3 Ergebnisse

3.1 Konstruktion der cph1- und der cph2- knockout-Mutante

↓50

Für die Untersuchung der Funktion der cyanobakteriellen Phytochrome Cph1 und Cph2 wurden durch den Einbau von Antibiokaresistenzgen-Kassetten verschiedene Deletions- und Insertionsmutanten erzeugt. Da die Insertion eines Antibiotikaresistenzgens, unabhängig vom inaktivierten Gen, phänotypische Effekte verursachen könnte, wurden Km-resistente und Cm-resistente Mutanten von beiden Phytochromen untersucht.

Zur Inaktivierung von cph1 (slr0473) wurde die Cm-Resistenzgen-Kassette zwischen zwei BalI-Restriktionsschnittstellen in sense-Richtung zum Gen eingefügt, die Km-Resistenzgen-Kassette hingegen wurde zwischen zwei HindII-Restriktionsorte sowohl in sense als auch in antisense-Richtung eingebaut (Abb. 8). Für die Mutagenese von cph2 (sll0821) wurde die Cm-Resistenzgen-Kassette in antisense-Ausrichtung in den StuI-Restriktionsort und die Km-Resistenzgen-Kassette in beiden Orientierungen zwischen die Restriktionsstellen StuI und SwaI inseriert (Abb. 8). Eine detailliertere Beschreibung der Mutagenese beider Phytochromgene findet sich bei Wilde et al. (2002).

↓51

Um mögliche kompensatorische oder überlappende Funktionen von Cph1 und Cph2 zu erfassen, wurde eine cph1 - /cph2 - -Doppelmutante konstruiert. Hierfür wurden die Konstrukte, die eine Km-Resistenzgen-Kassette enthalten, in die entsprechende Cm-resistente cph1 - - bzw. cph2 - -Einzelmutante von Synechocystis transferiert.

Für die Untersuchung der Phototaxis wurde eine weitere cph2 --Mutante konstruiert, bei der das cph2-Gen in seiner gesamten Länge durch eine Km- oder Cm-Kassette ersetzt wurde. Zu diesem Zweck wurde cph2 sowie die flankierenden Bereiche mittels der Primerpaare cph2-5L/cph2-3955R, cph2-3955L/cph2-4900R und slr0846FW/slr0846RV (Tab. 2) amplifiziert und die resultierenden PCR-Produkte in den pGEM-T-Vektor (Promega) kloniert. Anschließend wurden die verschiedenen Fragmente mittels geeigneter Restriktionsorte (ApaI und BsaBI) zusammengefügt. Die Antibiotikaresistenzgen-Kassetten wurden in sense- und antisense-Ausrichtung zu cph2 zwischen die Restriktionsorte NheI und BsaBI eingebaut (Abb. 8).

Die Transformation der genannten Konstrukte erfolgte wie bei Ermakova et al. (1993) beschrieben. Die Transformanten wurden auf der Basis der entsprechenden Resistenz selektiert und mittels PCR oder Southern-Blot-Analyse charakterisiert. Für alle Gene konnten homozygote Mutanten durch den Einbau von jeweils einer Kopie des entsprechenden Konstrukts gewonnen werden.

↓52

Abb. 8 : Schema zur Mutantenkonstruktion. Die verschiedenen Varianten von cph1 - und cph2 - wurden für die Analyse des Wachstumsverhaltens sowie für die Untersuchung der lichtinduzierten Motilität verwendet. Bei der Δcph2 --Mutante wurde das cph2-Gen vollständig entfernt. Dieser Mutantentyp wurde nur für Phototaxisexperimente genutzt.

3.2 Analyse der lichtabhängigen cph 1- und cph 2-Transkription

Zu Beginn der Arbeit lagen wenige Erkenntnisse über die Photoregulation der cph1- und cph2-Transkriptakkumulation vor. Daher wurde die Menge an cph1-mRNA und cph2-mRNA unter verschiedenen Lichtbedingungen im WT bzw. in den beiden Phytochrommutanten cph1 - und cph2 - analysiert. Hierfür wurden zunächst Kulturen vom WT und den Mutanten im ML angezogen und anschließend die Zellen für 1 h ins HL, Dunkel, BL, GL, RL und FRL gestellt. Die Lichtbedingungen für die Transkriptionsstudien entsprachen denen der Wachstumsanalysen.

Die Akkumulation des cph1-Transkripts wies nach einer einstündigen Inkubation unter verschiedenen Lichtbedingungen eine Zu- bzw. Abnahme unterschiedlichen Ausmaßes gegenüber der Akkumulation im ML auf (Abb. 9A). Der stärkste Anstieg des cph1-Transkriptniveaus (650 % des ML-Wertes) wurde unter FRL-Bedingungen beobachtet. Ebenso war die Menge an cph1-mRNA nach der Belichtung mit GL (350 % des ML-Wertes) sowie nach 1 h unter völligem Lichtausschluss (280 %) erhöht. Dahingegen war unter HL-Bedingungen die Transkriptakkumulation auf 15 % des ML-Wertes reduziert. Keine Änderung im cph1-Transkriptniveau wurde für RL ermittelt. Aufgrund der hohen Standardabweichung verbunden mit einer relativ geringen Zunahme der cph1-mRNA-Menge gegenüber dem ML-Wert kann nicht von einem eindeutigen Einfluss von BL auf die Transkriptakkumulation von cph1 gesprochen werden.

↓53

Abb. 9 : Lichtabhängige Änderung der cph1 - mRNA-Akkumulation im WT und der cph2 - -Mutante (A) sowie lichtabhängige Änderung der cph2 - mRNA-Akkumulation im WT (B) Die Änderung des Transkriptniveaus ist in Prozent des ML-Wertes dargestellt. Die Zellen aus einer Kultur, die unter ML-Bedingungen (30 µmol m-2 s-1) angezogen wurde, wurden für 1 h mit HL (165 µmol m-2 s-1), BL (12 µmol m-2 s-1), GL (8 µmol m-2 s-1), RL (15 µmol m-2 s-1) und FRL (0,3 W m-2) belichtet bzw. wurden für 1 h im Dunkeln (D) gehalten. Die Gesamt-RNA wurde isoliert. Nach der Entfernung der DNA erfolgte die cDNA-Synthese. Die Transkriptmenge wurde mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt und auf die 16S-RNA-Menge normiert, wobei jeweils der Mittelwert von Triplikaten in die Berechnung einbezogen wurde. Die Säulen repräsentieren den Mittelwert, der aus jeweils 1 oder 2 cDNA-Synthesen von 3 unabhängigen Belichtungsreihen kalkuliert wurde. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Im Gegensatz zu cph1 konnte für cph2 keine klare Lichtabhängigkeit der Transkriptmenge ermittelt werden (Abb. 9B). Cph2 wurde unter allen Lichtbedingungen transkribiert. Jedoch wies die cph2-Transkriptmenge nach dem Wechsel von ML in ein anderes Licht zwischen den verschiedenen Kulturen ein stark variables Verhalten auf, was in einer großen Streuung der Transkriptdaten resultierte.

Zur Untersuchung einer möglichen Autoregulation der cph1- und cph2-Transkription wurden Zellen der cph1 -- und cph2 --Mutante mit den gleichen Lichtbedingungen behandelt wie der WT. Im Ergebnis der cph1-mRNA- und cph2-mRNA-Analyse wurden ähnlich hohe Mengen dieser Transkripte ermittelt wie für den WT (Daten nicht gezeigt). Die lichtabhängige Änderung der cph1-Transkriptakkumulation in der cph1 --Mutante entsprach der beim WT beobachteten (Daten nicht gezeigt). Somit konnte kein regulatorischer Einfluss der Phytochrome Cph1 und Cph2 auf die Akkumulation ihrer Transkripte festgestellt werden.

↓54

Weiterhin wurde die Photoregulation der cph1-Transkriptmenge in der cph2 --Mutante sowie die Lichtregulation der cph2-Transkriptmenge in der cph1 --Mutante untersucht. Während sich die cph2-mRNA-Akkumulation in der cph1 --Mutante nicht von den Werten des WTs unterschied (Daten nicht gezeigt), bewirkte die cph2-Inaktivierung eine gegenüber dem WT veränderte Lichtregulation des cph1-Transkriptniveaus (Abb. 9A). In der cph2 --Mutante wurde der beim WT beobachtete Anstieg der cph1-Transkriptakkumulation im Dunkeln unterdrückt, so dass sich das Transkriptniveau im Dunkeln kaum vom ML-Wert unterschied. Im GL und FRL wurde, wie beim WT, eine Zunahme der cph1-mRNA-Akkumulation gegenüber dem ML-Wert gemessen (Abb. 9A). Jedoch war dieser Anstieg bei der cph2 --Mutante schwächer als beim WT. Die für die cph2 --Mutante ermittelte cph1-Transkriptmenge im BL entsprach nahezu dem ML-Wert. Unter dieser Lichtbedingung wurde beim WT ein durchschnittlicher Anstieg des cph1-Transkriptniveaus gemessen. Da jedoch die Standardabweichung sehr hoch war, konnte für den WT keine eindeutige Lichtregulation der cph1-Transkritptmenge im BL nachgewiesen werden. Daher zeigte die cph2-Inaktivierung keine Wirkung auf die cph1-Transkriptakkumulation im BL.

Im Gegensatz zu cph2 wies cph1 eine Photoregulation seiner Transkriptmenge auf. Weiterhin konnte ein Einfluss des Photorezeptors Cph2 auf die lichtabhängige Änderung des cph1-Transkriptmenge, besonders im Dunkeln, festgestellt werden.

3.3 Untersuchung des Wachstumsverhaltens

3.3.1 Einfluss verschiedener Lichtbedingungen auf das Wachstum des WTs und der Phytochrommutanten

Pflanzliche Phytochrome steuern eine Reihe von photomorphogenetischen Prozessen über die Wahrnehmung des Anteils von RL und FRL in ihrer Umgebung. Im Gegensatz dazu sind die Funktion cyanobakterieller Phytochrome sowie die Anforderungen an das Lichtregime zur Auslösung einer Reaktion dieser Photorezeptoren bisher unbekannt. Daher wurde zunächst das Wachstumsverhalten der Inaktivierungsmutanten von cph1 und cph2 unter kontinuierlichem RL und FRL analysiert. Weiterhin wurde der Einfluss verschiedener Lichtintensitäten sowie der Spektralfarben grün und blau auf das Wachstum untersucht. Für die Bestimmung der Wachstumsrate (µ) wuchsen der WT und die Phytochrommutanten in zeitgleich angezogenen Kulturen. Dies ließ eine Darstellung von µ in Prozent des WT-Wertes zu.

↓55

Die cph1 -- und die cph2 --Mutante zeigten unter RL und FRL ein gegensätzliches Verhalten: Während die cph1 --Mutante unter FRL im Vergleich zum WT schlechter wuchs, war das Wachstum der cph2 --Mutante im RL beeinträchtigt (Abb. 10). Die durchschnittlichen Wachstumsraten von cph1 - im FRL waren auf 65 % und von cph2 - unter RL auf 77 % des WT-Wertes reduziert. Unter Starklichtbedingungen (HL) war das Wachstum sowohl der cph1 --Mutante (55 % vom WT) als auch der cph2 --Mutante (75 % vom WT) gehemmt (Abb. 10). Mit sinkenden Lichtintensitäten nimmt auch die Wachstumsreduktion der Phytochrommutanten ab: Unter mittleren Lichtbedingungen ließ sich nur noch eine geringe Beeinträchtigung des Wachstums beobachten, unter Schwachlicht verschwand diese völlig. Die Einstrahlung von grünem und blauem Licht zeigte keine Wirkung auf das Wachstumsverhalten der Phytochrommutanten.

Um mögliche kompensatorische Effekte zu finden, wurde das Wachstumsverhalten der cph1 -/cph2 --Doppelmutante analysiert. Diese verhielt sich jedoch wie die Einzelmutanten: Wie bei cph2 - war das Wachstum unter RL vermindert (84 % vom WT). Eine Reduktion des Wachstums vergleichbar mit der von cph1 - wurde für FRL (55 % vom WT) und HL (56 % vom WT) ermittelt (Abb. 10).

