Funktionelle Analyse der Phytochrome Cph1 und Cph2 von Synechocystis sp. PCC 6803

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologin Brita Fiedler

geboren am 05.11.1973 in Dresden

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter/innen:
1. Prof. Dr. Thomas Börner
2. Prof. Dr. Hendrik Schubert
3. PD Dr. Tilman Lamparter

Tag der mündlichen Prüfung: 17. Dezember 2004

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der beiden cyanobakteriellen Phytochrome Cph1 und Cph2 untersucht. Dafür wurde zunächst das Wachstum von Mutanten mit einem inaktivierten cph1- bzw. cph2-Gen unter verschiedenen Lichtbedingungen analysiert. Das Wachstum aller Phytochrommutanten war unter Starklicht beeinträchtigt. Dahingegen wuchs die cph1 ^--Mutante im FRL schlechter als der Wildtyp, während das Wachstum der cph2 ^--Mutante im RL vermindert war. Eine cph1 ^- /cph2 ^--Doppelmutante zeigte unter allen Lichtbedingungen eine Wachstumsreduktion, die der jeweiligen Einzelmutante ähnlich war. Die genaue Ursache für die Beeinträchtigung des Wachstums der Phytochrommutanten konnte nicht ermittelt werden. Die verschiedenen Aspekte der Photosynthese, wie Pigmentzusammensetzung, maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate und 77K-Fluoreszenzemission, waren in den Phytochrommutanten nicht signifikant verändert.

Bei Synechocystis sp. PCC 6803 konnte eine lichtgerichtete Bewegung beobachtet werden, wobei man aufgrund von Aktionsspektren der Motilität eine Funktion der Phytochrome oder phytochromähnlichen Proteine bei der Steuerung der phototaktischen Bewegung vermutet. Dem Cph1-Protein konnte hierfür keine Rolle zugeordnet werden. Dahingegen scheint der Photorezeptor Cph2 die lichtgerichtete Bewegung der Zellen in Richtung einer Blaulichtquelle zu inhibieren. Eine Interaktion mit einem klassischen BL-Rezeptor konnte ausgeschlossen werden.

Eigene Schlagworte: Phytochrom , Cyanobakterien, Synechocystis sp. PCC 6803, Phototaxis

Abstract

The function of the cyanobacterial phytochromes Cph1 and Cph2 was investigated. At first, the growth of mutants with an inactivated cph1 or cph2 gene was analysed under different light conditions. The growth of all phytochrome mutants was affected under high-light conditions. However, the cph1 ^- mutant grew slower than the wild type in far-red light, whilst the cph2 ^- mutant revealed a reduced growth under red light conditions. A decreased growth of the cph1 ^-/cph2 ^- double mutant was observed under all light conditions with a growth rate similar to the corresponding single mutant. The exact reason for the growth impairment of the phytochrome mutants could not be ascertained. Different aspects of photosynthesis (pigment composition, maximal net-oxygen evolution and 77K fluorescence emission) were not changed significantly in the phytochrome mutants.

Synechocystis sp. PCC 6803 shows a movement towards a light source. Based on action spectra of motility phytochromes and phytochrome-like proteins are supposed to have a function in regulating the phototactic movement. An influence of the Cph1 protein in the phototactic movement was not demonstrated. Whereas, the Cph2 protein seems to be involved in the inhibition of the cell movement towards blue light. An interaction with a typical blue-light receptor was excluded.

