Wenn nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Chemikalien von Sigma-Aldrich (Taufenkirchen, Deutschland) bezogen.

Hitzestabile Lösungen und Labormaterialien wurden 20min bei 1,2bar und 121°C auto-klaviert. Hitzelabile Lösungen wurden über Membranfilter (0,2µm) sterilfiltriert.

Antiköper

Gebrauchslösung

Bezugsquelle

mAb 2F5

HIV-1-gp41-spezifischer, monoklonaler Antikörper (human)

ELISA: 0,2µg/ml in PBS/0,05% Tween20

WB: 0,5µg/ml in PBS/0,05% Tween20

AIDS Research & Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAD, NIH.

Dr. H. Katinger (Purtscher et al., 1994, 1996).

Ziege-anti-Human-Serum

(POD-Konjugat)

ELISA: 1:2000 in PBS/0,05% Tween20

WB: 1:2000 in PBS/0,05% Tween20

Sigma-Aldrich (Deutschland)

Ziege-anti-Ratte-Serum

(POD-Konjugat)

ELISA: 1:2000 in PBS/0,05% Tween20

WB: 1:2000 in PBS/0,05% Tween20

Sigma-Aldrich (Deutschland)

Kaninchen-anti-Ratte-IgG (POD-Konjugat)

ELISA: 1:2000 in PBS/0,05% Tween20

WB: 1:2000 in PBS/0,05% Tween20

Sigma-Aldrich (Deutschland)

Kaninchen-anti-Ratte

(POD-Konjugat)

Epitopmapping: 1:10000 in PBS/0,05% Tween20

DAKO (Großbritannien)

Kaninchen-anti-Ziege

(POD-Konjugat)

Epitopmapping: 1:10000 in PBS/0,05% Tween20

DAKO (Großbritannien)

Kaninchen-anti-human

(POD-Konjugat)

Epitopmapping: 1:10000 in PBS/0,05% Tween20

DAKO (Großbritannien)

Kaninchen-anti-Ziege-IgG-Fc

(FITC-Konjugat)

FACS-Analyse: 0,5µg/ml in PBS/10%FKS

Sigma-Aldrich (Deutschland)

Die verwendeten Peptide wurden von der Firma Jerini Biotools GmbH (Berlin, Deutschland) synthetisiert. Die Peptidsets wurden vom NIH (National Institutes of Health, AIDS Research and Reference Reagent Program) zur Verfügung gestellt.

Peptid

Aminosäuresequenz

PERV-E1

ALITGPQQLEKGLSC

PERV-E2

CREADQGWFEGWFNR

PERV-E1-Cys

AALITGPQQLEKGLSNLHRICKKK

PERV-E2-Cys

KKKCCREREADQGWFEGWFNRSPWM

PERV-ISU

LQNRRGLDLLFLKEGGLC

HIV-E1

LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSC

HIV-E2

CNEQELLELDKWASLWNWFDITNWL

DP178

YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

(Wild et al., 1994)

HIV-ISU

KQLQARILAVERYLKDQQL

6342-Mut1

AAAATLTVQARLLLS

6342-Mut2

AASVAATVQARLLLS

6342-Mut3

AASVTLAAQARLLLS

6342-Mut4

AASVTLTVAARLLLS

6342-Mut5

AASVTLTVQAAALLS

Peptidset

Katalognummer

HIV-1 MN Env (15-mer) Peptide, Komplettset

NIH-6451

HIV-1 HXB2 GAG (15-mer) Peptide, Komplettset

NIH-5107

Die für diese Arbeit verwendeten Oligonukleotide (Primer) zur spezifischen Amplifikation von DNA-Fragmenten durch PCR wurden von der Firma Sigma-Genosys (Steinheim, Deutschland) hergestellt und HPLC-gereinigt.

Fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide (Sonden) zur Quantifizierung der Provirusintegration mittels Realtime-PCR wurden von der Firma TIB MOLBIOL (Berlin, Deutschland) synthetisiert. Als Donorfluorophor wurde am 5´- Ende FAM (6-Carboxyfluoreszein), als Akzeptorfluorophor am 3`-Ende DDQ (Dabcyl- Dark Quencher) gekoppelt.

Die Sequenzen der verwendeten Primer und Sonden sind im Folgenden aufgeführt:

HIV-Realtime-PCR: (Cassols et al. 1991) 157-160

For:

5´GGARCAGCIGGAAGCACIATGG (SK68i)

Rev:

5´CCCCAGACIGTGAGITICAACA (SK69i)

Sonde:

5´- 6Fam-TGACGCTGACGGTACAGGCCAGAC-DDQ

HIV-Pol-PCR:

For:

5´TCTTAGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGG

Rev:

5´AACGACAAAGGTGAGTATCCCTGCCTAA

HIV-gp41 Klonierung:

For:

5´CGGGATCCGGAGCATCAGTAACGCTGACGGTACAAGCGAGACAGCTGCTGAGTGATATTG

Rev:

5´CGCTCGAGCTAATACCACAGCCAATTTGTTATGTTGAACCAGTTCCAAAGCGACGCCCA

PERV-Realtime-PCR:

For:

5´TCCAGGGCTCATAATTTGTC

Rev:

5´TGATGGCCATCCAACATCGA

Sonde:

5´- 6Fam-AGAAGGGACCTTGGCAGACTTTCT-DDQ

PERV-Pol-PCR:

For:

5´GTA CGT ACG TGG ATC CCT AAT CAC AGG ACC GCA ACA

Rev:

5´ACG TAC GTA CGA ATT CTC AGT TGA ACC ATC CTT AAA ACC

PERVp15E Klonierung:

For:

5´GTA CGT ACG TGG ATC CCT AAT CAC AGG ACC GCA ACA

Rev:

5´ACG TAC GTA CGA ATT CTC AGT TGA ACC ATC CTT AAA ACC A

T7 prom:

5´TAATACGACTCACTATAGGG

T7 term:

5´TTATAGCAAAATCCTTTC

Für die Durchführung gentechnischer Arbeiten (Klonierung, Expression von Proteinen und Mutagenese) wurden die kommerziell erhältlichen Escherichia coli Stämme Top10 und BL21-CodonPlus verwendet.

