1 Einleitung

1.1 Photorezeptoren in Pflanzen

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Die Fähigkeit, sich an Lichtbedingungen anzupassen, fördert maßgeblich die Überlebensfähigkeit von einfachsten bis zu komplexen Organismen. Dies beinhaltet die Akklimatisierung an hohe Lichtintensitäten, die über die Bildung von Sauerstoff- und anderen freien Radikalen in den Zellen unkontrollierte chemische Reaktionen mit biologisch wichtigen Makromolekülen herbeiführen und so ernsthafte Zellschädigungen hervorrufen können. Andererseits konkurrieren photosynthetisch aktive Organismen um ausreichendes Licht. Die Wahrnehmung von Lichtreizen geschieht über spezielle Photorezeptoren. Diese wurden hinsichtlich der Art des gebundenen Chromophors sowie der primären photochemischen Reaktion in verschiedene Klassen eingeteilt (van der Horst und Hellingwerf, 2004). Hierzu gehören die BL-Rezeptoren Cryptochrom (Cry), Phototropin (Phot), BLUF-Proteine und Xanthopsin, die Klasse der grünlicht(GL)- absorbierenden Rhodopsine sowie die reversibel RL/FRL-absorbierenden Phytochrome (Phy). Seit einigen Dekaden wird die Existenz von UV(B)-Photorezeptoren diskutiert, jedoch konnten diese bisher nicht näher charakterisiert werden (Frohnmeyer und Staiger, 2003).

1.2 Die pflanzlichen Phytochrome

Die Beobachtung, dass RL und FRL morphogenetische Prozesse in Pflanzen steuern, führte zur Entdeckung der Phytochrome. Borthwick et al. beschrieben 1952, dass die Samenkeimung von lichtkeimenden Nutzpflanzen nach Bestrahlung mit Licht mit einem Wirkungsmaximum bei 650 nm induziert wurde. Nach einer erneuten Bestrahlung mit Licht bei einer Wellenlänge von ca. 730 nm wurde jedoch dieser Induktionseffekt inhibiert. Im Jahr 1959 wurde die erfolgreiche Isolierung eines photoreversiblen Pigments aus Pflanzen beschrieben, welches in zwei Formen auftretend sowohl RL als auch FRL absorbiert (Butler et al., 1959). Frühen Hypothesen entsprechend wurde die aktive Konformation der FRL-absorbierenden Form des Phytochroms (Pfr) zugeordnet und die inaktive der RL-absorbierenden Form des Phytochroms (Pr), wobei als Chromophor ein Bilin zunächst vermutet und später bestätigt wurde (Hendricks und Borthwick, 1967; Furuya, 1993). Später zeigte sich, dass dieses Lichtreaktionssystem weitere photomorphogenetische Prozesse in der Pflanze steuert, wie Blüteninduktion, Hypokotylwachstum und Schattenvermeidung. Außerdem spielen Phytochrome beim Neusetzen der zirkadianen Uhr eine Rolle.

In dem Modellorganismus Arabidopsis thaliana (A. thaliana) wurden Gene für fünf verschiedene Phytochrome mit der Bezeichnung phyA bis phyE gefunden (Sharrock und Quail, 1989; Clack et al., 1994). Die Existenz von Phytochromfamilien konnte auch für weitere Arten belegt werden, wie für die Tomate mit 5 (Hauser et al., 1995) und den Reis mit 3 Mitgliedern (Mathews und Sharrock, 1996). Noch bevor die Existenz von verschiedenen phytochromkodierenden Genen in A. thaliana nachgewiesen werden konnte, wurden die pflanzlichen Phytochrome bereits in zwei Klassen unterteilt: die Vertreter vom Typ I sind lichtlabil, während zum Typ II lichtstabile Phytochrome gezählt werden (Furuya, 1993). In A. thaliana gehört nur PhyA der Gruppe vom Typ I an. PhyB-E hingegen werden dem Typ II zugeordnet (Wang undDeng, 2002). Phytochrome werden auch nach der Art ihrer Reaktion auf das eingestrahlte Licht charakterisiert: VLFR (very low fluence response) bezeichnet Prozesse, die bereits durch eine geringe Menge an Pfr ausgelöst werden und nicht mehr revertierbar sind. LFR (low fluence response) entspricht dem klassischen RL-/FRL-reversiblen Prozess. Reaktionen vom HIR-Typ (high irradiance response) erfordern eine längere Bestrahlung mit RL bzw. FRL oder Lichtpulse mit einer hohen Frequenz (Nagy und Schäfer, 2002; Fankhauser und Staiger, 2002). Im Fall von A. thaliana vermitteln die Phytochrome B, C, D und E Reaktionen vom LFR-Typ, während sich VLFR und HIR-Reaktionen auf PhyA beschränken (Nagy und Schäfer, 2002).

1.2.1  Molekulare Eigenschaften des Phytochroms

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Phytochrome perzipieren das ankommende Licht über einen Chromophor. Im Fall von PhyA aus A. thaliana konnte als chromophore Gruppe das Phytochromobilin (PΦB) identifiziert werden (Wang und Deng, 2002). Es wird allgemein angenommen, dass auch die anderen pflanzlichen Phytochrome PΦB als Chromophor verwenden (Fankhauser, 2001). Dieses lineare Tetrapyrrol ist kovalent an ein Cystein in der chromophorbindenden Domäne des Apoprotein gebunden (Lagarias und Lagarias, 1989). Wie bereits erwähnt, wechseln Phytochrome zwischen zwei Konformationen mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften: Die Pr-Form besitzt ein Absorptionsmaximum bei ca. 660 nm, die Pfr-Form hingegen bei 730 nm (Abb. 1B). Die Verschiebung des Absorptionsmaximums wird durch eine trans-cis-Isomerisierung der Doppelbindung zwischen dem C15 und dem C16-Atom am D-Ring des PΦB (Abb. 1A) verursacht (Wang und Deng, 2002), wobei die trans-Form der Pr-Konformation entspricht und die cis-Form der Pfr-Konformation. Neben dem Absorptionsmaximum im roten bzw. dunkelroten Wellenlängenbereich weist das Phytochrom ein zweites Maximum im blauen Spektralbereich auf. Auch hier unterscheidet sich die Pfr-Form von der Pr -Form: Die erste bildet den Peak bei ca. 400 nm und die zweite bei ca. 370 nm (siehe Abb. 1B).

Pflanzliche Phytochrome werden in der biologisch inaktiven Pr-Form synthetisiert. Durch die Absorption von rotem Licht erfolgt die Isomerisation zu der biologisch aktiven Pfr-Form. Die Einstrahlung von FRL kehrt diesen Prozess um. Beide Vorgänge erfolgen über eine Reihe von Zwischenprodukten (Foerstendorf et al., 1996). Ein vom Phytochrom-Typ abhängiger Prozentsatz an Pfr wird im Dunkeln zur Pr-Form revertiert. Jüngere Untersuchungen am lichtlabilen PhyA aus A. thaliana deuten daraufhin, dass die Dunkelreversion ein regulierter Prozess und keine Eigenschaft des Phytochrommoleküls ist (Nagy und Schäfer, 2002).

Da die Absorptionsspektren beider Konformationen sich teilweise überlappen, stellt sich ein wellenlängenabhängiges Photogleichgewicht zwischen der Pr-Form und der Pfr-Form ein. Im Sonnenlicht beträgt der Anteil der Pfr-Form am gesamten Phytochrom ca. 60 %. Bei Beschattung durch eine dichte Vegetation liegt dieses Verhältnis bei ca. 10 %, da hier das FRL anteilig gegenüber dem RL zunimmt (Smith, 2000).

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Abb. 1 : Photoisomerisation des Phytochromo bilins (PΦB) von der trans -Form zur cis -Form (A) und Absorptionsspektren der P fr - und der P r -Form des pflanzlichen Phytochroms (B) (modifiziert nach Sengbusch, 1996).