Keywords: phytochrome, cyanobacteria, Synechocystis sp. PCC 6803, phototaxis

Inhaltsverzeichnis

• Zusammenfassung
• 1 Einleitung
  • 1.1 Photorezeptoren in Pflanzen
  • 1.2 Die pflanzlichen Phytochrome
    • 1.2.1  Molekulare Eigenschaften des Phytochroms
    • 1.2.2 Intrazelluläre Lokalisation
    • 1.2.3 Signaltransduktionswege
  • 1.3 Die Entdeckung von phytochromähnlichen Proteinen in Synechocystis
    • 1.3.1 Das cyanobakterielle Phytochrom 1 (Cph1)
    • 1.3.2 Das cyanobakterielle Phytochrom 2 (Cph2)
    • 1.3.3 Phytochromähnliche Proteine in Synechocystis
  • 1.4 Die BL-Rezeptoren
  • 1.5 Die lichtinduzierte Motilität
  • 1.6 Zielstellung
• 2 Material und Methoden
  • 2.1 Material
    • 2.1.1 Chemikalien
    • 2.1.2 Radiochemikalien
    • 2.1.3 Enzyme
    • 2.1.4 Nukleinsäuren
    • 2.1.5 Kits
    • 2.1.6 Filter und Membranen
    • 2.1.7 Technische Geräte
    • 2.1.8 Verwendete Bakterienstämme
      • 2.1.8.1  Stämme von Synechocystis
      • 2.1.8.2 Stämme von E. coli
  • 2.2 Methoden
    • 2.2.1  Allgemeine Kultivierungsbedingungen der Mikroorganismen
    • 2.2.2 Konstruktion von Mutanten in Synechocystis
      • 2.2.2.1  Allgemeine Methoden
      • 2.2.2.2 Konstruktion von Mutanten durch ortsgerichteteMutagenese
      • 2.2.2.3 Erstellen einer Mini-Genbank
      • 2.2.2.4 Transformation von Synechocystis
      • 2.2.2.5 Konjugation
    • 2.2.3 Isolation von Nukleinsäuren
      • 2.2.3.1  Isolation der Gesamt-DNA aus Synechocystis
      • 2.2.3.2 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli und Synechocystis
      • 2.2.3.3 Präparation von RNA aus Synechocystis
      • 2.2.3.4 Spektrophotometrische Bestimmung von Nukleinsäure-Konzentrationen
    • 2.2.4 Analyse von Nukleinsäuren
      • 2.2.4.1 DNA-Sequenzierung
      • 2.2.4.2 Markierung von DNA-Sonden
      • 2.2.4.3 Southern-Blot-Analyse
      • 2.2.4.4 Koloniehybridisierung
      • 2.2.4.5 Northern-Blot-Analyse
      • 2.2.4.6 Quantitative real-time RT-PCR
    • 2.2.5 Wachstumsanalyse
      • 2.2.5.1  Kultivierungsbedingungen
      • 2.2.5.2 Berechnung der Wachstumsrate
      • 2.2.5.3 Kompetitionsexperimente
      • 2.2.5.4 Bestimmung von Photosyntheseparametern
        • 2.2.5.4.1 Analyse der Pigmentzusammensetzung
        • 2.2.5.4.2 Bestimmung des Phycocyanin/Chlorophyll a - Verhältnisses
        • 2.2.5.4.3 Aufnahme von 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren
        • 2.2.5.4.4 Messung der Sauerstofffreisetzung
    • 2.2.6 Untersuchung der Phototaxis
      • 2.2.6.1  Phototaxis-Assay
      • 2.2.6.2 Aufnahme eines Aktionsspektrums der BL-gesteuerten Motilität
      • 2.2.6.3 Untersuchung der TypIV-Pili mittels Transmissionselektronenmikroskopie
    • 2.2.7 Computeranwendungen
