-Dex6-Antigen zurückgeführt werden. Die Hemmung der Provirusintegration durch die Immunseren aller anderen Versuchstiere kann nicht als signifikant eingestuft werden.
Da neben den aufgezählten noch eine Reihe weiterer Störungen des Systems denkbar wären, wurden zur Absicherung der Daten umfangreiche Kontrollexperimente durchgeführt:
Nur aus den Immunseren isolierte IgG´s hemmen die VirusreplikationAus Präimmunserum und Immunserum wurden affinitätschromatographisch Immunglobuline der Klasse G bzw. TM-Protein-bindende Antikörper isoliert. Erwartungsgemäß konnten aus dem Präimmunserum keine virusspezifischen Antikörper isoliert werden. Die Virusreplikation wurde nur durch aus den Immunseren isolierte Antikörper gehemmt.
Die neutralisierende Aktivität der Immunseren kann durch E1/E2 abgeleitete Peptide gehemmt werden. Dieses Ergebnis weist auf die Hemmung der Virusreplikation durch E1/E2-spezifische Antikörper hin.
Die HIV-spezifischen Seren der Ratten S3 und Q3 hemmen die HIV-Replikation, jedoch nicht die Replikation des eng verwandten porzinen endogenen Retrovirus. Mit diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass die neutralisierende Wirkung der Seren HIV-spezifisch ist. Ein unspezifischer Effekt durch Chemokine oder Zytokine ist daher unwahrscheinlich.
In Versuchen zur Bestätigung der Ergebnisse wurden zehn Wistar-Ratten nach gleichen Immunisierungsschema mit freien Peptiden immunisiert. In keinem der induzierten Seren konnte HIV-neutralisierende Aktivität nachgewiesen werden. Trotz analoger Versuchsdurchführung zeigen die in den Folgeversuchen generierten Seren deutliche Unterschiede in der Verteilung der Antikörperbindungsstellen (analysiert durch Epitopkartierung) und demzufolge auch keine virusneutralisierende Aktivität. Auch der Titer an bindenden Antikörpern war im Vergleich zum ersten Immunisierungsversuch deutlich geringer. Die Ursachen der unterschiedlichen Versuchsergebnisse ist noch unklar.
Veröffentlichungen zeigen, dass 2F5 über eine besonders lange CDR3-Scheife (22 Aminosäuren) verfügt. Die durchschnittliche Länge der CDR3-Schleife humaner IgGs beträgt etwa 13 Aminosäurereste, die muriner IgGs 9-10 und die von Kaninchen 11-12 Aminosäurenreste (Wu et al., 1993). Eine lange CDR3-Schleife weist auf eine Antikörperreifung im Patienten hin (Kunert et al., 1998), wobei der Zeitpunkt des Auftretens solcher Antikörper wahrscheinlich der statistischen Zufälligkeit unterliegt. Die Bedeutung dieser langen CDR3-Schleife für die neutralisierende Aktivität von 2F5 wurde durch Untersuchungen von Zwick et al. (2004) belegt. In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, das Aminosäurenaustausche innerhalb der CDR3-Schleife von 2F5 zu einer Verringerung der neutralisierenden Aktivität der Antikörper bis zu 90% führt.
Kann durch aktive Immunisierung Schutz vor einer HIV-Infektion induziert werden?
Die Isolation breitneutralisierender Antikörper (2F5/4E10) aus infizierten Patienten zeigt, dass die Induktion neutralisierender Antikörper gegen den membranproximalen Bereich der gp41-Ektodomäne generell möglich ist. Diese These konnte durch die bisher durchgeführten Arbeiten grundsätzlich bestätigt werden. Auf Basis des Wirkmechanismus von 2F5 wurden Immunisierungsstudien durchgeführt, die zur Induktion neutralisierender Seren geführt haben. Obwohl nur in einem sehr geringen Teil der Versuchstiere neutralisierende Antikörper induziert wurden, die Reproduktion der Ergebnisse und der Test gegen Primär-isolate noch aussteht, ist es erstmals gelungen, neutralisierende Antikörper gegen diesen Bereich zu induzieren. Die Daten lassen hoffen, dass durch weitere intensive Forschungsarbeiten die Konstruktion von Antigen gelingt, die eine verlässliche Induktion solcher Antikörper gewährleisten. Die Ergebnisse der Studien zum passiven Immuntransfer im Menschen, SCID-Mäusen (severe combined immune deficiency) und Rhesusaffen zeigen die Effizienz solcher Antikörper (Stiegler et al., 2002; Gauduin et al., 1997). Wenn auch nach dem derzeitigen Kenntnisstand nicht sicher ist, dass so eine sterile Immunität im Menschen induziert werden kann, stellt die Induktion neutralisierender Antikörper auf Basis des hier erstellten Bindungsmodells einen viel versprechenden Ansatz dar.
Sollten sich in diesen Versuchen die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten bestätigen, ist davon auszugehen, dass eine präventive Immunisierung zukünftiger Transplantatempfänger durch rp15E möglich ist.
Derzeit gibt keine weiteren Hinweise auf eine Übertragung von PERV auf den Menschen. Auch die Xenotransplantation kann noch nicht im großen Umfang in die klinische Praxis eingeführt werden. Trotz vieler kleiner und großer Fortschritte wird die Lösung gravierender physiologischer, anatomischer und immunologischer Probleme noch mehrere Jahre oder sogar Jahrzehnte in Anspruch nehmen. Eine Einführung eines PERV-Impfstoffes in die klinischen Phasen scheint daher zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht sinnvoll. Die erfolgreichen in vivo-Versuche im Maus- und Katzenmodell vorausgesetzt, kann dieses Projekt somit als abgeschlossen betrachtet werden.