Pflanzliche Phytochrome sind lösliche Homodimere mit einem Molekulargewicht von ca. 125 kDa und einer Sequenz von meist 1100 Aminosäuren (AS). Die bisher bekannten Phytochrome in Pflanzen weisen eine sehr ähnliche Molekülarchitektur auf. Der N-terminale Teil besteht aus einer photosensorischen, den Chromophor bindenden input-Region mit einem Molekulargewicht von etwa 70 kDa. Der C-terminale Teil umfasst die regulatorische output-Region und ist mit 55 kDa kleiner als die photosensorische Region (Abb. 2). Beide Teile setzen sich aus verschiedenen Domänen zusammen. Am N-Terminus befindet sich die gering konservierte NTE-Domäne ( N - t erminal e xtension). Es wird angenommen, dass diese Sequenz die funktionellen Unterschiede zwischen den pflanzlichen Phytochromen verursacht, wie z.B. die unterschiedliche Stabilität der Pfr-Form in A. thaliana (Fankhauser, 2001). Für PhyA aus Avena sativa wurde demonstriert, dass der serinreiche erste Teil der NTE-Domäne in die Regulation zwischen den beiden Reaktionstypen VLFR und HIR, vermutlich über Phosphorylierung eines Serins, involviert ist (Casal et al., 2002). Für die Chromophorbindung ist ein spezieller GAF-Domänen-Typ mit Bilinlyase-Aktivität verantwortlich. GAF-Domänen sind nicht nur auf photoaktive Proteine beschränkt, sondern wurden zuerst als konservierte Domäne bei cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen in Vertebraten, cyanobakteriellen Adenylatzyklasen und dem Transkriptionsfaktor FhlA aus E. coli beschrieben (Arvind und Ponting, 1997). Die chromophortragenden GAF-Domänen beinhalten eine kurze Insertion mit einem konservierten Cystein, mit dem das lineare Tetrapyrrol verknüpft ist (Galperin et al., 2001).

Der regulatorische Teil besteht aus einer doppelten PAS-Domäne sowie einer Domäne mit Ähnlichkeit zu Histidinkinasen (HKR: h istidine k inase- r elated). Die strukturell den GAF-Domänen ähnelnden PAS-Domänen wurden überwiegend in Proteinen gefunden, die direkt oder indirekt in Signaltransduktionen involviert sind. Wie diese kommen sie in Proteinen aus Organismen der drei Hauptreiche Eukaryota, Bacteria und Archaea vor. Dieser Domänentyp besitzt die Fähigkeit, Biline, Flavine und Nukleotid-Kofaktoren zu binden. Zu den Stimuli, die von PAS-Domänen wahrgenommen werden, gehören u.a. Licht, Sauerstoff und das Redoxpotential (Taylor und Zhulin, 1999). Weiterhin wird eine stabilisierende Funktion dieser Domänen bei der Bildung von Dimeren diskutiert. Im Fall der pflanzlichen Phytochrome sind die beiden PAS-Domänen für die Interaktion mit Signalkomponenten (Fankhauser, 2001) notwendig. Außerdem wird ihnen eine Rolle bei der Stabilisierung der Pfr-Form von PhyB in A. thaliana (Fankhauser, 2001; Elich und Chory, 1997) zugeschrieben. Die am C-Terminus befindliche HKR-Domäne besitzt Ähnlichkeit zu den bakteriellen Histidinkinasen von Zwei-Komponenten-Systemen. Eine licht- und chromophorregulierte Phosphorylierung eines rekombinant exprimierten PhyA aus Avena sativa konnte gezeigt werden (Yeh und Lagarias, 1998), wobei jedoch anstelle des Histidins ein Serin (S598) phosphoryliert wurde (Lapko et al., 1999). Lapko et al. (1999) zeigten außerdem, dass die Phosphorylierung des S598 nur bei PhyA-Präparationen aus RL-bestrahlten Keimlingen von Avena sativa zu beobachten war und nicht bei im Dunkeln gewachsenen Keimlingen. Pflanzliche Phytochrome werden daher als Serin/Threonin-Proteinkinasen betrachtet.

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Inwieweit die Kinaseaktivität für die Phytochromfunktion benötigt wird, ist weiterhin Gegenstand von Diskussionen (Wang und Deng, 2002; Nagy und Schäfer, 2002).

Abb. 2 : Schematische Domänenarchitektur pflanzlicher Phytochrome. NTE: N- t erminal e xtension; GAF: Domänentyp, der zuerst in cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen, cyanobakteriellen Adenylatzyklasen und im Transkriptionsaktivator FhlA gefunden wurde. An ein Cystein in der GAF-Domäne ist das PΦB gebunden. Phy: Phytochrom-Domäne; Diese entspricht einer GAF-ähnlichen Domäne, die durch die PFAM-Database als eine gesonderte Domäne erkannt wird. PAS (PER-ARNT-SIM): Domäne, die ursprünglich in eukaryotischen Transkriptionsfaktoren gefunden wurden: in PER ( per iod clock protein) aus Drosophila melanogaster, ARNT ( a romatic hydrocarbon r eceptor n uclear t ranslocator) aus Vertebraten und SIM ( si ngle m inded) aus Drosophila melanogaster; HKR: h istidin k inase- r elated domain; Modifiziert nach Montgomery und Lagarias (2002).

1.2.2 Intrazelluläre Lokalisation

Das PΦB wird in den Chloroplasten aus Häm über das Zwischenprodukt Biliverdin IXα gebildet. Der Chromophor wandert in das Cytosol und wird mit dem dort synthetisierten Phytochrom-Apoprotein verknüpft (Wang und Deng, 2002). Mittels GUS- und GFP-Fusionsproteinen konnte die lichtregulierte Translokation von PhyA und PhyB in den Zellkern von A. thaliana beschrieben werden. Der Import von PhyB in den Zellkern wird durch Bestrahlung mit Weiß- oder RL ausgelöst. Dahingegen wird die Translokation von PhyA sowohl von RL als auch FRL induziert. Im Gegensatz zu PhyB ist der PhyA-Import strikt lichtinduziert und erfolgt mit einer wesentlich größeren Geschwindigkeit (Kircher et al., 2002).

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Im Zellkern sammeln sich die Phytochrome in definierten Bereichen und bilden eine als „Flecken“ bezeichnete Struktur. Im Fall von PhyB aus Tabak konnten Mas et al. (2000) nachweisen, dass diese „Flecken“ zusätzlich zu PhyB den BL-Rezeptor Cryptochrom 2 (Cry2) enthielten und beide Photorezeptoren interagieren. Aufgrund dieser Entdeckung wurde postuliert, dass zumindest die PhyB-enthaltenden „Flecken“ aktive Transkriptions- oder auch Degradationskomplexe mit einer wahrscheinlich hohen Anzahl von interagierenden Molekülen darstellen (Nagy und Schäfer, 2002).

Die Phytochrome C, D und E aus A. thaliana weisen ebenfalls einen lichtinduzierten Transport und „Flecken“-Bildung auf (Kircher et al., 2002). Das Auftreten der Akkumulationsstrukturen von PhyA bis PhyE in A. thaliana wird unterschiedlich durch das Licht reguliert und unterliegt einem diurnalen Rhythmus (Kircher et al., 2002).

1.2.3 Signaltransduktionswege

Trotz der langjährigen Forschung am pflanzlichen Phytochrom existieren große Lücken im Wissen um die Weiterleitung des Signals nach der Aufnahme des Lichtreizes. Auf Phytochrom zurückführbare Reaktionen unterscheiden sich stark in ihrer Geschwindigkeit. Diese Beobachtung sowie die Ähnlichkeit der C-terminalen Region zu bakteriellen Zwei-Komponenten-Systemen lassen vermuten, dass die Signalübertragung auf verschiedenen Wegen erfolgt.