• 3 Ergebnisse
  • 3.1 Konstruktion der cph1- und der cph2- knockout-Mutante
  • 3.2 Analyse der lichtabhängigen cph 1- und cph 2-Transkription
  • 3.3 Untersuchung des Wachstumsverhaltens
    • 3.3.1 Einfluss verschiedener Lichtbedingungen auf das Wachstum des WTs und der Phytochrommutanten
    • 3.3.2 Kompetitives Wachstum von WT und Phytochrommutanten
    • 3.3.3 Bestimmung von Photosyntheseparametern
      • 3.3.3.1 Pigmentanalyse
      • 3.3.3.2 Messung der maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsraten
      • 3.3.3.3 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren
  • 3.4 Untersuchung der lichtinduzierten Motilität
    • 3.4.1 Motilität unter verschiedenen Lichtbedingungen
      • 3.4.1.1 Der Einfluss der Spektralfarbe auf die Motilität
      • 3.4.1.2 Das phototaktische Verhalten unter bidirektionaler Einstrahlung von Licht
      • 3.4.1.3 Aktionsspektrum der Motilität im blauen Wellenlängenbereich
      • 3.4.1.4 Komplementationsanalyse: Austausch der chromophorbindenden Cysteine von Cph2 durch ortsgerichteteMutagenese
      • 3.4.1.5 Motilität von WT und cph2 ^- in einer Mischkultur
      • 3.4.1.6 Einfluss der externen Zugabe von cAMP und cGMP sowie der Photosyntheseinhibitoren DCMU und DBMIB auf die BL-gesteuerte Motilität
    • 3.4.2 Untersuchungen der TypIV-Pili
      • 3.4.2.1 Northern-Blot-Analyse
      • 3.4.2.2 Elektronenmikroskopische Untersuchung
    • 3.4.3 Untersuchung der Motilität weiterer Photorezeptormutanten
  • 3.5 Analyse der IS-Elemente im Synechocystis–Chromosom
    • 3.5.1  Vergleich des phototaktischen Verhaltens verschiedener WT-Varianten von Synechocystis
    • 3.5.2 Untersuchung der BL-induzierten Motilität ausgewählter Photorezeptormutanten verschiedener WT-Varianten von Synechocystis
    • 3.5.3 Analyse der IS-Elemente über Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)
• 4 Diskussion
  • 4.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der Phytochrommutanten
  • 4.2 Untersuchung von Photosyntheseparametern
  • 4.3 Die Lichtregulation der cph1- und cph2-Transkriptakkumulation
  • 4.4 Die Funktion der Phytochrome Cph1 und Cph2 in der lichtinduzierten Motilität
    • 4.4.1 Aktionsspektrum und BL-Rezeptoren
    • 4.4.2 GAF-Domänen-Analyse
    • 4.4.3 Zwei Photorezeptoren vermitteln die positive Phototaxis in Synechocystis.
    • 4.4.4 Untersuchung der TypIV-Pili
    • 4.4.5 Einfluss von cAMP und cGMP auf die Phototaxis
    • 4.4.6 Weitere Photorezeptoren
  • 4.5 Vergleich verschiedener WT-Varianten und Analyse der IS-Elemente
  • 4.6 Schlussfolgerung und Ausblick
• Abkürzungsverzeichnis
• Literatur
• Publikationsliste
• Danksagung
• Erklärung
• Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

