4 Diskussion

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Die Phytochrome regulieren in Pflanzen verteilt über den gesamten Lebenszyklus eine Reihe von photomorphogenetischen Prozessen, beginnend mit Steuerungsvorgängen bei der Samenkeimung, der De-Etiolierung der Keimlinge, Prozessen zur Schattenvermeidung, Einstellung der circadianen Uhr und Blüteninduktion (Sullivan und Deng, 2003). Die Regulation der genannten Entwicklungsprozesse findet über ein z. T. komplexes Netzwerk statt, wobei verschiedene Phytochrome sowie der BL-Rezeptor Cryptochrom beteiligt sein können (Quail, 2002; Sullivan und Deng, 2003).

Die Sequenzierung bakterieller Genome zeigte, dass Phytochrome phylogenetisch älter sind als bisher angenommen. Phytochrome und phytochromähnliche Proteine wurden in verschiedenen Cyanobakterienspezies sowie in nichtphotosynthetischen Eubakterien wie Agrobacterium tumesfaciens,Deinococcus radiodurans undPseudomonas aeruginosa (Karniol und Vierstra, 2003; Davis et al., 1999) gefunden. Aufgrund des einfachen Zellaufbaus von Prokaryoten ist eine mit den Pflanzenphytochromen vergleichbare Rolle der bakteriellen Phytochrome bzw. phytochromähnlichen Proteine nicht zu erwarten. Montgomery und Lagarias (2002) formulierten die Hypothese, wonach Phytochrome aus Vorläuferproteinen mit einer Funktion als Bilinsensor entstanden sind. Einige Vertreter der bakteriellen Phytochrome und phytochromähnlichen Proteine könnten somit keine oder zumindest nicht eine alleinige Funktion als Lichtsensor haben.

↓93

Das Genom von Synechocystis enthält die ORFs slr0473 (cph1) und sll0821 (cph2), für deren Genprodukte die phytochromkennzeichnenden Eigenschaften, wie die Bindung eines linearen Tetrapyrrols und die Photokonversion zwischen zwei Konformationen nach der Einstrahlung von RL oder FRL, nachgewiesen werden konnten (Hughes et al., 1997; Yeh et al., 1997; Park et al., 2000; Wu und Lagarias, 2000). Um die Funktion dieser beiden cyanobakteriellen Phytochrome aufzuklären, wurden deren kodierende Gene durch die Insertion von Antibiotikaresistenzgen-Kassetten inaktiviert. Weiterhin wurde eine Doppelmutante von cph1 und cph2 erzeugt, um eventuelle kompensatorische oder überlappende Funktionen von Cph1 und Cph2 zu erfassen. Die wichtigsten Ergebnisse aus der Charakterisierung der Phytochrommutanten sind in Abb. 29 zusammengefasst.

Abb. 29 : Zusammenfassung der wichtigsten Resultate aus der Analyse der cph1 - - und cph2 - -Mutanten

4.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der Phytochrommutanten

Um die Auswirkungen der Inaktivierung der beiden cyanobakteriellen Phytochrome in Synechocystis zu charakterisieren, wurde zunächst das Wachstum der einzelnen Phytochrommutanten sowie der Doppelmutante unter verschiedenen Lichtbedingungen untersucht. Dazu gehörten die Wachstumsanalyse unter verschiedenen Lichtintensitäten sowie Lichtqualitäten.

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Die Untersuchung des Wachstums in Abhängigkeit von der Lichtqualität ergab, dass die phytochromrelevanten Spektralbereiche RL und FRL einen Einfluss auf das Wachstum der Phytochrommutanten ausübten. Hierbei verhielten sich die cph1 -- und die cph2 --Mutante gegensätzlich: Während cph1 - unter FRL eine gegenüber dem WT verminderte Wachstumsrate vorwies, wuchs cph2 - unter RL schlechter (Abb. 10). Die Doppelmutante zeigte jeweils das gleiche Wachstumsverhalten wie die Einzelmutanten.

Wie bereits erwähnt, liegen Phytochrome in zwei Konformationen vor: Im RL dominiert die FRL-absorbierende Pfr-Form, die RL-absorbierende Pr-Form hingegen ist die überwiegende Konformation im FRL. Für pflanzliche Phytochrome wird angenommen, dass Pfr die biologisch aktive Form darstellt (Sullivan und Deng, 2003). In Synechocystis zeigte die Pr-Form eines rekombinanten Cph1-Proteins aus E. coli eine höhere Phosphorylierungsrate und Phosphatübertragung auf den Response-Regulator Rcp1 als die Pfr-Form des Photorezeptorproteins (Yeh et al., 1997). Dies lässt vermuten, dass die Pr-Form von Cph1 die biologisch aktive Form ist. Ein ähnliches Bild ergibt sich auch für die beiden Phytochrome CphA und CphB aus Calothrix sp. PCC 7601. Hier wurde ebenfalls die im FRL vorliegende Pr-Form von CphA und CphB stärker autophosphoryliert, wobei jedoch im Gegensatz zu Cph1 der Transfer des Phosphats vom Sensorprotein auf den entsprechenden Response-Regulator unter RL nicht aufgehoben wurde (Hübschmann et al., 2001b). Unter Verwendung der Absorptionsspektren des rekombinanten, mit PCB assemblierten Cph1-Proteins (Lamparter et al., 1997) wurde der Anteil der Pr-Form an der Gesamtmenge an Phytochrom unter den für diese Arbeit genutzten FRL-Bedingungen mit 90 % berechnet (unter RL 42 %). Daher ist anzunehmen, dass unter diesen Lichtbedingungen Cph1 hauptsächlich in seiner aktiven Form vorliegt. Wenn die Pr-Konformation von Cph1 die biologisch aktive Form ist, sollte sich eine Mutante mit einem inaktivierten cph1-Gen unter FRL anders verhalten als der WT. Dies konnte durch die Aufnahme von Wachstumskurven beobachtet werden: Die cph1 --Mutante zeigte ein auf ca. 60 % vom WT vermindertes Wachstum im FRL, während RL keinen Einfluss auf das Wachstum von cph1 - ausübte (Abb. 10). Auch während des kompetitiven Wachstums von WT und cph1 - in einer Mischkultur wurden die Mutantenzellen nach 12 Tagen im FRL verdrängt. Somit sprechen die Daten aus der Wachstumsanalyse dafür, dass Pr tatsächlich die biologisch aktive Form ist. Jedoch ist nicht völlig auszuschließen, dass nicht auch die Pfr-Form von Cph1 am Beginn einer weiteren Signalkette stehen könnte. So existieren für pflanzliche Phytochrome Hinweise, dass die als biologisch inaktiv geltende Konformation, hier die Pr-Form, auch eine biologische Aktivität besitzen könnte (Reed, 1999; Shinomura et al., 2000). Resultate aus der Untersuchung der phytochromgesteuerten Hypokotyl-Elongation bei A. thaliana deuten auf eine Funktion der photozyklisierten Pr-Form von PhyA (Shinomura et al., 2000), d. h. die neu synthetisierte Grundform Pr muss eine Photokonversion in die Pfr- und zurück in die Pr-Form vollzogen haben.

Ein umgekehrtes Wachstumsverhalten zeigte die cph2 --Mutante. Diese wuchs unter RL-Bedingungen schlechter, während das Wachstum im FRL nicht beeinträchtigt war (Abb. 10). Auch während des kompetitiven Wachstums von WT und cph2 - im RL nahm eingigen Tagen der Anteil der Mutantenzellen im Vergleich zum WT ab (Abb. 11D). Dies spricht dafür, dass die im RL dominierende Pfr-Form von Cph2 die biologisch aktive Konformation ist, so wie es für pflanzliche Phytochrome angenommen wird. Das Ausmaß der Wachstumsreduktion (ca. 80 %) war geringer ausgeprägt als bei der cph1 --Mutante im FRL (ca. 60 %). Eine mögliche Ursache hierfür könnte im verhältnismäßig niedrigen Anteil von Cph2 in seiner Pfr-Form unter unseren RL-Bedingungen zu suchen sein. Der Pfr-Anteil wurde für die in dieser Arbeit beschriebenen RL-Bedingungen mit 58 % berechnet. Allerdings bezieht sich dieser Wert auf das Absorptionsspektrum des rekombinanten, mit PCB assemblierten Cph1-Proteins aus E. coli, welches dem Spektrum eines in Synechocystis überexprimiertem Cph1 entsprach (Hübschmann et al., 2001a). Die Absorptionseigenschaften des nativen Cph2 müssen nicht dem von Cph1 entsprechen. Vielmehr weisen bisherige Daten aus der spektrophotometrischen Analyse eines in E. coli rekombinant exprimierten Cph2-Proteins mit PCB als Chromophor auf eine Verschiebung der Maxima von Pfr und Pr um ca. 10 bzw. 16 nm in den kürzeren Wellenlängenbereich gegenüber Cph1 hin (Wu und Lagarias, 2000; Park et al., 2000). Dies würde bedeuten, dass der tatsächliche Anteil der Pfr-Form des Cph2-Photosensors höher gewesen sein kann. Eine genaue Berechnung des Pfr- und Pr-Anteils des Cph2-Proteins unter den untersuchten Lichtbedingungen war nicht möglich, da entsprechende Daten nicht verfügbar waren. Über die Natur des Chromophors und die Absorptionscharakteristika des nativen Cph2-Proteins ist bisher nichts bekannt.

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Das Vorhandensein von zwei Phytochromen (AtBphP1, AtBphP2) mit gegensätzlichen photobiologischen Eigenschaften konnte für Agrobacterium tumefaciens beschrieben werden (Karniol und Vierstra, 2003). Die Analyse der rekombinanten Phytochrom-Proteine aus Agrobacterium tumefaciens deutete darauf hin, dass die Grundform von AtBphP1 der Pr-Form und die von AtBphP2 der Pfr-Konformation entspricht. Beide Sensorproteine sind Histidinkinasen. Während die Pr-Form von AtBphP1 eine höhere Histidinkinase-Aktivität besaß als die Pfr-Form, wurde für AtBphP2 eine höhere Histidinkinase-Aktivität der Pfr- im Vergleich zur dazugehörigen Pr-Form ermittelt. Aufgrund dieser gegensätzlichen photobiologischen Eigenschaften vermuten die beiden Autoren, dass AtBphP1 und AtBphP2 als gegensätzliche Photorezeptoren fungieren könnten.

Die cph1 - /cph2 --Doppelmutante wuchs sowohl im RL als auch im FRL schlechter als der WT (Abb. 10), wobei sich das Ausmaß der Wachstumsreduktion nicht wesentlich von den Werten für die entsprechenden Einzelmutanten unterschied. Daher lässt zumindest die Analyse des Wachstumsverhaltens der Phytochrommutanten keine kompensatorischen oder überlappenden Funktionen von Cph1 und Cph2 erkennen. Das schließt nicht aus, dass die Untersuchung anderer physiologischer Parameter zu anderen Schlussfolgerungen führen kann.

Unter HL-Bedingungen wuchsen alle Phytochrommutanten schlechter als der WT (Abb. 10), wobei das Wachstum der einzelnen Phytochrommutanten in unterschiedlichem Ausmaß betroffen war. So hatte HL auf die cph1 --Mutante mit einer Wachstumsreduktion von ca.
40 % gegenüber dem WT einen größeren Einfluss als auf die cph2 --Mutante (ca. 20 % Wachstumsverminderung gegenüber dem WT). Somit scheint das Ausschalten des cph1-Gens einen stärkeren Effekt auf das Zell-Wachstum zu haben als das des cph2-Gens. Obwohl unter HL beide Einzelmutanten schlechter wuchsen, erreichte die prozentuale Wachstumsrate der cph1 -/cph2 --Doppelmutante keinen geringeren Wert als die der cph1 --Mutante.