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In den letzten Jahren konnten einige Arbeitsgruppen mittels two-hybrid-Systemen in Hefen und pull-down-Experimenten eine Reihe von potentiellen Interaktionspartnern von pflanzlichen Phytochromen aufspüren. Zu den zuerst gefundenen gehören neben den BL-Rezeptoren Cry1 und Cry2 (Ahmad et al., 1998; Mas et al., 2000) die Proteine phytochrome interacting factor 3 (PIF3) (Ni et al., 1998) und PIF4 (Huq und Quail, 2002), das phytochrome kinase substrat 1 (PKS1) (Fankhauser et al., 1999), die nucleoside diphosphate kinase 2 (NDPK2) (Choi et al., 1999), der A. thaliana response regulator 4 (ARR4) (Sweere et al., 2001), das Protein early flowering 3 (ELF3) (Liu et al., 2001) sowie das Phytohormon Auxin (Colón-Carmona et al., 2000). Der Großteil dieser Interaktionspartner ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert. ARR4 und NDPK2 wurden sowohl im Zellkern als auch im Cytoplasma nachgewiesen. Nur PKS1 scheint auf das Cytoplasma begrenzt zu sein.

PKS1 wird durch PhyA in lichtabhängiger Weise phosphoryliert. Die exakte Funktion dieses cytoplasmatischen Proteins ist nicht bekannt. Jedoch nimmt man aufgrund der Analysedaten von PKS1-Überexpressionsmutanten an, dass PKS1 als negativer Regulator von PhyB fungiert bzw. die von PhyA und B ausgehenden Signaltransduktionswege miteinander koordiniert (Fankhauser et al., 1999). PIF3 wurde vergleichsweise intensiv untersucht. Dieses Protein gehört zur Klasse der basic-helix-loop-helix-Transkriptionsfaktoren und bindet sequenzspezifisch an die G-Box, einem Motiv in der Promotorregion verschiedener lichtregulierter Gene. DNA-gebundenes PKS1 interagiert reversibel mit PhyB in seiner Pfr-Form (Quail, 2002). ARR4 interagiert spezifisch mit den ersten 173 Aminosäuren der N-terminalen Region von PhyB aus A. thaliana. ARR4 besitzt wahrscheinlich eine signalintegrierende Funktion zwischen dem RL-perzipierenden PhyB und dem Phytohormon Cytokinin (Sweere et al., 2001).

Der gegenwärtige Wissensstand in der Phytochromforschung lässt erkennen, dass die von pflanzlichen Phytochromen ausgehende Signaltransduktionswege ein komplexes Netzwerk bilden. Die frühen Komponenten der Signalkette lassen sich in drei Gruppen einteilen: (I) downstream von PhyA (z.B. SPA1, PAT1, FHY1), (II) von PhyB (z.B. ELF3, PIF4, GIGANTEA) oder (III) von beiden Phytochromen (z.B. PIF3, NPDK2, PSI2) agierende Proteine (Quail, 2002; Kim et al., 2002). Die nach diesem Modell über diese Übertragungswege weitergeleiteten Signale münden teilweise in einen „Signal-Integrations“-Prozess, der mechanistisch bisher undefiniert ist. Dieser Integrationsprozess umfasst positive Faktoren - wie HY5 - oder negative Regulatoren der Photomorphogenese - wie die DET/COP/FUS-Gruppe (Quail, 2002; Kim et al., 2002). Komponenten aus der DET/COP/FUS-Gruppe bilden im Kern einen Multiprotein-Komplex, das COP9-Signalosom. Aufgrund der Ähnlichkeit dieses Komplexes mit dem 26S-Proteasom aus Eukaryoten wird angenommen, dass das COP9-Signalosom für eine gezielte Degradation von Proteinen im Kern verantwortlich ist (Quail, 2002; Schäfer und Bowler, 2002).

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Neben diesen Beispielen für Phytochrom-Interaktionspartner wird seit vielen Jahren die Rolle von cGMP, Ca2+-Ionen und Calmodulin als second messenger bei der Vermittlung von cytoplasmalokalisierten Signaltransduktionswegen diskutiert. Neuere Untersuchungsergebnisse im Fall von G-Proteinen und Ca2+-Ionen lieferten Hinweise für eine mögliche Funktion bei der phytochromregulierten Genexpression (Schäfer und Bowler, 2002).

Zu den am schnellsten eintretenden Wirkungen von Phytochromen gehören verschiedene elektrische Reaktionen. Es liegen Berichte vor über die Involvierung von Phytochromen im Ionen-Flux über die Plasmamembran bei Physcomitrella und einer Reihe von Grünalgen sowie die Chloroplastenbewegung bei der Grünalge Mougeotia (Neff et al., 2000).

Phytochromen wird Proteinkinase-Aktivität zugeschrieben, die jedoch nur im Fall von PhyA aus A. sativa nachgewiesen werden konnte (siehe Kap.1.2.1). In der Literatur werden verschiedene Prozesse aufgeführt, in die eine Proteinkinase-Aktivität involviert sein könnte. Beispiele hierfür sind die Regulation der nukleo-cytoplasmatischen Verteilung der Phytochrome oder auch die Lokalisierung weiterer Komponenten von die Genexpression steuernden Signalketten (Nagy und Schäfer, 2002). Weiterhin könnten Phytochrome auf diese Weise die Aktivität von anderen Kinasen oder Enzymen beeinflussen, wie Ca2+-abhängige Kinasen oder cGMP-synthetisierende Enzyme. Über die Phosphorylierung spezieller Proteine könnten Phytochrome das Öffnen und Schließen von Ionenkanälen steuern (Kim et al., 2002). Diese Photorezeptoren könnten jedoch auch Teil eines neuartigen two-component-phosphorelay-Systems darstellen, wie es für PhyB und seinen Response-Regulator ARR4 postuliert wurde (Sweere et al., 2001; Wang und Deng, 2002).

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Trotz der zunehmenden Erkenntnisse zur PhyA- und PhyB-abhängigen Signaltransduktion ist wenig über Signalketten bekannt, die von PhyC-E ausgehen. Die Fähigkeit dieser Phytochrome zur Translokation ist bekannt (siehe Kap.1.2.2), jedoch konnte bisher kein Interaktionspartner gefunden werden (Nagy und Schäfer, 2002).

1.3 Die Entdeckung von phytochromähnlichen Proteinen in Synechocystis

Lange Zeit nahm man an, dass Phytochrome auf das Pflanzenreich beschränkt sind. Dies änderte sich, als Mitte der 90er Jahre die phytochromähnlichen Proteine RcaE im Cyanobakterium Fremyella diplosiphon (Kehoe und Grossman, 1996) und PlpA in Syne chocystis (Wilde et al., 1997) gefunden wurde sowie die erste vollständige Sequenz des Cyanobakteriums Synechocystis veröffentlicht wurde. Die Analyse des Genoms ergab, dass das Synechocystis-Genom mehrere offene Leserahmen (ORF) mit Ähnlichkeit zu pflanzlichen Phytochromen enthält (Kaneko et al., 1996). Schmitz et al. (2000) beschrieben ein weiteres phytochromähnliches Protein, das CikA in Synechococcus elongatus (PCC7942). Spätestens mit der Entdeckung phytochromähnlicher Proteine in den nichtphotosynthetischen Eubakterien Deinococcus radiodurans und Pseudomonas aeruginosa (Davis et al., 1999) stellte sich heraus, dass Phytochrome eine weitaus vielfältigere Klasse von Photorezeptoren sowie phylogenetisch viel älter sind als bis zu diesem Zeitpunkt angenommen.