• Tab. 1: Verwendete Plasmide.
• Tab. 2: Für PCR- und Sequenzierungsreaktionen eingesetzte Primer. Die Sequenzen sind in 5’-3’-Richtung angegeben. Die in den mutagenisierenden Primern ausgetauschten Nukleotide sind fett gedruckt und unterstrichen.
• Tab. 3: Bezugsquellen verschiedener WT-Stämme. Diese wurden für die Analyse der IS-Elemente im Synechocystis-Genom sowie für Motilitätsuntersuchungen eingesetzt. Die in dieser Tabelle aufgestellte Nummerierung der WT-Stämme stimmt mit der in Kap. 3.5 des Ergebnisteils überein. Die Nr. 6 entspricht dem WT, der für die Inaktivierung der Gene cph1 und cph2 verwendet wurde.
• Tab. 4: Photorezeptormutanten von Synechocystis. Diese Mutanten waren bereits zu Beginn dieser Arbeit vorhanden.
• Tab. 5: Eichfaktoren für die HPLC-Pigmentbestimmung.
• Tab. 6: Verwendete Photodioden.
• Tab. 7: Interferenzfilter mit Wellenlänge des Transmissionsmaximums und verwendeter Lichtquelle.
• Tab. 8: Liste der verwendeten Computerprogamme und Internetanwendungen.
• Tab. 9: Wachstumsraten (µ) der Phytochrommutanten in Prozent vom WT unter mixotrophen Bedingungen im HL, RL und FRL nach Zugabe von 0,2 % Glukose. In der Tabelle sind Mittelwerte±Standardabweichungen aufgeführt. Die Mittelwerte stammen aus mindestens drei unabhängigen Anzuchtreihen. Die durchschnittlichen Wachstumsraten des WT betrugen 0,025±0,005 h-1 (HL), 0,054±0,010 h-1 (RL) und 0,019±0,003 h-1 (FRL).
• Tab. 10 : Pigmentzusammensetzung von WT und Phytochrommutanten unter den Licht bedingungen HL, RL und FRL. Der Chl-Gehalt sowie das Car/Chl-Verhältnis wurde mittels HPLC bestimmt. Das PC/Chl-Verhältnis wurde aus Gesamtzellspektren berechnet (siehe 2.2.5.4.2). In der Tabelle sind Mittelwerte±Standardabweichungen aufgeführt. In die Berechnung wurden die Analysedaten sowohl Km-resistenter als auch Cm-resistenter cph1 ^- - und cph2 ^- -Mutanten einbezogen. Die Mittelwerte stammen aus mindestens drei unabhängigen Anzuchtreihen.
• Tab. 11: Maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsraten von WT und Phytochrommutanten. Die Kulturen wurden unter HL, RL und FRL angezogen. Die Bestimmung der maximalen Sauerstofffreisetzungsraten erfolgte im WL bei 30 °C (siehe 2.2.5.4.4). Der Mittelwert und die Standardabweichung berechnen sich aus den Daten von fünf (HL) bzw. drei (RL, FRL) unabhängigen Anzuchtreihen. Der Chl-Gehalt wurde mittels HPLC ermittelt.
• Tab. 12: Aktionsspektrum der lichtinduzierten Motilität des WTs in einem Wellenlängenbereich zwischen 370 bis 500 nm. Für die Aufnahme des Aktionsspektrums wurden Interferenzfilter kombiniert mit verschiedenen Lichtquellen eingesetzt. Die Lichtintensität betrug in Abhängigkeit vom Filter 1 bis 3 µmol m-2 s-1.
• Tab. 13: Übersicht über die Konstrukte zur Inaktivierung von Genen weiterer potentieller BL-Rezeptoren.
• Tab. 14: Phototaktisches Verhalten von pixJ1-, bluf-, cry- und lov- sowie der Doppelmutanten im GL, RL und FRL.
• Tab. 15: Phototaktisches Verhalten von Mutanten mit einem inaktivierten phytochromähnlichen Protein unter verschiedenen Lichtbedingungen.
• Tab. 16: Phototaktisches Verhalten verschiedener Mutanten potentieller BL-Photorezeptoren und phytochromähnlicher Proteine in den WT-Varianten WT Nr.2 und Nr.4 im BL. Diese beiden WT-Varianten besitzen die Fähigkeit, sich in Richtung BL zu bewegen. Somit zeigten diese beiden WT-Varianten bezüglich der BL-gesteuerten Motilität die gleichen Eigenschaften wie cph2-. Zur Inaktivierung der Gene, welche die potentiellen BL-Photorezeptoren kodieren, wurden die in Tab. 13 und Tab. 15 aufgelisteten Konstrukte verwendet.
• Tab. 17: Analyse der IS-Elemente im Genom der WT-Variante Nr. 6 unserer Arbeitsgruppe und deren Änderung gegenüber dem Genom anderer motiler WT-Stämme von Synechocystis. Die Tabelle fasst die Ergebnisse aus mehreren RFLP-Analysen zusammen, für die mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnittene DNA eingesetzt wurde.
• Tab. 18: Funktionen echter und potentieller Photorezeptoren bei der Vermittlung der lichtinduzierten Motilität von Synechocystis.