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Stärkere Beeinträchtigungen des Wachstums im WL waren nur unter hohen Lichtintensitäten zu beobachten: Mit abnehmender Lichtstärke verminderte sich auch die Wachstumsreduktion, so dass unter LL-Bedingungen keinerlei Unterschiede im Wachstum von WT und Phytochrommutanten zu erkennen war. Die Wachstumsverminderung aller Phytochrommutanten unter HL-Bedingungen zeigt, dass die Inaktivierung von cph1 und cph2 die Fähigkeit herabsetzte, Lichtstress zu bewältigen. Hierbei spielt die Anpassung des Photosyntheseapparats an überoptimales Licht eine große Rolle (siehe Kap. 4.2).

4.2 Untersuchung von Photosyntheseparametern

Cyanobakterien können sich auf verschiedene Weise an überschüssiges Licht in ihrer Umgebung anpassen. Welcher Regulationsweg zur Akklimatisierung an hohe Lichtintensitäten in Phytochrommutanten von Synechocystis betroffen ist, konnte jedoch nicht herausgefunden werden. Problematisch für photosynthetisch aktive Organismen ist die mit steigenden Lichtintensitäten einhergehende Gefahr der verstärkten Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies über den photosynthetischen Elektronentransport (Niyogi, 1999). Eine Möglichkeit, diese Gefahr zu vermindern, ist die Reduktion der lichtsammelnden Antennen sowie die verstärkte Bildung von photoprotektiv wirkenden Pigmenten. Derartige Anpassungsmechanismen konnten für den WT beobachtet werden. Dies zeigt auch, dass die für das Wachstum unter HL-Bedingungen eingesetzte Lichtmenge tatsächlich einer Stress-Situation entsprach. Laut Analyse der Pigmentzusammensetzung unterschieden sich jedoch WT und Phytochrommutanten nicht wesentlich voneinander (Tab. 10). Die Phytochrommutanten senkten den Chl-Gehalt auf einen ähnlichen Wert wie der WT. Im Gegenzug war die Chl-bezogene Karotinoidmenge wie im WT heraufgesetzt. Für das PC/Chl-Mengenverhältnis konnten ebenfalls keine signifikanten Differenzen zwischen WT und den einzelnen Phytochrommutanten erfasst werden.

Auch im RL und FRL konnten keine wesentlichen Unterschiede im Chl-Gehalt sowie im Car/Chl- und PC/Chl-Verhältnis zwischen dem WT und den Phytochrommutanten festgestellt werden (Tab. 10). Die höchsten Chl-Mengen wurden bei den im RL gewachsenen Synechocystis-Zellen gemessen. Unter FRL-Bedingungen waren die ermittelten Chl-Mengen leicht reduziert. Für Cyanobakterien bedeutet FRL, erkennbar an den sehr geringen Wachstumsraten unter diesen Bedingungen, eine extreme Lichtlimitation. Unter derartigen Bedingungen müssen photosynthetisch aktive Organismen den Aufbau des Photosyntheseapparates mit dem damit einhergehenden Energieaufwand für die Syntheseschritte ausbalancieren, um genügend Energie für andere Vorgänge in der Zelle sowie die Zellteilung bereitstellen zu können. Solche Reduktionen des Photosyntheseapparates unter Lichtmangelbedingungen wurden anhand von blattflächenbezogenen Pigmentanalysen auch bei höheren Pflanzen festgestellt (Hansen et al., 2002). Im Gegensatz zum Chl-Gehalt unterschied sich die Chl-bezogene Karotinoidmenge nicht wesentlich von den Werten im RL. Dies zeigt, dass die Karotinoide im gleichen Ausmaß wie das Chl reduziert waren. Das gegenüber HL und RL erhöhte PC/Chl-Verhältnis im FRL lässt schlussfolgern, dass die Phycobilisomenantenne vergrößert war. Mit einer Ausdehnung der lichtsammelnden Antennen vermögen Cyanobakterien unter Lichtmangelbedingungen das wenige ankommende Licht effizienter einzufangen und an die Photosysteme weiterzuleiten (Grossman et al., 1993). Ein weiteres Problem ist die im FRL verstärkt auftretende Überanregung des PSI. Die Phycobilisomen übertragen die Anregungsenergie hauptsächlich auf das PSII (Grossman et al., 1993). Mit der Vergrößerung der bei ca. 630 nm absorbierenden Phycobilisomen versuchen Cyanobakterien eine mögliche Ungleichverteilung der Elektronen über die Elektronentransportkette zu kompensieren. Im Gegensatz zum FRL war die Phycobilisomenantenne im RL verkleinert. Hier glichen die ermittelten PC/Chl-Werte denen aus dem HL oder lagen sogar geringfügig darunter (Tab. 10).

↓97

Cyanobakterien passen sich einem ungünstigen Lichtregime auch durch Änderung der PSI/PSII-Stoichiometrie an (Fujita, 1997). So verschiebt sich im FRL das PSI/PSII-Verhältnis zugunsten des PSII, um eine Überanregung des PSI zu reduzieren. Informationen über mögliche Verschiebungen in der Stoichiometrie der Photosysteme liefert die Aufnahme von 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren, bei der die Fluoreszenz erfasst wird, die von den Chl-Molekülen in den jeweiligen core-Komplexen der beiden Photosysteme ausgestrahlt wird. Jedoch weisen keine der aufgenommenen 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren von WT- oder Mutantenzellen, die im HL, RL oder FRL angezogen wurden, auf eine Änderung des PSI/PSII-Verhältnisses zwischen WT oder Phytochrommutanten hin, die die Wachstumsreduktion der Mutanten unter den genannten Lichtbedingungen erklären könnte (Kap. 3.3.3.3).

Eine Verminderung des Wachstums als Folge eines beeinträchtigten Elektronenflusses über die Photosynthesekette, verbunden mit unzureichender Fixierung von anorganischem Kohlenstoff, konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Die für cph1 -, cph2 - und die Doppelmutante ermittelte Photosyntheserate, die hier als maximale Netto-Sauerstofffreisetzung gemessen wurde, hatte unter HL- und RL-Bedingungen nahezu WT-Niveau. Mögliche Unterschiede in der Photosyntheserate zwischen WT und Phytochrommutanten unter FRL-Bedingungen werden durch die sehr großen Standardabweichungen der Mittelwerte verdeckt, so dass sich hier keine eindeutige Aussage treffen lässt. Außerdem wies die cph2 --Mutante, wie die cph1 -- und die Doppelmutante, im FRL eine Reduktion der Chl-bezogenen maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsrate auf. Das Wachstum der cph2 --Mutante war jedoch im Gegensatz zu den beiden anderen Mutanten im FRL nicht vermindert.

Die Sauerstoffentwicklung variierte stark zwischen den verschiedenen Lichtbedingungen. Bei den im Vergleich zum HL verringerten Werten im RL spielen sicherlich die unter RL-Einfluss erhöhten Chl-Gehalte eine Rolle, die die Bezugsgröße für die Sauerstofffreisetzung darstellen. Im FRL hingegen lagen die für diese Lichtbedingung ermittelten Werte für die maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate weit über denen im HL und im RL. Da sich die Chl-Gehalte im FRL in einem Größenbereich zwischen HL und RL befinden, kann die Bezugsgröße Chl nicht als Erklärungsmöglichkeit für die hohe Sauerstoffentwicklung im FRL dienen. Vielmehr scheinen sich andere Anpassungsprozesse vollzogen zu haben, in deren Folge die Photosynthese mit einer höheren Effizienz arbeitete. Bedenkt man den im FRL herrschenden extremen Lichtmangel, ist eine Optimierung der Photosynthese zur verbesserten Bereitstellung von Photosyntheseprodukten nachvollziehbar.

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Zusammenfassend lässt sich sagen, dass kein eindeutiger Zusammenhang zwischen den verschiedenen Aspekten der Photosynthese und dem verminderten Wachstum der Phytochrommutanten unter HL-, RL- oder FRL-Bedingungen hergestellt werden konnte. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass der Einfluss von Cph1 und Cph2 auf die Photosynthese in dieser Arbeit hauptsächlich auf physiologischer Ebene untersucht wurde. In anderen Eubakterien konnte eine Funktion der bakteriellen Phytochrome bzw. phytochromähnlichen Proteine bei der Regulation der Synthese des Photosyntheseapparates oder dem Aufbau von Schutzmechanismen zur Photoprotektion nachgewiesen werden (siehe unten). In Freymella diplosiphon, einem Cyanobakterium mit der Fähigkeit zur komplementären chromatischen Adaptation, ist der Photorezeptor RcaE über einen Phosphorelay in die Regulation die Genexpression von Operonen involviert, welche für lichtsammelnde Proteine der Phycobilisomen kodieren (Stowe-Evans und Kehoe, 2004). Dadurch ist Freymella diplosiphon in der Lage, die Anteile von PC und Phycoerythrin in den Phycobilisomen in Abhängigkeit vom GL bzw. RL zu variieren und so die für die Photosynthese essentielle Lichtsammlung zu optimieren. Terauchi et al. (2004) demonstrierten kürzlich die Fähigkeit des RcaE-Apoproteins, einen Chromophor zu binden. Jedoch konnte keine Photokonversion des RcaE-Holoproteins aus Freymella diplosiphon nach Anregung mit GL oder RL gezeigt werden. In dem nichtphotosynthetischen Bakterium Deinococcus radiodurans steuert das Phytochrom BphP die Biosynthese des Karotinoids Deinoxanthin (Davis et al., 1999). In dem symbiontisch lebenden Bradyrhizobium ORS278 wiesen Mutanten mit dem inaktivierten Phytochrom BrbphP, das nahe dem Photosynthese-Gencluster lokalisiert ist, einen stark reduzierten Photosyntheseapparat auf (Giraud et al., 2002). Für dieses Phytochrom nehmen die Autoren an, dass die Pr-Form von BrbphP als ein Antagonist für den Repressor der Genexpression des Photosynthese-Genclusters, PpsR, wirkt. Am C-Terminus befindet sich eine PAS/S-Box. Daher findet die Signalübertragung wahrscheinlich über Protein-Protein-Interaktionen statt (Giraud et al., 2002). Ähnliche Ergebnisse lieferte die Untersuchung des Phytochroms RpBphP aus dem Purpurbakterium Rhodopseudomonas palustris, welches mit Bradyrhizobium ORS278 nahe verwandt ist (Giraud et al., 2004).

Die Wirkung der Mutation von cph1 und cph2 auf die Transkriptmenge ausgewählter Photosynthesegene in Synechocystis wurde von Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe untersucht. Hier konnte jedoch kein deutlicher Einfluss der beiden Phytochrome auf das Transkriptniveau der untersuchten Gene festgestellt werden (unveröffentliche Resultate).

Beeinflussen Cph1 und Cph2 auf irgendeine Weise die Photosynthese, sollte die Zugabe von Glukose die Beeinträchtigung des Wachstums gegenüber dem WT aufheben. Synechocystis kann Glukose als Energie- und Kohlenstoffquelle nutzen und ist dadurch zu einem Wachstum ohne Licht befähigt, wenn den Zellen ein täglicher BL-Puls gegeben wird (Anderson und McIntosh, 1991).

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Im RL und FRL stimulierte die Glukosezugabe das Wachstum sowohl des WTs als auch der Phytochrommutanten (Tab. 9). Der Unterschied in der Wachstumsrate zwischen cph2 - bzw. der Doppelmutante und dem WT wurde zwar reduziert, verschwand jedoch nicht völlig: Der durchschnittliche µ-Wert der beiden Mutanten betrug ca. 80 % vom WT in einer glukosefreien Kultur und ca. 90 % vom WT in einer glukosehaltigen Kultur. Hierbei verhielten sich cph2 - und die cph1 -/cph2 --Doppelmutante gleich. Unter mixotrophen Bedingungen im FRL wuchs cph1 - durchschnittlich mit der gleichen Geschwindigkeit wie der WT. Die Doppelmutante hingegen zeigte eine geringe Wachstumsreduktion gegenüber dem WT.