1.3.1 Das cyanobakterielle Phytochrom 1 (Cph1)

Das vom ORF slr0473 (Cyanobase) kodierte Protein Cph1 weist unter den der Phytochromgruppe zugehörigen Proteinen in Synechocystis die größte Ähnlichkeit zu pflanzlichen Phytochromen auf (Abb. 3 und Abb. 4). Die C-terminale Region des Cph1-Proteins gleicht den Sensor-Histidinkinasen eubakterieller Zwei-Komponenten-Systeme. Die Domänenarchitektur von Cph1 unterscheidet sich in einigen Punkten von der pflanzlicher Phytochrome. Der cyanobakterielle Photorezeptor ist mit 748 AS wesentlich kürzer als die bekannten Phytochrome aus Pflanzen. Am N-Terminus fehlt die NTE-Domäne. Stattdessen besitzt Cph1 in diesem Bereich eine zusätzliche PAS-Domäne (Abb. 4). Weiterhin fehlt die Doppel-PAS-Domäne im regulatorischen Modul des Cph1-Proteins.

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Phytochrome zeichnen sich durch die Eigenschaft zur Photokonversion zwischen einer RL- und einer FRL-absorbierenden Konformation aus. Mittels eines rekombinanten Cph1-Apoproteins aus E. coli konnte die Fähigkeit zur autokatalytischen Bindung des linearen Tetrapyrrols Phycocyanobilin (PCB) nachgewiesen werden. Das resultierende Cph1-Holoprotein zeigt die für Phytochrome charakteristische cis-trans-Isomerisierung nach Anregung mit RL bzw. FRL. Somit kann das cyanobakterielle Cph1 als echtes Phytochrom bezeichnet werden (Hughes et al., 1997; Yeh et al., 1997). Das Vorkommen von PΦB in Synechocystis konnte bisher nicht gezeigt werden. Der ORF slr0116 mit der größten Ähnlichkeit seines Genprodukts zur PΦB:Ferredoxin-Oxidoreduktase (HY2), welche in A. thaliana das Biliverdin IXα zu PΦB umwandelt (Kohchi et al., 2001), kodiert in Synechocystis für eine PCB:Ferredoxin-Oxidoreduktase (PcyA; Frankenberg et al., 2001). Trotzdem konnte die Fähigkeit von Cph1 zur autokatalytischen Bindung von PΦB mit einem gegenüber dem Cph1-PCB-Holoprotein leicht verschobenen Absorptionsmaximum nachgewiesen werden. Unabhängig vom gebundenen Chromophor, wies die Pfr-Form von Cph1 in beiden Fällen (706 nm beim PCB-Cph1- bzw. 718 nm beim PΦB-Cph1-Addukt) gegenüber der entsprechenden Form des pflanzlichen Phytochroms eine Verschiebung des Absorptionsmaximums in den kürzerwelligen Bereich auf. Dieses Resultat lässt sich mit der fehlenden NTE-Domäne erklären (Yeh et al., 1997). Hingegen ähnelte das Absorptionsmaximum der Pr-Form (654 nm beim PCB-Cph1- bzw. 668nm beim PΦB-Cph1-Addukt) dem des pflanzlichen Phytochroms. Die Ähnlichkeit zwischen dem Differenzspektrum des rekombinant exprimierten Cph1-Proteins mit PCB als Chromophor aus E. coli und dem Differenzspektrum des aus Synechocystis isolierten Cph1-Proteins weist auf PCB als natürlichen Chromophor hin (Hübschmann et al., 2001a). Weiterhin konnte mittels fluorescence-resonance-energy-transfer-Technik belegt werden, dass sich Cph1 wie pflanzliche Phytochrome zu Dimeren zusammen lagert (Otto et al., 2003).

Wenige Basenpaare hinter dem cph1-Gen wurde ein ORF (slr0474) entdeckt, der für den Response-Regulator Rcp1 kodiert (Lamparter et al., 1997; Yeh et al., 1997). Dieses 147 AS lange Protein gehört zur Superfamilie der Response-Regulatoren vom CheY-Typ. Yeh et al. (1997) konnten den Transfer eines Phosphat-Restes von Cph1 auf Rcp1 demonstrieren: Die Autophosphorylierung des Histidins H538 in der HK-Domäne im Cph1-Protein findet hauptsächlich in seiner Pr -Form nach der Perzeption von FRL statt. Das Phosphat wird von Cph1 auf das Aspartat D68 in Rcp1 übertragen. Interessanterweise deuten die Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe darauf hin, dass im Gegensatz zum pflanzlichen Phytochrom die Pr -Form die aktive Konformation ist. Allerdings sehen Hughes und Lamparter (1999) die Möglichkeit, dass Cph1 einen bifunktionalen Photorezeptor mit einer Proteinkinase-Form (Pr) und einer Proteinphosphatase-Form (Pfr) darstellt. Das daraus abgeleitete Vorhandensein von mehr als einer aktiven Form konnte jedoch noch nicht experimentell belegt werden. Der Response-Regulator Rcp1 ist das einzig bekannte Nachfolgeglied in der von Cph1 induzierten Signaltransduktionskette. Dieses Protein besitzt keine DNA-bindende Domäne. Daher ist zu vermuten, dass die Signalweiterleitung über einen komplexeren Weg als das einfache Zwei-Komponenten-System erfolgt.

Obwohl Cph1 photochemisch und photophysikalisch intensiv untersucht wurde, konnte noch keine biologische Funktion dieses Photorezeptors nachgewiesen werden. Allerdings wurden Daten zur Regulation der Expression des cph1/rcp1-Operons veröffentlicht, die auf einen Einfluss von Licht, Glukose und Eisenmangel auf die Menge an cph1/rcp1-mRNA verweisen (García-Domínguez et al., 2000; Singh et al., 2003).

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Abb. 3 : Multiples Sequenz-Alignment der GAF-Domänen von pflanzlichen Phyto chromen aus A. thaliana ( At -PhyA-E), Avena sativa ( As -PhyA) sowie den cyano bak teriellen Phytochromen Cph1 und Cph2. Ähnlichkeitsgruppierungen: (1) D = E, (2) K = R, (3) F = Y = W, (4) L = I = V = M; Konservierungsgrad: G= 100 %, G= 80 %, G = 60 %; A. thaliana (At-PhyA-E); Avena sativa (As-PhyA); aus Synechocystis: Cph1; Cph2-GAF1 (N-terminale GAF-Domäne von Cph2); Cph2-GAF2 (mittlere GAF-Domäne von Cph2); Cph2-GAF3 (C-terminale GAF-Domäne von Cph2). Das chromophorbindende Cystein findet sich an Position 113 des Sequenz-Alignments.