Abbildungsverzeichnis

• Abb. 1 : Photoisomerisation des Phytochromo bilins (PΦB) von der trans -Form zur cis -Form (A) und Absorptionsspektren der P _fr - und der P _r -Form des pflanzlichen Phytochroms (B) (modifiziert nach Sengbusch, 1996).
• Abb. 2 : Schematische Domänenarchitektur pflanzlicher Phytochrome. NTE: N- t erminal e xtension; GAF: Domänentyp, der zuerst in cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen, cyanobakteriellen Adenylatzyklasen und im Transkriptionsaktivator FhlA gefunden wurde. An ein Cystein in der GAF-Domäne ist das PΦB gebunden. Phy: Phytochrom-Domäne; Diese entspricht einer GAF-ähnlichen Domäne, die durch die PFAM-Database als eine gesonderte Domäne erkannt wird. PAS (PER-ARNT-SIM): Domäne, die ursprünglich in eukaryotischen Transkriptionsfaktoren gefunden wurden: in PER ( per iod clock protein) aus Drosophila melanogaster, ARNT ( a romatic hydrocarbon r eceptor n uclear t ranslocator) aus Vertebraten und SIM ( si ngle m inded) aus Drosophila melanogaster; HKR: h istidin k inase- r elated domain; Modifiziert nach Montgomery und Lagarias (2002).
• Abb. 3 : Multiples Sequenz-Alignment der GAF-Domänen von pflanzlichen Phyto chromen aus A. thaliana ( At -PhyA-E), Avena sativa ( As -PhyA) sowie den cyano bak teriellen Phytochromen Cph1 und Cph2. Ähnlichkeitsgruppierungen: (1) D = E, (2) K = R, (3) F = Y = W, (4) L = I = V = M; Konservierungsgrad: G= 100 %, G= 80 %, G = 60 %; A. thaliana (At-PhyA-E); Avena sativa (As-PhyA); aus Synechocystis: Cph1; Cph2-GAF1 (N-terminale GAF-Domäne von Cph2); Cph2-GAF2 (mittlere GAF-Domäne von Cph2); Cph2-GAF3 (C-terminale GAF-Domäne von Cph2). Das chromophorbindende Cystein findet sich an Position 113 des Sequenz-Alignments.
• Abb. 4 : Domänenarchitektur der Phytochrome und phytochromähnlichen Proteine in Synecho cystis Die Organisation der Domänen wurde mit dem Domänenanalyse-Programm Smart (http://smart.embl-heidelberg.de) bestimmt. GAF: Domänentyp, der zuerst in cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen, cyanobakteriellen Adenylatzyklasen und im Transkriptionsaktivator FhlA gefunden wurde. PFAM-phytochrome: entspricht der PHY-Domäne aus Abb. 2; PAS: siehe Abb. 2; PAC: Motiv, welches sich C-terminal der PAS-Domäne anschließt; HisKA (Dimerisations- und Phosphoakzeptor-Domäne) und HATPase_c sind Subdomänen der HK-Domäne; REC: CheY-homologe Receiver-Domäne; DUF1: entspricht der GGDEF-Domäne; DUF2: entspricht der EAL-Domäne; HAMP: Domäne in Histidinkinasen, Adenylylcyclasen, M ethyl binding proteins, Phosphatasen; MA: M ethyl- a ccepting chemotaxis-like domains (chemotaxis sensory transducer); TM: Transmembran-Domäne.
• Abb. 5 : Multiples Sequenz-Alignment zwischen der chromophorbindenden Region inner halb der GAF-Domänen pflanzlicher Phyto chrome und den GAF-Domänen von Phytochromen bzw. phytochromähnlichen Proteinen aus Synechocystis Ähnlichkeitsgruppierungen: (1) D = E, (2) K = R, (3) F = Y = W, (4) L = I = V = M; Konservierungsgrad: G= 100 %, G= 80 %, G = 60 %; A. thaliana (At-PhyA-E); Avena sativa (As-PhyA); aus Synecho cystis: Cph1; Cph2-GAF1 (N-terminale GAF-Domäne von Cph2); Cph2-GAF2 (mittlere GAF-Domäne von Cph2); Cph2-GAF3 (C-terminale GAF-Domäne von Cph2); PlpA; PixJ1-GAF1 (N-terminale GAF-Domäne von PixJ1); PixJ1-GAF2 (C-terminale GAF-Domäne von PixJ1); Sll1473; Slr1212; Slr1393-G1 (N-terminale GAF-Domäne von Slr1393); Slr1393-G2 (mittlere GAF-Domäne von Slr1393); Slr1393-G3 (C-terminale GAF-Domäne von Slr1393); Slr1969. Das chromophorbindende Cystein findet sich an Position 61 des Sequenz-Alignments.
• Abb. 6 : Position der Primer für die Konstruktion von cph2 -Mutanten mittels ortsgerichteter Mutagenese. Das chromophorbindende Cystein im N-terminalen Bereich wurde durch ein Alanin ausgetauscht, das Cystein im C-terminalen Bereich durch ein Valin.