Bakterien:

Top10 F´(Stratagene, Amsterdam, Niederlande): E. coli (F´(laclq, Tn10(TetR)) mcrA ∆(mrrhsdRMS-mcrBC) Φ80 lacZ∆m15 ∆lacX74 deoR recA1 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1nupG)

BL21-CodonPlus(DE3)-RP (Stratagene, Amsterdam, Niederlande): E. coli B F- ompThsdS (rB- mB) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU proL Camr)

Plasmide:

Zur IPTG-induzierten Expression rekombinanter Proteine wurde der pCal-n-Flag-Vektor der Firma Stratagene verwendet (#204302; Stratagene, Amsterdam, Niederlande). Das Expressionsprodukt ist mit einem Fusionsprotein (calmodulin binding peptide, CBP) versehen, über das eine affinitätschromatographische Isolation ermöglicht wird. CBP kann durch proteolytischen Verdau mit Thrombin vom Zielprotein abgespalten werden.

Der pCal-n-Flag-Vektor ist mit einem Markergen ausgestattet, welches die Ampicillinresistenz (Amp^R) codiert und die Selektion von positiven Transformanden ermöglicht.

Die Bakterienzellen wurden auf Luria-Bertani-Agarplatten bzw. als Schüttelkultur in Luria-Bertani-Medium bei 37°C/225rpm kultiviert. Zur Selektion plasmidtragender Transformanden wurde ein entsprechendes Antibiotikum zugegeben (Ampicillin 100µg/ml). Im Folgenden wird Luria-Bertani mit LB und Ampicillin mit Amp abgekürzt.

Zur Kultivierung der Mikroorganismen wurden LB-Medium bzw. LB-Agar-Platten, gegebenenfalls unter Zugabe eines entsprechenden Selektionsantibiotikums eingesetzt.

LB-Medium:

(pH 7,5)

Trypton

Hefeextrakt

NaCl

1,0 % (w/v)

0,5 % (w/v)

0,5 % (w/v)

LB Agarplatten:

Trypton

Hefeextrakt

NaCl

Agar-Agar

1,0 % (w/v)

0,5 % (w/v)

0,5 % (w/v)

1,2 % (w/v)

Das Medium wurde autoklaviert, die LB-Platten unter sterilen Bedingungen gegossen und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Um Ampicillin-Stammlösungen herzustellen, wurden 100mg/ml Ampicillin in bidestilierten Wasser gelöst, sterilfiltriert, aliquotiert und lichtgeschützt bei –20 °C gelagert.

Durch Transformation kann Plasmid-DNA in elektro- oder chemokompetente Bakterienzellen eingebracht werden (Cohen et al., 1972). In dieser Arbeit wurden ausschließlich chemokompetente Zellen verwendet.

Um chemokompetente Zellen herzustellen, wurden die Bakterien aus der logarithmischen Wachstumsphase einer Behandlung mit speziellen Transformationspuffern unterzogen. Der hohe Gehalt an Calcium-Ionen (Ca²⁺) in diesen Puffern führt dazu, dass die bakterielle Plasmamembran für fremde DNA durchlässig wird (Darnel et al., 1994).

Die Herstellung chemokompetenter Bakterien erfolgte nach den Angaben im QIAexpressionist (Qiagen, 3.Auflage, 1997, S.30). Die Zellsuspension wurde in 1,5ml Reaktionsgefäße aliquotiert (je 200µl). Die Lagerung der in flüssigem Stickstoff schockgefrorenen Aliquote erfolgte bei –80°C.

Zur Übertragung der DNA wurde ein Aliquot chemokompetenter Bakterienzellen auf Eis aufgetaut, vorsichtig resuspendiert und 95µl der Zellsuspension mit 5µl des Ligierungsansatzes vermischt. Der Ansatz wurde 30min auf Eis inkubiert und anschließend bei 42°C für 90s einem Hitzeschock ausgesetzt. Anschließend wurde für weitere 3min auf Eis inkubiert, 500µl LB-Medium zugegeben und für 45min bei 37°C geschüttelt. Die Zellsuspension wurde 3min bei 3000xg zentrifugiert, der Überstand dekantiert, die Zellen mit dem verbliebenen Medium resuspendiert und auf LB+Amp Platten ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht bebrütet.

Für eine Vorkultur wurden 6ml LB+Amp mit einer Bakterienkolonie oder 4µl einer Glycerindauerkultur angeimpft und bei 37°C in einem Inkubationsschüttler bei 37°C über Nacht geschüttelt.

Um E. coli-Stämme bzw. Bakterienzellen eines Klones zu konservieren, wurden Glycerindauerkulturen angelegt. Dafür wurden in einem 1,5ml Eppendorfreaktionsgefäß 450µl einer Vorkultur mit 900µl Glycerin vermischt und bei –20°C gelagert.

Proteinkonzentrationsbestimmung 

Die Bestimmung der Proteinkonzentration von Lösungen erfolgte nach der klassischen Bradfordmethode oder durch eine Biuretreaktion (BCA Protein Assay, Pierce, Bonn, Deutschland). Während die Bradfordreaktion auf der Komplexierung der Proteine mit einen Farbstoff (Coomassie Blue R250, BioRad, München, Deutschland) und der damit verbundenen Verschiebung des Absorptionsspektrums basiert, nutzt der BCA-Assay das Reduktionpotential der Aminosäuren Cystein, Cystin, Tyrosin und Tryptophan. Durch die Chelatisierung einwertiger Kupferionen mit je 2 Molekülen Bichinoninsäure (BCA) kommt es zu einer Biuretreaktion. Der Komplex hat sein Absorptionsmaximum bei 562nm. Das Ansetzen der Lösungen sowie die Durchführung des Tests erfolgte nach Angaben des Herstellers.