1.3.2 Das cyanobakterielle Phytochrom 2 (Cph2)

Das zweite bekannte cyanobakterielle Phytochrom Cph2 (Cyanobase: sll0821) weist, wie Cph1, eine hohe Sequenzähnlichkeit der chromophorbindenden GAF-Domäne zu pflanzlichen Phytochromen auf (Abb. 3). Wie diese ist das Protein mit 1276 AS relativ groß. Cph2 besitzt im Vergleich zu Cph1 und den pflanzlichen Phytochromen eine ungewöhnliche Domänenarchitektur: Die für diese Photorezeptoren charakteristische Einteilung in eine N-terminale photosensorische Region und eine C-terminale regulatorische Region fehlt (Abb. 4). Cph2 zeigt keinerlei Sequenzhomologie zu Histidinkinasen oder den Serin/Threonin-Kinasen pflanzlicher Phytochrome. Stattdessen enthält Cph2 drei GAF-Domänen. Wu und Lagarias (2000) demonstrierten anhand eines in E. coli rekombinant exprimierten Cph2-Proteins sowie Cph2-Fragmenten, dass die beiden äußeren GAF-Domänen ein lineares Tetrapyrrol autokatalytisch binden können. Die Bindung von PΦB sowie PCB als Chromophor erfolgt am Cystein C129 der N-terminalen GAF1-Domäne und am C1022 der C-terminalen GAF3-Domäne. Die Bilinlyase-Aktivität der mittleren GAF-Domäne wurde bisher nicht nachgewiesen. Das konservierte Cystein ist in dieser Domäne nicht vorhanden (Abb. 5). Die beiden Chromophor-Bindungsdomänen weisen nicht die gleichen spektroskopischen Eigenschaften auf. Nur an die N-terminale GAF1-Domäne assembliertes PΦB oder PCB ist zur RL-FRL-Photokonversion befähigt, wobei sowohl die Absorptionsmaxima der Pfr- als auch der Pr-Form gegenüber den entsprechenden Konformationen von Cph1 in den kürzerwelligen Bereich verschoben sind (Park et al., 2000; Wu und Lagarias, 2000). Die GAF3-Domäne mit PCB als Addukt ist nicht photochromisch. Das im blauen Wellenlängenbereich liegende Absorptionsmaximum ist gegenüber dem im roten Bereich erhöht (Wu und Lagarias, 2000). Die gleichen Autoren vermuten, dass eine Region von 20 bis 23 AS in der Nähe des chromophorbindenden Cysteins für die Fähigkeit zur Photokonversion entscheidend ist. Diese Region fehlt in der AS-Sequenz der GAF3-Domäne. Welcher Chromophor in vivo an Cph2 bindet, ist nicht bekannt.

Der Cph2-Photorezeptor enthält die für Phytochrome ungewöhnlichen Domänen GGDEF und EAL (Abb. 4). Diese beiden Domänentypen sind mit Ausnahme obligater Parasiten unter den Eubakterien weit verbreitet. Oftmals sind sie Teil großer Multi-Domänen-Proteine, die experimentell kaum bzw. gar nicht charakterisiert sind. Interessanterweise wurden beide Domänentypen sowohl in sensorischen als auch regulatorischen Modulen prokaryotischer Signaltransduktionssysteme gefunden (Galperin et al., 2001). Die GGDEF-Domäne wurde zuerst als konserviertes Sequenzmotiv in der C-terminalen Region des Response-Regulators PleD in Caulobacter crescentus beschrieben. PleD ist in der Steuerung der Differenzierung von beweglichen Schwärmer- zu unbeweglichen Stielzellen involviert, in dem das Protein wahrscheinlich eine Immobilisierung der Schwärmerzelle durch Abschalten der Flagellum-Rotation und Bildung des charakteristischen Stieles auslöst (Hecht und Newton, 1995). In Acetobacter xylinum regulieren GGDEF-EAL-Domänen-Proteine die extrazelluläre Zellulose-Biosynthese. In diesem Zusammenhang wurde ein neuartiges Effektormolekül identifiziert, das zyklische Diguanosinmonophosphat (c-diGMP) (Galperin et al., 2001). Gegenwärtig wird die Funktion dieser Domänenkombination als c-diGMP-Zyklase bzw. -Phosphodiesterase diskutiert.

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Abb. 4 : Domänenarchitektur der Phytochrome und phytochromähnlichen Proteine in Synecho cystis Die Organisation der Domänen wurde mit dem Domänenanalyse-Programm Smart (http://smart.embl-heidelberg.de) bestimmt. GAF: Domänentyp, der zuerst in cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen, cyanobakteriellen Adenylatzyklasen und im Transkriptionsaktivator FhlA gefunden wurde. PFAM-phytochrome: entspricht der PHY-Domäne aus Abb. 2; PAS: siehe Abb. 2; PAC: Motiv, welches sich C-terminal der PAS-Domäne anschließt; HisKA (Dimerisations- und Phosphoakzeptor-Domäne) und HATPase_c sind Subdomänen der HK-Domäne; REC: CheY-homologe Receiver-Domäne; DUF1: entspricht der GGDEF-Domäne; DUF2: entspricht der EAL-Domäne; HAMP: Domäne in Histidinkinasen, Adenylylcyclasen, M ethyl binding proteins, Phosphatasen; MA: M ethyl- a ccepting chemotaxis-like domains (chemotaxis sensory transducer); TM: Transmembran-Domäne.

Über die Art der Signalweiterleitung vom Cph2-Photorezeptor auf ein Akzeptormolekül liegen keinerlei Erkenntnisse vor. Wie bereits erwähnt, besitzt Cph2 keine HK-Domäne, so dass die Signaltransduktion nicht über ein klassisches Zwei-Komponenten-System stattfinden kann. Eine Weiterleitung des Signals könnte über Protein-Protein-Interaktion erfolgen oder über eine mögliche Zyklisierung bzw. Aufspaltung von c-diGMP. Beide Prozesse wurden für Cph2 bisher nicht nachgewiesen.

1.3.3 Phytochromähnliche Proteine in Synechocystis

Das Synechocystis-Chromosom enthält weitere ORFs mit teilweise geringer Ähnlichkeit ihrer Genprodukte zu pflanzlichen Phytochromen (Abb. 4). Da ihre Fähigkeit zur Photokonversion nicht nachgewiesen wurde, werden diese Proteine zu der Gruppe der phytochromähnlichen Proteine zusammengefasst. Nur für wenige phytochromähnliche Proteine wurde Bilinlyase-Aktivität dokumentiert.

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In der Vergangenheit wurden verschiedene Klassifizierungsmöglichkeiten bakterieller Phytochrome vorgeschlagen. So teilen Montgomery und Lagarias (2002) diese Proteine hinsichtlich der Domänenarchitektur in die Familien (1) Cph1, (2) Cph2 und (3) phytochromähnliche Proteine ein, wonach die in diesem Kapitel beschriebenen Proteine zu einer eigenständigen Gruppe zusammengefasst werden. Vierstra und Davis (2000) betrachten nur den bekannten bzw. vermuteten Bindungsort des Chromophors innerhalb der GAF-Domäne. Demnach lassen sich die bakteriellen Phytochrome bzw. phytochromähnlichen Proteine in eine CH-, XH und eine CL-Gruppe einteilen. Im Fall der erstgenannten CH-Gruppe folgt dem chromophorbindenden Cystein ein Histidin, welches für die Anheftung des Chromophors und dessen Photochromozität eine wichtige Rolle spielt (Vierstra und Davis, 2000). Zu diesem Typ gehören alle bekannten Phytochrome aus Pflanzen sowie Cph1, Cph2 und einige Vertreter der phytochromähnlichen Proteine. Bei dem CL-Typ befindet sich an der Stelle des konservierten Histidins ein Leucin. Bei der XH-Gruppe fehlt das konservierte Cystein. Stattdessen ist diese Position durch eine hydrophobe Aminosäure wie Leucin, Valin oder Methionin besetzt. Ein Beispiel für diesen Typus stellt CphB aus Calothrix sp. PCC 7601 dar. Bei diesem Protein wird ein lineares Tetrapyrrol nichtkovalent an ein Leucin gebunden. Trotzdem konnte für CphB die Fähigkeit zur Photokonversion mit einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von Pfr und Pr in den längerwelligen Bereich nachgewiesen werden (Jorissen et al., 2002). Bei dem Photorezeptor Agp1 aus Agrobacterium tumesfaciens befindet sich auf der Cysteinposition ein Valin. Doch als Bindungsort des Chromophors erwies sich das Cystein C20 außerhalb der GAF-Domäne (Lamparter et al., 2002).

Für Synechocystis wurde eine Zahl von 10 phytochromähnlichen Proteinen angenommen (Montgomery und Lagarias, 2002). Über die Mitglieder dieser Gruppe wurde, mit Ausnahme von PlpA und PixJ1, wenig publiziert. In Abb. 5 ist ein multiples Alignment der Aminosäuresequenz der GAF-Domänen aus den phytochromähnlichen Proteinen sowie den echten Phytochromen aus Synecho cystis (Cph1 und Cph2) und höheren Pflanzen (At-PhyA-E und As-PhyA) dargestellt.