• Abb. 7 : Spektralverteilung des für Wachstumsanalysen und Phototaxisstudien (Kap. 2.2.6 ) genutzten Lichtes.
• Abb. 8 : Schema zur Mutantenkonstruktion. Die verschiedenen Varianten von cph1 ^- und cph2 ^- wurden für die Analyse des Wachstumsverhaltens sowie für die Untersuchung der lichtinduzierten Motilität verwendet. Bei der Δcph2 ^--Mutante wurde das cph2-Gen vollständig entfernt. Dieser Mutantentyp wurde nur für Phototaxisexperimente genutzt.
• Abb. 9 : Lichtabhängige Änderung der cph1 - mRNA-Akkumulation im WT und der cph2 ^- -Mutante (A) sowie lichtabhängige Änderung der cph2 - mRNA-Akkumulation im WT (B) Die Änderung des Transkriptniveaus ist in Prozent des ML-Wertes dargestellt. Die Zellen aus einer Kultur, die unter ML-Bedingungen (30 µmol m^-2 s^-1) angezogen wurde, wurden für 1 h mit HL (165 µmol m^-2 s^-1), BL (12 µmol m^-2 s^-1), GL (8 µmol m^-2 s^-1), RL (15 µmol m^-2 s^-1) und FRL (0,3 W m^-2) belichtet bzw. wurden für 1 h im Dunkeln (D) gehalten. Die Gesamt-RNA wurde isoliert. Nach der Entfernung der DNA erfolgte die cDNA-Synthese. Die Transkriptmenge wurde mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt und auf die 16S-RNA-Menge normiert, wobei jeweils der Mittelwert von Triplikaten in die Berechnung einbezogen wurde. Die Säulen repräsentieren den Mittelwert, der aus jeweils 1 oder 2 cDNA-Synthesen von 3 unabhängigen Belichtungsreihen kalkuliert wurde. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
• Abb. 10 : Wachstumsraten (µ) der Phytochrommutanten in Prozent vom WT unter HL, ML, RL und FRL. Die Kulturen von WT und Mutante wurden zum gleichen Zeitpunkt gestartet. Dies erlaubt eine prozentuale Angabe der Wachstumsrate. Die Säulen stellen den Mittelwert der relativen Wachstumsrate von cph1 ^- (hellgrau), cph2 ^-(grau) und cph1 ^- /cph2 ^- (schwarz) dar (n = 4-8, für ML n = 3). Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. In die Kalkulation des Mittelwerts wurden die relativen Wachstumsraten sowohl der Km- als auch der Cm-resistenten cph1 ^-- und cph2 ^--Mutanten einbezogen. Die durchschnittlichen Wachstumsraten des WT betrugen 0,033±0,007 h^-1 (HL), 0,030±0,007 h^-1 (ML), 0,032±0,007 h^-1 (RL) und 0,0054±0,0017 h^-1 (FRL).
• Abb. 11 : Kompetitives Wachstum von WT und Phytochrommutanten ( cph1 ^- cph2 ^- ) im HL (A und B), FRL (C), RL (D) und LL (E und F). Die grauen Balken repräsentieren den prozentualen Anteil der cph1 ^- - bzw. cph2 ^- -Zellen an der Gesamtzellzahl. Für die Kompetitionsstudien wurden Kulturen von WT und Phytochrommutanten eingesetzt, die sich in einer Zwischenkultur an die Lichtbedingungen HL, LL, RL und FRL anpassen konnten. Während des kompetitiven Wachstums von WT und Mutanten wurden über eine von der Wachstumsgeschwindigkeit abhängigen Zeitspanne Proben genommen. Diese wurden auf Km-haltige sowie antibiotikafreie Agarplatten ausplattiert. Die Abbildungen stellen repräsentative Ergebnisse dar.
• Abb. 12 : Vergleichende Darstellung der 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren ganzer Zellen von WT im HL, RL und FRL (A) sowie von WT und cph1 ^- unter HL (B). Die Zellsuspensionen wurden auf ca. 5 µg Chl eingestellt und nach 10 min Dunkeladaption in 70 % Glycerol eingefroren. Das Chl wurde mit einer Wellenlänge von 440 nm angeregt. Die Spektren wurden auf ihr Maximum (bei 725 nm) normiert.
• Abb. 13 : Motilität von WT, cph1 ^- cph2 ^- und der Doppelmutante unter FRL (A), RL (B), GL (C), BL (D). Die Richtung des eingestrahlten Lichtes ist durch einen Pfeil markiert. Die Zellen wurden in drei verschiedenen Entfernungen von der Lichtquelle aufgetragen (gekennzeichnet durch eine gestrichelte Linie), wobei die zweite und dritte Position eine Reduktion der Lichtintensität auf ca. 60 % und 35 % gegenüber der lichtzugewandten ersten Position aufwies. Die Lichtintensitäten an den ersten Positionen betrugen 0,2 W m^-2 (FRL), 0,3 W m^-2 (RL), 0,6 µmol m^-2 s^-1 (GL) und 1,3 µmol m^-2 s^-1 (BL). Die Zellen wurden nach Auftragung auf die Agarplatte für 14 Tage mit den oben genannten Lichtfarben belichtet.