Im HL wirkte sich die Glukosezugabe negativ auf das Wachstum des WTs aus. Unter diesen Bedingungen ist Licht nicht der wachstumslimitierende Faktor. In dessen Folge herrscht bei ausreichender Versorgung mit anorganischem Kohlenstoff in der Zelle eher ein Überangebot an Zuckern. Ein Überschuss an Kohlenstoffmetaboliten bewirkt offenbar eine Runterregulierung der Photosynthese (Paul und Pellny, 2003). Diese feedback-Mechanismen stehen in engem Zusammenhang mit dem Kohlenstoff/Stickstoff-Balance sowie der Verfügbarkeit an anorganischem Phosphat in der Zelle.

Die durch die Synechocystis-Zelle aufgenommene Glukose kann entweder über die Glykolyse dem Stoffwechsel zugeführt oder zu Glykogen umgesetzt werden. Der Kohlenhydratspeicher Glykogen wird in der stationären Wachstumsphase (Lehmann und Wöber, 1976) sowie unter nährstofflimitierenden Bedingungen gebildet (Schneegurt et al. 1997). Die Regulation des Kohlenstoff-Stoffwechsels unter HL-Bedingungen ist für Synechocystis bisher nicht klar. Pelroy et al. (1976) analysierten am Cyanobakterium Aphanocapsa 6714 die Stoffwechselrouten von exogen zugefügter [14C]-Glukose. Hierbei ermittelten die Autoren, dass unter mixotrophen Bedingungen die aufgenommene Glukose zum überwiegenden Teil zu Proteinen und zum geringeren Teil in Glykogen umgesetzt wird. In Synechocystis sollte bei normalen Stickstoffangebot die Glukose überwiegend in den Baustoffwechsel eingeschleust werden. Inwieweit die Glukose beim WT unter HL-Bedingungen zu einer Hemmung des Wachstums führt, ist unklar.

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Die Wachstumsraten von cph1 - und cph2 - in einer photoheterotroph im HL wachsenden Kultur entsprachen nahezu dem Wert des unter gleichen Bedingungen gewachsenen WTs (Tab. 9). Für die beiden Phytochrommutanten bedeutete die Glukosezugabe eine leichte Förderung des Wachstums gegenüber einer glukosefreien Kultur unter den gleichen Lichtbedingungen, wobei sich die stärkste Wachstumsstimulation bei der cph1 --Mutante beobachten ließ. Das Zusetzen von Glukose zum Medium wirkte sich zwar auch positiv auf das Wachstum der cph1 -/cph2 --Doppelmutante aus, jedoch nicht im gleichen Maß wie bei cph1 -.

Die wachstumsfördernde Wirkung der Glukose im HL lässt vermuten, dass die Phytochrommutanten durch die Glukosezugabe eine verminderte Energieproduktion ausgleichen können. Dies verweist auf eine mögliche Störung der Photosyntheseleistung in den Mutantenzellen. Jedoch deuten die Daten aus der Pigmentanalyse, der Aufnahme von 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren und der Bestimmung der maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsrate nicht auf eine Beeinträchtigung der Photosynthese hin.

Ist die Aufnahme von anorganischem Kohlenstoff bei den Phytochrommutanten vermindert, könnten die Zellen das beim Glukoseabbau frei werdende CO2 im Calvin-Zyklus nutzen. Wäre im HL die Kohlenstoffaufnahme oder die CO2-konzentrierenden Mechanismen in den Mutanten herabgesetzt, hätte sich dies in einer reduzierten maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsrate der Phytochrommutanten gegenüber dem WT niederschlagen müssen. Dies konnte jedoch nicht gezeigt werden. Weiterhin liegen keine Informationen über die tatsächliche Produktion von ATP und den Reduktionsäquivalenten NADH und NADPH sowie deren Umsetzung in den Zellen vom WT und den Phytochrommutanten vor. Yang et al. (2002) ermittelten eine überschüssige Produktion von NADH/NADPH in einer mixotroph unter normalen Lichtbedingungen wachsenden Synechocystis-Kultur. So könnte einerseits die ATP-Synthese oder die Bereitstellung an Reduktionsäquivalenten über die Photosynthesekette in den Mutantenzellen nicht mit dem gleichen Ertrag stattfinden wie in den WT-Zellen. Andererseits könnten die Phytochrommutanten auch einen erhöhten ATP- oder NADH/NADPH-Bedarf besitzen, um durch die Mutation von cph1 und cph2 entstandene Effekte auszugleichen. Durch die Glukose-Zugabe würde den Mutantenzellen eine zusätzliche Möglichkeit zur ATP- bzw. NADH/NADPH-Synthese über die Glukose-Abbauwege, die in Synechocystis auch im Licht aktive Atmungskette (Yang et al., 2002) oder einen alternativen nichtrespiratorischen Weg der Energiegewinnung zur Verfügung stehen. Ähnliches lässt sich auch zu dem photoheterotrophen Wachstum von cph1 - und cph1 -/cph2 - im FRL sowie cph2 - und cph1 -/cph2 - im RL sagen (Tab. 9), wobei bei der cph2 --Mutante im RL und der Doppelmutante im HL, RL und FRL noch andere Prozesse betroffen sein müssen, da die Glukosezugabe für keine vollständige Angleichung der Wachstumsrate an die des WTs unter den genannten Kulturbedingungen sorgte.

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Glukose besitzt vermutlich eine vielfältige Wirkung auf die Zelle. García-Domínguez et al. (2000) fanden einen Einfluss der Glukose auf die cph1-mRNA-Akkumulation: Der starke Anstieg der cph1-Transkriptmenge beim Übergang vom Licht ins Dunkel wurde durch die exogene Zugabe von Glukose vollständig aufgehoben. Somit beinflusst die Glukose die Transkription des cph1-Gens oder die Stabilität der cph1-mRNA. Die Transkriptakkumulation von cph1 und cph2 in mixotroph wachsenden Synechocystis-Kulturen unter unseren Lichtbedingungen wurden nicht untersucht. Daher ist nicht bekannt, ob cph1 im FRL unter Einfluss von Glukose im Medium transkribiert wird.

4.3 Die Lichtregulation der cph1- und cph2-Transkriptakkumulation

In dieser Arbeit wurde die lichtabhängige Akkumulation der cph1- und cph2-mRNA im WT mittels quantitativer real time RT-PCR untersucht. Für cph1 konnte ein Einfluss von Lichtintensität und Lichtfarbe auf die Transkriptmenge gezeigt werden (Abb. 9A). So war die cph1-mRNA-Menge im HL gegenüber ML vermindert, während im Dunkeln, GL sowie im FRL ein Anstieg der Transkriptakkumulation von cph1 gegenüber dem ML-Wert ermittelt wurde. Den stärksten Einfluss auf die cph1-mRNA-Menge übte HL mit 15 % und FRL mit 650 % der Transkriptmenge vom Wert unter ML-Bedingungen aus. Der Abfall der Transkriptmenge von cph1 - im HL könnte mit einem verminderten Bedarf des Cph1-Proteins unter dieser Lichtbedingung zusammenhängen. Jedoch wurde gerade im HL eine Wirkung der Inaktivierung des cph1-Gens auf das Wachstum festgestellt (Abb. 10). Die Transkriptakkumulation lässt jedoch keine Aussage über die tatsächliche Menge an Cph1-Protein in der Zelle zu. Hübschmann et al. (2001a) berechneten aus Absorptionsspektren 23 Moleküle Cph1 pro Zelle in einem Synechocystis-Stamm, der ein His-tag-Cph1-Fusionsprotein überexprimiert. Erfolgte die Expression von cph1 unter der Kontrolle des starken, lichtregulierten psbA2-Promotors, wurde ein Anstieg der Cph1-Moleküle pro Zelle auf nur 200 kalkuliert, obwohl eine wesentlich höhere cph1-Transkriptionsmenge gemessen wurde. Diese Diskrepanz zwischen der cph1-mRNA-Transkriptakkumulation des unter der Kontrolle des psbA2-Promotors stehenden Gens und der Zahl an Cph1-Molekülen in der Zelle deuten entweder auf eine geringe Translation des Transkripts oder auf einen raschen Umsatz dieses Proteins. Hübschmann et al. (2001a) vermuten, dass Cph1 als Holoprotein stabil und als Apoprotein instabil sein könnte, was in diesem Fall für einen Mangel an freiem PCB für die Bindung als Chromophor sprechen würde.

Nach 1 h im Dunkeln stieg die Menge an cph1-mRNA in den Zellen an. Dies wurde auch durch andere Arbeitsgruppen gezeigt (García-Domínguez et al., 2000; Park et al., 2000). Die Zunahme der cph1-mRNA-Akkumulation im FRL korreliert mit dem verminderten Wachstum der cph1 --Mutante im Vergleich zum WT in diesem Licht (Abb. 10). Das beeinträchtigte Wachstum der cph1 --Mutante im FRL deutet auf eine Funktion des Cph1-Photorezeptors bei der Anpassung an eine Umgebung mit erhöhtem FRL-Anteil. Ein verstärkter Bedarf an Cph1-Protein unter diesen Lichtbedingungen ist daher denkbar. Es liegen jedoch keine Informationen darüber vor, ob der Anstieg der cph1-Transkriptmenge im FRL auch mit einer Zunahme an funktionstüchtigem Cph1-Protein einhergeht. Bezüglich des FRL unterscheiden sich die Resultate anderer Arbeitsgruppen von den hier vorgestellten Daten, wobei deren experimentelle Ansätze von den unsrigen abwichen. Park et al. (2000) konnte kein cph1-Transkript in einer mixotroph im FRL wachsenden Kultur finden. García-Domínguez et al. (2000) belichtete aus dem Dunkeln kommende Zellen mit einem kurzen FRL-Puls und ermittelte eine starke Abnahme der cph1-mRNA-Menge.

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Auch hinsichtlich des RL-Einflusses auf die Transkriptakkumulation ergaben sich unterschiedliche Ergebnisse. In dieser Arbeit war nach 1 h im RL die cph1-Transkriptmenge gegenüber dem Wert im ML unverändert (Abb. 9A). Park et al. (2000) jedoch konnten unter dieser Lichtbedingung die höchsten Signale für das cph1-Transkript überhaupt messen, während García-Domínguez et al. (2000), wie auch schon für FRL, eine drastische Abnahme der Transkriptmenge beobachteten. Letztere Arbeitsgruppe demonstrierte eine starke Lichtregulation der cph1-Transkriptmenge mit einer starken Zunahme im Dunkeln und einem entsprechenden Absinken des Transkripts im Licht, unabhängig von der Spektralfarbe. Hierbei spielte eine verminderte Stabilität des cph1-Transkripts im Licht eine Rolle. Die Autoren sehen daher eine Funktion des Cph1-Photosensors bei der Regulation von Prozessen bei Licht-Dunkel- bzw. Dunkel-Licht-Übergängen. Der Einfluss eines Kurztagsrhythmus (10 h WL, 14 h Dunkel) auf das Wachstum der Phytochrommutanten im ML wurde ebenfalls untersucht, ohne einen Unterschied zu finden (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise hätten sich kurze Lichtpulse stärker auf das Wachstum der Mutanten ausgewirkt als der Kurztagsrhythmus, andererseits konnten in dieser Arbeit nicht die von García-Domínguez et al. (2000) beschriebenen drastischen Änderungen in der cph1-Transkriptakkumulation zwischen Licht und Dunkel festgestellt werden. Diese Änderungen fielen deutlich geringer aus (Abb. 9A). Auch führten García-Domínguez et al. (2000) keine Untersuchungen zur Menge an Cph1-Protein pro Zelle durch. Somit ist nicht bekannt, ob das cph1-Transkript in dem Ausmaß translatiert wurde, wie dessen Akkumulation im Dunkeln zunahm.

Neben dem Anstieg der cph1-mRNA-Menge im FRL und im Dunkeln wurde auch eine Zunahme des Transkripts im GL beobachtet (Abb. 9A). Der verwendete GL-Filter besitzt die Eigenschaft, im Wellenlängenbereich oberhalb von 730 nm Licht zu transmittierten. Jedoch ist die in diesem Bereich ankommende Lichtintensität sehr gering und entspricht nicht den FRL-Bedingungen, unter denen ein Anstieg des cph1-Transkriptniveaus gemessen wurde. Daher ist anzunehmen, dass die Zunahme der cph1-Transkriptakkumulation im GL nicht auf den geringen Infrarot-Anteil des GL-Filters zurückzuführen ist.