Insgesamt konnte ein Einfluss des Phytochroms Cph1 auf das Wachstum im FRL und im HL festgestellt werden. Für das Phytochrom Cph2 hingegen konnte eine Wirkung auf das Wachstum im RL und im HL gezeigt werden. Das Wachstumsverhalten der cph1 -/cph2 --Doppelmutante deutete nicht auf eine kompensatorische oder überlappende Funktion von Cph1 und Cph2 hin.

↓56

Abb. 10 : Wachstumsraten (µ) der Phytochrommutanten in Prozent vom WT unter HL, ML, RL und FRL. Die Kulturen von WT und Mutante wurden zum gleichen Zeitpunkt gestartet. Dies erlaubt eine prozentuale Angabe der Wachstumsrate. Die Säulen stellen den Mittelwert der relativen Wachstumsrate von cph1 - (hellgrau), cph2 -(grau) und cph1 - /cph2 - (schwarz) dar (n = 4-8, für ML n = 3). Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. In die Kalkulation des Mittelwerts wurden die relativen Wachstumsraten sowohl der Km- als auch der Cm-resistenten cph1 -- und cph2 --Mutanten einbezogen. Die durchschnittlichen Wachstumsraten des WT betrugen 0,033±0,007 h-1 (HL), 0,030±0,007 h-1 (ML), 0,032±0,007 h-1 (RL) und 0,0054±0,0017 h-1 (FRL).

Weiterhin wurde der Einfluss von Glukose auf die Wachstumsreduktion unter HL, RL und FRL untersucht. Die Zugabe von 0,2 % Glukose förderte das Wachstum des WTs im RL und FRL. Unter HL-Bedingungen hingegen war das Wachstum der glukosehaltigen WT-Kulturen gegenüber den glukosefreien reduziert (74 %). Unter dieser Lichtintensität wirkte die Glukose leicht wachstumsstimulierend auf die Phytochrommutanten, so dass sich im Resultat die Wachstumsraten des WT und der Einzelmutanten nahezu anglichen bzw. sich die Wachstumsreduktion der Doppelmutante gegenüber dem WT verminderte (Tab. 9). Eine Annäherung der Wachstumsraten der Mutanten an den WT-Wert wurde auch für RL und FRL beobachtet werden (Tab. 9). Somit konnte die Zugabe von Glukose die wachstumshemmende Wirkung der Inaktivierung von cph1 im FRL vollständig und von cph2 im RL teilweise aufheben.

Tab. 9: Wachstumsraten (µ) der Phytochrommutanten in Prozent vom WT unter mixotrophen Bedingungen im HL, RL und FRL nach Zugabe von 0,2 % Glukose. In der Tabelle sind Mittelwerte±Standardabweichungen aufgeführt. Die Mittelwerte stammen aus mindestens drei unabhängigen Anzuchtreihen. Die durchschnittlichen Wachstumsraten des WT betrugen 0,025±0,005 h-1 (HL), 0,054±0,010 h-1 (RL) und 0,019±0,003 h-1 (FRL).

Lichtbedingung

Stamm

µ (% vom WT)

HL

WT

cph1 -

cph2 -

cph1 - /cph2 -

-

97±9

97±2

83±14

RL

WT

cph2 -

cph1 - /cph2 -

-

89±8

88±12

FRL

WT

cph1 -

cph1 - /cph2 -

-

97±17

84±13

3.3.2 Kompetitives Wachstum von WT und Phytochrommutanten

↓57

Um die Unterschiede im Wachstumsverhalten von WT und Mutante zu untermauern, wurden Kompetitionsexperimente durchgeführt. Hierfür wurden Zellen von WT und Mutante aus der exponentiellen Wachstumsphase von unter FRL, RL, HL und Schwachlicht (LL) gewachsenen Kulturen im Verhältnis 1:1 miteinander vermischt. Die anschließend verdünnte Mischkultur wuchs über eine von der Wachstumsgeschwindigkeit abhängigen Zeitspanne weiter. Unter HL- und RL-Bedingungen, bei denen sich die Zellen mit einer hohen Rate teilen (durchschnittliche Verdopplungszeit tD des WT im HL 21 h sowie im RL 23 h), betrug die Inkubationsdauer der Mischkultur 6 bzw. 7 d. Aufgrund der geringen Verwertbarkeit von FRL und LL in der Photosynthese wuchsen die Kulturen unter diesen Lichtbedingungen sehr langsam (tD des WT im FRL 128 h sowie im LL 70 h). Daher wurde der Zeitraum des kompetitiven Wachstums unter diesen Lichtbedingungen auf 12 bzw. 13 Tage verlängert. Eine mögliche Verschiebung des Mengenverhältnisses von WT- und Mutantenzellen wurde über ein periodisches Ausplattieren von Zellproben auf antibiotikahaltige sowie -freie Agarplatten und Auszählen der gewachsenen Kolonien erfasst. Für die Kompetitionsexperimente wurden nur Km-resistente Phytochrommutanten eingesetzt, da die Cm-resistenten Mutanten eine geringe Überlebensrate nach dem Wechsel von einer antibiotikafreien Kultur auf eine Cm-haltige Agarplatte aufwiesen.

Während des kompetitiven Wachstums von WT und cph1 - verschob sich der prozentuale Anteil der Mutantenzellen zugunsten des WT sowohl unter HL als auch unter FRL (Abb. 11A und C). Nach 6 Tagen unter HL-Bedingungen sank der prozentuale Anteil von cph1 - in der Mischkultur auf 11 %. Aufgrund der geringen Wachstumsrate im FRL konnte eine stärkere Reduktion von cph1 - (17 %) gegenüber dem WT erst nach 12 Tagen beobachtet werden.

Ein ähnliches Bild zeigte sich beim kompetitiven Wachstum der cph2 --Mutante und des WTs unter HL (Abb. 11B). Hier wurde cph2 - am Ende des sechstägigen Wachstums nahezu vollständig durch den WT verdrängt. Auch im RL konnte sich der WT gegenüber cph2 - durchsetzen (Abb. 11D). Nach 7 Tagen enthielt die Mischkultur nur noch 8 % Mutantenzellen.

↓58

Die Verschiebung des prozentualen Anteils der Phytochrommutanten zugunsten des WTs könnte auch durch eine abnehmende Überlebensfähigkeit der Mutantenzellen nach dem Wechsel von einer antibiotikafreien Dauerkultur zu einem Km-haltigen Medium hervorgerufen werden. Um dies ausschließen zu können, wurden Kompetitionsexperimente unter LL-Bedingungen ausgeführt, unter denen die Phytochrommutanten in normalen Wachstumskurven keine Wachstumsreduktion gegenüber dem WT aufwiesen. Wie Abb. 11E und F zeigen, blieb unter LL der prozentuale Anteil von WT- und Mutantenzellen jeweils konstant.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kompetitionsexperimente die Resultate aus der Bestimmung der lichtabhängigen Wachstumsraten widerspiegeln: Die c ph1 --Mutante wies ein vermindertes Wachstum unter HL und FRL auf. Unter diesen Lichtbedingungen nahm auch beim gleichzeitigen Wachstum von cph1 - und WT in einer gemeinsamen Kultur der prozentuale Anteil der Mutante gegenüber dem WT ab. Die cph2 --Mutante wuchs unter HL und RL schlechter als der WT. Ebenso dominierte der WT über die cph2 --Mutante in einer gemeinsamen Kultur unter diesen Lichtkonditionen.

Abb. 11 : Kompetitives Wachstum von WT und Phytochrommutanten ( cph1 - cph2 - ) im HL (A und B), FRL (C), RL (D) und LL (E und F). Die grauen Balken repräsentieren den prozentualen Anteil der cph1 - - bzw. cph2 - -Zellen an der Gesamtzellzahl. Für die Kompetitionsstudien wurden Kulturen von WT und Phytochrommutanten eingesetzt, die sich in einer Zwischenkultur an die Lichtbedingungen HL, LL, RL und FRL anpassen konnten. Während des kompetitiven Wachstums von WT und Mutanten wurden über eine von der Wachstumsgeschwindigkeit abhängigen Zeitspanne Proben genommen. Diese wurden auf Km-haltige sowie antibiotikafreie Agarplatten ausplattiert. Die Abbildungen stellen repräsentative Ergebnisse dar.

3.3.3 Bestimmung von Photosyntheseparametern

3.3.3.1 Pigmentanalyse

↓59

In ihrer natürlichen Umgebung sind Cyanobakterien einem wechselnden Lichtregime ausgesetzt. Cyanobakterien passen sich diesen Bedingungen an, indem sie bei einem Überangebot an Licht ihre lichtsammelnden Antennen zugunsten von protektiv wirkenden Pigmenten reduzieren bzw. bei Lichtmangel ihre Antennen vergrößern. Die beobachteten Wachstumsreduktionen der Phytochrommutanten könnten mit Änderungen in der Pigmentzusammensetzung und dem Pigmentgehalt in einer Wechselbeziehung stehen. Daher wurde eine Pigmentanalyse mittels HPLC sowie Aufnahmen von Absorptionsspektren ganzer Zellen durchgeführt.

Im HL war der Chl-Gehalt der WT-Zellen erwartungsgemäß gegenüber den unter FRL und RL genommenen Proben vermindert (Tab. 10), wobei der höchste Chl-Gehalt unter RL gemessen wurde. Das Verhältnis von Car zu Chl erreichte im HL doppelt so hohe Werte wie im FRL und RL. Das Car/Chl-Ratio unter FRL und RL variierte kaum zwischen den beiden Lichtqualitäten. Unter allen untersuchten Lichtbedingungen zeigte sowohl der Chl-Gehalt als auch das Car/Chl-Verhältnis der cph1 -, cph2 - sowie der Doppelmutante keine signifikanten Abweichungen vom WT (Tab. 10), wobei auch die unter jeweils einer Lichtbedingung gemessenen Anteile der Karotinoide Myx, Zea, Ech und β-Car am Car-Pool ebenfalls nicht zwischen WT und Mutante variierten (Daten nicht gezeigt). Dies trifft ebenso auf das aus Absorptionsspektren ganzer Zellen berechnete PC/Chl-Verhältnis zu. Auch hier waren keine klaren Unterschiede zwischen den Werten von WT und Mutanten zu erkennen.

Der Vergleich der Pigmentdaten von WT und Phytochrommutanten zeigt, dass die Beeinträchtigung des Wachstums nicht durch eine ungenügende Anpassung des Pigmentapparates an die jeweiligen Lichtbedingungen verursacht wurde.

↓60

Tab. 10 : Pigmentzusammensetzung von WT und Phytochrommutanten unter den Licht bedingungen HL, RL und FRL. Der Chl-Gehalt sowie das Car/Chl-Verhältnis wurde mittels HPLC bestimmt. Das PC/Chl-Verhältnis wurde aus Gesamtzellspektren berechnet (siehe 2.2.5.4.2). In der Tabelle sind Mittelwerte±Standardabweichungen aufgeführt. In die Berechnung wurden die Analysedaten sowohl Km-resistenter als auch Cm-resistenter cph1 - - und cph2 - -Mutanten einbezogen. Die Mittelwerte stammen aus mindestens drei unabhängigen Anzuchtreihen.