Die Bestimmung der Absorption zur Erstellung einer Eichgeraden sowie des Proteingehaltes einer Probe erfolgte durch dreifache Bestimmungen.

Trennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Trennung von Proteingemischen nach dem Molekulargewicht erfolgte durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Laemmli, et al., 1970, Schägger und Jagow, 1988). Die Proben wurden zuvor 1:1 in 2ixiProbenauftragspuffer (50mM Tris/12% (v/v), Glycerin/4% (w/v), SDS/5% (v/v), β-Mercaptoethanol/0,01% (w/v) Coomassie Blue G250 (Biorad, Hercules, USA)) aufgenommen, 3min bei 95°C denaturiert und unlösliches Material bei 10⁴xg 5min abzentrifugiert. Es wurden je nach Molekulargewicht des zu trennenden Proteins 10; 12,5 und 16%ige Polyacrylamidtrenngele (88 x 55 x 0,75 mm) mit 4%igen Sammelgelen (10mm) eingesetzt. Die Auftrennung erfolgte zunächst bei 100-125V (Sammelgel), dann bei 125-175V (Trenngel) in der Gelapparatur Mini Protean II der Firma BioRad.

Die Zusammensetzung der Gele und verwendeten Puffer ist im Folgenden dargestellt:

Acryamid (%)

4%

10%

12%

14%

16%

Gelpuffer

1ml

2,5ml

2,5ml

2,5ml

2,5ml

Acyl/Bisacryamid-Lsg.

0,4ml

2,5ml

3ml

3,5ml

4ml

ddH2O

1,6ml

2,5ml

2ml

1,5ml

1ml

APS (10%)

50µl

50µl

50µl

50µl

50µl

TEMED

5µl

5µl

5µl

5µl

5µl

Gelpuffer:

0,1M Tris/0,3% (w/v) SDS /pH 8,4

TEMED:

N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine, USB, Cleveland, USA

Acyl/Bisacryamid:

37,5:1 (30%), Rotiphorese Gel30, Roth Karslruhe, Deutschland

Kathodenpuffer:

0,1M Tris/ 0,1M Tricin/ 0,1% (w/v) SDS/pH 8,25

Anodenpuffer :

0,2M Tris/ pH 8,9

Entfärbe-Lösung:

10%(v/v) Essigsäure/25%(v/v) Methanol in ddH₂O

Färbelösung:

0,1 % (w/v Coomassie R250/10 % (v/v) Trichloressigsäure/

50 % (v/v) Methanol

Isolierung PERV-p15E-spezifischer Antikörper durch Affinitätschromatographie

Zur immunologischen Analyse (Western Blot/ ELISA/ FACS/ Immunfluoreszenz/ Epitopkartierung) p15E-spezifischer Antikörper wurden neben dem entsprechenden Immunserum auch aus dem Serum isolierte spezifische Antikörper eingesetzt. Bei besonders sensitiven Analyseverfahren, wie FACS, Epitopkartierung und Immunfluoreszenz können so störende Kreuzreaktionen vermieden und besser interpretierbare Ergebnisse erzielt werden. Durch den Einsatz isolierter Antikörper im Neutralisationsassay wurde der Beweis der antikörperabhängigen Neutralisation erbracht und antivirale Wirkung der Seren durch Cytokine oder Chemokine ausgeschlossen. Die p15E-spezifischen Antikörper wurden durch Isolierung aus Ziegenserum (Ziege20) mittels Affinitätschromatographie gewonnen.

Das Serum (ca. 15ml) wurde mit einem Glasstab homogenisiert und unter Eiskühlung trop-fenweise mit 4M (NH₄)₂SO₄-Lösung (pH 8,0) im Verhältnis 1:1 versetzt und eine Stunde bei 4°C gerührt. Die so ausgefällten Proteine wurden bei 4°C/3000xg 10min pelletiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet in 0,9%iger NaCl (w/v) Lösung (2/3 des Ausgangsvolumen) gelöst. Nach erneuter Fällung wurde das Pellet in 1/3 des Ausgangsvolumens aufgenommen und gegen Chromatographiepuffer (20mM Na₂HPO₄, 500mM NaCl, pH 7,0) dialysiert bis die Proteinlösung klar war.

Zur Herstellung der Affinitätssäule wurde CH-Sepharose 4B der Firma Pharmacia verwandt. Die Aktivierung der Sepharose, die Kopplung mit gereinigten p15E sowie das Blockieren, Waschen und die Lagerung der Säule erfolgte nach Herstellerangaben. Das Säulenvolumen betrug 6ml.

Die Säule wurde gegen Chromatographiepuffer äquilibriert und dann wurde die Proteinlösung (ca. 10ml) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5ml/h aufgetragen. Nach Auftrag des Serums wurde die Säule mit Chromatographiepuffer solange gewaschen bis die Proteinkonzentration im Durchfluss unter 5µg/ml lag. Danach erfolgte die Elution mit 15ml 0,1M Glycin/HCl (pH 2,7) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10ml/h. Das Eluat wurde in 10 Fraktionen á 2ml gesammelt, wobei in die Reagenzgläser je 200µl einer 300mM Tris (pH 9,0)-Lösung vorgelegt wurde, um das Eluat sofort zu neutralisieren.

Nach der Elution wurde die Säule sofort mit zweimal 1ml 300mM Tris-Lösung neutralisiert (20ml/h) und mit 0,02 % Natriumazid (w/v) in Chromatographiepuffer äquilibriert.

Die einzelnen Fraktionen wurden im Bradford-Proteinbestimmungsassay und im ELISA getestet.