GL bedeutet für Synechocystis in Hinblick auf die Nutzbarkeit für die Photosynthese Schwachlicht, da in diesem Wellenlängenbereich Chl und PC kaum Licht absorbieren. Daher stellt sich die Frage, ob der Reizauslöser für den Anstieg der cph1-Transkriptakkumulation im GL die geringe Lichtintensität oder die Lichtfarbe Grün darstellt. Die Transkriptmenge von cph1 unter geringen Lichtintensitäten wurde zwar nicht selbst gemessen, trotzdem ist eine erhöhte cph1-mRNA-Akkumulation im Schwachlicht vorstellbar, da sich hohe Lichtintensitäten negativ und Dunkel positiv auf die Transkriptmenge auswirkten. Würde diese Erklärung zutreffen, dann müsste die photosynthetische Elektronentransportkette die cph1-Transkription oder die Stabilität des Transkripts beeinflussen. García-Domínguez et al. (2000) konnten jedoch keinen Einfluss der Inhibitoren des photosynthetischen Elektronentransports DCMU und DBMIB auf die cph1-Transkriptmenge feststellen. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit für die Zunahme des cph1-Transkriptniveaus im GL wäre ein potentieller GL-Photorezeptor. Dieser müsste einem bisher unbekannten Typ von GL-Rezeptoren angehören, da das Synechocystis-Chromosom im Gegensatz zu Anabaena sp. PCC 7120 (Jung et al., 2003) kein Gen enthält, das für das Apoprotein des GL-Rezeptors Rhodopsin kodiert.

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Die Analyse der lichtabhängigen cph1-Transkriptakkumulation deutet auf das Wirken eines oder mehrerer Photorezeptoren oder auch eines Redoxsensors hin, die zum einen die Lichtstärke zum anderen FRL und vielleicht auch GL wahrnehmen. Das Phytochrom Cph2 könnte eines dieser Photorezeptoren sein, da in der cph2 --Mutante eine gegenüber dem WT veränderte Lichtregulation des cph1-Transkriptniveaus festgestellt werden konnte (Abb. 9A). Im Gegensatz zum WT wurde bei der cph2 --Mutante kein Anstieg der cph1-Transkriptakkumulation nach dem Übergang von ML zum Dunkel gemessen. Dies verweist auf eine mögliche Funktion des Photorezeptors Cph2 bei der Wahrnehmung des Umweltreizes Dunkel bzw. bei der Wahrnehmung von Licht-Dunkel-Übergängen. Hierbei ist jedoch nicht bekannt, ob Cph2 die cph1-Transkriptakkumulation über die Stabilität des cph1-Transkripts oder die Transkription des cph1-Gens reguliert.

Die cph2-Inaktivierung zeigte auch einen Einfluss auf die Höhe der cph1-Transkriptakkumulation im GL und FRL (Abb. 9A). Unter diesen Lichtbedingungen war die beim WT beobachtete Zunahme des cph1-Transkriptniveaus in der cph2 --Mutante gegenüber dem WT verringert, aber noch vorhanden. Somit spielt zwar das Cph2-Protein beim Anstieg der cph1-Transkriptmenge nach dem Wechsel vom ML zu GL und FRL eine Rolle, jedoch müssen weitere Photorezeptoren in die Lichtregulation der cph1-Transkriptakkumulation involviert sein.

Die Wirkung eines Phytochroms auf die Photoregulation der Transkriptmenge eines anderen Phytochroms konnte für PhyA und PhyB aus A. thaliana gezeigt werden (Cantón und Quail, 1999). Die Autoren ermittelten eine Abnahme der phyA-Transkriptakkumulation nach dem Übergang vom Dunkel zu RL. Diese Reduktion des phyA-Transkriptniveaus verschwand jedoch in der phyB --Mutante.

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Im Gegensatz zu cph1 ließ sich kein klarer Einfluss von Licht auf die cph2-Transkriptakkumulation erkennen (Abb. 9B). Unter den verschiedenen Lichtbedingungen fanden sich teilweise große Schwankungen in der cph2-mRNA-Menge zwischen den einzelnen Versuchen.

Park et al. (2000) fanden die höchste Menge an cph2-Transkriptin heterotroph gewachsenen Kultur und kaum Transkript in einer mixotroph im WL gewachsenen Kultur. Unter photoheterotrophen Bedingungen im RL wurde ebenfalls eine starke Akkumulation des cph2-Transkripts festgestellt. Die für die Untersuchung der Lichtwirkung auf das cph2-Transkript gewählten Bedingungen dieser Autorengruppe sind jedoch kaum mit den hier vorgestellten Belichtungsexperimenten vergleichbar. In dieser Arbeit wurde der kurzzeitige Lichteinfluss unter photoautotrophen Kulturbedingungen auf die cph2-mRNA-Akkumulation untersucht und nicht der langfristige Lichteinfluss bei Synechocystis-Zellen mit Glukose im Anzuchtmedium.

Eine mögliche Autoregulation der cph1- und der cph2-Transkription wurde untersucht, indem die lichtabhängige Änderung der Transkriptmenge in der cph1 --Mutante sowie in der cph2 --Mutante analysiert wurde. Dabei wurde festgestellt, dass die Inaktivierung der beiden phytochromkodierenden Gene die Menge an cph1- bzw. cph2-mRNA nicht beeinflusste (Daten nicht gezeigt). Somit wird weder die cph1- noch die cph2-Transkription durch das entsprechende Phytochrom selbst reguliert. In Dikotyledonen hingegen ist das Phytochrom PhyA in die FRL-induzierte Abnahme der phyA-mRNA-Akkumulation involviert (Cantón und Quail, 1999).

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Neben Cph2 könnten phytochromähnliche Proteine an der Regulation der cph1-Transkriptakkumulation beteiligt sein. Ein GL-Sensor in Synechocystis ist bisher nicht gefunden worden. Ein Gen, welches für das Apoprotein des GL-perzipierenden Rhodopsins kodiert, ist laut Cyanobase-Datenbank nicht vorhanden. Jedoch liegen verstärkt Hinweise auf einen bisher unbekannten potentiellen GL-Rezeptor bei Pflanzen (Folta, 2004) sowie auch bei Synechocystis (Choi et al., 2003) vor. Auch die für diese Arbeit durchgeführten Untersuchungen der lichtinduzierten Motilität deuteten auf das mögliche Vorhandensein eines GL-Sensors in Synechocystis. So behielten Synechocystis-Zellen ihre Fähigkeit zum GL zu laufen, wenn den Phototaxisplatten 10 µM DCMU enthielten (Abb. 20B). Somit kann zumindest die lineare, photosynthetische Elektronentransportkette bei der GL-Wahrnehmung ausgeschlossen werden.

4.4 Die Funktion der Phytochrome Cph1 und Cph2 in der lichtinduzierten Motilität

Studien zum Einfluss der Spektralfarbe auf die Motilität zeigten, dass Synechocystis eine positive Phototaxis im gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich aufwies (Choi et al., 1999). Dieses phototaktische Verhalten ließ sich nicht durch Inhibitoren der Photosynthesekette hemmen. Dies deutet daraufhin, dass die Steuerung der lichtabhängigen Motilität unabhängig von der linearen photosynthetischen Elektronentransportkette wahrscheinlich durch mehrere Photorezeptoren erfolgt.

Die lichtinduzierte Motilität von cph1 -, cph2 - und der Doppelmutante wurde im WL sowie in verschiedenen Spektralbereichen untersucht und mit dem Verhalten des WTs verglichen. Im WL bewegten sich die Phytochrommutanten wie auch der WT in Richtung Lichtquelle. Die gleichen Beobachtungen ließen sich auch für die Motilität im FRL, RL und GL festhalten (Abb. 13A-C). Somit ließ sich keine Funktion von Cph1 und Cph2 bei der Steuerung der Zellbewegung unter diesen Lichtbedingungen nachweisen.

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Anders verhielten sich die Synechocystis-Zellen im BL. Hier konnte keine Bewegung des WT induziert werden, während die cph2 --Mutante in Richtung BL-Quelle lief (Abb. 13D). Die Inaktivierung des cph1-Gens bewirkte keine Änderung im phototaktischen Verhalten im BL gegenüber dem WT. Die cph1 -/cph2 --Doppelmutante hingegen wies das gleiche Verhalten wie cph2 - auf, d. h. die Mutantenzellen wanderten zum BL. Somit deutet die Analyse der BL-abhängigen Motilität auf eine Funktion des Photosensors Cph2 bei der Inhibierung der Bewegung von Synechocystis. Dieses Resultat ist insofern ungewöhnlich, da Cph2 ein echtes Phytochrom darstellt, d. h. eine RL/FRL-Photokonversion zeigt und daher wie ein pflanzliches Phytochrom als RL/FRL-Photorezeptor angesehen werden kann. Eine Erklärung des beobachteten Phänotyps von cph2 - im BL könnte aus der für Phytochrome ungewöhnlichen Domänenarchitektur von Cph2 hervorgehen. Dieser Lichtrezeptor enthält neben der N-terminalen Chromophorbindungsstelle eine zweite am C-Terminus (Wu und Lagarias, 2000). Diese besitzt nicht die für echte Phytochrome charakteristische Fähigkeit zur Photokonversion, entspricht also eher dem Domänentyp von phytochromähnlichen Proteinen. Stattdessen ist die Absorption dieser Bindungsdomäne mit PCB als Chromophor im blauen Wellenlängenbereich gegenüber der Absorption im roten Wellenlängenbereich deutlich verstärkt (Abb. 30A). Daraus lässt sich eine mögliche Rolle von Cph2 als BL-Rezeptor ableiten.

Die Funktion eines phytochromähnlichen Proteins als potentieller BL-Sensor konnte bereits für PlpA aus Synechocystis nachgewiesen werden (Wilde et al., 1997). Hierbei zeigte eine Mutante mit einem inaktivierten plpA-Gen unter photoautotrophen Bedingungen im BL ein verzögertes Wachstum. Bei Cph2 beschränkte sich die Wirkung des BL auf die Phototaxis. Es konnten keine Wachstumsunterschiede zwischen WT und cph2 - im BL unter photoautotrophen Bedingungen festgestellt werden (Daten nicht präsentiert).

Insgesamt konnte für das Phytochrom Cph1 keine Funktion in der lichtinduzierten Motilität nachgewiesen werden. Das Cph2-Protein hingegen besitzt eine Rolle bei der Inhibition der Zellbewegung im BL. Auf Agarplatten angezogene Synechocystis-Zellen zeigen oftmals eine vom Licht unabhängige Bewegung. In Phototaxisexperimenten im BL konnte eine solche Bewegung beim WT und der cph1 --Mutante nicht beobachtet werden. Daher ist zu vermuten, dass nicht nur die Phototaxis sondern die Motilität generell inhibiert ist.

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In Phototaxisexperimenten mit einer bidirektionalen Einstrahlung von BL und einer weiteren Lichtfarbe (GL, RL und FRL) ließ sich die Motilität des WTs und der cph1 --Mutante induzieren. Dies hing jedoch vom Verhältnis von BL und der zweiten Lichtfarbe an der jeweiligen Position auf der Agarplatte ab, auf der die Zellen aufgetragen wurden. Sinkt der BL-Anteil, gewinnt der WT und cph1 - die Fähigkeit zur lichtgerichteten Zellbewegung zurück. Hierbei spielte es keine Rolle, ob die zweite Lichtfarbe GL, RL oder FRL war (Abb. 14A-C). Zeigten der WT und die cph1 --Mutante an den BL-fernen Positionen Motilität, wanderten die Zellen stets in Richtung GL, RL oder FRL. Anhand der photokinetischen Reaktion der Zellen lässt sich die beobachtete Bewegung eher einer positiven Phototaxis zur GL-, RL- bzw. FRL-Quelle zuordnen als einer Fortbewegung von der BL-Quelle (negative Phototaxis): Die Zellen an der Position mit der höchsten Intensität an GL, RL oder FRL zeigten eine höhere Laufgeschwindigkeit als die an Positionen mit einer geringeren Lichtintensität (Abb. 14A-C).