Lichtbedingung

Stamm

Chl

(µg OD 750nm -1 )

Car/Chl

(µg µg -1 )

PC/Chl

HL

WT

cph1 -

cph2 -

cph1 - /cph2 -

2,31±0,59

2,64±0,38

2,49±0,65

2,72±0,31

0,65±0,14

0,71±0,09

0,66±0,12

0,74±0,09

0,91±0,07

0,84±0,06

0,88±0,06

0,95±0,06

RL

WT

cph1 -

cph2 -

cph1 - /cph2 -

4,22±0,28

4,11±0,42

4,00±0,38

3,91±0,29

0,31±0,04

0,31±0,03

0,30±0,03

0,35±0,03

0,80±0,08

0,81±0,05

0,90±0,08

0,77±0,03

FRL

WT

cph1 -

cph2 -

cph1 - /cph2 -

3,34±0,35

3,16±0,57

3,27±0,23

3,33±0,25

0,32±0,02

0,29±0,03

0,32±0,07

0,34±0,06

0,98±0,11

1,01±0,14

1,07±0,14

0,96±0,16

Für die Daten wurde ein t-Test durchgeführt. Bei allen Werten lag p über 0,05.

3.3.3.2 Messung der maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsraten

Der Vergleich der Sauerstofffreisetzungsraten zwischen WT und Phytochrommutanten liefert Hinweise auf mögliche Störungen in der Anpassung der Photosynthesekomponenten an gegebene Lichtbedingungen, wie der photosynthetische Elektronentransport sowie die aktive Aufnahme von anorganischem Kohlenstoff und dessen Fixierung. Die Abhängigkeit der Sauerstofffreisetzung von der Lichtmenge lässt sich durch eine Sättigungskurve beschreiben: Bis zum Erreichen einer bestimmten Lichtintensität nimmt die Netto-Sauerstofffreisetzungsrate linear zu. Oberhalb dieser Lichtintensität bleibt die Sauerstofffreisetzungsrate nahezu konstant. Bei sehr hohen Lichtmengen kann es zur Photoinhibition kommen, wobei die Netto-Freisetzung von Sauerstoff abnimmt.

Tab. 11: Maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsraten von WT und Phytochrommutanten. Die Kulturen wurden unter HL, RL und FRL angezogen. Die Bestimmung der maximalen Sauerstofffreisetzungsraten erfolgte im WL bei 30 °C (siehe 2.2.5.4.4). Der Mittelwert und die Standardabweichung berechnen sich aus den Daten von fünf (HL) bzw. drei (RL, FRL) unabhängigen Anzuchtreihen. Der Chl-Gehalt wurde mittels HPLC ermittelt.

Lichtbedingung

Stamm

Maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate

(µmol O 2 mg -1 Chl h -1 )

HL

WT

cph1 -

cph2 -

cph1 - /cph2 -

267±46

260±102

282±14

218±70

RL

WT

cph1 -

cph2 -

cph1 - /cph2 -

149±45

146±55

146±43

155±53

FRL

WT

cph1 -

cph2 -

cph1 - /cph2 -

950±451

612±129

672±267

600±48

Für die Daten wurde ein t-Test durchgeführt. Bei allen Werten lag p über 0,05.

↓61

Die maximale Netto-Sauerstofffreisetzung von unter HL, RL und FRL gewachsenen Kulturen vom WT und den Phytochrommutanten wurde im WL bestimmt. Die während der Messung der Sauerstoffentwicklung eingestrahlte Lichtintensität wurde solange heraufgesetzt bis die Netto-Sauerstofffreisetzung nicht mehr anstieg. Die dabei ermittelten Werte sind in Tab. 11 aufgeführt. Die Chl-bezogene Netto-Sauerstofffreisetzungsrate des WT zeigte eine klare Abhängigkeit vom Anzuchtlicht. Die im HL angezogenen WT-Kulturen wiesen eine durchschnittliche maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate von 267 µmol O2 mg-1 Chl h-1 auf (Tab. 11). WT-Kulturen, die unter RL-Bedingungen gewachsen waren, zeigten mit 149 µmol O2 mg-1 Chl h-1 eine im Vergleich zum HL verringerte maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate. Unter FRL hingegen war diese mit 950 µmol O2 mg-1 Chl h-1 deutlich erhöht (Tab. 11).

Die maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsraten der zeitgleich mit dem WT angezogenen cph1 --, cph2 -- und Doppelmutanten unterschieden sich unter HL und RL nicht von den WT-Werten (Tab. 11). Die maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsraten der mit FRL belichteten Mutantenkulturen lagen mit 600 bis 672 µmol O2 mg-1 Chl h-1 unterhalb des WT-Werts (950 µmol O2 mg-1 Chl h-1). Jedoch ist der gefundene Unterschied in der durchschnittlichen maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsrate nicht die Ursache für das beeinträchtigte Wachstum von cph1 - und cph1 -/cph2 - im FRL: Zum einen lagen die Werte für die maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate von cph2 - in einem ähnlichen Bereich wie die von cph1 - sowie der Doppelmutante (Tab. 11). Die cph2 --Mutante zeigte jedoch im Gegensatz zu den beiden letzteren Mutanten keine Wachstumsreduktion im FRL. Zum anderen sind die Unterschiede in der maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsrate zwischen dem WT und den Phytochrommutanten aufgrund der hohen Standardabweichung nicht signifikant.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unter keiner Lichtbedingung wesentliche Abweichungen in der maximalen Sauerstoffentwicklung zwischen WT und Mutanten zu beobachten waren. Somit deuten die Ergebnisse aus der Messung der Sauerstofffreisetzung auf keine deutlichen Modifikationen in der Effizienz oder im Aufbau des Photosyntheseapparats in seiner Gesamtheit hin.

3.3.3.3 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren

↓62

Das beobachtete reduzierte Wachstum der Phytochrommutanten könnte durch eine unzureichende Anpassung von Komponenten des Photosyntheseapparats hervorgerufen worden sein. Die Aufnahme von 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren bei Anregung von Chl a visualisiert bei Cyanobakterien unter bestimmten Bedingungen die Stoichiometrie von Photosystem II (PSII) und Photosystem I (PSI). Zur Auffindung möglicher Unterschiede zwischen WT und Phytochrommutanten wurden 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren von in Glycerol eingefrorenen Zellen aufgenommen, bei denen Chl a (bei 440 nm) angeregt wurde.

Abb. 12 : Vergleichende Darstellung der 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren ganzer Zellen von WT im HL, RL und FRL (A) sowie von WT und cph1 - unter HL (B). Die Zellsuspensionen wurden auf ca. 5 µg Chl eingestellt und nach 10 min Dunkeladaption in 70 % Glycerol eingefroren. Das Chl wurde mit einer Wellenlänge von 440 nm angeregt. Die Spektren wurden auf ihr Maximum (bei 725 nm) normiert.

Cyanobakterien weisen zwischen den Arten eine vergleichsweise hohe Variabilität in der Zusammensetzung der lichtsammelnden Antennen sowie in der PSII/PSI-Stoichiometrie auf, welches die Fluoreszenzemission beeinflusst (Campbell et al., 1998). Die exakte Position und das relative Maximum der Fluoreszenzemission von PSI und PSII ist daher bei Cyanobakterien von der Spezies abhängig. In Synechocystis besitzt das Allophycocyanin im Bereich zwischen 670 und 675 nm ein Maximum. Bei 685 nm emittieren der terminale Emitter der Phycobilisomen und das CP43 (PSII) sowie bei 695 nm das CP47 (PSII) und das Reaktionszentrum des PSII. Die intensivste Emission (bei ca. 725 nm) geht von mit PSI assoziiertem Chl a aus (Mao et al., 2003). Wie am Beispiel des WTs in Abb. 12A dargestellt, änderte sich die relative Intensität der Fluoreszenzemission von PSII in Relation zu PSI in Abhängigkeit von den Lichtbedingungen während der Anzucht: Im HL und FRL war die relative Fluoreszenzemission des PSII im Vergleich zum RL erhöht. Die 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren von cph1 --, cph2 -- und Doppelmutante unter HL, RL und FRL wiesen keine signifikanten Änderungen gegenüber den entsprechenden Spektren des WTs auf, wie für cph1 - und WT unter HL in Abb. 12B gezeigt wird. Daher kann eine Änderung in der Struktur der Photosysteme als Ursache für die Beeinträchtigung des Wachstums der Phytochrommutanten ausgeschlossen werden.

3.4 Untersuchung der lichtinduzierten Motilität

↓63

Synechocystis besitzt die Fähigkeit zu einer lichtgerichteten aktiven Ortsänderung. Bisherige Untersuchungen deuten auf eine Funktion von Photorezeptoren bei der Lichtregulation dieser Bewegung hin (Choi et al., 1999). Zu Beginn dieser Arbeit war noch kein Photosensor mit einer entsprechenden Funktion bekannt. Daher wurde der Einfluss der Phytochrome Cph1 und Cph2 auf die lichtinduzierte Motilität analysiert.

3.4.1 Motilität unter verschiedenen Lichtbedingungen

3.4.1.1 Der Einfluss der Spektralfarbe auf die Motilität

Für die Untersuchung der lichtinduzierten Motilität wurden Zellen von WT, cph1 - , cph2 - und der Doppelmutante auf glukosehaltige Agarplatten aufgetragen. Anschließend wurden diese Agarplatten in einen Lichtgradienten von FRL, RL, GL und BL gestellt. Diese Lichtfarben wurden mittels Plastikfiltern (Lee) erzeugt.

Nach einer zweiwöchigen Belichtung mit FRL, RL und GL zeigte der WT eine deutliche Bewegung in Richtung der Lichtquelle (Abb. 13A-C). Ebenso verhielten sich cph1 - , cph2 - sowie die Doppelmutante, so dass man unter diesen Bedingungen nicht von einem Einfluss der beiden cyanobakteriellen Phytochrome auf die Steuerung der Motilität sprechen kann. Ein anderes Bild ergab sich bei der Untersuchung der BL-vermittelten Zellbewegung (Abb. 13D). WT und cph1 - verharrten auf ihrer Ausgangsposition, während die Zellen von cph2 - und cph1 - /cph2 - zur BL-Quelle wanderten. Die BL-vermittelte Motilität wurde auch mit Hilfe weiterer BL-Quellen untersucht, die Licht in einem stärker eingegrenzten Wellenlängenbereich aussenden. Die Einstrahlung von Licht, das durch Kombination eines blauen dichroischen Filters sowie eines UV-cut-off-Filters erzeugt wurde, erbrachte das gleiche Resultat wie die Verwendung der blauen Plastikfilter. Auch hier bewegten sich nur cph2 - und cph1 - /cph2 - in Richtung BL, während der WT und die cph1 --Mutante nicht motil waren (Daten nicht gezeigt). Das gleiche gilt auch für die Verwendung von BL-Photodioden (Daten nicht gezeigt).

↓64

Im FRL, RL und GL bewegte sich cph1 - /cph2 - langsamer als der WT, cph1 - und cph2 - . Auch unter BL war die Geschwindigkeit der cph1 - /cph2 - -Zellen vermindert. Dieser Effekt konnte auch bei Phototaxisuntersuchungen von Doppelmutanten anderer Photorezeptoren beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Daher liegt die Vermutung nahe, dass die herabgesetzte Laufgeschwindigkeit von dem gleichzeitigen Vorhandensein zweier Antibiotikaresistenzgen-Kassetten verursacht wurde.

Abb. 13 : Motilität von WT, cph1 - cph2 - und der Doppelmutante unter FRL (A), RL (B), GL (C), BL (D). Die Richtung des eingestrahlten Lichtes ist durch einen Pfeil markiert. Die Zellen wurden in drei verschiedenen Entfernungen von der Lichtquelle aufgetragen (gekennzeichnet durch eine gestrichelte Linie), wobei die zweite und dritte Position eine Reduktion der Lichtintensität auf ca. 60 % und 35 % gegenüber der lichtzugewandten ersten Position aufwies. Die Lichtintensitäten an den ersten Positionen betrugen 0,2 W m-2 (FRL), 0,3 W m-2 (RL), 0,6 µmol m-2 s-1 (GL) und 1,3 µmol m-2 s-1 (BL). Die Zellen wurden nach Auftragung auf die Agarplatte für 14 Tage mit den oben genannten Lichtfarben belichtet.