Obwohl gezeigt werden konnte, dass die Induktion HIV-neutralisierender Antikörper durch den gewählten Ansatz generell möglich ist, sind die Ergebnisse der Immunisierungsstudien unbefriedigend. Wie unter 4.3. bereits diskutiert, könnte ein Grund dafür in dem für die Versuche nur bedingt geeigneten Rattenmodell liegen. Die Wiederholung der Versuche im Kaninchenmodell ist bereits angelaufen.
Eingehende Strukturuntersuchungen zur Interaktion der identifizierten E1-Sequenz mit dem 2F5-Epitop durch spektroskopische Methoden sind notwendig. Die Kenntnis über die genaue Sekundär- bzw. Tertiärstruktur der beiden Peptide während der Bildung eines neu-tralisierenden Epitopes, könnte beim Design eines effektiven Antigens von entscheidender Bedeutung sein.
Obwohl derzeit keine in vivo-Übertragung von PERVs auf den Menschen beschrieben ist, zeigen Untersuchungen, dass PERVs in vitro an humane Zellen adaptieren und diese produktiv infizieren können. Damit stellen PERVs ein potentielles Risiko im Rahmen der Xenotransplantation dar.
Die aus HIV-Infizierten isolierten, breit neutralisierenden monoklonalen Antikörper 2F5 und 4E10 binden an eine Domäne im C-terminalen Bereich der Ektodomäne des TM-Proteins gp41 von HIV, die ähnlich lokalisiert ist wie die bei PERV. Die Induktion 2F5-ähnlicher Antikörper ist bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht gelungen. Mittels Bindungsstudien und Hemmung der Neutralisation durch entsprechende synthetische Peptide wurde im N-terminalen Bereich von gp41 eine Domäne identifiziert, die an der hochaffinen Bindung von 2F5 entscheidend beteiligt ist. Diese Domäne ist ähnlich lokalisiert wie die bei PERV.
Auf Basis dieser neuen Erkenntnisse wurden Immunisierungsstudien in Ratten durchgeführt. Zur Immunisierung wurden rekombinant hergestellte, beide Domänen von gp41- enthaltende Proteine, sowie synthetische Peptide, die von dem 2F5 Epitop und der neu identifizierten N-terminalen bindungsunterstützenden Domäne abgeleitetet wurden, eingesetzt. Die Immunisierung mit rekombinanten gp41-Proteinen führte nicht zur Induktion neutralisiernder Seren, jedoch konnten in zwei Fällen HIV-1-neutralisierende Antikörper durch Immunisierung mit entsprechenden synthetischen Peptiden induziert werden. Kontrollversuche bestätigen die HIV-Spezifität dieser neutralisierenden Seren.
Für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes am Robert Koch-Institut und die stetige Diskussionsbereitschaft möchte ich mich herzlich bei Prof. Dr. Reinhard Kurth und bei Dr. Joachim Denner (BMG Ressortforschung 328-13500/03) bedanken.
Für die externe Betreuung der Arbeit danke ich Prof. Dr. Detlev Krüger vom Institut für Virologie der Humboldt-Universität Berlin.
Bei allen Mitarbeitern Arbeitsgruppe P23 bedanke ich mich für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die technische Assistenz. Mein besonderer Dank gilt Mirco Schmolke und Alexander Karlas für die gute Zusammenarbeit und die zahlreichen Denkanstöße in fachlichen Diskussionen.
Für die Durchführung der Capture-ELISA danke ich Dr. Stephen und Nicky Norley. Darüber hinaus danke ich Dr. Stephen Norley für seine stetige Diskussionsbereitschaft.
Für die Unterstützung bei den Rattenversuchen danke ich Annette Dietrich und dem gesamten Team des Tierstalls im Robert Koch-Institut.
Für die Unterstützung bei den Ziegenversuchen danke ich dem Team von Dr. Wolf vom Institut für Risikobewertung in Berlin-Marienfelde.
Dr. Heinz Ellerbrock und Dr. Claudia Kücherer gilt mein Dank für die Unterstützung bei der Etablierung der Realtime-PCR.
Meinen Eltern danke ich für die moralische und finanzielle Unterstützung während des gesamten Studium und der Doktorandenzeit.
Meiner Freundin Nadine gilt mein besonderer Dank für die Geduld und das Verständnis, das sie mir während der Anfertigung dieser Arbeit klaglos entgegenbrachte
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Folgende Reagenzien wurden durch das NIH AIDS Research and Reference Reagent Program zu Verfügung gestellt:
HIV-1 gp41 monoklonaler Antikörper (2F5) von Dr. Herman Katinger
C8166 von Dr. Robert Gallo
HIV-1 MN Env und HIV-1HXB2 GAG Peptidset
Aminosäuresequenzen sind im Ein-Buchstaben-Code dargestellt:
Die Basen von Oligonucleotidsequenzen sind in folgendem Code aufgeführt:
Eigene Publikationen
Paper:
Patentanmeldung:
Poster und Vorträge:
Ich erkläre hiermit an Eides statt, dass die vorliegende Dissertation von mir selbst und ohne unzulässige Hilfe Dritter verfasst wurde, auch in Teilen keine Kopie anderer darstellt und die benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur vollständig angegeben sind.
Uwe Fiebig