Die im BL motile cph2 -- sowie die Doppelmutante zeigten bei der bidirektionalen Einstrahlung von BL und einer weiteren Lichtfarbe eine unterschiedliche Bevorzugung der Bewegungsrichtung, die davon abhängig war, ob diese weitere Lichtfarbe GL, RL oder FRL war. In einem BL-GL- und einem BL-FRL-Feld wanderten cph2 - und cph1 - /cph2 - zu der Lichtquelle, die den Zellen am nächsten war (Abb. 14A und C). In einem BL-RL-Feld hingegen bewegten sich die beiden Mutanten auf allen Positionen in Richtung RL-Quelle (Abb. 14B). Wurde jedoch bei einer bidirektionalen Einstrahlung von BL und RL die Intensität des RL durch eine zusätzlich angebrachte Graufolie stark reduziert, konnte Motilität bei den Zellen von cph2 - und cph1 - /cph2 - induziert werden, die sich dicht an der BL-Quelle befanden (Daten nicht gezeigt). Somit zeigte die cph2 -- und die Doppelmutante eine Bevorzugung von Spektralfarben in Hinblick auf die Laufrichtung mit folgender Reihenfolge: RL, FRL und GL. Bei der Festlegung der Reihenfolge von FRL und GL wurde berücksichtigt, dass die eingestrahlte FRL-Intensität geringer war als die des GL.

4.4.1 Aktionsspektrum und BL-Rezeptoren

Vor einiger Zeit konnte für pflanzliche Phytochrome eine Interaktion zwischen dem RL/FRL-Lichtrezeptor Phytochrom und dem BL-Sensor Cryptochrom nachgewiesen werden (Mas et al., 2000). Diese Erkenntnis wirft die Frage auf, ob das cyanobakterielle Phytochrom Cph2 für die Inhibition der Motilität im BL verantwortlich ist, oder ob hier eine Interaktion mit einem bisher unbekannten BL-Rezeptor vorliegt. Um einer Antwort auf diese Frage näher zu kommen, wurde das Aktionsspektrum der BL-gesteuerten Motilität von WT und cph2 - analysiert sowie die Motilität von Inaktivierungsmutanten potentieller BL-Rezeptoren in Synechocystis unter BL-Bedingungen untersucht.

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Bisher wurden im Synechocystis-Genom drei verschiedene ORFs mit Sequenzähnlichkeit ihrer Genprodukte zu bekannten BL-Rezeptoren gefunden. Dazu gehören (1) sll1629 (cry), das ein Cryptochrom vom DASH-Typ kodiert (Hitomi et al., 2000; Brudler et al., 2003), (2) slr0359 (lov) mit einer für Phototropine charakteristischen LOV-Domäne (Crosson et al., 2003) und (3) slr1694 (bluf), ein Vertreter der BLUF-Proteine (Masuda et al., 2004).

Durch die Inaktivierung des cph2-Gens sind die Mutantenzellen zur Motilität im BL befähigt. Dies bedeutet, dass die cph2 --Mutante BL wahrnehmen kann. Somit muss es einen weiteren Lichtsensor geben, der die Phototaxis im blauen Wellenlängenbereich reguliert. Um diesen Photorezeptor identifizieren zu können, wurde die Motilität im BL von Doppelmutanten von Cph2 und jeweils einem BL-Rezeptor untersucht.

Durch die Aufnahme eines Aktionsspektrums der Motilität im blauen Wellenlängenbereich sollte ein Bezug zwischen dem Aktionsmodus des gesuchten Photorezeptors für die Inhibition der Zellbewegung zum BL und den spektralen Eigenschaften von Cph2 oder eines potentiellen BL-Rezeptoren hergestellt werden. Im Ergebnis des mit Interferenzfiltern erstellten Aktionsspektrums wies der WT im Licht mit einem Emissionsmaximum bei 461 nm und darunter keine Motilität auf (Tab. 12; Abb. 30B). Bei Verwendung von Interferenzfiltern mit einem Transmissionsmaximum bei 474 nm und darüber bewegten sich die WT-Zellen zur Lichtquelle. Dieses Aktionsspektrum ähnelt stärker dem Absorptionsspektrum der C-terminalen GAF-Domäne als dem der GAF-Domäne am N-Terminus eines rekombinanten Cph2-Proteins mit PCB als Chromophor (Abb. 30A; Wu und Lagarias, 2000). Die Absorption der N-terminalen GAF-Domäne erreicht bereits bei ca. 450 nm ein Minimum, während die Absorptionsbande der C-terminalen Domäne im blauen Wellenlängenbereich leicht in den längerwelligen Bereich verschoben ist. Allerdings beziehen sich die veröffentlichten Spektren auf ein in E. coli rekombinant exprimiertes Cph2-Protein. Die Absorptionseigenschaften des nativen Cph2 sind nicht bekannt. Flavoproteine, zu denen die meisten BL-Rezeptoren gehören, weisen im blauen Wellenlängenbereich eine breite Absorptionsbande auf, die bis in den blau-grünen Spektralbereich reicht. So wurde für das in E. coli rekombinant exprimierte BLUF-Protein aus Synechocystis nach einer Lichtaktivierung ein Maximum bei 457 nm mit einer Absorptionsschulter bei 483 nm beobachtet (Masuda et al., 2004). Letztere entspricht einer Wellenlänge, bei der die WT-Zellen bereits eine lichtgerichtete Motilität aufwiesen. Ähnliche spektrale Eigenschaften konnten auch für ein rekombinantes Cry-Protein von Synechocystis beschrieben werden (Hitomi et al., 2000). Somit unterstützt das Aktionsspektrum der BL-gesteuerten Motilität des WTs die Annahme, das Cph2 der Photorezeptor für die Inhibierung der Zellbewegung im BL selbst ist. Das erzielte Aktionsspektrum ähnelt stärker den Absorptionsseigenschaften der C-terminalen als der N-terminalen GAF-Domäne im blauen Wellenlängenbereich. Ob sich die BL-Sensor-Funktion einer der beiden Chromophorbindungsdomänen zuordnen lässt, kann nur eine Analyse der GAF-Domänen klären.

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Abb. 30 : Vergleich des Absorptionsspektrums der C-terminalen GAF-Domäne mit PCB als Addukt (A) mit dem Aktionsspektrum der lichtinduzierten Motilität des WT (B). Die Abb. 30A stammt aus der Veröffentlichung von Wu und Lagarias (2000).

Um weitere Belege zu finden, dass das Cph2-Protein der Photorezeptor für die Inhibierung der Motilität im BL ist, wurden die BL-Photorezeptoren Cry, LOV und BLUF inaktiviert. Das phototaktische Verhalten der resultierenden Mutanten im BL wurde untersucht. Hierbei verhielten sich die cr y --, lov -- und die blu f --Mutanten wie der WT, d. h. sie zeigten keine Phototaxis (Abb. 23). Somit sprechen die erzielten Resultate nicht für eine Interaktion von Cph2 mit einem der getesten, potentiellen BL-Rezeptoren bei der Vermittlung der BL-gesteuerten Motilität.

Da die cph2 --Mutante im BL motil ist, muss in Synechocystis ein BL-Rezeptor vorhanden sein, der die Phototaxis im blauen Wellenlängenbereich steuert. Die Proteine Cry, LOV und BLUF zeigten hierbei keine Funktion bei der generellen BL-Wahrnehmung zur Regulation der lichtinduzierten Motilität: Die cr y -cph2 --, lov -cph2 -- und die blu f -cph2 --Doppelmutanten waren im BL motil, wobei die Mutation im bluf-Gen allerdings eine Umkehrung der Bewegungsrichtung der blu f -cph2 --Mutantenzellen bewirkte (Abb. 23). Somit kann die blu f -cph2 --Doppelmutante zwar noch BL wahrnehmen, jedoch ist die positive Phototaxis beeinträchtigt. Also muss es einen weiteren Photorezeptor geben, der die Lichtrichtung im BL perzipiert.

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Es besteht die Möglichkeit, dass das Genom von Synechocystis Gene für BL-Sensoren eines bisher unbekannten Typs enthält. Viele der bisher bekannten Photorezeptoren wurden erst in den letzten 10 Jahren entdeckt. Für andere Photosensoren, wie die für UV(B)- oder GL in höheren Pflanzen, gibt es nur Hinweise auf ihre mögliche Existenz (Frohnmeyer und Staiger, 2003; Folta, 2004; Briggs und Christie, 2002). Außerdem sind im Synechocystis-Genom laut Cyanobase-Datenbank eine ganze Reihe von ORFs vorhanden, die für hypothetische Proteine mit bisher unbekannter Funktion kodieren.

Es ist auch nicht auszuschließen, dass die ausgewählten BL-Rezeptoren überlappende Funktionen haben, so dass nach Ausschalten eines BL-Rezeptors ein anderer dessen Funktion übernimmt. In diesem Fall würde erst die Inaktivierung aller BL-Sensoren in der cph2 --Mutante die Motilität im BL beeinträchtigen.

Der Einfluss des Photosyntheseinhibitors DCMU auf die Motilität von WT und der cph2 --Mutante im BL wurde untersucht. Eine Motilität des WTs durch DCMU wurde im BL nicht induziert. Die cph2 --Mutante zeigte ein variables Verhalten, d. h. sowohl positive Phototaxis als auch eine Hemmung der Motilität wurde beobachtet (Abb. 20A). Dies deutet darauf hin, dass die photosynthetische Elektronentransportkette unter bestimmten Lichtbedingungen doch die Photobewegung der Zelle regulieren könnte. Choi et al. (1999) fanden keinen Einfluss von DCMU auf die lichtinduzierte Motilität. Diese Experimente wurden jedoch nur unter WL-Bedingungen durchgeführt. Daher ist es nicht auszuschließen, dass im blauen Spektralbereich die Photosynthesekette in der cph2 --Mutante in die Lichtwahrnehmung für die Photobewegung involviert ist. Die beobachtete Variabilität im Verhalten der cph2 --Mutante auf DCMU-haltigen Agarplatten im BL könnte dadurch verursacht wurden sein, dass der Inhibitor DCMU nicht in allen Experimenten für eine ausreichende Blockierung des Elektronentransports zwischen PSII und dem Plastochinonpool sorgte. Eine mögliche Rolle der photosynthetischen Elektronentransportkette in der Steuerung der Motilität wurde bei dem Purpurbakterium Rhodospirillum centeum festgestellt (Jiang und Bauer, 2001), wobei als Bindeglied zwischen der photosynthetischen Elektronentransportkette und der chemosensorischen Signaltransduktionskaskade vermutlich das MCP-Protein Ptr fungiert.

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Möglicherweise wird in der cph2 --Mutante das BL-Signal zur Steuerung der Photobewegung nicht durch einen BL-Rezeptor sondern durch die Photosynthesekette wahrgenommen.

4.4.2 GAF-Domänen-Analyse

Die chromophorbindenden GAF-Domänen des Cph2-Proteins unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Absorptionseigenschaften im blauen Wellenlängenbereich (Wu und Lagarias, 2000). Die C-terminale GAF-Domäne mit PCB als Addukt besitzt ein Absorptionsmaximum bei 421 nm (Abb. 30A). Dahingegen ist der Absorptionsbereich der N-terminalen Domäne mit einem assembliertem PCB in Richtung UV(A)-Bereich verschoben. Die Fähigkeit eine chromophore Gruppe zu binden ist zwar bekannt, jedoch liegen keine Informationen über die Absorptionseigenschaften des nativen Proteins vor. Mit der Inaktivierung eines der beiden potentiell chromophorbindenden Cysteine sollte geklärt werden, ob sich die Funktion als BL-Sensor für die Motilität einer der beiden GAF-Domänen zuordnen lässt und ob die publizierten Absorptionseigenschaften der entsprechenden GAF-Domäne mit dem erzieltem Aktionsspektrum vergleichbar sind. Die Inaktivierung der chromophorbindenden Aminosäuren erfolgte über Austausch der Cysteine gegen eine geeignete Aminosäure durch ortsgerichtete Mutagenese. Die verschiedenen cph2-Varianten (cph2-, GAF1 *-, GAF2 - und GAF3*-pVZ321, siehe Abb. 16 und Abb. 17) wurden als pVZ321-Konstrukt über triparentale Konjugation in eine Δcph2 --Mutante transferiert. Das pVZ321-Plasmid kann sich in Synechocystis autonom replizieren.