Abb. 5 : Multiples Sequenz-Alignment zwischen der chromophorbindenden Region inner halb der GAF-Domänen pflanzlicher Phyto chrome und den GAF-Domänen von Phytochromen bzw. phytochromähnlichen Proteinen aus Synechocystis Ähnlichkeitsgruppierungen: (1) D = E, (2) K = R, (3) F = Y = W, (4) L = I = V = M; Konservierungsgrad: G= 100 %, G= 80 %, G = 60 %; A. thaliana (At-PhyA-E); Avena sativa (As-PhyA); aus Synecho cystis: Cph1; Cph2-GAF1 (N-terminale GAF-Domäne von Cph2); Cph2-GAF2 (mittlere GAF-Domäne von Cph2); Cph2-GAF3 (C-terminale GAF-Domäne von Cph2); PlpA; PixJ1-GAF1 (N-terminale GAF-Domäne von PixJ1); PixJ1-GAF2 (C-terminale GAF-Domäne von PixJ1); Sll1473; Slr1212; Slr1393-G1 (N-terminale GAF-Domäne von Slr1393); Slr1393-G2 (mittlere GAF-Domäne von Slr1393); Slr1393-G3 (C-terminale GAF-Domäne von Slr1393); Slr1969. Das chromophorbindende Cystein findet sich an Position 61 des Sequenz-Alignments.

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Das phytochromähnliche Protein PlpA ( p hytochrome l ike p rotein A;Cyanobase: sll1124) ist der erste potentielle Photorezeptor in Synechocystis, zu dem Resultate physiologischer Untersuchungen veröffentlicht wurden. Diese verdeutlichten, dass PlpA eine Funktion für das photoautotrophe Wachstum im BL ausübt (Wilde et al., 1997). Die molekulare Ursache für den im BL beobachteten Phänotyp konnte jedoch bisher nicht geklärt werden. Das 1371 AS lange PlpA ist ein Multidomänen-Protein (Abb. 4). Der N-Terminus besitzt keine Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen. Der mittlere Teil des Proteins besteht aus einer Reihe von PAS- und PAC-Domänen sowie einer GAF-Domäne mit einer begrenzten Ähnlichkeit (25 % Übereinstimmung, 45 % Ähnlichkeit) zu den Chromophor-Bindungsdomänen bekannter pflanzlicher Phytochrome. Die Fähigkeit von PlpA ein Chromophor zu binden, konnte bisher nicht gezeigt werden. Zwar ist das konservierte Cystein vorhanden, jedoch befindet sich an der Stelle des benachbarten Histidins ein Alanin (Abb. 5). Der C-Terminus besitzt Ähnlichkeit zu HK-Domänen. Dies lässt auf eine mögliche Signalweiterleitung über ein Zwei-Komponenten-System schließen. Der Response-Regulator von PlpA konnte noch nicht identifiziert werden. Das plpA-Gen bildet nicht wie cph1 ein Operon mit einem ORF, der für einen Response-Regulator kodiert.

Das phytochromähnliche Protein PixJ1 (auch TaxD1 oder PisJ1; cyanobase: sll0041) wurde durch die unabhängig voneinander arbeitenden Forschungsgruppen von M. Ikeuchi und A. Grossman in Zusammenhang mit Studien der lichtinduzierten Motilität von Synecho cystis als ein Regulator der positiven Phototaxis entdeckt (Yoshihara et al., 2000; Bhaya et al., 2001a). Untersuchungen des Einflusses von Lichtintensität und Spektralfarbe auf das phototaktische Verhalten von pixJ1-knockou t-Mutanten verweisen auf eine Rolle des PixJ1-Proteins als low-fluence-response-Photorezeptor, der die positive Phototaxis im roten Wellenlängenbereich reguliert (Ng et al., 2003). Interessanterweise konnten Yoshihara und Ikeuchi (2004) eine Photokonversion des aus Synechocystis isolierten PixJ1-Proteins zwischen einer GL-absorbierenden und einer BL-absorbierenden Form dokumentieren.

In die Ausprägung der Motilität ist eine Vielzahl von Genen involviert. Teilweise sind diese, wie auch sll0041, in zwei großen Genclustern angeordnet. Die vorhergesagten Genprodukte dieser Gencluster besitzen Ähnlichkeit zu den Regulatorkomponenten der Chemotaxis (Che-Proteine) in Enterobakterien (Yoshihara et al., 2002).

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Wie Cph2 weist das PixJ1-Protein für Phytochrome eine vergleichsweise ungewöhnliche Domänenarchitektur auf (Abb. 4). Im Protein sind zwei GAF-Domänen mit Ähnlichkeit zu den chromophorbindenden GAF-Domänen pflanzlicher Phytochrome enthalten (Abb. 5), wobei ein Chromophor unbekannter Natur an die C-terminale Domäne gebunden wird (Yoshihara und Ikeuchi, 2004). Neben der Sequenzähnlichkeit zu Phytochromen besitzt dieses Protein im C-terminalen Bereich Ähnlichkeit zu konservierten Domänen des Che-Proteins MCP. Die Methyltransferase CheR methyliert spezifische Glutamat-Reste in der MCP-Domäne (im Domänen-Suchprogramm Smart als MA-Domäne betitelt).

Die Entfernung der Methyl-Gruppe erfolgt durch die Methylesterase CheB. Jedoch konnte im Synechocystis-Genom kein CheR-Homolog gefunden werden, sodass eine Methylierung von PixJ1 fraglich ist (Yoshihara et al., 2000).

Wie das Vorhandensein einer Transmembran-Domäne andeutet, könnte PixJ1 möglicherweise mit der Plasmamembran assoziiert sein. Im Fall des PixJ1-Homologs SepixJ aus Synechococcus elongatus konnte dies erfolgreich mittels Immunogold-Markierung nachgewiesen werden (Konou et al., 2002).

1.4 Die BL-Rezeptoren

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Bereits im 19. Jahrhundert dokumentierten Sachs und Darwin BL-Reaktionen von Pflanzen, wie Phototropismus und das Öffnen der Stomata (zitiert in Briggs und Christie, 2002). Trotzdem blieb die Suche nach der Identität der verantwortlichen Photorezeptoren lange Zeit erfolglos. Erst 1993 wurde das Cryptochrom 1 (Cry1) in A. thaliana entdeckt (Ahmad und Cashmore, 1993), welches für die BL-vermittelte Inhibition des Hypokotyllängenwachstums sowie für die Kontrolle der Anthocyanakkumulation in Keimlingen verantwortlich ist (Ahmad et al., 1995). Die Phototropine, eine weitere Klasse von BL-Rezeptoren, wurden infolge genetischer Studien von Arabidopsis-Mutanten mit der Unfähigkeit des Hypokotyls zum Phototropismus identifiziert (Liscum und Briggs, 1995).