IgG-Isolierung durch ProteinG-Chromatographie

Gegen das Transmembranprotein von HIV-1 (gp41) gerichtete Antikörper konnten nicht über eine spezifische Antigen-Affinitätschromatographie aus Seren isoliert werden, da das gp41 in wässrigen Lösungen präzipitierte, was eine Kopplung an Sepharose unmöglich macht. Um IgG´s von restlichen Serumsbestandteilen abzutrennen wurde ein Montage^® Antibody Purification Kit (Millipore, Billerica, USA) verwendet. Die Aufreinigung erfolgte nach Herstellerprotokoll. Diese Methode erlaubt eine schnelle und einfache Isolation von Immunglobulinen der Klasse G, wobei allerdings speziesabhängig nicht alle Subklassen isoliert werden können. Bei Anwendung dieser Methode muss damit gerechnet werden, dass neben anderen Immunglobulinen (wie z.B. IgM oder IgA) auch antigenspezifische IgG verloren gehen.

Epitopkartierung 

Zur Identifizierung der Antikörperbindungsstellen (Epitopkartierung) innerhalb eines bekannten Antigens wurden Pepspot-Membranen (Jerini, Berlin, Deutschland), die aus jeweils um 13 Aminosäuren überlappenden 15meren Peptiden bestand, verwendet. Diese Peptide wurden in Form von „PepSpots“ auf einer Zellulosemembran immobilisiert. Die verwendeten Peptide wurden kovalent über den C-Terminus an die Membran gekoppelt und sind N-terminal mit einem Acetylrest als Schutzgruppe versehen.

In der vorliegenden Arbeit wurden Membranen verwendet, die die Aminosäuresequenz der Transmembranproteine des HIV-1 IIIB (gp41) und PERV A (p15E) repräsentieren. Die Inkubation der zu untersuchenden Seren bzw. Antikörper erfolgte nach Herstellerangaben. Die Seren wurden 1:500 in Blockierungspuffer verdünnt, als Kontrolle wurde das jeweilige Präimmunserum verwendet.

Western Blot Analyse

Die immunologische Analyse der durch SDS-PAA-Gelelektrophorese massenabhängig aufgetrennten Proteine erfolgte mittels Western Blot (Towbin et al., 1989). Durch diese Technik können sehr spezifisch geringe Mengen (< 2 ng) eines bestimmten Proteins nachgewiesen werden.

In dieser Arbeit wurde das Semidry-Blotting-Verfahren (Biorad Trans-Blot SD^®, Semi-Dry Transfer Cell, Biorad, Hercules, USA) eingesetzt. Die Proteine wurden bei 12V/45min auf eine PVDF-Membran (Polyvinyldifluorid, 0,2µm, Millipore, Billerica, USA) geblottet. Um unspezifische Bindungen zu minimieren wurde die geblottete Membran 2h bei RT geblockt (10% FKS in PBS). Die Inkubation mit dem primären Antikörper (primäres Antiserum bzw. Präimmunserum in einer Verdünnung von 1:100 bis 1:1000, monoklonale Antikörper 0,3µg/ml) erfolgte über Nacht bei 4°C in Blockierungspuffer. Nach dreimaligen Waschen (je 10min in 50ml PBS/0,05% Tween20/pH 7,4) wurde die Membran für 2h/RT mit einen Primärantikörper-spezifischen, POD-konjugierten Detektionsantikörper (siehe 2.3.) inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen (w.o.) entfernt und die Membran für 10min in 50ml einer 25mM Tris-Lösung (pH 8,0) geschwenkt. Anschließend erfolgte die Detektion der gebundenen POD-Konjugate durch eine DAB-Substratlösung (25mM Tris/ 0,5mg/ml Diaminobenzidin (DAB/0,05% H₂O₂). Die Entwicklung wurde solange fortgeführt, bis braune Banden zu erkennen waren und dann durch Spülen mit Wasser (bidest.) abgebrochen. Um ein späteres Nachdunkeln des Blots zu verhindern, wurde die Membran dreimal 10min in Wasser (bidest.) gespült. Zur Lagerung wurde die Membran zwischen Filterpapieren getrocknet, in Folie eingeschweißt und lichtgeschützt aufbewahrt. Alle Wasch- und Inkubationsschritte wurden unter leichtem Schütteln auf einem Inkubationsschüttler durchgeführt.

ELISA

Der enzyme linked immuno sorbet assays (ELISA) wurde neben der Western Blot Analyse zur spezifischen Detektion von Antikörpern genutzt. Der Nachweis beruht, wie der Western Blot, auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion, die durch ein Primärantikörper-spezifisches Antikörper-Enzym-Konjugat quantifiziert werden kann.

Im Vergleich zur Western Blot Analyse ermöglicht der ELISA die Titerbestimmung der im Serum enthaltenen bindenden Antikörper sowie die Bestimmung der Avidität (Bindungsenergie eines Antikörpers/Antiserum zu seinem Antigen) monoklonaler Antikörper oder Antiseren zu ihrem Antigen.

Um die Avidität von Seren und Antikörpern zu Peptiden und rekombinanten Proteinen zu vergleichen, wurden zunächst diese Antigene in einem geeigneten Lösungsmittel (10%DMSO in ddH₂O oder ddH₂O) auf eine Nunc Probind™-96-Well-Platte aufgebracht und ü.N. bei 37°C eingedampft. Ungesättigte Bindungsstellen auf der Plattenoberfläche wurden durch einstündige Inkubation mit 200μl Blockierungspuffer/Well (10% FKS in PBS) blockiert. Die Platte wurde in einem Tecan ELISA-Washer mit 300μl Waschpuffer/Well (PBS/0,05% Tween20) dreimal gewaschen. Die Primärseren/-antikörper wurden in geeigneter Konzentration in PBS/0,05% Tween20 (100μl Volumen) mit unterschiedlichen Konzentrationen Harnstoff (0-8M) für 2h bei 37°C inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch drei Waschzyklen entfernt. Das Sekundärantikörper-POD-Konjugat (100μl Volumen) wurde in geeigneter Konzentration (0,2-1μg/ml) in Blockierungspuffer für 2h bei 37°C auf der Platte inkubiert. Ungebundene Sekundärantikörperkonjugate wurden durch fünf Waschzyklen entfernt. Die Platte wurde durch Ausschlagen von allen Flüssigkeitsresten befreit und mit 50μl/well Substratlösung (PBS pH 6,0/ 1mg/ml o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) inkubiert bis eine deutliche Farbreaktion festzustellen war (1-15min). Durch Zugabe von 25μl Tritisol™ (Merck, Darmstadt, Deutschland) wurde die enzymatische Substratumsetzung gestoppt. Die Farbreaktion wurde mit einem Tecan ELISA-Reader Classic (TECAN, Grodig, Östereich) bei 492/620nm quantifiziert. Alle Ansätze wurden in drei oder vier Replikaten gemessen. Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate wurden mit dem Tabellenkalkulations-Programm Microsoft-Excel berechnet.