Während die GAF2 - und GAF3*-Transkonjuganten stets im BL motil waren, zeigten die cph2-Transkonjuganten ein variables Verhalten (Abb. 17B): Ein dem WT entsprechendes Fehlen der Motilität im BL wurde oftmals nur bei neu hergestellten Transkonjuganten beobachtet. Ältere Kulturen schienen diese Eigenschaften wieder zu verlieren. Auch die Analyse der GAF1*-Transkonjuganten erbrachte keine klaren Resultate. Allerdings verhielten sich diese mehrheitlich wie die cph2 - -Mutante, d. h. die GAF1*-Transkonjuganten waren im BL motil. Somit war eine endgültige Zuordnung der BL-Sensor-Funktion zu einer der beiden chromophorbindenden GAF-Domänen nicht möglich. Ein pVZ321-Plasmid konnte zwar für jedes der verschiedenen cph2-Varianten mittels PCR nachgewiesen werden (Abb. 17C), jedoch erlaubt diese Methode keine Aussage darüber, ob tatsächlich in allen Synechocystis-Zellen das pVZ321-Plasmid noch vorhanden war. Wie Abb. 18 verdeutlicht, genügte schon ein geringer Anteil an cph2 --Zellen, um Motilität in Erscheinung treten zu lassen. Daher könnte der nichtstabile Phänotyp der cph2-Transkonjuganten durch einen Verlust des pVZ321-Plasmids in einem Teil der Zellen herrühren. Unabhängig davon ist bei der Interpretation der Daten zu beachten, dass der Austausch von Aminosäuren zu einer verminderten Stabilität und damit Funktionstüchtigkeit des Proteins führen kann. Aufgrund einer geringen oder überhaupt nicht vorhandenen Menge an Cph2-Protein in der Zelle, würden in diesem Fall die GAF1*- oder GAF3*-Transkonjuganten wie die cph2 - im BL motil sein, obwohl die GAF1- oder GAF3-Domäne keine Rolle in der BL-Wahrnehmung zur Inhibierung der Motilität spielt.

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Wie im vorherigen Abschnitt erwähnt, reichte ein geringer Anteil von cph2 --Zellen gegenüber WT-Zellen in einer Mischkultur im BL aus, um den motilen Phänotyp der cph2 --Mutante dominieren zu lassen (Abb. 18). Diese Beobachtung lässt verschiedene Erklärungsmöglichkeiten zu. Synechocystis bildet lange Pili aus, die für die aktive Fortbewegung des Cyanobakteriums notwendig sind (Bhaya et al., 2000). Der geringe Prozentsatz an motilen cph2 --Zellen könnte genügen, um einen Großteil der im BL nichtmotilen WT-Zellen mit Hilfe der Pili mit sich zu ziehen. Weiterhin ist es denkbar, dass cph2 - einen unbekannten Faktor in das Medium abgibt, der Motilität bei den WT-Zellen induziert.

4.4.3 Zwei Photorezeptoren vermitteln die positive Phototaxis in Synechocystis.

Wie bereits erwähnt, zeigten die Doppelmutanten von cph2 und den potentiellen BL-Rezeptoren eine gerichtete Bewegung innerhalb des BL-Gradienten. Interessanterweise wanderten die Zellen der blu f -cph2 --Doppelmutante von der Lichtquelle weg, während cr y -cph2 - und lov -cph2 - sich zum Licht bewegten. Somit scheint das BLUF-Protein in Synechocystis wie PixJ1 eine Rolle bei der Vermittlung der positiven Phototaxis auszuüben. Die Funktion des phytochromähnlichen Proteins PixJ1 in der Steuerung der positiven Phototaxis wurde durch Yoshihara et al. (2000) und Bhaya et al. (2001a) nachgewiesen. Über das BLUF-Protein aus Synechocystis ist wenig bekannt. Das Protein wurde spektroskopisch durch Masuda et al. (2004) charakterisiert. Eine mögliche Funktion des BLUF-Proteins in der Steuerung der positiven Phototaxis wurde durch eine japanische Arbeitsgruppe in Form eines Kongressbeitrags beschrieben (Okajima et al., 2003).

Die Wirkung der pixJ1-Inaktivierung auf die lichtinduzierte Motilität von Synechocystis wurde in dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Hier interessierte besonders das phototaktische Verhalten von pixJ1 -- und pixJ1 -cph2 --Mutanten im BL, da in diesem Spektralbereich sich die WT-Variante aus unserer Arbeitsgruppe in Hinblick auf die Motilität anders verhielt als andere WT-Varianten von Synechocystis (siehe Kap. 3.5.1). Dabei stellte sich die Frage, ob sich im BL durch die pixJ1-Mutation negative Phototaxis in unserem WT induzieren lässt. Unter BL-Bedingungen war jedoch die pixJ1 --Mutante wie der WT nicht motil (Abb. 24B). Die pixJ1 -cph2 --Doppelmutante hingegen zeigte negative Phototaxis. Somit ist die inhibierende Wirkung des Lichtsensors Cph2 auf die Motilität im BL stärker als die Wirkung des PixJ1-Photorezeptors. Unter den Bedingungen WL, FRL, RL und GL zeigten die pixJ1 -- und pixJ1 -cph2 --Mutanten die in der Literatur beschriebene negative Phototaxis (Tab. 14).

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Ng et al. (2003) beschrieben detaillierte Aktionsstudien zur Auswirkung der pixJ1 --Inaktivierung auf die Motilität der Zellen. Auch hier ließ sich negative Phototaxis der Mutanten über nahezu den gesamten sichtbaren Spektralbereich beobachten, wobei die Mutantenzellen am stärksten auf monochromatisches Licht von 475 nm reagierten. Der PixJ1-Photorezeptor weist für phytochromähnliche Proteine insofern ungewöhnliche spektrale Eigenschaften auf, als dass dieser Lichtsensor zu einer Photokonversion zwischen einer BL-absorbierenden und einer GL-absorbierenden Form befähigt ist (Yoshihara und Ikeuchi, 2004). Aufgrund der Daten aus der Charakterisierung des PixJ1-Proteins schließen die Autoren auf eine Funktion von PixJ1 als BL-Rezeptor. Dies widerspricht der Interpretation des Aktionsspektrums des Motilitätsverhaltens der pixJ1 --Mutante von Ng et al. (2003), die PixJ1 als einen RL-Rezeptor verstehen. Somit hat die GL/BL-Photokonversion möglicherweise keine Bedeutung für die Regulation der positiven Phototaxis durch das PixJ1-Protein.

Die Inaktivierung des pixJ1-Gens erbrachte im BL das gleiche Resultat wie die Mutagenisierung des bluf-Gens, d. h. die Einzelmutanten waren im BL nicht motil, während die blu f -cph2 -- und pixJ1 -cph2 --Doppelmutanten negative Phototaxis zeigten (Abb. 23B und Abb. 24B). Vermutlich wirkt der Lichtsensor BLUF nicht über die gleiche Signaltransduktionskette wie PixJ1, da sich blu f - und pixJ1 - im GL und FRL unterschiedlich verhielten. Während sich beide Photorezeptormutanten im RL von der Lichtquelle fortbewegten, war eine negative Phototaxis der pixJ1 --Mutante, aber keine Motilität oder nur eine geringe positive Phototaxis der blu f --Mutanten im GL und FRL zu beobachten (Tab. 14). Hierbei ist es jedoch möglich, dass höhere Intensitäten von GL bzw. FRL ebenfalls eine negative Phototaxis der blu f --Mutanten induzieren könnten.

Über welchen Mechanismus das BLUF-Protein aus Synechocystis wirken könnte, ist nicht bekannt. Dieser BL-Rezeptor besteht weitgehend nur aus der BLUF-Domäne. Daher ist von einer Interaktion mit einem weiteren Protein auszugehen. Das Wirkungsspektrum der bluf-Mutation erstreckte sich außer auf BL auch auf GL, RL und FRL. Dies deutet neben einer BL-Sensor-Funktion auch auf eine GL/RL/FRL-Sensor-Funktion des BLUF-Proteins hin. Das BLUF-Protein absorbiert Licht in einem Wellenlängenbereich zwischen 330 und 500 nm (Masuda et al., 2004). Somit könnte das BLUF-Protein mit einem weiteren Photorezeptor interagieren, der Licht oberhalb einer Wellenlänge von 500 nm perzipiert.

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Interessanterweise sind RL und BL, in welchem die blu f -- und blu f -cph2 --Mutante negative Phototaxis zeigten, die Lichtfarben, die am besten von der Photosynthesekette verwertet werden können. Dahingegen waren die blu f --Mutante und die blu f -cph2 --Doppelmutante im GL und FRL, Lichtfarben mit einer geringen Nutzbarkeit in der Photosynthese, nicht motil oder wiesen eine geringe positive Phototaxis auf. Dies weist auf eine Rolle der Photosynthesekette in der lichtinduzierten Motilität hin. Choi et al. (1999) dokumentierten jedoch anhand von Phototaxisexperimenten mit den Inhibitoren der Photosynthesekette DCMU und DBMIB, dass die Elektronentransportkette nicht in der Steuerung der lichtvermittelten Motilität involviert ist.

Interessanterweise befindet sich in der unmittelbaren Umgebung des bluf-Gens der ORF slr1697 (Abb. 23A), der für die Serin/Threonin-Proteinkinase SpkB kodiert. Kamei et al. (2003) demonstrierten, dass das zur Pkn2-Unterfamilie gehörende SpkB-Protein für die Motilität der Zellen notwendig ist. Mutanten mit einem inaktiviertem spkB-Gen zeigten nur noch eine sehr schwache Phototaxis. Die Bildung der für die Motilität essentiellen langen Pili war nicht gestört.SpkB ist nicht die einzige Serin/Threonin-Proteinkinase mit Funktion in der Motilität. Dem Genprodukt von slr1443 (SpkE) wird eine Rolle bei der post-translationalen Modifikation des Pilin-Peptids zugeschrieben (Kim et al., 2004). Wie SpkB beeinflusst auch SpkA die Motilität, ohne die Biogenese der langen Pili zu beeinträchtigen (Kamei et al., 2001). Der ORF slr1693, der direkt vor dem bluf-Gen liegt, kodiert für einen Response-Regulator der PatA-Unterfamilie. Die Gene sll0038 und slr1041, die für andere Response-Regulatoren dieses Typs in Synechocystis kodieren, sind Bestandteile von Gen-Clustern, deren Produkte in die Steuerung der positiven Phototaxis bzw. in die generelle Motilität involviert sind (Yoshihara et al., 2002). Ob der PatA-Response-Regulator Slr1693 ebenfalls eine Rolle in der Regulation der lichtinduzierten Zellbewegung spielt, ist nicht bekannt. Ist dies jedoch der Fall, könnte das beobachtete Verhalten der blu f --Mutante im BL, GL, RL und FRL auf einen polaren Effekt durch die Insertion der Antibiotikaresistenzgen-Kassette in das bluf-Gen zurückzuführen sein, wodurch die Transkription des Gens slr1693 beeinträchtigt wäre. Ein polarer Effekt auf slr1697 kann ausgeschlossen werden, da sich zwischen diesem Gen und slr1694 ein weiteres Gen befindet, das für eine Phenylalanyl-tRNA-Synthetase kodiert.