Cryptochrome besitzen Ähnlichkeit zu den DNA-reparierenden Photolyasen (Ahmad und Cashmore, 1993). Dies betrifft nicht nur die Aminosäuresequenz, sondern auch die Art der Chromophor-Kofaktoren und die lichtabhängige Arbeitsweise (Malhotra et al., 1995). Das 70 bis 80 kDa große Cryptochrommolekül bildet zwei erkennbare Regionen aus: Über weite Bereiche des Proteins erstreckt sich die PHR-Domäne ( ph otolyase- r elated) mit Sequenzähnlichkeit zu mikrobiellen Photolyasen (Ahmad und Cashmore, 1993). Am C-terminalen Ende des Cryptochroms aus Pflanzen befindet sich ein zusätzlicher Sequenzabschnitt variierender Länge. Dieser ist in Photolyasen nicht enthalten und besitzt keine große Sequenzähnlichkeit zu bekannten Proteinen (Lin, 2002). Jedoch scheint dieser Sequenzabschnitt im Fall von Cry1 und 2 aus A. thaliana für deren Funktion bedeutend zu sein (Ahmad et al., 1995; Yang et al., 2000). Experimente mit Fusionsproteinen von GUS (β-Glucuronidase) und der C-terminalen Domäne des Cry1- oder Cry2-Proteins aus A. thaliana deuten auf eine Funktion dieses Proteinabschnitts bei der Weiterleitung des Signals (Yang et al., 2000). Trotz seiner variablen Länge konnten drei Sequenz-Motive in dem C-terminalen Bereich sowohl in Cryptochromen aus höheren als auch aus niederen Pflanzen ermittelt werden, die zusammen die DAS-Domäne (DQXVP-acidic-STAES) bilden (Lin und Shalitin, 2003).

Photolyasen binden zwei verschiedene Kofaktoren. Im N-terminalen Bereich befindet sich entweder ein Pterin (Methenyltetrahydrofolat) oder ein Deazaflavin mit Lichtsammelfunktion. Die Anregungsenergie wird zu einem katalytisch wirkenden Chromophor (ein Flavinadeninnukleotid) am C-Terminus weitergeleitet (Cashmore et al., 1999). Die meisten der für die Bindung des Chromophors wichtigen Aminosäuren sind auch in Cryptochromen konserviert (Lin, 2002).

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Die Art der photochemischen Reaktion nach der Perzeption des Lichtreizes konnte bisher nicht aufgeklärt werden. Aufgrund der Ähnlichkeit zu Photolyasen ist ein Photozyklus mit einer Elektronenübertragung zwischen Pterin und Flavinadeninnukleotid denkbar (Sancar, 2003). Über die weitere Signalübertragung ist bekannt, dass Cry1 aus A. thaliana direkt mit COP1 interagiert (Wang et al., 2001). Es wird angenommen, dass COP1 eine E3-Ubiquitin-Ligase zum gezielten Abbau des Transkriptionsfaktors HY5 über ein 26S-Proteasom darstellt (Wang et al., 2001). Eine Interaktion zwischen Phytochrom und Cryptochrom in A. thaliana wurde in Kapitel 1.2.3 beschrieben. Interessanterweise konnte Bouly et al. (2003) in vitro eine lichtstimulierte Autophosphorylierung eines Serin-Restes im Cry1 aus A. thaliana sowie eines Serin-Restes im Cry1 aus Homo sapiens nachweisen. Eine BL-abhängige Phosphorylierung des Cry1- und des Cry2-Proteins aus A. thaliana in vivo zeigten Shalitin et al. (2003) und (2002). Die tatsächliche Funktion dieser Autophosphorylierungsaktivität konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Allerdings deuten bisherige Resultate von Cry1 und 2 daraufhin, dass die Phosphorylierung eine Rolle bei der Funktion sowie Stabilität beider Proteine spielt (Shalitin et al., 2002; Shalitin et al., 2003).

Der BL-Rezeptor Cryptochrom ist im Pflanzen- und Tierreich weit verbreitet. Kürzlich veröffentlichte Arbeiten lieferten Indizien für das Vorhandensein eines potentiellen Cryptochroms in Synechocystis (Cry; auch PhrB, cyanobase: sll1629) (Hitomi et al., 2000; Ng und Pakrasi, 2001), welches einer neuen Cryptochrom-Klasse mit der Bezeichnung DASH ( D rosophila melanogaster, A . thaliana, S ynechocystis, H omo sapiens) zugeordnet werden konnte (Brudler et al., 2003). Die phylogenetische Analyse von Cry aus Synechocystis zeigte eine nähere Verwandschaft dieses Proteins zu Cryptochromen aus Tieren als zu Cry1 und Cry2 aus A. thaliana (Brudler et al., 2003). Die Bindung des Kofaktors Flavinadeninnukleotid konnte beschrieben werden (Hitomi et al., 2000). Brudler et al. (2003) postulierten, dass das Cry als ein Repressor in der transkriptionellen Regulation in Synechocystis fungieren könnte.

Der zweite BL-Rezeptortyp Phototropin stellt ein Protein mit einer C-terminalen Serin/Threonin-Kinase und zwei chromophorbindenden PAS-Domänen im N-terminalen Bereich dar (Briggs und Christie, 2002). Die letzteren beiden Domänen gehören einer Untergruppe von PAS-Domänen an, die häufig Bestandteil von Proteinen sind, die durch Licht ( l ight), Sauerstoff ( o xygen) und Redoxpotential ( v oltage) reguliert werden und deshalb als eine eigene Gruppe mit der Bezeichnung LOV zusammengefasst wurden (Lin, 2002; Crosson et al., 2003). Beide LOV-Domänen binden ein Flavinmononukleotid, welches nach Lichtanregung einen Photozyklus durchläuft. Während dieses Photozyklus’ geht der Flavinmononukleotid-Kofaktor eine Bindung mit der Sulfatgruppe eines Cysteins ein. Die daraus resultierende Konformationsänderung aktiviert wahrscheinlich die Serin/Threonin-Kinase, was eine Signalweiterleitung initiieren könnte (Briggs und Christie, 2002).

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Ein phototropinkodierender ORF konnte in Synechocystis nicht entdeckt werden. Jedoch existiert im Synechocystis-Genom mindestens ein Gen (slr0359), dessen Genprodukt eine LOV-Domäne enthält. Hinsichtlich seiner Domänenarchitektur unterscheidet sich das Protein stark von den Phototropinen. Slr0359 stellt vielmehr ein Multidomänenprotein mit PAS-Domänen sowie einer GGDEF- und einer EAL-Domäne dar. Crosson et al. (2003) ordnet dieses Protein in die Gruppe der LOV-Phosphodiesterasen ein. Da das photoaktive Cystein sowie ein Großteil der mit dem Chromophor interagierenden Aminosäuren in der LOV-Domäne des Slr0359-Proteins vorhanden sind, postulieren die Autoren BL-Absorptionsfähigkeit dieser Domäne und eine Regulation der Proteinaktivität durch Licht.

Eine weitere BL-Photorezeptorfamilie stellen die BLUF-Proteine dar. Kennzeichnend für diese Klasse ist das Vorhandensein einer BLUF-Domäne (Gomelsky und Klug, 2002). Der bekannteste Vertreter ist AppA aus Rhodobacter sphaeroides, wo über die Bildung eines AppA-PpsR2-Komplexes die Expression von Photosynthesegenen in Abhängigkeit von der BL-Intensität sowie in Abhängigkeit vom Redox-Status der Zelle kontrolliert wird (Masuda und Bauer, 2002). Die chromophore Gruppe dieses Photorezeptors ist ein Flavinadenindinukleotid, das nichtkovalent an die BLUF-Domäne am N-Terminus gebunden ist (Gomelsky und Kaplan, 1998; Gomelsky und Klug, 2002). Die initiierende Photochemie und die signalauslösende Strukturänderung dieser Photorezeptorfamilie konnte noch nicht völlig aufgeklärt werden. BLUF-Proteine lassen sich in zwei Untergruppen einteilen: (1) komplexe Multidomänen-Proteine und (2) kurze Proteine bestehend aus der BLUF-Domäne und 30 bis 70 AS (Gomelsky und Klug, 2002). In die erste Untergruppe lässt sich das AppA einordnen sowie das PAC-Protein ( p hotoactivated a denylyl c yclase) aus Euglena gracilis, die photophobische Reaktionen dieser Alge reguliert (Iseki et al., 2002). Zur zweiten Untergruppe gehört das Genprodukt von slr1694 aus Syne chocystis mit bisher unbekannter Funktion.