Zur Bestimmung der Titer spezifischer Antikörper in Seren nach einer Immunisierung wurden die Seren gegen die entsprechenden Präimmunseren ausverdünnt. Der Titer eines Serums entspricht der letzten Verdünnungsstufe, bei der die Absorption signifikant über dem Hintergrund durch das Präimmunserum liegt.

Immunfluoreszenzmikroskopie

Zur spezifischen Detektion viraler Proteine auf der Zelloberfläche oder im Zellinneren wurde die Immunfluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Dazu wurden Zielprotein-spezifische Antikörper mit infizierten und uninfizierten Zellen inkubiert. Um intrazellulär vorliegende Proteine zu detektieren, wurde die Membran mittels Detergenz (Inkubation mit 0,5% Triton in PBS für 15min bei RT) permeabilisiert. Die spezifische Bindung dieser Antikörper wurde mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern (0,5µg/ml FITC-Konjugat, Sigma-Aldrich, Taufenkirchen, Deutschland) detektiert. Wird der Fluoreszenzfarbstoff über eine UV-Lichquelle angeregt, wird Licht einer farbstoffspezifischen Wellenlänge vom Fluorophor-Antikörperkonjugat emittiert, das durch den Einsatz abgestimmter Filter, die die interferierende Wellenlängen ausblenden, sichtbar wird.

PERV-infizierte und naive 293-Zellen wurden auf Objektträgern ausgesät und kultiviert. Die adhärente Kultur wurde nach zwei Tagen mit PBS gespült und in 2%-Formaldehydlösung in PBS für 1h fixiert. Anschließend wurde dreimal je 10min mit PBS gewaschen. Um unspezifische Bindungen der Antikörper zu minimieren, wurde der Objektträger 1h bei Raumtemperatur in Blokierungspuffer inkubiert, bevor das Primärserum (1:1000) bzw. Primärantikörper (1µg/ml, 2h/RT/in Blockierungpuffer) zugegeben wurde. Die Zellen wurden erneut dreimal für je 10min mit PBS gewaschen und anschließend 1h mit FITC-konjugierten Sekundärantikörper in Blockierungspuffer in Dunkelheit inkubiert.

Um den Fluoreszenzfarbstoff zu stabilisieren, wurden die Zellen mit einem Eindeckmittel (Pro Long, Molecular Probes, Leiden, Niederlande) behandelt. Die Fluoreszenzaufnahmen wurden mit einen Nikon Eclipse 300 Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Düsseldorf, Deutschland) gemacht.

Durchfluss-Zytometrie

Zur immunologischen Analyse von Zellen wurde die Durchflusszytometrie (Flow Cytometrie/FACS, fluorescence activated cell sorting) eingesetzt. Die Zellen wurden zuvor mit Fluoreszenz-Farbstoffen spezifisch, über Antikörper-Konjugate markiert, die nach Anregung Licht einer bestimmten Wellenlänge emittieren. Für die in dieser Arbeit durchgeführten FACS-Analysen wurde das FACSCalibur (BD Biosciences, USA) eingesetzt, die Auswertung der Fluoreszenzmessung erfolgte über die mitgelieferte Software.

In den Untersuchungen wurden nicht permeabilisierte Zellen eingesetzt, da die Bindung spezifischer Seren (Ziege 16/20 und gereinigte Antikörper) an das native Transmembranprotein PERV-p15E auf der Zelloberfläche analysiert werden sollte. Dazu wurden 2x10⁶ adhärente Zellen einer PERV-infizierten Kultur mechanisch vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Die Zellen wurden durch mehrmaliges Resuspendieren vereinzelt und dreimal mit je 30ml PBS gewaschen. Zwischen den Waschschritten wurde die Zellsuspension bei 500xg 10min pelletiert und der Überstand verworfen. Um unspezifische Bindungen der Antikörper zu unterbinden, wurden die Zellen in 30ml Blockierungspuffer (PBS mit 10% FKS) inkubiert. Die blockierten Zellen wurden pelletiert (w.o.) und das Pellet in 30ml der Primärantikörperlösung (Seren 1:2000/gereinigte Antikörper 100µg/ml in Blockierungspuffer verdünnt) aufgenommen und 60min leicht schüttelnd auf Eis inkubiert. Die Zellsuspension wurde pelletiert und fünfmal mit eiskaltem PBS gewaschen (w.o.). Die Inkubation der Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sekundärantikörper (Kaninchen-anti-Ziege-IgG-Fc-FITC-Konjugat, 0,5µg/ml in Blockierungspuffer, siehe 2.3.) erfolgte in Dunkelheit (w.o.). Nach weiteren fünf Waschschritten wurde das Pellet in einer 2%igen Formaldehydlösung (v/v) aufgenommen und fein resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde direkt im Zytometer analysiert.