4.4.4 Untersuchung der TypIV-Pili

Über welchen Prozess Cph2 die lichtinduzierte Bewegung im BL inhibiert, konnte noch nicht geklärt werden. Die Zellen von Synechocystis bewegen sich auf festen Oberflächen auf eine Weise, die als twitching motility bezeichnet wird (Yoshihara und Ikeuchi, 2004). Hierfür sind sogenannte TypIV-Pili notwendig (Bhaya et al., 1999), wobei Synechocystis zwei Arten von Pili ausbildet: lange (mehr als 2 µm Länge und 6-8 nm Durchmesser) sowie in großer Zahl vorkommende kurze Pili (2-3 nm Durchmesser) (Bhaya et al., 2000; Yoshihara und Ikeuchi, 2004). Die Pili setzen sich aus Pilin-Untereinheiten zusammen, die durch die pilA-Gene kodiert werden. Bhaya et al. (2000) demonstrierten, dass die Inaktivierung des pilA1-Gens zu einem Verlust der langen Pili und einem nichtmotilen Phänotyp führt. Die Analyse der Transkriptakkumulation von pilA1 im WT und der cph2 --Mutante im BL und WL deutete jedoch nicht auf einen Einfluss des Photorezeptors Cph2 auf die Menge der pilA1-mRNA (Abb. 21).

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Die Analyse von Transposonbanken (Bhaya et al., 2001b) sowie eine ganze Reihe von Veröffentlichungen verweisen jedoch auf eine stetig wachsende Anzahl von Genprodukten, die auf verschiedene Weise in die Motilität involviert sind. Die genaue Wirkungsweise dieser Genprodukte in der lichtinduzierten Motilität konnte größtenteils nicht beschrieben werden, aber es werden Funktionen bei Biogenese und Steuerung der Pili sowie Funktionen in der Assemblierung der Pili und dem phototaktischen Verhalten selbst vermutet (Yoshihara und Ikeuchi, 2004). Die vergleichende Untersuchung der TypIV-Pili von WT und cph2 - mittels Elektronenmikroskopie sollte näheren Aufschluss darüber geben, ob sich der Aufbau des Bewegungsapparates vom WT im BL von dem der Mutante unterscheidet. Die elektronenmikroskopische Analyse erbrachte ein variables Ergebnis. In einem Fall besaßen die WT-Zellen unter BL-Bedingungen im Durchschnitt weniger Pili als cph2 -. Die zu einem anderen Zeitpunkt durchgeführten Untersuchungen lieferten jedoch ein umgekehrtes Bild: Hier hatte der WT mehr Pili ausgebildet als die Mutante. Somit scheint die Ausbildung des Pili-Apparates des WT im BL nicht durch den Lichtsensor Cph2 beeinflusst zu sein. Allerdings ist bei der Interpretation dieser Daten zu berücksichtigen, dass bisher keine genauen Forschungen über den Zusammenhang von Motilität und Grad der Pilierung durchgeführt wurden. Bisher ist nur bekannt, dass sowohl das Fehlen von langen Pili als auch ein Übermaß an Pili („Hyperpilierung“) zu einem Verlust der Motilität der Zellen führt (McBride, 2001). Weiterhin konnte noch gezeigt werden, dass eine nichtmotile Mutante mit einem inaktiviertem sycrp1-Gen, welches ein cAMP-Rezeptorprotein kodiert, eine reduzierte Anzahl von langen Pili ausbildete (Yoshimura et al., 2002b).

Die vorliegenden Daten deuten zwar nicht auf einen Einfluss des Cph2-Proteins auf die Bildung der langen Pili im BL, jedoch lassen die elektronenmikroskopischen Aufnahmen der Zellen keinen Rückschluss auf die Funktionstüchtigkeit der Pili zu. Es wird angenommen, dass die als twitching motility bezeichnete Fortbewegungsweise über eine wiederholte Extension und Retraktion der TypIV-Pili abläuft. Solche Verhaltensmechanismen konnten für die Pili von Pseudomonas aeruginosa anhand von Videoaufnahmen visualisiert werden (Skerker und Berg, 2001). Wie bereits erwähnt, ist eine ganze Reihe von Genprodukten in den Aufbau des Pili-Apparats sowie in die Regulation der phototaktischen Bewegung involviert. Den Proteinen PilT1 und PilB1 wird eine Funktion als Motor bei der Extension und Retraktion der Pili zugeschrieben (Bhaya et al., 2000; Yoshihara und Ikeuchi, 2004). Es besteht die Möglichkeit, dass der Photorezeptor Cph2 die Aktivität dieser beiden Proteine im BL reguliert. Allerdings wiesen Mutanten mit einem inaktiviertem pilT1- bzw. pilB1-Gen einen hyperpilierten bzw. pilifreien Morphotyp auf (Bhaya et al., 2000). Diese Forschungsdaten sprechen eher gegen einen Einfluss von Cph2 auf PilT1 und PilB1, da weder ein hyperpilierter noch ein pilifreier Morphotyp eindeutig für WT-Zellen im BL nachgewiesen werden konnte. Dessen ungeachtet kann die Funktionstüchtigkeit der Pili auch über andere Wege beeinträchtigt sein. Die Motilität von Synechocystis sowie die anderer, sich auf eine ähnliche Weise fortbewegender Eubakterien wird zwar seit einigen Jahren intensiv studiert, jedoch bestehen große Lücken im Verständnis um die molekularen Mechanismen, die hinter diesen Zellbewegungen stehen.

4.4.5 Einfluss von cAMP und cGMP auf die Phototaxis

In den letzten Jahren wurden einige Forschungsergebnisse über die Rolle zyklischer Nukleotide bei der Regulation der Motilität veröffentlicht. So induzierte bei Synechocystis die externe Zugabe von cAMP Motilität bei einer vormals nichtmotilen Mutante mit einem ausgeschalteten cya1-Gen, das eine Adenylat-Zyklase kodiert (Terauchi und Ohmori, 1999). Das cAMP-Rezeptorprotein SYCRP1 aus Synechocystis ist in die Biogenese der langen TypIV-Pili involviert (Yoshimura et al., 2002b). In Euglena gracilis steuert eine photoaktivierbare Adenylyl-Zyklase mit zwei BLUF-Domänen die step-up-photophobische Reaktion (Iseki et al., 2002).

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Eine potentielle Störung von cAMP- oder cGMP-abhängigen Signalketten bei der BL-gesteuerten Motilität von WT oder cph2 --Mutante konnte über die externe Zugabe der beiden zyklischen Nukleotide zu dem Phototaxis-Assay nicht nachgewiesen werden (Abb. 19). Terauchi und Ohmori (2004) konnten für Cya1 in Synechocystis zeigen, dass diese Adenylat-Zyklase für den Anstieg des cAMP-Spiegels im BL verantwortlich ist und schlussfolgern daraus, dass die Motilität im BL über eine cAMP-Signalkette mit Cya1 als Adenylat-Zyklase und SYCRP1 als potentielles Nachfolgeglied stimuliert wird. Im Gegensatz zu unserem WT war der von dieser Arbeitsgruppe verwendete WT-Stamm im BL motil. Dies wirft die Frage auf, ob in unserem WT die Aktivität von Cya1 im BL vielleicht durch das Cph2-Protein herabgesetzt wird. Sollte dies der Fall sein, hätte die externe Zugabe von cAMP die Motilität des WTs induzieren müssen. Das war aber in unseren Versuchen nicht der Fall. Interessanterweise fanden Terauchi und Ohmori (2004) nur eine Änderung des cAMP-Spiegels nach dem Wechsel von Dunkel nach BL, nicht jedoch nach dem Wechsel ins RL oder FRL. Im Gegensatz dazu beschrieben Ohmori et al. (2002) für Anabaena cylindrica einen reversiblen Abfall bzw. Anstieg des cAMP-Gehaltes nach Belichtung mit RL bzw. FRL, was die Autoren auf eine mögliche Wirkung eines Phytochroms zurückführen. Für Synechocystis ist bekannt, dass die in den verschiedenen Laboratorien weltweit für Forschungszwecke genutzten WT-Stämme nicht mehr genetisch einheitlich sind (Ikeuchi und Tabata, 2001). Es ist somit nicht auszuschließen, dass Synechocystis-Stämme existieren, die eine andere Art der Lichtregulation des cAMP-Spiegels besitzen.

Ebenso wie cAMP lieferte die externe Zugabe von cGMP zum Phototaxis-Assay keinen Hinweis auf eine Verschiebung des cGMP-Spiegels zwischen WT und cph2 - unter BL-Bedingungen. Beide zeigten jeweils das gleiche phototaktische Verhalten wie im Assay ohne zusätzliches cGMP. Die bisher einzige bekannte Guanylat-Zyklase in Synechocystis ist Cya2 (Ochoa et al., 2000). Eine Rolle von cGMP-abhängigen Signalketten mit regulativer Funktion bei der Motilität wurde bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht für Synechocystis beschrieben. Das Vfr-Protein, ein Homolog zum cAMP-Rezeptor-Protein aus E. coli, reguliert in Pseudomonas aeruginosa u. a. das quorum sensing und die Motilität der Zellen (Beatson et al., 2002), die wie bei Synechocystis über die Bewegungsweise der twitching motility erfolgt. Dieses Protein ist insofern interessant, als dass es die Motilität und das quorum sensing wahrscheinlich über unabhängige Wege durch Bindung verschiedener zyklischer Nukleotide reguliert. Im BL konnte die externe Zugabe von cAMP oder cGMP weder Motilität beim WT hervorrufen noch die Zellbewegung der cph2 --Zellen inhibieren.

Es ist nicht auszuschließen, dass zusätzlich zugefügtes c-diGMP entsprechende Effekte gezeigt hätte. Das Cph2-Protein enthält sogenannte GGDEF- und EAL-Domänen. Von diesen nimmt man an, dass sie eine Rolle bei der Synthese oder Spaltung von c-diGMP, einem neuartigen Effektormolekül, spielen (Galperin et al., 2001). Erst kürzlich konnte für PleD, einen ungewöhnlichen Response-Regulator aus Caulobacter crescentus mit zwei N-terminalen Receiver-Domänen und einer C-terminalen GGDEF-Domäne, die Zyklisierung von 2 GTP-Molekülen zu c-diGMP gezeigt werden (Paul et al., 2004). Dabei konnten die Autoren demonstrierten, dass die Zyklase-Aktivität eine intakte GGDEF-Domäne erfordert und GTP-spezifisch ist.

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Eine Rolle von cAMP und cGMP in der Motilität im BL konnte nicht gezeigt werden. Da das Cph2-Protein zwei GGDEF-Domänen und eine EAL-Domäne besitzt, könnte der Photosensor Cph2 die Inhibition der Motilität des WT im BL über eine Änderung des c-diGMP-Spiegels in der Zelle regulieren.

4.4.6 Weitere Photorezeptoren

Bereits publizierte Aktionsstudien der lichtregulierten Motilität von Synechocystis lassen auf das Wirken mehrer Photorezeptoren bei der Steuerung der Zellbewegung schließen (Choi et al., 1999; Ng et al., 2003). Zusätzlich zu den bereits erwähnten Mutanten mit inaktivierten Genen für die Phytochrome Cph1 und Cph2 sowie den potentiellen BL-Sensoren Cry, LOV und BLUF wurden weitere Mutanten mit einem Defekt in Genen erzeugt, die für phytochromähnliche Proteine kodieren.

Das phototaktische Verhalten von plpA --, 1473 --, 1393 --, 1969 --Mutanten wurde in Abhängigkeit vom WL sowie von FRL, RL, GL und BL analysiert. Wie schon für cph1 - (Abb. 13A-D), cr y - und lov - (Tab. 14) konnte für diese Mutanten keine Funktion bei der Steuerung der lichtabhängigen Motilität unter den untersuchten Lichtbedingungen nachgewiesen werden (Tab. 15 und Tab. 18). Die Motilität der BL-Rezeptormutanten wurde ebenfalls im UV(A)-Licht, GL, RL und FRL getestet (Daten nicht gezeigt). Auch unter diesen Lichtbedingungen wiesen die Mutanten eine zum Licht gerichtete Bewegung auf und verhielten sich somit wie der WT. Da diese Rezeptoren wahrscheinlich nur Licht unterhalb von 500 nm absorbieren, hätte eine Änderung im Phänotyp im GL, RL und FRL auf eine Interaktion mit einem weiteren Photorezeptor verwiesen. Solche Interaktionen konnten für Cryptochrome und Phytochrome in höheren Pflanzen nachgewiesen werden (Mas et al., 2000).