• Abb. 14 : Bidirektionale Einstrahlung von BL kombiniert mit FRL (A), RL (B) und GL (C) im 180°-Winkel. Die Richtung des einfallenden Lichts ist durch Pfeile markiert. Die Lichtfarben wurden durch Verwendung von Plastikfiltern erzeugt. Die Zellen wurden auf verschiedene Positionen innerhalb des Lichtfeldes aufgetragen (gekennzeichnet durch eine gestrichelte Linie), so dass sich variierende Anteile der jeweiligen Lichtfarben ergab.
• Abb. 15 : Motilität von WT, cph1 ^- cph2 ^- und der Doppelmutante unter Einfluss erhöhter (A) und geringer (B) BL-Intensität. Für das Phototaxisexperiment wurden Plastikfilter eingesetzt. Die Plastikfilter haben die Eigenschaft, im dunkelrotem Wellenlängenbereich zu einem geringen Anteil Licht durchzulassen. Die Lichtstärke wurde von ca. 1,3 µmol m^-2 s^-1 auf 35 µmol m^-2 s^-1 erhöht bzw. auf 0,1 µmol m^-2 s^-1 herabgesetzt.
• Abb. 16 : Schematische Darstellung von cph2 -Mutanten, bei denen je eine der beiden chromophorbindenden Cysteine mittels ortsgerichteter Mutagenese durch ein Alanin bzw. Valin ausgetauscht wurde bzw. die GAF-Domäne vollständig entfernt wurde.
• Abb. 17 : Komplementation der cph2 -Deletion mit einem cph2 -Gen , bei dem entweder eines der chromophorbindenden Cysteine durch ein Alanin (GAF1*) oder ein Valin (GAF3*) ausgetauscht wurde bzw. die mittlere GAF-Domäne ohne nachgewiesene Bilin-Binde fähigkeit vollständig entfernt wurde (GAF2 ^- ). Als Kontrolle diente ein cph2-pVZ321-Konstrukt, dessen GAF-Domänen nicht verändert wurden. Die Position der cph2-Insertion in den pVZ321-Vektor ist in (A) dargestellt. Das Laufverhalten der Transkonjuganten unter BL ist in (B) abgebildet. (C) zeigt den Nachweis der aus Synechocystis isolierten Plasmide durch eine PCR unter Verwendung der Primer pVZ321-Km1403 und cph2-370RV, die an die Km-Kassette im pVZ321 bzw. an das inserierte cph2-Gen binden.
• Abb. 18 : Motilität von Mischkolonien mit sich graduell änderndem Anteil von WT- und cph2 ^- -Zellen. Eine separat angezogene Kultur von WT und Mutante wurde auf eine gleiche OD eingestellt. WT und cph2 ^- wurden in variierendem Mengenanteil zueinander (siehe Tabelle in der Abbildung) gemischt. Anschließend wurden 3 µl des abzentrifugierten Zellpellets auf eine Agarplatte aufgetropft. Der ursprüngliche Auftragungsort ist durch einen Kreis gekennzeichnet. Als Kontrolle dienten eine reine WT- sowie cph2 ^--Kultur. 0: keine Motilität; +: Motilität, wobei die Stärke des Symbols das Ausmaß der Motilität im Vergleich zur reinen cph2 ^--Kolonie beschreibt. Die Abbildung stellt ein repräsentatives Ergebnis dar.
• Abb. 19 : Einfluss der externen Zugabe von cAMP und cGMP auf die BL-gesteuerte Motilität von WT und den Phytochrommutanten.
• Abb. 20 : Einfluss von DCMU auf das phototaktische Verhalten im BL (A) und GL (B). Die Agarplatten enthielten 10 µM DCMU. Für das in (A) dargestellte Experiment wurden Zellen verwendet, die vorher auf Phototaxisplatten im WL gelaufen waren.
• Abb. 21 : Northern-Blot-Analyse der pilA1 -mRNA aus WT- und cph2 ^- -Zellen. Für die RNA-Isolation wurden Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase für 2 h mit WL bzw. BL belichtet. Die Gesamt-RNA (2 µg) wurde elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einer pilA1-spezifischen Sonde hybridisiert. Als Kontrolle wurde eine Sonde gegen die 16S-RNA eingesetzt.
• Abb. 22 : Beispiele für elektronenmikroskopische Aufnahmen der TypIV-Pili von WT und cph2 ^- Für die elektronenmikroskopische Untersuchung wurden Zellen von Phototaxisplatten entnommen, die für ca. zwei Wochen mit BL belichtet wurden. Die Kontrastierung der Pili-Strukturen erfolgte durch Bedampfung mit einer Platin/Paladium-Legierung.