Bei der in Abb. 13C dargestellten Phototaxisplatte legten die Zellen von WT und Phytochrommutanten, welche auf die am weitesten von der Lichtquelle entfernten Position aufgetragen wurden, eine kürzere Distanz zurück als die Zellen auf der lichtzugewandten ersten Position. Dieses Resultat lässt sich mit Photokinese erklären, d. h. die Laufgeschwindigkeit der Zellen ist von der Lichtintensität abhängig. Auch in Abb. 13D sind photokinetische Reaktionen erkennbar.

↓65

Insgesamt konnte keine Funktion des Phytochroms Cph1 in der Steuerung der lichtinduzierten Motilität festgestellt werden. Die Analyse der cph2 --Mutante deutet auf eine Funktion des Lichtsenors Cph2 in der Inhibierung der Motilität des WTs im BL hin.

3.4.1.2 Das phototaktische Verhalten unter bidirektionaler Einstrahlung von Licht

In diesem Kapitel wird der Einfluss einer zusätzlich eingestrahlten Lichtfarbe auf die BL-gesteuerte Motilität beschrieben. Hierfür wurde im 180°-Winkel von der BL-Quelle eine weitere Lichtquelle mit FRL, RL oder GL angeordnet. Die Zellen von WT und Phytochrommutanten wurden relativ zu den beiden Lichtquellen auf verschiedene Positionen aufgetragen.

Abb. 14 : Bidirektionale Einstrahlung von BL kombiniert mit FRL (A), RL (B) und GL (C) im 180°-Winkel. Die Richtung des einfallenden Lichts ist durch Pfeile markiert. Die Lichtfarben wurden durch Verwendung von Plastikfiltern erzeugt. Die Zellen wurden auf verschiedene Positionen innerhalb des Lichtfeldes aufgetragen (gekennzeichnet durch eine gestrichelte Linie), so dass sich variierende Anteile der jeweiligen Lichtfarben ergab.

↓66

Bei der Einstrahlung einer weiteren Lichtfarbe (FRL, RL, GL) zusätzlich zum BL erhielt der WT seine Fähigkeit zur Motilität zurück, wobei die Zellen sich jedoch zur FRL-, RL- bzw. GL-Quelle bewegten (Abb. 14A-C). Ebenso verhielt sich die gleichfalls im BL immobile cph1 --Mutante. Im Fall der BL-FRL-Belichtung beeinflusste die Entfernung zur jeweiligen Lichtquelle die Laufrichtung der cph2 - sowie der Doppelmutante (Abb. 14A).

Bei der bidirektionalen Einstrahlung von BL und RL (Abb. 14B) bewegten sich cph2 - und cph1 - /cph2 - bevorzugt in Richtung RL: Auch an der Position, die dem BL am nächsten war, wiesen die Zellen dieser Mutanten eine schwache Bewegung zum RL auf. Hingegen zeigten der auf der gleichen Position innerhalb des BL-RL-Gradienten befindliche WT sowie die cph1 --Mutante keine Motilität. An der Position mit erhöhtem RL-Anteil liefen sowohl der WT als auch die Phytochrommutanten in Richtung RL.

Die bidirektionale Belichtung mit GL und BL (Abb. 14C) lieferte ein ähnliches Bild wie die BL-FRL-Belichtung: Auch hier wanderten die Zellen von cph2 - und cph1 - /cph2 - zur der Lichtquelle mit der geringsten Entfernung, während sich nur die näher zum GL befindlichen Zellen von WT und cph1 - in Richtung GL bewegten.

↓67

Es konnte gezeigt werden, dass sich die Hemmung der Motilität von WT und cph1 - im BL durch die Einstrahlung von FRL, RL oder GL aufheben ließ. Hierbei konnte nur dann Motilität beim WT und der cph1 --Mutante induziert werden, wenn der Anteil von FRL, RL bzw. GL gegenüber BL hoch genug war.

3.4.1.3 Aktionsspektrum der Motilität im blauen Wellenlängenbereich

Phytochrome absorbieren sowohl rotes als auch blaues Licht, wobei das Absorptionsmaximum im langwelligen Bereich gegenüber dem im kurzwelligen Bereich verstärkt ist (Abb. 1 zeigt ein typisches Absorptionsspektrum eines Phytochroms.). Cph2 besitzt zwei chromophorbindende GAF-Domänen. Während das PCB-Addukt der N-terminalen GAF-Domäne eines rekombinanten Cph2-Proteins in seinen Absorptionseigenschaften einem typischen Phytochrom ähnelt, zeigt das PCB-Addukt der C-terminalen Domäne keine Photochromozität jedoch eine gegenüber dem RL verstärkte Absorption von BL (Wu und Lagarias, 2000). Die bisherigen Daten lassen nicht erkennen, ob Cph2 als BL-Rezeptor die Motilität im BL inhibiert oder ob dieser Photorezeptor mit einem BL-Sensor interagiert. Die Aufnahme eines Aktionsspektrums der BL-gesteuerten Motilität des WTs sollte Aufschluss über eine mögliche Vergleichbarkeit des Aktionsspektrums mit dem Absorptionsspektrum der C-terminalen GAF-Domäne von Cph2 oder dem eines typischen BL-Rezeptors geben.

Das Aktionsspektrum wurde mit Hilfe von Interferenzfiltern aufgenommen, die Licht in einem relativ schmalen Wellenlängenbereich transmittieren. Wurde ein Interferenzfilter mit einem Transmissionsmaximum bei 474 nm und höher eingesetzt, konnte eine Bewegung der WT-Zellen in Richtung der Lichtquelle beobachtet werden (Tab. 12). Wurden hingegen die Zellen mittels eines Interferenzfilters mit 461 nm und geringer belichtet, zeigte der WT keine Motilität. Als Kontrolle diente die cph2 --Mutante. Diese zeigte unter den meisten Lichtbedingungen eine positive Phototaxis (Tab. 12). Jedoch bewirkte die Einstrahlung von UV(A)-Licht (Maximum bei 370 nm) eine negative Phototaxis der Mutante. Bei Experimenten mit Interferenzfiltern mit einem Transmissionsmaximum bei 405 nm wurden variierende Resultate erzielt. So wurde sowohl postive als auch negative Phototaxis der cph2 --Zellen beobachtet.

↓68

Tab. 12: Aktionsspektrum der lichtinduzierten Motilität des WTs in einem Wellenlängenbereich zwischen 370 bis 500 nm. Für die Aufnahme des Aktionsspektrums wurden Interferenzfilter kombiniert mit verschiedenen Lichtquellen eingesetzt. Die Lichtintensität betrug in Abhängigkeit vom Filter 1 bis 3 µmol m-2 s-1.

Wellenlänge des Transmissionsmaximums (nm)

WT

cph2 -

370

keine Motilität

negativ

405

keine Motilität

negativ/positiv

436

keine Motilität

positiv

446

keine Motilität

positiv

451

keine Motilität

positiv

461

keine Motilität

positiv

474

positiv

positiv

480

positiv

positiv

490

positiv

positiv

504

positiv

positiv

Zur Untersuchung der BL-gesteuerten Motilität wurden die Zellen von WT und Phytochrommutanten mit Licht geringer Intensität (bis zu 3 µmol m-2 s-1) belichtet. Daher ist es nicht auszuschließen, dass sich WT und cph1 - unter dem Einfluss von BL mit einer höheren Lichtintensität wie cph2 - verhalten und in Richtung Lichtquelle wandern.

Zu diesem Zweck wurde die Intensität des eingesetzten BLs verstärkt und das phototaktische Verhalten des WT und der Phytochrommutanten unter diesen Bedingungen analysiert. Leider konnte nur eine BL-Intensität von maximal 35 µmol m-2 s-1 erzielt werden. Bei einer Einstrahlung von 35 µmol m-2 s-1 BL waren weder WT noch cph1 - zu einer lichtgerichteten Bewegung befähigt (Abb. 15A). Die cph2 - -Mutante und die Doppelmutante hingegen bewegten sich in Richtung BL. Die Abb. 15A läßt Photokinese bei der cph2 - -Mutante und der cph1 - /cph2 - -Doppelmutante erkennen: Die auf den Positionen näher an der Lichtquelle befindlichen Zellen bewegten sich schneller als die auf den weiter vom Licht entfernten Positionen. Ein Teil der Zellen von cph2 - und der Doppelmutante, die auf die Position dicht an der Lichtquelle aufgetragen wurden, zeigten negative Phototaxis.

↓69

Abb. 15 : Motilität von WT, cph1 - cph2 - und der Doppelmutante unter Einfluss erhöhter (A) und geringer (B) BL-Intensität. Für das Phototaxisexperiment wurden Plastikfilter eingesetzt. Die Plastikfilter haben die Eigenschaft, im dunkelrotem Wellenlängenbereich zu einem geringen Anteil Licht durchzulassen. Die Lichtstärke wurde von ca. 1,3 µmol m-2 s-1 auf 35 µmol m-2 s-1 erhöht bzw. auf 0,1 µmol m-2 s-1 herabgesetzt.

Ein völlig anderes Bild ergab sich, wenn die Intensität des eingestrahlten BL stark reduziert wurde. Sank die Lichtintensität auf Werte unter ca. 0,1 µmol m-2 s-1 war der WT zu einer positiven Phototaxis befähigt (Abb. 15B). Eine mögliche Ursache für diesen Effekt könnte in den Eigenschaften der Plastikfilter zu finden sein, die hauptsächlich für die Untersuchung der BL-gesteuerten Motilität verwendet wurden. Diese öffnen bei einer Wellenlänge von ca. 680 nm und lassen so FRL zu einem geringen Anteil durch. Wurden für die Untersuchung der Motilität im BL Filter oder Photodioden eingesetzt, die nur reines BL transmittieren bzw. emittieren, konnte der oben beschriebene Effekt nicht beobachtet werden: Auch bei einer sehr geringen BL-Intensität bewegte sich der WT nie in Richtung Licht (Daten nicht gezeigt).

3.4.1.4 Komplementationsanalyse: Austausch der chromophorbindenden Cysteine von Cph2 durch ortsgerichteteMutagenese

Wie bereits erwähnt, besitzt Cph2 sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus eine chromophorbindende GAF-Domäne. Trotz differenter spektraler Eigenschaften vermögen beide gebundenen Chromophore in unterschiedlichem Ausmaß blaues Licht zu absorbieren. Folgender Abschnitt soll die Frage klären, ob die BL-Perzeption einer der beiden Domänen zugeordnet werden kann. Zu diesem Zweck wurden Mutanten von cph2 konstruiert, bei denen jeweils eines der chromophorbindenden Cysteine über ortsgerichteteMutagenese des entsprechenden Tripletts durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde. Im Fall des Cystein129 in der N-terminalen GAF-Domäne geschah dies durch ein Alanin (GAF1*), im Fall des Cystein1022 in der C-terminalen GAF-Domäne durch ein Valin (GAF3*) (Abb. 16). Die Fähigkeit der mittleren GAF-Domäne zur Bindung eines Chromophor ist nicht bekannt. Das konservierte Cystein ist in dieser Domäne ist nicht vorhanden. Die Funktion dieser Domäne ist bisher unklar. Möglicherweise dient diese Domäne der Protein-Protein-Interaktion oder der Anheftung weiterer Liganden. Die GAF2-Domäne wurde ausgeschaltet, indem diese in frame zwischen den Restriktionsorten NaeI (577) und HindII (1342) deletiert wurde (GAF2-). Dadurch wurde das Protein um insgesamt 255 AS verkürzt.

↓70

Die beschriebenen Mutationen wurden zunächst in einem bereits existenten cph2-pQE12-Konstrukt erzeugt. Bei diesem befindet sich das cph2-Gen unter Kontrolle des lacZ-Promotors und besitzt an seinem C-terminalen Ende einen His-tag. Mittels der Restriktionsendonukleasen XhoI und PvuII wurde cph2 aus dem pQE12-Vektor ausgeschnitten und zwischen die Schnittstellen von XhoI und SmaI in der Km-Kassette des pVZ321-Vektor inseriert (Abb. 17A), einem sich in Synechocystis autonom replizierenden Plasmids (Zinchenko et al., 1999). Das resultierende Konstrukt wurde anschließend durch Konjugation in die Km-resistente Δcph2 --Mutante (Abb. 8) eingeschleust. Das Vorhandensein der verschiedenen cph2-pVZ321-Konstrukte wurde nach Isolation dieser Plasmide aus den Transkonjuganten mittels PCR nachgewiesen (Abb. 17C).