Kopplung von synthetischen Peptiden an Trägermoleküle

Um eine gesteigerte Immunogenität durch Multimerisierung von synthetischen Peptiden zu erreichen, wurden verschiedene Kopplungsmethoden eingesetzt:

• Kopplung an KLH und BSA
  Die Kopplung von Peptiden an Trägerproteine wie BSA oder KLH erfolgte unter Verwendung eines reaktiven Carbodiimd-Linkers (EDC, 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid, Pierce, Bonn, Deutschland). Durch die Reaktion mit den Carboxylgruppen der Peptide bildet EDC ein reaktives Zwischenprodukt, das mit den primären Aminen eine kovalente Amidbindung eingehen kann.Die Kopplung erfolgte nach Angaben des Herstellers. Es wurden 2mg der synthetischen Peptide (4mg/ml) mit 1mg des Trägerproteins (5mg/ml) gekoppelt, was etwa einem 30fachen molaren Überschuss an synthetischen Peptiden darstellt.

• Kopplung an Dextran
  Neben BSA oder KLH wurde als Trägermolekül ein Polysaccharid (Dextran6, Sigma, Taufenkirchen, Deutschland) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6kDa verwendet. Vorteil von Polysacchariden als Trägermolekülen, ist dass diese alleine nicht immunogen sind und sich dadurch die Immunantwort hauptsächlich gegen das gekoppelte Peptid richtet. Die Konjugation erfolgte über die α- oder ε-Aminogruppen der Peptide an durch NaIO₄-Behandlung aktiviertes Dextran6. Die Kopplung von 4mg Dextran mit 8mg Peptid erfolgte nach Böcher et al. (1992).
  Die Kopplung von Peptiden über primäre Aminogruppen ist zwar eine relativ einfache und effektive Methode zur Herstellung von Peptid-Dextran-Konjugaten, jedoch kann so nur ein heterogenes Kopplungsprodukt erhalten werden. Je nach Anzahl der im Peptid enthaltenen primären Aminogruppen vergrößert sich die Anzahl der möglichen Produkte und die Wahrscheinlichkeit von Quervernetzungen zwischen den Molekülen. Eine zielgerichtete und definierte Bindung des Peptids an das Trägermolekül ermöglicht der Einsatz von bifunktionalen Linkern, wie 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid (PDPH). Dieser verbindet eine Sulfohydrylgruppen (die z.B. durch Cystein in das Peptid eingefügt wurde) des Peptids mit einer Carbonylgruppe des Dextrans (Hermanson et al., 1996). Vorausgesetzt, es ist nur eine schwefelhaltige Aminosäure vorhanden, kann so nur ein einziges Produkt entstehen. Die Vernetzung von Dextranmolekülen ist nicht möglich. Die Kopplung von 4mg Dextran mit 8mg Peptid erfolgte nach Zara et al. (1991).

• Vernetzung von Cystein-flankierten Peptiden zu Di- und Trimeren
  Die Peptide sollten über die endständigen Cysteine unter Ausbildung einer Disulfidbrücke oxidiert werden und damit Di-bzw. Trimere ausbilden. Die Ausbildung von Trimeren sollte durch das Einfügen eines zweiten endständigen Cysteins in eines der beiden zu koppelnden Peptide ermöglicht werden. Die Peptide wurden in bidestillierten Wasser in einem Glasgefäß gelöst und durch Zugabe von reinem Ammoniak auf einen pH 8.5 eingestellt. Im basischen Milieu dissoziieren Protonen von den Sulhydrylgruppen, dadurch wird der Schwefel reaktiv. Mit Hilfe einer Pipette wurde Luft (gasförmiger Sauerstoff) in die Lösung eingeblasen. Die Oxidation wurde über SDS-PAGE und Western Blot Analyse kontrolliert.

Die Kopplungsprodukte wurden ü.N. gegen PBS dialysiert, um ungekoppelte Peptide, Trägermoleküle und Kopplungschemikalien zu entfernen. Die Konjugate wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot Analyse charakterisiert. Die Ausbeuten an gekoppelten Peptiden wurden durch BCA-Proteinkonzentrationsbestimmungsassays bestimmt (siehe 2.14.1).

Herstellung von Acetonpuder aus Bakterienlysat

Die für immunchemische Analysen verwendeten Seren enthalten neben spezifischen Antikörpern auch Immunglobuline, die eine Affinität zu verschiedenen E. coli-Proteinen besitzen. Um dadurch bedingte unspezifische Signale zu unterbinden, wurden diese Immunglobuline vor der Primärantikörperinkubation durch Bindung und Ausfällung an E. coli-Proteine in Form von Acetonpuder entfernt.

Zur Herstellung des Acetonpuders wurden 200ml einer induzierten und mit dem Leervector transformierten BL 21 E. coli-Kultur mit 3000xg abzentrifugiert und das Zellsediment in 3ml PBS resuspendiert. Danach wurden die Bakterien durch 5 Ultraschallimpulse (á 15s) auf Eis lysiert und die Proteine durch Zugabe von 12ml Aceton (-20°C) für 30 min präzipitiert. Das Präzipitat wurde abzentrifugiert (10min/3000 x g) und in 3ml frischem Aceton resuspendiert. Es wurde erneut zentrifugiert (w.o.) und der Überstand dekantiert. Das Proteinpellet wurde getrocknet und fein zermahlen.

Zur Adsorption wurde die Primärantikörperlösung mit 6mg/ml Acetonpuder versetzt und 60min bei 4°C leicht schüttelnd inkubiert. Danach wurde die Lösung zentrifugiert (w.o.) und der Überstand als Primärantikörperlösung im Western Blot bzw. im ELISA verwendet.