• Abb. 23 : Schema des bluf ^- -Konstrukts (A) und Motilität potentieller BL-Rezeptoren unter BL-Bedingungen (B). Das bluf-Gen ist mit ca. 500 bp relativ kurz. Daher wurden für die Inaktivierung des bluf-Gens die benachbarten Gene ebenfalls amplifiziert. Der ORF slr1693 kodiert für einen Response-Regulator von PatA-Typ und sll1553 für eine Phenylalanyl-tRNA-Synthetase. Die Pfeile geben die Position der Primer (ca. 150 bp vor dem jeweiligen Translationsstartpunkt) zur Amplifikation des Genabschnittes an. Δcph2 ^- stellt eine Mutante von cph2 dar, bei der das Gen vollständig entfernt wurde (Abb. 8). Dieser Mutantentyp wies das gleiche phototaktische Verhalten im BL auf wie die cph2 ^--Variante.
• Abb. 24 : Schema zur Konstruktion der pixJ1 ^- -Mutante (A) und phototaktisches Verhalten von pixJ1 ^- sowie der pixJ1 ^- /Δ cph2 ^- -Doppelmutante unter unidirektionaler Einstrahlung von BL (B).
• Abb. 25 : Lichtinduzierte Motilität verschiedener WT-Stämme von Synechocystis in Abhängigkeit vom WL und BL (A) sowie Southern-Blot-Analyse des cph2 -Gens in jenen WT-Varianten (B). Für die Southern-Blot-Analyse wurde die mit dem Restriktionsenzym HindIII fragmentierte chromosomale DNA mit einer Sonde gegen cph2 hybridisiert.  Eine Aufschlüsselung der Nummern ist in Tab. 3 im Kap. 2.1.8.1 dargestellt. In der Spur Nr. 6 ist die DNA des WT aufgetragen, der für die Inaktivierung der Gene cph1 und cph2 verwendet wurde.
• Abb. 26 : RFLP-Analyse der zur ISY203-Gruppe gehörigen IS-Elemente im Genom von Synechocystis Die genomische DNA verschiedener WT-Stämme wurde mittels des Restriktionsenzyms Eco32I geschnitten und elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Transfer der DNA auf einen Filter wurde diese mit einer ISY203-spezifischen Sonde hybridisiert. Eine Aufschlüsselung der Nummern ist in Tab. 3 im Kap. 2.1.8.1 dargestellt. In der Spur Nr. 6 ist die DNA des WT aufgetragen, der für die Inaktivierung der Gene cph1 und cph2 verwendet wurde.
• Abb. 27 : RFLP-Analyse der IS-Elemente aus den Gruppen ISY508 (A) und ISY100 (B) sowie des Gens slr1336 (C). Für die Hybridisierung mit einer Sonde gegen ISY100 und ISY508 wurde die genomische DNA mit dem Restriktionsenzym Eco32I geschnitten. Die chromosomale DNA für die RFLP-Analyse des slr1336-Gens wurde mit der Endonuklease XbaI fragmentiert. Eine Aufschlüsselung der Nummern ist in Tab. 3 im Kap. 2.1.8.1 dargestellt. In der Spur Nr. 6 ist die DNA des WT aufgetragen, der für die Inaktivierung der Gene cph1 und cph2 verwendet wurde.
• Abb. 28 : Genombereich, in dem sich das IS-Element sll1257 befindet. Die Abbildung repräsentiert einen Ausschnitt einer in der Cyanobase erhältlichen Genkarte dieser Region. Die IS-Elemente innerhalb dieser Genomregion sind durch Kästchen hervorgehoben. Der Pfeil markiert die Position der Insertion der pSYSG-Sequenz. Der ORF sll1258 kodiert für eine dCTP-Deaminase und der ORF slr1336 für einen potentiellen Ca²⁺/H⁺-Antiporter. Die Farben symbolisieren Kategorien, nach denen die Gene hinsichtlich der zu erwartenden Funktion ihrer Genprodukte eingeteilt sind. weiß: Proteine unbekannter Funktion; grau: hypothetische Proteine; schwarz: andere Kategorien; lila: Biosynthese von Purinen, Pyrimidinen, Nukleosiden, Nukleotiden; blau: Translation; grün: Transport; oliv: Photosynthese und Respiration; orange: RNA; rot: Energie-Metabolismus. Die Bezeichnung der Katagorien stammt aus der Cyanobase.
• Abb. 29 : Zusammenfassung der wichtigsten Resultate aus der Analyse der cph1 ^- - und cph2 ^- -Mutanten
• Abb. 30 : Vergleich des Absorptionsspektrums der C-terminalen GAF-Domäne mit PCB als Addukt (A) mit dem Aktionsspektrum der lichtinduzierten Motilität des WT (B). Die Abb. 30A stammt aus der Veröffentlichung von Wu und Lagarias (2000).