Abb. 16 : Schematische Darstellung von cph2 -Mutanten, bei denen je eine der beiden chromophorbindenden Cysteine mittels ortsgerichteter Mutagenese durch ein Alanin bzw. Valin ausgetauscht wurde bzw. die GAF-Domäne vollständig entfernt wurde.

Die Untersuchung der BL- und der WL-abhängigen Motilität der Transkonjuganten zeigte, dass die Komplementation des cph2-knockouts mit cph2-pVZ321 das WT-Verhalten im BL wiederherstellen konnte (Abb. 17B). Dahingegen behielten GAF3* und GAF2 - die Fähigkeit, zu einer BL-Quelle zu laufen. Die verschiedenen Klone von GAF1* verhielten sich mehrheitlich wie die cph2 - -Mutante, d.h. sie waren unter BL-Bedingungen motil.

↓71

Leider war der beobachtete Phänotyp der cph2-pVZ321-Variante nicht stabil. Meist zeigten nur wenige Wochen alte Transkonjuganten WT-Verhalten. Nach einiger Zeit setzte sich der Mutantenphänotyp durch, obwohl sich das cph2-pVZ321-Plasmid in den Zellen noch nachweisen ließ.

Abb. 17 : Komplementation der cph2 -Deletion mit einem cph2 -Gen , bei dem entweder eines der chromophorbindenden Cysteine durch ein Alanin (GAF1*) oder ein Valin (GAF3*) ausgetauscht wurde bzw. die mittlere GAF-Domäne ohne nachgewiesene Bilin-Binde fähigkeit vollständig entfernt wurde (GAF2 - ). Als Kontrolle diente ein cph2-pVZ321-Konstrukt, dessen GAF-Domänen nicht verändert wurden. Die Position der cph2-Insertion in den pVZ321-Vektor ist in (A) dargestellt. Das Laufverhalten der Transkonjuganten unter BL ist in (B) abgebildet. (C) zeigt den Nachweis der aus Synechocystis isolierten Plasmide durch eine PCR unter Verwendung der Primer pVZ321-Km1403 und cph2-370RV, die an die Km-Kassette im pVZ321 bzw. an das inserierte cph2-Gen binden.

3.4.1.5 Motilität von WT und cph2 - in einer Mischkultur

Dieses Kapitel beschreibt die Auswirkung einer Mischkultur von WT und cph2 --Mutante auf die BL-gesteuerte Motilität. Dazu wurden Mischkolonien mit variierenden Anteilen von 0,1 % bis 99,9 % cph2 - an der Mischkultur hergestellt und deren Motilität im BL untersucht. Dabei reichte eine sehr geringe Menge an cph2 --Zellen aus, um Motilität der Mischkolonien zum BL zu induzieren (Abb. 18).

↓72

Somit könnte der im vorherigen Kap. 3.4.1.4 beschriebene instabile Phänotyp der cph2-pVZ321-Transkonjuganten auf eine zunehmende Anzahl von Zellen in der cph2-pVZ321-Transkonjuganten-Kultur zurückzuführen sein, die das cph2-pVZ321-Plasmid wieder verloren haben.

Abb. 18 : Motilität von Mischkolonien mit sich graduell änderndem Anteil von WT- und cph2 - -Zellen. Eine separat angezogene Kultur von WT und Mutante wurde auf eine gleiche OD eingestellt. WT und cph2 - wurden in variierendem Mengenanteil zueinander (siehe Tabelle in der Abbildung) gemischt. Anschließend wurden 3 µl des abzentrifugierten Zellpellets auf eine Agarplatte aufgetropft. Der ursprüngliche Auftragungsort ist durch einen Kreis gekennzeichnet. Als Kontrolle dienten eine reine WT- sowie cph2 --Kultur. 0: keine Motilität; +: Motilität, wobei die Stärke des Symbols das Ausmaß der Motilität im Vergleich zur reinen cph2 --Kolonie beschreibt. Die Abbildung stellt ein repräsentatives Ergebnis dar.

3.4.1.6 Einfluss der externen Zugabe von cAMP und cGMP sowie der Photosyntheseinhibitoren DCMU und DBMIB auf die BL-gesteuerte Motilität

In den letzten Jahren konnten verschiedene Arbeitsgruppen einen Zusammenhang zwischen Motilität und cAMP bzw. Adenylat-Zyklasen sowohl bei Synechocystis (Terauchi und Ohmori, 1999; Yoshimura et al., 2002a; Yoshimura et al., 2002b) als auch bei anderen Mikroorganismen wie Euglena gracilis (Ntefidou et al., 2003) herstellen. Aufgrund dieser möglichen Verbindung zwischen Cph2 und dem Einfluss zyklischer Nukleotide auf die Steuerung der Motilität wurde den Phototaxisplatten 100 µM cAMP bzw. cGMP zugesetzt und das Verhalten von WT und Phytochrommutanten unter BL beobachtet. Wie in Abb. 19 ersichtlich, veränderte die Zugabe von cAMP bzw. cGMP nicht das Laufverhalten unter BL: Der WT zeigte weder eine Bewegung entlang des BL-Gradienten, noch wurde die Motilität von cph2 - inhibiert.

↓73

Abb. 19 : Einfluss der externen Zugabe von cAMP und cGMP auf die BL-gesteuerte Motilität von WT und den Phytochrommutanten.

Weiterhin wurde die Wirkung der Photosyntheseinhibitoren DCMU und DBMIB auf die Zellbewegung von WT und Phytochrommutanten unter BL-Bedingungen untersucht. Zu diesem Zweck wurde den Phototaxisplatten jeweils 0,5 oder 10 µM DCMU bzw. DBMIB zugegeben. Im Fall von DBMIB, das den Elektronenfluss vom Cytochrom-b6/f-Komplex auf das Plastocyanin verhindert, konnte keine Auswirkung der Zugabe dieses Inhibitors auf die Motilität des WTs und der cph2 --Mutante beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise lieferte die Zugabe von DCMU, das den Elektronenfluss vom PSII in den Plastochinonpool durch Bindung an das D1-Protein unterbricht, höchst unterschiedliche Resultate: Während der WT sich im BL nie bewegte, konnten für cph2 - sowohl Fälle registriert werden, bei denen sich die Mutante normal in Richtung BL-Quelle bewegte, aber auch Fälle, bei denen die Mutante keine Bewegung zeigte. In Abb. 20A ist ein Beispiel für ein Phototaxisexperiment mit DCMU dargestellt, bei dem ein Klon von cph2 - keine und ein weiterer Klon eine geringe positive Phototaxis zeigte.

Das phototaktische Verhalten von WT und Phytochrommutanten auf DCMU-haltigen Platten wurde auch im GL, RL und FRL untersucht. Unter diesen Lichtbedingungen zeigten WT und Phytochrommutanten eine lichtinduzierte Motilität in Richtung der jeweiligen Lichtquelle, wie für GL in Abb. 20B dargestellt. Somit konnte kein Einfluss des Photosyntheseinhibitors DCMU auf die Lichtbewegung im GL, RL und FRL festgestellt werden. Die beobachtete Hemmung der Motilität der cph2 --Mutante im BL deutet auf eine mögliche Rolle der photosynthetischen Elektronentransportkette in der Steuerung der Photobewegung im blauen Spektralbereich.

↓74

Abb. 20 : Einfluss von DCMU auf das phototaktische Verhalten im BL (A) und GL (B). Die Agarplatten enthielten 10 µM DCMU. Für das in (A) dargestellte Experiment wurden Zellen verwendet, die vorher auf Phototaxisplatten im WL gelaufen waren.

3.4.2 Untersuchungen der TypIV-Pili

3.4.2.1 Northern-Blot-Analyse

Wie bereits erwähnt, benötigen die Synechocystis-Zellen für die Bewegung spezielle TypIV-Pili. Die Immobilität des WTs im blauen Wellenlängenbereich könnte durch eine eingeschränkte Bildung der TypIV-Pili verursacht werden. Der Pilus besteht hauptsächlich aus dem Strukturelement Pilin. Für die Biogenese der für die Motilität notwendigen Pili ist das pilinkodierende pilA1-Gen (Cyanobase: sll1694) notwendig (Bhaya et al., 1999).

Abb. 21 : Northern-Blot-Analyse der pilA1 -mRNA aus WT- und cph2 - -Zellen. Für die RNA-Isolation wurden Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase für 2 h mit WL bzw. BL belichtet. Die Gesamt-RNA (2 µg) wurde elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einer pilA1-spezifischen Sonde hybridisiert. Als Kontrolle wurde eine Sonde gegen die 16S-RNA eingesetzt.

↓75

Die Abb. 21 repräsentiert die vergleichende Northern-Blot-Analyse der pilA1-Transkriptmenge in WT- und cph2 - -Zellen unter WL- und BL-Bedingungen. Die Abbildung zeigt, dass die pilA1-Transkriptakkumulation durch die Bestrahlung mit BL nicht beeinflusst wurde. Ebenso war die Transkriptmenge im WT gegenüber der Phytochrommutante nicht erkennbar beeinträchtigt. Somit kann der nichtmotile Phänotyp des WT unter BL nicht auf eine eingeschränkte Bildung der TypIV-Pili aufgrund einer verminderten pilA1-Transkriptakkumulation zurückgeführt werden.

3.4.2.2 Elektronenmikroskopische Untersuchung

Das Ergebnis aus der Untersuchung der pilA1-Expression erlaubt keine Aussage über die tatsächliche Ausprägung der Pili. Die elektronenmikroskopische Analyse der Pili soll Aufschluss über die Anzahl der TypIV-Pili unter BL geben. Hierfür wurden WT- und cph2 --Zellen von BL- sowie WL-bestrahlten Laufplatten verwendet. Die Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Gilbert Tischendorf am Institut für Pflanzenphysiologie und Mikrobiogie der FU Berlin durchgeführt.

Die Pili von Synechocystis lassen sich visuell in zwei Typen einteilen: zum einen gibt es feine Pili mit einer geringen Länge sowie lange und kräftige Pili (Abb. 22). Für letztere wurde eine Funktion bei der Motilität nachgewiesen (Bhaya et al., 2000). Der Vergleich elektronenmikroskopischer Bilder verschiedener Versuchsansätze von WT bzw. Mutante unter jeweils gleichen Lichtbedingungen zeigte, dass die Anzahl der langen Pili sehr variabel ist. So besaß der WT in einem Versuchsansatz unter BL-Bedingungen weniger Pili als cph2 - und einem anderen Ansatz hingegen mehr Pili. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist jedoch nichts über den Zusammenhang von Pili-Zahl und Laufgeschwindigkeit bekannt, außer dass eine völlige Abwesenheit von Pili sowie ein Übermaß an Pili („Hyperpilierung“) zu einem Verlust der Motilitätsfähigkeit führt.

↓76

Da der WT unter BL weder einen deutlichen Mangel an langen Pili noch eine eindeutige Hyperpilierung aufwies, lässt sich die Ausbildung der Pili nicht gesichert als Ursache für die Immobilität des WTs unter BL festlegen.

Abb. 22 : Beispiele für elektronenmikroskopische Aufnahmen der TypIV-Pili von WT und cph2 - Für die elektronenmikroskopische Untersuchung wurden Zellen von Phototaxisplatten entnommen, die für ca. zwei Wochen mit BL belichtet wurden. Die Kontrastierung der Pili-Strukturen erfolgte durch Bedampfung mit einer Platin/Paladium-Legierung.