Dichtegradientenzentrifugation

Um Viren aus Zellkulturüberständen zu konzentrieren und von Zell- und Mediumbestandteilen zu separieren, wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Zur Vorreinigung und Konzentration wurden die Zellkulturüberstände 3h bei 10⁶xg durch ein 22%iges Saccharosekissen zentrifugiert (Rotor SW28, Beckman-Coulter CU-L8-70 Ultrazentrifuge). Dazu wurde 4ml einer 22%igen Saccharoselösung in ein Zentrifugenröhrchen (Beckman Ultra-Clear 25x89mm) vorgelegt und vorsichtig mit 28ml Virusüberstand überschichtet. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und das Viruspellet ü.N. in 0,5ml TSE bei 4°C gelöst. Die gelösten Pellets von 6 Röhrchen wurden vereinigt und auf einen vorbereiteten Saccharosegradienten (15-65% in einem Beckman Ultra-Clear 10x89mm-Zentrifugenröhrchen) geschichtet. Der Gradient wurde aus einer 15%igen und einer 65%igen Saccharoselösung mit Hilfe eines Gradientenmischers (Biorad, Hercules, USA) hergestellt. Retroviren banden bei einer Dichte von 1,1663 g/cm³ (38% Sucrose). Nach 4stündiger Zentrifugation bei 10⁶xg (Rotor SW41, Beckman-Coulter) bildet sich bei dieser Dichte ein weißer Ring, der vorsichtig mit einer Kanüle durch seitliches Einstechen abgenommen wurde. Die Dichte der entnommenen Fraktionen wurde in einem Refraktometer bestimmt. Der Virusgehalt wurde durch Bestimmung der Aktivität der reversen Transkriptase und durch Western Blot Analyse bestimmt.

Quantifizierung der reversen Transkriptase

Durch Bestimmung der RT-Aktivität (reverse Transkriptase) einer Probe kann die produktive Infektion einer Zellkultur oder eines Organismus durch Retroviren nachgewiesen und quantifiziert werden. Die RT ist ein nur in Retroviren vorkommendes Enzym, das die Synthese der proviralen DNA katalysiert

Die Quantifizierung der RT-Aktivität erfolgte mit Hilfe des kommerziellen HS-Kit Mg²⁺ (Cavidi Tech AB, Upsala, Schweden), die Proben wurden als Triplikate bestimmt, die Messung der Farbreaktion erfolgte im Tecan ELISA-Reader Classic (TECAN, Grodig, Östereich), die Auswertung der Messergebnisse erfolgte mit Hilfe des Tabellenkalkulationsprogramms Excel (Microsoft). Es wurde nach dem „über Nacht-Protokoll“ des Herstellers verfahren.

Die RT-Aktivität von Überständen infizierter Zelllinien wurde immer mit der von Überständen der naiven Zellen verglichen, da diese oft mit Segementen eines retroviralen Genoms transformiert sind (z.B. C8166 mit einem defektem HTLV-II-Genom), was zu einem falschpositiven Ergebnis führen kann.

Versuchstiere

Zur Immunisierung wurden 8-12 Wochen alte, weibliche Wistar-Ratten vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR, Berlin, Deutschland) verwendet. Die Tiere wurden in der Tierversuchsabteilung des Robert Koch Instituts gehalten. Die Ziegen wurden in der Tierversuchsanstalt des BfR, Berlin-Marienfelde gehalten.

Applikation des Antigens

Das Antigen wurde in PBS aufgenommen und 1:1 mit Freund´s Adjuvant (Pierce, Bonn, Deutschland) vermischt und durch mehrmaliges Resuspendieren durch eine 0,6mm Kanüle (BD, Heidelberg, Deutschland) emulgiert.

Die Immunisierung der Ratten erfolgte intramuskulär (je 250µl in die Muskulatur der Hinterläufe) und subcutan (500µl unter das Nackenfell), die Immunisierung der Ziegen intramuskulär (je 500µl in die Muskulatur der Hinterläufe) mit 0,5mg Antigen in 1ml Emulsion. Der Boost erfolgte nach 21 Tagen nach gleichem Applikationsschema.

Blutabnahme und Serumgewinnung

Die Blutentnahme bei Ratten (ca. 1,5ml) erfolgte durch retrobulbäre Punktion unter Inhalationsnarkose durch Isofluran (Cuarmed, Karlsruhe, Deutschland), bei Ziegen (ca. 50ml) aus der Halsvene. Nach einwöchiger Akklimatisierungsphase wurde Präimmunblut, 21 Tage nach der Boostimmunisierung Immunblut entnommen. Weitere Blutungen erfolgten je nach Bedarf, aber maximal im 14-tägigen Abstand.

Das Blut wurde 30min bei 20°C und danach 15h bei 4°C gelagert. Nach dieser Zeit wurde das entstandene Koagulat 15min bei 40000xg pelletiert, der Serumsüberstand abgenommen, aliquotiert und bei -20°C gelagert.

Verwendete Zellen, Medien und Viren

Zellen:

C8166:

Humane T-Zelllinie mit defektem HTLV-II-Genom (AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH; R. Gallo (Salahuddin et al., 1983))

293:

Humane embryonale Nierenzelllinie (ATCC, Manassas, VA, USA)

Medien und Zusätze:

RPMI (für C8166)

(Invitrogen, Leek, Niederlande)

10%(v/v) FKS

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

2% (v/v) L-Glutamin-Lösung (200mM)

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

1,5% (v/v) HEPES (1M)

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

10⁴ U/ml Penicillin

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

10 mg/ml Streptomycin

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

RPMI (für 293)

(Invitrogen, Leek, Niederlande)

10%(v/v) FKS

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

2% (v/v) L-Glutamin-Lösung (200mM)

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

1% (v/v) HEPES (1M)

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

10⁴ U/ml Penicillin

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

10 mg/ml Streptomycin

(Biochrom, Berlin, Deutschland)

Viren

HIV-1 IIIB

(zur Verfügung gestellt von Dr. C. Kücherer, Robert Koch-Institut)

PERV/5°

(Specke et al., 2001)

Einfrieren und Auftauen von Zellen

Die langfristige Lagerung von Zellen erfolgte in flüssigem Stickstoff bei -196°C. Um die Zerstörung der Zellen durch Bildung von Eiskristallen zu minimieren, wurden diese in speziellen Einfriermedium (90% FKS, 10% DMSO) inkubiert.