Vertreter des BL-Rezeptortyps Xanthopsin sind das photoactive yellow protein (PYP) aus Ectothiorhodospira halophila mit der Funktion der Vermittlung photophobischer Reaktionen (van der Horst und Hellingwerf, 2004) sowie das PYP-Phytochrom-Fusionsprotein Prp aus Rhodospirillum centeum (Jiang et al., 1999). Die Absorption von Licht bewirkt eine Konformationsänderung des Proteins über eine trans-cis-Isomerisierung des Chromophors trans-p-Coumarinsäure (Braatsch und Klug, 2004; van der Horst und Hellingwerf, 2004).

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Die membranassoziierten Rhodopsine sind hauptsächlich als Lichtsensor und Ionenpumpe in Archaea (Spudich, 1998) sowie als Sehfarbstoff in Augen von Vertebraten bekannt (Garriga und Manyosa, 2002). Das Apoprotein Opsin bindet als Chromophor das lineare Polyen Retinal. Das Rhodopsin wird durch eine trans-cis-Isomerisierung des Retinals nach der Aufnahme eines Photons aktiviert (van der Horst und Hellingwerf, 2004). In Halobacterium salinarium steuern die Sensorrhodopsine I und II die Phototaxis dieses Archaeons (Spudich, 1998). In der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii wird die lichtinduzierte Motilität ebenfalls durch zwei Rhodopsine vermittelt (Sineshchenkov et al., 2002; Beckmann und Hegemann, 1991). Weiterhin wurden opsinkodierende Gene in Neurospora crassa (Bieszke et al., 1999) und in Anabaena sp. PCC 7120 (Jung et al., 2003) gefunden.

1.5 Die lichtinduzierte Motilität

Verschiedene Cyanobakterienspezies sind zu einer aktiven Ortsveränderung befähigt, wodurch günstigere Umgebungen aufgesucht werden können. Zu den Umweltfaktoren, die Motilität auslösen können, zählt das Licht. Die lichtinduzierte Motilität wird in verschiedene Bewegungstypen unterteilt, die als Phototaxis, Photokinese und photophobische Reaktion bezeichnet werden (Häder, 1979). Die Phototaxis beschreibt die gerichtete Bewegung entlang eines Lichtgradienten. Die Abhängigkeit der Laufgeschwindigkeit von der Lichtintensität wird Photokinese genannt. Photophobische Reaktionen beschreiben kurzzeitige Bewegungen, die durch ein plötzliches Ansteigen oder Absinken der Lichtintensität ausgelöst werden.

Synechocystis sp. PCC 6803 weist ebenfalls einen motilen Phänotyp auf. Die Zellen können sich vermutlich nicht frei im Wasser bewegen, sondern benötigen hierfür eine feste Oberfläche. Wie bei Pseudomonas aeruginosa (McBride, 2001) sind für die Fortbewegung der Synechocystis-Zellen sogannte TypIV-Pili notwendig (Bhaya et al., 1999; Bhaya et al., 2000). Die Art der Bewegung wird als twitching oder gliding motility bezeichnet. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Synechocystis-Zellen ist vergleichsweise langsam. So betrug die von Choi et al. (1999) ermittelte Höchstgeschwindigkeit 15,8 µm min-1.

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In den letzten Jahren konnte eine Vielzahl von Genen in Synechocystis identifiziert werden, deren Produkte für die Motilität notwendig sind (Bhaya et al., 2001b; Yoshihara und Ikeuchi, 2004). Aktionsstudien der lichtinduzierten Motilität deuten auf das Wirken mehrerer Photorezeptoren bei der Steuerung der Zellbewegung hin (Choi et al., 1999; Ng et al., 2003). Wie in Kap. 1.3.3 beschrieben wurde, konnte die Funktion des phytochromähnlichen Proteins PixJ1 als ein Regulator der positiven Phototaxis nachgewiesen werden (Yoshihara et al., 2000; Bhaya et al., 2001a). Das PixJ1-kodierende Gen sll0041 ist Bestandteil eines Genclusters, dessen Genprodukte Ähnlichkeit zu den Regulatorkomponenten der Chemotaxis in Enterobakterien CheY, CheW, CheA und MCP aufweisen (Yoshihara et al., 2002). Das PixJ1-Protein entspricht hierbei dem MCP ( m ethyl-accepting c hemoreceptor p rotein) (Yoshihara et al., 2000; Bhaya et al., 2001a). Die übrigen durch dieses Gencluster kodierten Proteine zeigten sich ebenfalls als notwendig für die positive Phototaxis (Yoshihara et al., 2002). Der pilG-Gencluster kodiert für Proteine, die für die Bildung der TypIV-Pili notwendig sind (Yoshihara et al., 2002). Ein Pilus besteht hauptsächlich aus Pilin-Untereinheiten, die durch die pilA-Gene kodiert werden. Das Synechocystis-Genom enthält mehrere pilA-Gene, von denen jedoch nur die Inaktivierung von pilA1 zu einem Verlust der Motilität führte (Bhaya et al., 1999; Yoshihara et al., 2001; Bhaya, 2004). Die Proteine PilB1 und PilT1 werden als Motoren der Zellbewegung angesehen, indem sie die Extension und Retraktion der TypIV-Pili steuern (Bhaya et al., 2000; Bhaya, 2004). Weiterhin konnte die Funktion der Serin/Threonin-Kinasen SpkA (Kamei et al., 2001), SpkB (Kamei et al., 2003) und SpkE (Kim et al., 2004) sowie der Adenylat-Zyklase Cya1 (Terauchi und Ohmori, 1999) und des cAMP-Rezeptorproteins SYCRP1 (Yoshimura et al., 2002b) in der Motilität nachgewiesen werden.

Obwohl bereits eine ganze Reihe von Genprodukten mit einer Funktion in der lichtinduzierten oder generellen Motilität identifiziert werden konnte, existieren noch viele offene Fragen: Welche Photorezeptoren spielen neben dem beschriebenen PixJ1-Protein für eine phototaktische Reaktion eine Rolle? Wie werden die verschiedenen Signale integriert? Wie löst die Signalkette die Bewegung der Zelle aus?

1.6 Zielstellung

Zu Beginn der Arbeit war die Funktion der beiden cyanobakteriellen Phytochrome Cph1 und Cph2 in Synechocystis unbekannt. Daher wurden Mutanten mit einem inaktivierten cph1 bzw. cph2-Gen hergestellt. Desweiteren wurde eine Doppelmutante beider Gene erzeugt, um mögliche kompensatorische oder überlappende Funktionen von Cph1 und Cph2 aufzuspüren.

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Die Aufklärung der Funktion der beiden Phytochrome beinhaltete eine Wachstumsanalyse unter verschiedenen Lichtqualitäten sowie Lichtintensitäten. Bei der Ergründung der Ursachen für die Wachstumsminderung der Phytochrommutanten stand die Untersuchung der Photosynthese mit verschiedenen Methoden im Mittelpunkt. Dazu gehörten die Analyse der Pigmentzusammensetzung, die Messung der Sauerstofffreisetzung und die Aufnahme von 77K-Fluoreszenzspektren.

Einen weiteren Schwerpunkt stellte die Untersuchung der lichtgerichteten Motilität dar. Für Synechocystis wird angenommen, dass die Steuerung der Zellbewegung über mehrere Photorezeptoren erfolgt. Zu Beginn dieser Arbeit war in Synechocystis kein Photorezeptor mit einer Funktion in der Regulation der Motilität bekannt. Das phototaktische Verhalten der Phytochrommutanten wurde unter verschiedenen Lichtqualitäten untersucht. Die Studien zur lichtgerichteten Motilität schlossen Mutanten weiterer photorezeptorkodierender Gene ein.


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01.11.2005