3.4.3 Untersuchung der Motilität weiterer Photorezeptormutanten

Die Ergebnisse aus der Untersuchung der Motilität unter BL deuten auf eine Funktion des Photorezeptors Cph2 bei der Regulierung der Zellbewegung unter dieser Lichtbedingung hin. Die Fähigkeit des Cph2-Proteins, im blauen Wellenlängenbereich Licht zu absorbieren, konnte zwar gezeigt werden (Wu und Lagarias, 2000), jedoch erlauben die bisherigen Daten keine Aussagen darüber, ob Cph2 allein für die Inhibierung der Bewegung unter BL verantwortlich ist, oder ob Cph2 mit einem klassischen BL-Rezeptor interagiert. Da sich die cph2 --Mutante in Richtung BL-Quelle bewegen kann, muss ein weiterer Photorezeptor für die Vermittlung der BL-gesteuerten Motilität vorhanden sein. Dieser unbekannte Photorezeptor kann über die Inaktivierung des kodierenden Gens in der cph2 --Mutante identifiziert werden.

↓77

Bisher ist in Pflanzen das Vorhandensein zweier verschiedener BL-Sensoren, Cryptochrom und Phototropin, beschrieben wurden. Das Genom von Synechocystis enthält den ORF sll1629, dessen Genprodukt eine hohe Ähnlichkeit zu dem BL-Rezeptor Cryptochrom aufweist. Hingegen konnte kein ORF gefunden werden, der für ein klassisches Phototropin kodiert. Jedoch besitzt das Genprodukt von slr0359 im N-terminalen Bereich Ähnlichkeit zu den chromophorbindenden LOV-Domänen der Phototropine, sodass eine mögliche Fähigkeit dieses Proteins zur BL-Absorption nicht auszuschließen ist. Von beiden Genen wurden Defektmutanten hergestellt (Tab. 13). Anschließend wurde das phototaktische Verhalten dieser Mutanten unter BL-Bedingungen analysiert. Wie in Abb. 23B ersichtlich, zeigten sowohl die cr y - (Mutante mit einem Defekt in sll1629; entspricht dem phrB-Gen) als auch die lov - -Mutante (Mutante mit einem Defekt in slr0359) keine Motilität unter BL-Bedingungen, wie auch der WT. Die cr y - /Δcph2 - - und die lov - /Δcph2 - -Doppelmutante verhielten sich wie die cph2 - -Einzelmutante.

Tab. 13: Übersicht über die Konstrukte zur Inaktivierung von Genen weiterer potentieller BL-Rezeptoren.

Gen

Bezeichnung

Antibiotika kassette

Einbauort

sll1629

cr y -

Km

HpaI

slr0359

lov -

Km

Eco147I-Eco147I

slr1694

blu f -

Km

siehe Abb. 23A

AppA ist ein BL-Photorezeptor, der in Rhodobacter sphaeroides die Expression von Photosynthesegenen in Abhängigkeit von der BL-Intensität sowie in Abhängigkeit vom Redox-Status der Zelle kontrolliert (Masuda und Bauer, 2002). Das Genom von Synecho cystis enthält den ORF slr1694, dessen Genprodukt im N-terminalen Bereich Ähnlichkeit zu AppA aus Rhodobacter sphaeroides besitzt. Das BLUF-Protein in Synechocystis besteht weitgehend nur aus der BLUF-Domäne. Eine genaue Funktion dieses Proteins ist bisher nicht bekannt. Allerdings konnte die Fähigkeit des BLUF-Proteins, ein Flavin zu binden, für dieses vermutlich als Trimer oder Tetramer vorliegende Protein nachgewiesen werden (Masuda et al., 2004). Das Gen slr1694 wurde in Synechocystis inaktiviert (Abb. 23A) und die Motilität der Mutante (Bezeichnung: blu f -) unter BL untersucht. Wie schon cr y - und lov - wies auch blu f - unter BL den gleichen Phänotyp wie der WT auf: Auch diese Mutante zeigte keine Motilität unter BL (Abb. 23B). Die blu f -cph2 --Doppelmutante unterschied sich in ihrem Laufverhalten von cr y -cph2 - und lov -cph2 -. Im Gegensatz zu diesen Mutanten bewegte sich blu f -cph2 - von der Lichtquelle fort.

↓78

Die beschriebenen Resultate aus der Untersuchung der BL-abhängigen Bewegung von Mutanten mit einem inaktivierten potentiellen BL-Photorezeptor deuten nicht auf eine Interaktion zwischen dem cyanobakteriellen Phytochrom Cph2 und Proteinen mit Ähnlichkeit zu den klassischen BL-Photorezeptortypen Cryptochom und Phototropin sowie den BLUF-Proteinen. Auch ließ sich diesen Proteinen keine Funktion bei der BL-gesteuerten Motilität in der cph2 --Mutante zuordnen, wobei jedoch das BLUF-Protein in Synechocystis bei der Vermittlung der positiven Phototaxis im BL eine Rolle zu spielen scheint.

Abb. 23 : Schema des bluf - -Konstrukts (A) und Motilität potentieller BL-Rezeptoren unter BL-Bedingungen (B). Das bluf-Gen ist mit ca. 500 bp relativ kurz. Daher wurden für die Inaktivierung des bluf-Gens die benachbarten Gene ebenfalls amplifiziert. Der ORF slr1693 kodiert für einen Response-Regulator von PatA-Typ und sll1553 für eine Phenylalanyl-tRNA-Synthetase. Die Pfeile geben die Position der Primer (ca. 150 bp vor dem jeweiligen Translationsstartpunkt) zur Amplifikation des Genabschnittes an. Δcph2 - stellt eine Mutante von cph2 dar, bei der das Gen vollständig entfernt wurde (Abb. 8). Dieser Mutantentyp wies das gleiche phototaktische Verhalten im BL auf wie die cph2 --Variante.

Für das phytochromähnliche Protein PixJ1 konnte gezeigt werden, dass dieser Photorezeptor eine Rolle bei der Vermittlung der positiven Phototaxis spielt (Yoshihara et al., 2000; Bhaya et al., 2001a). Unter BL-Bedingungen ist die Motilität des WTs in Richtung Lichtquelle gehemmt. Daher ist es von Interesse, wie sich die Mutation von pixJ1 bzw. eine Doppelmutation dieses Gens und cph2 auf das Laufverhalten unter BL auswirkten. Zu diesem Zweck wurde eine pixJ1 --Mutation nach dem in Abb. 24A skizzierten Schema im WT und der Cm-resistenten Δcph2 - erzeugt. Die Motilität von pixJ1 - sowie der Doppelmutante wurde unter BL sowie unter FRL, RL und GL untersucht. Unter den letztgenannten Lichtbedingungen verhielten sich pixJ1 - und die Doppelmutante entgegengesetzt zum WT und cph2 -, d. h. während sich WT und cph2 - zum Licht bewegten, zeigten pixJ1 - und pixJ1 -cph2 -negative Phototaxis (Tab. 14). Die Inaktivierung von pixJ1 übte jedoch keinen Einfluss auf das Verhalten des WTs im BL aus: PixJ1 - zeigte wie der WT keine Motilität im BL (Abb. 24B). Die unter anderen Lichtbedingungen beobachtete negative Phototaxis von pixJ1 - trat nur auf, wenn zusätzlich cph2 inaktiviert war (Abb. 24B).

↓79

Abb. 24 : Schema zur Konstruktion der pixJ1 - -Mutante (A) und phototaktisches Verhalten von pixJ1 - sowie der pixJ1 - cph2 - -Doppelmutante unter unidirektionaler Einstrahlung von BL (B).

PixJ1 -- und pixJ1 -cph2 - verhielten sich im BL genauso wie blu f - und blu f -cph2 -, d. h. die pixJ1-Einzelmutante war nicht motil während sich die Doppelmutante von der Lichtquelle fortbewegte.

Das Laufverhalten vonblu f - und blu f -cph2 - im GL und FRL unterschied sich jedoch von pixJ1 - und pixJ1 -cph2 -. Unter diesen Lichtbedingungen zeigte blu f - und die Doppelmutante keine oder nur eine sehr schwache Motilität (Tab. 14). Im RL hingegen wiesen blu f - und blu f -cph2 - wie pixJ1 -- und pixJ1 -cph2 - eine negative Phototaxis auf (Tab. 14). Insgesamt deuten die Daten aus dem Phototaxis-Assay darauf, dass BLUF in Synechocystis ebenfalls in die Steuerung der positiven Phototaxis involviert sein könnte, wobei jedoch PixJ1 und BLUF die Regulation der Motilität vermutlich über getrennte Signalketten steuern.

↓80

Die Motilität von cr y - und lov - sowie deren cph2 --Doppelmutanten wurden ebenfalls unter FRL, RL und GL untersucht. Jedoch konnte für diese Photorezeptormutanten keine Abweichungen im Laufverhalten gegenüber dem WT festgestellt werden (Tab. 14). Unter den hier eingesetzten Lichtbedingungen konnte den beiden potentiellen Lichtsensoren Cry und LOV keine Funktion bei der Regulierung der lichtinduzierten Motilität nachgewiesen werden.

Tab. 14: Phototaktisches Verhalten von pixJ1-, bluf-, cry- und lov- sowie der Doppelmutanten im GL, RL und FRL.

Stamm

GL

RL

FRL

WT

positiv

positiv

positiv

pixJ1 -

pixJ1 -cph2 -

negativ

negativ

negativ

negativ

negativ

negativ

blu f -

blu f -cph2 -

stark eingeschränkte Motilität

stark eingeschränkte Motilität

negativ

negativ

stark eingeschränkte Motilität

stark eingeschränkte Motilität

cr y -

cr y -cph2 -

positiv

positiv

positiv

positiv

positiv

positiv

lov -

lov -cph2 -

positiv

positiv

positiv

positiv

positiv

positiv

Das phytochromähnliche Protein Plp beeinflusst das photoautotrophe Wachstum unter BL (Wilde et al., 1997). Daraus resultiert die Frage, ob PlpA auch eine Funktion bei der Steuerung der BL-Motilität ausübt. Hierfür wurden Zellen einer plpA --Mutante (zur Konstruktion der Mutante siehe Tab. 15) auf glukosehaltige Agarplatten aufgetragen und die Motilität unter BL und zusätzlich unter FRL, RL und GL getestet. Wie der WT zeigte die plpA --Mutante keine Bewegung entlang eines BL-Gradienten (Tab. 15). Auch nach Belichtung mit FRL, RL und GL unterschied sich plpA - nicht vom WT: Wie der WT wanderten die Mutanten in Richtung Lichtquelle (Tab. 15).

↓81

Neben PixJ1 und PlpA wurde auch der Einfluss weiterer phytochromähnlicher Proteine auf die Richtungswahrnehmung bei der phototaktischen Bewegung untersucht. Zu diesem Zweck wurden Mutanten mit einem Defekt in den Genen sll1473, slr1393 und slr1969 erzeugt (Tab. 15). Anschließend wurde die Motilität der Mutantenzellen unter FRL, RL, GL und BL analysiert. Das Ergebnis der Untersuchungen zeigte, dass unter den getesteten Lichtbedingungen die Genprodukte von sll1473, slr1393 und slr1969 keinen Einfluss auf die Steuerung der Bewegungsrichtung ausüben: Unter BL konnte keine Bewegung der entsprechenden Mutanten 1473 -, 1393 - und 1969 - beobachtet werden. Hingegen waren die Mutantenzellen zur einer Bewegung in Richtung FRL, RL und GL befähigt (Tab. 15). Damit demonstrierten 1473 -, 1393 - und 1969 - unter allen Lichtbedinungen WT-Verhalten.

Tab. 15: Phototaktisches Verhalten von Mutanten mit einem inaktivierten phytochromähnlichen Protein unter verschiedenen Lichtbedingungen.