Die Zellen wurden resuspendiert und 10min bei 10³xg pelletiert. Das Zellpellet wurde in sterilem Einfriermedium aufgenommen, resuspendiert und je 1ml der Suspension in sterile Kryoröhrchen überführt. Um einen schonenden Einfrierprozess zu gewährleisten, wurden die Röhrchen in Zellstoff gewickelt und in einer verschlossenen Styroporbox 16h bei -80°C gelagert. Im Anschluss wurden die Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff überführt.

Anlegen von Virusstocks

Um eine gute Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der verschiedenen Versuche gewährleisten zu können, wurden in allen Infektionsversuchen einheitliche Virusstocks eingesetzt. Titrierte Virusüberstände wurden in Kryoröhrchen in 1ml Aliquots in flüssigem Stickstoff bis zu ihrer Verwendung gelagert.

Die Berechnung der TCID₅₀/ml wurde nach folgender Formel durchgeführt:

HIV-1 IIIB Stocks:

Zum Anlegen von HIV-Überständen wurde eine frisch passagierte C8166-Kultur (1:5 aus einer dicht gewachsenen Kultur) in einer T175-Zellkulturflasche (TPP, Midwest Scientific St. Louis, MO, USA) mit 1x10⁴ TCID₅₀ HIV-IIIB infiziert und bei 37°C, 95% Luftfeuchte und 5%CO₂ inkubiert. Nach 72h wurde die Kultur in 50ml Röhrchen überführt und bei 750xg pelletiert. Der Überstand wurde filtriert (0,45µm) und in 1ml Portionen bei -196°C bis zur Verwendung gelagert. Zur Bestimmung der im Überstand enthaltenen infektiösen Partikel (TCID₅₀) wurde ein Aliquot aufgetaut und auf C8166 titriert. Nach 72h Inkubation wurde die HIV-Provirusintegration über eine Pol-spezifische PCR nachgewiesen (siehe 2.13.7.).

PERV-5° Stocks:

PERV-5°-Überstände wurden von einer konvluenten gewachsenen, infizierten 293-Kultur entnommen. Aufbereitung und Lagerung erfolgte analog zur Behandlung der HIV-Überstände (siehe oben). Die Titration der Überstände zur Bestimmung der TCID₅₀ erfolgte auf uninfizierten 293-Zellen. Der Nachweis der Provirusintegration erfolgte wie unter 2.13.7. beschrieben.

Neutralisationsassay PERV

Zum Nachweis der PERV-neutralisierenden Aktivität induzierter Seren wurde ein in-vitro-Neutralisationstest etabliert. Dieser Test basiert auf dem Nachweis der PERV-Provirusintegration nach 9-tägiger Inkubation uninfizierter 293-Zellen mit PERV-Überständen in Anwesenheit von Medium, Präimmunserum und Immunserum, durch PCR mit PERV-Pol-spezifischen Primern (PK1/6, siehe 2.5.).

Dazu wurden pro Well 3x10³ uninfizierte 293-Zellen in 100µl Medium in einer sterilen 96-Well-Flachbodenplatte (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) ausgesät. Nach 24stündiger Inkubation im Zellkulturbrutschrank wurde das Medium abgenommen, dabei wurde darauf geachtet, dass die adhärenten 293-Zellen nicht durch Kratzen auf dem Boden oder zu starken Sog abgelöst wurden. In einer zweiten Platte wurden vorher 100µl PERV-5°-Virusstock in einer 1:2 Verdünnung ausverdünnt und mit 100µl vorverdünnten Serum (1:10 bzw. 1:20 Verdünnung im Well) gemischt und bei 37° für 45min im Brutschrank inkubiert. Die verwendeten Seren wurden zuvor durch 30min Inkubation bei 56°C dekomplementiert. Die mit den Seren vorinkubierten Überstände wurden dann auf die Zellen pipettiert. Am Tag drei und sechs wurden die Überstände abgenommen, mit 200µl PBS “ohne“ gespült, mit 50µl einer 0,25%igen Trypsinlösung von der Platte gelöst und durch mehrmaliges Resuspendieren in 150µl frischem Medium vereinzelt. 100µl der Zellsuspension wurden verworfen und zu den verbleibenden Zellen 150µl frisches Medium gegeben. Am Tag neun nach der Infektion wurden die Überstände abgenommen und die Zellen lysiert. Die Lyse der Zellen erfolgte durch dreimaliges Einfrieren (-80°C) und Auftauen (56°C). Durch die anschließende dreistündige Inkubation mit 100µl einer Proteinase K-Lösung (Invitrogen, Leek, Niederlande) bei 56°C wurden DNA-assoziierte Proteine enzymatisch abverdaut. Die anschließende Inaktivierung der Proteinase K erfolgte bei 95°C für 30min. Das Zelllysat wurde bis zur Verwendung bei -20°C gelagert oder direkt als Template für die Provirusnachweis-PCR eingesetzt.

Im Verlauf dieser Arbeit wurde zum Nachweis der Provirusintegration ein Realtime Assay etabliert. Spätere Messungen zur Quantifizierung der Provirusintegration erfolgten mit Hilfe dieses Assays. Die Durchführung erfolgte wie oben beschrieben. Durch die hohe Sensitivität und dem Wegfall einer Endpunktbestimmung bei diesem Assay konnte jedoch das Splitten der Zellen und das Ausverdünnen des Virusstocks wegfallen. Die Zellen wurden mit einer TCID₅₀ von 1x10^2,43 /ml inkubiert, die Lyse erfolgte nach 72h. Alle Proben wurden als Triplikate gemessen

Neutralisationsassay HIV

Der Nachweis HIV-neutralisierender Aktivität induzierter Seren erfolgte im Wesentlichen analog zum PERV-Neutralisationsassay (2.16.4.). Seren und monoklonale Antikörper wurden mit einer TCID₅₀ von 1x10³ vorinkubiert (w.o.) und dann 72h mit 5x10⁴ C8166 Zellen (Gesamtvolumen 200µl/well) inkubiert. Die Quantifizierung der Provirusintegration erfolgte durch Realtime PCR.