Gen

Bezeich-nung

Antibiotika kassette

Einbauort

Motilität unter BL

Motilität unter FRL, RL, GL

-

WT

-

-

nicht motil

motil

plpA (sll1124)

plpA -

Km

EcoRI-EcoRI

nicht motil

motil

sll1473

1473 -

Cm

BsaBI

nicht motil

motil

slr1393

1393 -

Cm

BsaBI-BsaBI

nicht motil

motil

slr1969

1969 -

Km

EheI

nicht motil

motil

Insgesamt konnte für die phytochromähnlichen Proteine PlpA, Sll1473, Slr1393 und Slr1969 sowie für die potentiellen BL-Rezeptoren Cry und LOV keine Funktion in der Steuerung der lichtinduzierten Motilität nachgewiesen werden. Die beiden Lichtsensoren PixJ1 und BLUF spielen eine Rolle in der Vermittlung der positiven Phototaxis.

3.5 Analyse der IS-Elemente im Synechocystis–Chromosom

↓82

Synechocystis sp. PCC 6803 wurde vor einigen Jahrzehnten aus einem kalifornischen See isoliert. Seitdem wird dieser Stamm in zahlreichen Laboratorien weltweit kultiviert und für Forschungszwecke eingesetzt. Während dieser langen Zeit stellte sich heraus, dass der Stamm in verschiedenen Laboratorien keinen einheitlichen Phänotyp besitzt. So existieren glukosetolerante wie auch glukosesensitive Stämme sowie motile als auch unbewegliche Synecho cystis-Varianten (Ikeuchi und Tabata, 2001). Es besteht die Möglichkeit, dass die ursprünglich isolierten Synechocystis-Zellen nicht genotypisch einheitlich waren. Dies trifft jedoch laut R. Rippka nicht zu (mündliche Mitteilung). Bei der Entstehung dieser Variabilität könnten IS-Elemente eine Rolle gespielt haben. Infolge der Genomanalyse des durch eine japanische Arbeitsgruppe sequenzierten WT-Stammes konnten 77 IS-ähnliche Elemente ermittelt werden, die sich hinsichtlich ihrer terminalen, invers repetitiven Sequenzen in 9 Gruppen einteilen lassen (Ikeuchi und Tabata, 2001). Insgesamt 26 der gefundenen IS-Elemente enthalten einen ORF, der für eine Transposase kodiert. Die ISY203-Gruppe ist als transpositionsaktiv bekannt. So ist der ORF sll1473, der für ein phytochromähnliches Protein kodiert, wahrscheinlich nur in der sequenzierten Stamm-Variante durch ein Transposon dieser Gruppe unterbrochen (Okamoto et al., 1999).

3.5.1  Vergleich des phototaktischen Verhaltens verschiedener WT-Varianten von Synechocystis

Wie bereits erwähnt, existieren motile und nichtmotile Varianten des Synechocystis-Stammes PCC 6803. Ähnliche Variationen innerhalb des Stammes könnten auch hinsichtlich der Regulation der BL-gesteuerten Motilität bestehen. Bestärkt wird diese Vermutung durch eine Veröffentlichung einer koreanischen Arbeitsgruppe, in der die Fähigkeit des WT zur Phototaxis innerhalb eines BL-Gradienten beschrieben werden konnte (Choi et al., 1999). Im folgenden Abschnitt werden die Ergebnisse aus der vergleichenden Analyse der BL-gesteuerten Motilität von PCC 6803-Varianten aus unterschiedlichen Laboratorien dargestellt.

Für die Untersuchungen der Motilität wurden acht WT-Stämme eingesetzt. Von den getesteten Stämmen zeigten drei unter WL keine phototaktische Bewegung (Abb. 25A). Dazu gehört unter anderem die Kazusa-Stamm-Variante (Nr. 3 in Abb. 25A), der für die Sequenzierung des Genoms verwendet wurde. Aus der gleichen Abbildung geht hervor, dass die in unserer Arbeitsgruppe verwendete WT-Variante (Nr. 6 in Abb. 25B) der einzige motile WT ist, dessen Bewegung unter BL gehemmt ist. Da der beobachtete Phänotyp der übrigen motilen WT-Varianten dem der cph2 - -Mutante entspricht,wurde das Vorhandensein des cph2-Gens in den WT-Stämmen mittels Southern-Blot-Analyse überprüft. Diese zeigte, dass das Gen in allen untersuchten WT-Varianten existiert (Abb. 25B). Jedoch erlaubt diese Methode keine Aussage über die Funktionstüchtigkeit des cph2-Gens in diesen WT-Stämmen. Somit könnte die Aufhebung der Inhibition der BL-abhängigen Motilität durch die Inaktivierung des cph2-Gens möglicherweise nur bei unserem WT beobachtbar sein.

↓83

Abb. 25 : Lichtinduzierte Motilität verschiedener WT-Stämme von Synechocystis in Abhängigkeit vom WL und BL (A) sowie Southern-Blot-Analyse des cph2 -Gens in jenen WT-Varianten (B). Für die Southern-Blot-Analyse wurde die mit dem Restriktionsenzym HindIII fragmentierte chromosomale DNA mit einer Sonde gegen cph2 hybridisiert.
Eine Aufschlüsselung der Nummern ist in Tab. 3 im Kap. 2.1.8.1 dargestellt. In der Spur Nr. 6 ist die DNA des WT aufgetragen, der für die Inaktivierung der Gene cph1 und cph2 verwendet wurde.

3.5.2 Untersuchung der BL-induzierten Motilität ausgewählter Photorezeptormutanten verschiedener WT-Varianten von Synechocystis

Der in dieser Arbeit hauptsächlich verwendete WT (Nr. 6) unterschied sich hinsichtlich seiner Motilität im BL von anderen motilen WT-Varianten. Unter den getesteten BL-Bedingungen war dieser nicht zu einer Bewegung entlang eines BL-Gradienten befähigt, während andere motile WT-Stämme dies vermochten (Abb. 25A). Es besteht die Möglichkeit, dass die WT-Variante Nr. 6 eine Mutation in einem Gen besitzt, das einen BL-Photorezeptor kodiert. In diesem Fall könnte die Inaktivierung des cph2-Gens die Auswirkung dieser Mutation kompensieren. Zu diesem Zweck wurden die in Kap. 3.4.3 beschriebenen Konstrukte verwendet, um die entsprechenden Gene für potentielle BL-Photorezeptoren in den WT-Stämmen Nr. 2 und 4 zu inaktivieren. Anschließend wurde die Motilität der gewonnenen Mutanten unter BL untersucht.

Wie in Tab. 16 gezeigt, verhielten sich die cr y -- und lov --Mutante der WT-Variante Nr.2 und Nr.4 wie die entsprechenden WTen. Die Fähigkeit der Mutanten, sich in Richtung BL zu bewegen, blieben erhalten. Die blu f --Mutante war zwar ebenfalls im BL motil, jedoch wurde hier sowohl positive als auch negative Phototaxis beobachtet. Weiterhin wurden Mutanten mit einem inaktivierten Gen von plpA, slr1969 und sll1473 hergestellt, welche phytochromähnliche Proteine kodieren, die möglicherweise BL absorbieren können (Wilde et al., 1997; Wu und Lagarias, 2000). Auch diese Mutanten zeigten, wie der dazugehörige WT, Motilität in Richtung BL (Tab. 16).

↓84

Somit kann eine Mutation in den Genen cry, lov, bluf, plpA, slr1473 und slr1969 nicht die Ursache für das nichtmotile Verhalten der WT-Variante (Nr. 6) unserer Arbeitsgruppe sein.

Tab. 16: Phototaktisches Verhalten verschiedener Mutanten potentieller BL-Photorezeptoren und phytochromähnlicher Proteine in den WT-Varianten WT Nr.2 und Nr.4 im BL. Diese beiden WT-Varianten besitzen die Fähigkeit, sich in Richtung BL zu bewegen. Somit zeigten diese beiden WT-Varianten bezüglich der BL-gesteuerten Motilität die gleichen Eigenschaften wie cph2-. Zur Inaktivierung der Gene, welche die potentiellen BL-Photorezeptoren kodieren, wurden die in Tab. 13 und Tab. 15 aufgelisteten Konstrukte verwendet.

  

WT Nr.2

WT Nr.4

WT

 

motil

motil

Mutanten:

cr y -

motil

motil

 

lov -

motil

motil

 

blu f -

motil b)

motil b)

 

plpA -

motil

motil

 

1473 -

motil

n. u. a)

 

1969 -

motil

n. u. a)

n. u. - nicht untersucht

↓85

Sowohl positive als auch negative Phototaxis wurde beobachtet.

3.5.3 Analyse der IS-Elemente über Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)

Die in unserer Arbeitsgruppe genutzte WT-Variante (Nr. 6) unterscheidet sich unter BL-Bedingungen in ihrem Phänotyp von anderen Varianten von Synechocystis sp. PCC 6803. Von allen untersuchten WT-Varianten mit der Fähigkeit zur lichtinduzierten Motilität war der WT Nr. 6 die einzige WT-Variante, die im BL keine Zellbewegung zeigte (Abb. 25A). Eine mögliche Ursache für dieses Phänomen könnten die 77 IS-Elemente im Synechocystis-Chromosom sein.

Die IS-Elemente der ISY203-Gruppe sind als transpositionsaktiv bekannt (Okamoto et al., 1999). So konnten im Genom der zur Sequenzierung benutzten Kazusa-WT-Variante (Nr. 3 in Abb. 26) gleich drei zusätzliche IS-Elemente dieses Typs gegenüber dem zweier anderer WT-Varianten ermittelt werden. Daher wurden zunächst durch die RFLP-Analyse mittels Southern-Blot-Technik die Anzahl der IS-Elemente aus dieser Gruppe sowie die möglichen Änderungen ihrer Positionen im Chromosom bestimmt. Hierfür wurde die chromosomale DNA verschiedener WT-Varianten von Synechocystis sp. PCC 6803 mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Die fragmentierte DNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Membran übertragen. Die DNA-Fragmente, auf denen sich ein IS-Element befindet, wurden durch Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde gegen die IS-Elemente der ISY203-Gruppe sichtbar gemacht. Die Zuordnung der verschiedenen IS-Elemente zu den markierten Banden im Southern-Blot erfolgte über die Berechnung der zu erwartenden Fragmentgrößen der geschnittenen DNA. Die Größe der Hybridisierungsbanden wurde mit Hilfe von DNA-Markern bestimmt.

↓86

In Abb. 26 ist ein Beispiel für einen Southern-Blot dargestellt, bei dem die DNA mit dem Restriktionsenzym Eco32I geschnitten wurde. In Spur 6 wurde die DNA der WT-Variante (Nr. 6) aus unserer Arbeitsgruppe aufgetragen. Im Gegensatz zu allen anderen getesteten WT-Varianten fehlte bei diesem WT die Hybridisierungsbande im Größenbereich von 10 kb, die das IS-Element sll1255 enthalten soll (Abb. 26). Stattdessen erschien eine neue Bande im Größenbereich von 8,5 kb. In diesem Bereich befinden sich auch die DNA-Fragmente, welche die IS-Elemente vom ISY203-Typ sll1560 bzw. sll1997/sll1999 enthalten. Aufgrund der Überlagerung durch drei markierte Fragmente kam es zu einer Verstärkung des Hybridisierungssignals. Die Verschiebung der 10kb-Hybridisierungsbande in den Bereich kürzerer Fragmentlängen bedeutet entweder, dass das IS-Element sll1255 an eine andere Stelle im Genom unserer WT-Variante gesprungen ist oder, dass durch eine Änderung in der Genomsequenz eine neue Erkennungsstelle für Eco32I und damit ein verkürztes Fragment entstanden ist.

Die DNA der einzelnen WT-Varianten wurde auch mit anderen Restriktionsenzymen fragmentiert. Bei der Verwendung der Enzyme HindIII und EcoRI wurde ebenfalls ein verändertes Hybridisierungsmuster ermittelt (Abbildungen nicht gezeigt), das stets auf das Fragment hinwies, auf dem sich das IS-Element sll1255 befindet. Dies deutet darauf hin, dass es im Genom unserer WT-Variante zu größeren Änderungen gekommen sein muss als zum Austausch einzelner Basenpaare, welche die Erkennungssequenz nur eines Restriktionsenzyms betreffen. Somit hat sich sll1255 entweder an eine andere Stelle im Genom eingebaut, oder dieses IS-Element ist nicht gesprungen, aber es liegt eine größere Veränderung in dem Genombereich vor, in dem sich sll1255 befindet.

Wie bereits erwähnt, besitzt der Kazusa-WT-Stamm drei zusätzliche IS-Elemente (sll1474, sll1780 und slr1635) vom ISY203-Typ, die in anderen WT-Varianten nicht gefunden wurden (Okamoto et al., 1999). Das Vorhandensein dieser IS-Elemente im Genom der Kazusa-WT-Variante (Nr. 3 in Abb. 26) konnte bestätigt werden und konnte bei keinem der hier verwendeten WT-Varianten gezeigt werden (Abb. 26).

↓87

Abb. 26 : RFLP-Analyse der zur ISY203-Gruppe gehörigen IS-Elemente im Genom von Synechocystis Die genomische DNA verschiedener WT-Stämme wurde mittels des Restriktionsenzyms Eco32I geschnitten und elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Transfer der DNA auf einen Filter wurde diese mit einer ISY203-spezifischen Sonde hybridisiert. Eine Aufschlüsselung der Nummern ist in Tab. 3 im Kap. 2.1.8.1 dargestellt. In der Spur Nr. 6 ist die DNA des WT aufgetragen, der für die Inaktivierung der Gene cph1 und cph2 verwendet wurde.

Tab. 17: Analyse der IS-Elemente im Genom der WT-Variante Nr. 6 unserer Arbeitsgruppe und deren Änderung gegenüber dem Genom anderer motiler WT-Stämme von Synechocystis. Die Tabelle fasst die Ergebnisse aus mehreren RFLP-Analysen zusammen, für die mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnittene DNA eingesetzt wurde.

Gruppe

Anzahl der IS-Elemente im Kazusa-Stamm a)

Änderung im Genom

ISY100

33

ja

ISY120

7

nein

ISY203

11

ja

ISY352

11

nein

ISY391

5

nein

ISY508

6

ja

ISY523

19

nein

ISY802

6

nein

übrige

14

nein

a) laut Cyanobase-Datenbank

Die DNA wurde auch mit Sonden gegen die übrigen IS-Gruppen hybridisiert. Während bei ISY120, ISY391, ISY523, ISY802 keine Änderung im Hybridisierungsmuster der DNA aus der WT-Variante Nr. 6 gegenüber den übrigen zu finden war (Tab. 17), unterschied sich das Muster im Fall von ISY100 und ISY508. Auch hier waren Abweichungen in der Abfolge der Banden bei der Verwendung bestimmter Restriktionsenzyme zu beobachten.

↓88

Die Abb. 27A zeigt ein Autoradiogramm, bei dem die DNA mit einer Sonde gegen die IS-Elemente der ISY508-Gruppe hybridisiert wurde. Laut Cyanobase sollten auf dem Autoradiogramm drei Banden für Fragmente zu finden sein, welche die IS-Elemente sll0808/ssl1507, slr1585/slr1586 und slr1282/slr1283 enthalten. Zum ISY508-Typ gehören sechs IS-Elemente. Da jedoch jeweils zwei dieser IS-Elemente im Genom direkt nebeneinander angeordnet sind und das verwendete Restriktionsenzym Eco32I weder innerhalb des ORF noch zwischen den ORFs schneidet, befinden sich je zwei der IS-Elemente auf einem Fragment. Die drei Hybridisierungsbanden lassen sich im Autoradiogramm nur in der Spur 3 finden (Abb. 27A), auf dem die fragmentierte DNA der Kazusa-WT-Variante aufgetragen wurde. Bei den übrigen WT-Varianten fehlte die Hybridisierungsbande, welche die beiden IS-Elemente slr1585 und slr1586 enthält. Eine neue Hybridisierungsbande in einem anderen Größenbereich konnte nicht erfasst werden. Somit enthält das Genom der Kazusa-WT-Variante zwei weitere zusätzliche IS-Elemente neben den bereits bekannten sll1474, sll1780 und slr1635 vom ISY203-Typ.

Abb. 27 : RFLP-Analyse der IS-Elemente aus den Gruppen ISY508 (A) und ISY100 (B) sowie des Gens slr1336 (C). Für die Hybridisierung mit einer Sonde gegen ISY100 und ISY508 wurde die genomische DNA mit dem Restriktionsenzym Eco32I geschnitten. Die chromosomale DNA für die RFLP-Analyse des slr1336-Gens wurde mit der Endonuklease XbaI fragmentiert. Eine Aufschlüsselung der Nummern ist in Tab. 3 im Kap. 2.1.8.1 dargestellt. In der Spur Nr. 6 ist die DNA des WT aufgetragen, der für die Inaktivierung der Gene cph1 und cph2 verwendet wurde.

Die genomische DNA unserer WT-Variante unterschied sich ebenfalls im Hybridisierungsmuster von der DNA der übrigen Synechocystis-Varianten nach Markierung des Filters mit einer Sonde gegen die IS-Elemente der ISY508-Gruppe. Im Autoradiogramm fehlte die Hybridisierungsbande, die sll0808 und ssl1507 enthält. Stattdessen erscheint im Bereich größerer DNA-Fragmente eine neue Hybridisierungsbande (Nr. 6 in Abb. 27A). Somit müssen die beiden benachbarten IS-Elemente entweder an eine andere Stelle im Genom gesprungen sein, oder in der ursprünglichen Erkennungssequenz des Eco32I-Restriktionsenzyms fand ein Basenpaaraustausch statt, so dass nun ein verlängertes Fragment entstand.

↓89

Wurde die DNA mit einer Sonde gegen die IS-Elemente der ISY100-Gruppe hybridisiert, konnten für die genomische DNA unserer WT-Variante ebenfalls Abweichungen im Hybridisierungsmuster im Vergleich zu zwei anderen WT-Varianten festgestellt werden (Abb. 27B). Die Bande, die mit den beiden benachbarten IS-Elementen sll1256 und sll1257 hybridisiert, war nicht vorhanden. Dafür fand sich im Bereich zwischen 3 und 3,8 kb eine neue Bande. Auch hier muss sich eine Transposition von sll1256 und sll1257 ereignet haben, oder durch Basenpaaraustausche ist eine neue Erkennungsstelle für das hier verwendete Restriktionsenzym Eco32I entstanden.

In dem Autoradiogramm (Abb. 27B) ist in den beiden Spuren, in denen die DNA der WT-Varianten Nr. 2 und 4 aufgetragen wurden, eine zusätzliche Hybridisierungsbande im Größenbereich um 33 kb zu erkennen, die keiner der bekannten IS-Elemente aus der ISY100-Gruppe zugeordnet werden konnte. Im Gegenzug konnten drei IS-Elemente (ssl0426, sll1436 und sll1437), die im Genom nebeneinander liegen, im Autoradiogramm nicht identifiziert werden. Somit könnten diese drei IS-Elemente im Genom unserer WT-Variante nicht vorhanden und in dem Genom der beiden anderen untersuchten WT-Varianten an eine andere Stelle gesprungen sein (Die Analyse der DNA der Kazusa-WT-Variante ist in Abb. 27B nicht dargestellt.).

Betrachtet man die Lokalisation der IS-Elemente sll1255 (ISY203), ssl1507/sll0808 (ISY508) und sll1256/sll1257 (ISY100) im Genom, so fällt auf, dass diese sich alle in derselben Genomregion befinden (Abb. 28). Daher könnten alle die in der RFLP-Analyse beobachteten Unterschiede im Hybridisierungsmuster unserer WT-Variante im Vergleich zu anderen Varianten auf Veränderungen innerhalb dieser Genomregion zurückzuführen sein.

↓90

Um die Veränderung in der genomischen Region um sll1255 exakter bestimmen zu können, wurde von dieser eine Minibank angefertigt. Die anschließende Sequenzierung klärte, dass unmittelbar upstream von sll1257 eine Insertion durch eine DNA erfolgt ist, deren Sequenz eine hohe Ähnlichkeit zu dem Plasmid pSYSG aus Synechocystis aufweist. Das genaue Ausmaß der Insertion konnte nicht ermittelt werden, da das für die Herstellung der Minibank verwendete Restriktionsenzym HindIII in der inserierten DNA-Sequenz schnitt.

In der Region upstream von sll1257 befindet sich der ORF slr1336, welcher für einen potentiellen Ca2+/H+-Antiporter kodiert. Dieses Protein ist für die Erklärung der fehlenden Motilität unserer WT-Variante im BL interessant, da Kalzium die Motilität von Synecho cystis beeinflusst (Moon et al., 2004). Der ORF sll1258 kodiert für eine dCTP-Deaminase. Ein Defekt in diesem Gen ist wahrscheinlich nicht die Ursache für den nichtmotilen Phänotyp unseres WTs.

Für slr1336 wurde eine RFLP-Analyse durchgeführt, wobei eine Sonde verwendet wurde, die nur mit diesem Gen hybridisiert. Nach den errechneten Fragmentgrößen sollte im Autoradiogramm eine Hybridisierungsbande im Bereich um 4 kb zu finden sein. Wie in Abb. 27C zu sehen, konnte zwar bei unserer WT-Variante (Nr. 6) ein Hybridisierungssignal für slr1336 registriert werden, jedoch befand sich die Bande in einem Größenbereich um 7 kb.

↓91

Abb. 28 : Genombereich, in dem sich das IS-Element sll1257 befindet. Die Abbildung repräsentiert einen Ausschnitt einer in der Cyanobase erhältlichen Genkarte dieser Region. Die IS-Elemente innerhalb dieser Genomregion sind durch Kästchen hervorgehoben. Der Pfeil markiert die Position der Insertion der pSYSG-Sequenz. Der ORF sll1258 kodiert für eine dCTP-Deaminase und der ORF slr1336 für einen potentiellen Ca2+/H+-Antiporter. Die Farben symbolisieren Kategorien, nach denen die Gene hinsichtlich der zu erwartenden Funktion ihrer Genprodukte eingeteilt sind. weiß: Proteine unbekannter Funktion; grau: hypothetische Proteine; schwarz: andere Kategorien; lila: Biosynthese von Purinen, Pyrimidinen, Nukleosiden, Nukleotiden; blau: Translation; grün: Transport; oliv: Photosynthese und Respiration; orange: RNA; rot: Energie-Metabolismus. Die Bezeichnung der Katagorien stammt aus der Cyanobase.

Ob die Verlängerung des Fragments allein durch die Insertion der pSYSG-Sequenz zwischen sll1257 und slr1336 hervorgerufen wurde, oder ob es zu größeren Umlagerungsprozessen in diesem Genombereich mit Auswirkung auf die Transkription von betroffenen Genen kam, lässt sich jedoch mit dieser RFLP-Analyse nicht bestimmen. Genauere Aussagen sind nur durch eine Sequenzierung dieses Genombereichs möglich.

Anhand von RFLP-Analysen konnte belegt werden, dass sich die WT-Variante von Synechocystis aus unserer Arbeitsgruppe genotypisch von anderen WT-Varianten unterscheidet. Allerdings können noch weitere Änderungen im Genom unserer am intensivsten untersuchten WT-Variante aufgetreten sein, die bisher noch nicht identifiziert wurden. Ob die gefundene Änderung in der Genomregion, in der sich u. a. das IS-Element sll1257 befindet, tatsächlich die Ursache für die fehlende Motilität unserer WT-Variante im BL ist, kann durch die RFLP-Analyse nicht geklärt werden. Dazu sind weitere Untersuchungen erforderlich, wie z. B. Mutantenanalysen und die Komplementation mit einer DNA-Bank von anderen WT-Varianten.

↓92

Die meisten Abweichungen in der Anzahl von IS-Elementen zeigte der Kazusa-WT-Stamm, der für die Sequenzierung des Genoms von Synechocystis sp. PCC 6803 verwendet wurde.


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01.11.2005