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Tab. 18: Funktionen echter und potentieller Photorezeptoren bei der Vermittlung der lichtinduzierten Motilität von Synechocystis.

Photorezeptor

Mögliche Funktion in der Motilität

Referenz

Phytochrome:

  

Cph1

keine

diese Arbeit

Cph2

Inhibition der Motilität zum BL

diese Arbeit

Phytochromähnliche Proteine:

 

PlpA

keine

diese Arbeit

PixJ1

Vermittlung der positiven Phototaxis

Yoshihara et al. (2000)

Bhaya et al. (2001a)

diese Arbeit

Sll1473

keine

diese Arbeit

Slr1393

keine

diese Arbeit

Slr1969

keine

diese Arbeit

Potentielle BL-Rezeptoren:

 

Cry

keine

diese Arbeit

LOV

keine

diese Arbeit

BLUF

Vermittlung der positiven Phototaxis

Okajima et al. (2003)

diese Arbeit

4.5 Vergleich verschiedener WT-Varianten und Analyse der IS-Elemente

Der in dieser Arbeit verwendete WT-Stamm zeigte im BL keine Motilität. Diese Eigenschaft unterscheidet sich von den Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen. So berichtete Choi et al. (1999) von einer postiven Phototaxis bei 460 nm, wobei allerdings die Geschwindigkeit der Zellen gegenüber anderen Wellenlängen herabgesetzt war. Auch der WT-Stamm aus der Arbeit von Ng et al. (2003) bewegte sich im BL-Feld, wobei die Bewegungsrichtung von der Intensität des eingestrahlten BL abhing. Bei einem anderen Cyanobakterium, dem thermophilen Synechococcus elongatus, konnte auch bei erhöhten Lichtintensitäten keine Phototaxis im Spektralbereich zwischen 350 und 470 nm induziert werden (Kondou et al., 2001). Synechococcus elongatus und die für diese Arbeit genutzte WT-Variante ähneln sich somit hinsichtlich ihrer im BL inhibierten Motilität, wobei jedoch noch keine Daten über das phototaktische Verhalten des hier analysierten WTs bei sehr hohen BL-Intensitäten vorliegen. Von sicherlich vorhandenen Unterschieden im experimentellen Ansatz abgesehen, deutet das variable Verhalten der verschiedenen WT-Stämme von Synechocystis darauf hin, dass es im Verlaufe der langen Kultivierung dieses Cyanobakteriums in diversen Laboratorien zu Änderungen im Genotyp gekommen sein kann.

Das phototaktische Verhalten der in diesem Labor vorhandenen Sammlung an WT-Varianten von Synechocystis sp. PCC 6803 wurde im BL sowie unter anderen Lichtbedingungen untersucht. Im Ergebnis dessen zeigte sich, dass einige Stamm-Varianten die Fähigkeit zur Motilität im WL verloren hatten. Weiterhin stellte sich heraus, dass von den motilen Stämmen nur der WT aus unserem Labor nicht die Fähigkeit zur lichtgerichteten Bewegung im BL besaß (Nr. 6 in Abb. 25A). Da die Inaktivierung des cph2-Gens in diesem WT die Phototaxis zum BL induzierte, wurde das Vorhandensein von cph2 in den verschiedenen WT-Varianten über RFLP-Analyse geprüft. In allen WT-Varianten konnte ein Signal für cph2 im richtigen Größenbereich registriert werden (Abb. 25B). Jedoch können über die RFLP-Analyse nur umfangreichere Änderungen im Genom erfasst werden. Punktmutationen, die zu einem Ausfall eines funktionstüchtigen Cph2-Proteins führen würden, können mit dieser Methode nur dann registriert werden, wenn sie die Erkennungsstelle des verwendeten Restriktionsenzyms modifiziert haben. Das cph2-Gen wurde im Chromosom der WT-Variante sequenziert, die für die Inaktivierung von Cph1 und Cph2 verwendet wurde. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Gensequenz der in der Cyanobase-Datenbank veröffentlichten Sequenz entsprach (Daten nicht gezeigt). Da kein Antikörper gegen das Cph2-Protein vorhanden war, war es nicht möglich, die Produktion des Proteins in den einzelnen Synechocystis-Stämmen zu testen. Weiterhin ist nicht völlig auszuschließen, dass in den im BL motilen Stämmen die von Cph2 ausgehende Signalkette aufgrund einer Mutation unterbrochen ist. Da diese Signalkette bis zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht aufgeklärt wurde, konnten entsprechende Untersuchungen nicht durchgeführt werden.

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Es besteht die Möglichkeit, dass einer der ORFs, die für potentielle BL-Rezeptoren in Syne cho cystis kodieren, in unserem WT defekt ist. Um dies auszuschließen, wurden das cry-, lov- und das bluf-Gen in den im BL motilen WT-Stämmen Nr. 2 und 4 inaktiviert. Da die entsprechenden Mutanten ihre Fähigkeit zur Motilität im BL behielten (Tab. 16), lässt sich ein inaktives Cry-, LOV- oder BLUF-Protein als Ursache für die fehlende Motilität in WT-Nr. 6, dem in unserer Arbeitsgruppe am intensivsten untersuchten WT, ausschließen.

Bei der Entstehung von Mutationen spielen neben externen Faktoren sogenannte IS-Elemente eine große Rolle, die über enzymatische Transpositionsereignisse an einen beliebigen Ort im Genom integriert werden können. Im Synechocystis-Genom sind eine große Anzahl dieser IS-Elemente vorhanden, die in Abhängigkeit von ihrer Sequenz in verschiedene Gruppen eingeteilt werden (Ikeuchi und Tabata, 2001). Für den vollständig sequenzierten Kazusa-Stamm konnten im Vergleich zu anderen WT-Varianten bereits drei zusätzlich vorhandene IS-Elemente ermittelt werden, die alle der ISY203-Gruppe zuzurechnen sind (Okamoto et al., 1999). Eines dieser IS-Elemente befindet sich im ORF sll1473, der für ein phytochromähnliches Protein kodiert. Die Verteilung der IS-Elemente im Genom des WTs unserer Arbeitsgruppe wurde über eine RFLP-Analyse untersucht und mit dem Bandenmuster anderer WT-Stämme verglichen. Die meisten Unterschiede wurden hierbei zwischen dem sequenzierten Kazusa-Stamm und den übrigen Stämmen gefunden. Aber auch die im BL nichtmotile WT-Variante wies mindestens eine Änderung im Genom auf (Spur Nr. 6 in Abb. 26 und Abb. 27). Hier wurde ein Teil des pSYSG-Plasmids in den Genombereich eingebaut, in dem sich die IS-Elemente des ISY100-Typs sll1257/sll1256 befinden (Abb. 28). Die Sequenzanalyse ergab, dass sich die pSYSG-DNA unmittelbar nach dem ORF sll1257 anschließt. Sucht man sich den Bereich auf dem pSYSG-Plasmid, der die höchste Ähnlichkeit seiner Sequenz mit der Sequenz der in das Chromosom inserierten DNA hat, findet man in direkter Umgebung ebenfalls ein IS-Element des ISY100-Typs. Somit könnte die DNA über homologe Rekombination in das Chromosom eingebaut worden sein.

In welchem Ausmaß der Einbau der Plasmid-DNA zu Fehlern in der Sequenz in dieser Genomregion führte und ob in Folge dieser Insertion das beobachtete Verhalten unseres WTs im BL auftrat, konnte noch nicht ermittelt werden. Die RFLP-Analyse des Gens slr1336 zeigte (Abb. 27C), dass der Einbau wahrscheinlich zwischen diesem Gen und sll1257 erfolgte (Abb. 28). Das Autoradiogramm in Abb. 27C belegt zwar, dass slr1336 im Chromosom der WT-Variante Nr. 6 vorhanden ist, nicht aber, ob das Gen in seiner gesamten Länge im Genom vorhanden ist. Das Gen slr1336 kodiert für einen Ca2+/H+-Antiporter. Moon et al. (2004) beschrieben den Einfluss von Kalzium in der Motilität. Wurde slr1336 durch den Einbau der Plasmid-DNA inaktiviert, könnte dies eine mögliche Ursache für die fehlende Motilität der WT-Variante Nr. 6 im BL sein. Der Nachweis, dass die Integration der pSYSG-DNA in die Genomregion, in der sich die IS-Elemente sll1256 und sll1257 sowie slr1336 befinden, der Grund für das beobachtete Verhalten unserer WT-Variante im BL ist, erfordert jedoch weitere Untersuchungen. Dies beinhaltet eine Sequenzanalyse der Insertionsregion im Genom sowie eine Inaktivierungsanalyse der betroffenen Gene in einer anderen Variante von Synechocystis sp. PCC 6803, die eine BL-induzierte Zellbewegung zeigte.

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Neben der beschriebenen Insertion einer Plasmid-DNA in das Genom der WT-Variante Nr. 6 können weitere, noch nicht identifizierte Veränderungen im Chromosom dieses WTs entstanden sein, die die tatsächliche Ursache für die fehlende Photobewegung unserer WT-Variante im BL ist. Derzeit wird versucht, diesen Ort über Komplementation mit einer Cosmidbank zu lokalisieren, die mit der genomischen DNA des Kazusa-Stamms angefertigt wurde (Shibata et al., 2001). Mit der Cosmidbank, die uns von T. Ogawa zur Verfügung gestellt wurde und ein auf Tn7-basierendes Transposon mit einer Cm-Resistenzgen-Kassette enthält, wurden Zufallsmutanten in der WT-Variante unserer Arbeitsgruppe erzeugt. Derzeit werden die erzielten Klone auf ihr phototaktisches Verhalten im BL untersucht. Hierbei werden die Klone selektiert, welche sich - wie die cph2 --Mutante bzw. die anderen Stamm-Varianten von Synechocystis - in Richtung BL bewegen. Bei der anschließenden Analyse des Insertionsorts des Transposons ist sowohl der durch das Transposon unterbrochene ORF von Interesse - als mögliche Komponente der vom Cph2-Protein ausgehenden Signalkette - als auch die übrigen auf dem Cosmid befindlichen Gene, die einen defekten ORF auf dem Genom des für diese Arbeit verwendeten WTs komplementiert haben könnten. Eine genauere Zuordnung der Funktion ist nur über weitere Mutagenisierungen der entsprechenden ORFs in diesem WT möglich.

4.6 Schlussfolgerung und Ausblick

Die beiden Phytochrome Cph1 und Cph2 beeinflussen das Wachstum unter bestimmten Lichtbedingungen. Die Inaktivierung des cph1-Gens wirkte sich negativ auf das Wachstum der Mutante im FRL aus, die Inaktivierung des cph2-Gens hingegen auf das Wachstum im RL. Beide Mutanten wuchsen im HL schlechter. Desweiteren ließ sich dem Cph2-Photorezeptor eine Funktion bei der Inhibierung der Motilität in Richtung BL zuordnen, da die WT-Zellen unter den in dieser Arbeit verwendeten BL-Bedingungen nicht motil waren, während die cph2 --Mutanten eine postive Phototaxis zeigten. Diese Beobachtung konnte nicht auf eine Interaktion des RL/FRL-Sensors Cph2 mit einem bekannten BL-Photorezeptor in Synechocystis zurückgeführt werden, da eine Inaktivierung der BL-Sensoren (Cry, LOV, BLUF) keine Änderung im phototaktischen Verhalten im BL gegenüber dem WT bewirkte. Vielmehr waren die Daten aus der Aufnahme eines Aktionsspektrums der BL-gesteuerten Motilität mit den Absorptionseigenschaften der mit PCB assemblierten C-terminalen GAF-Domäne des Cph2-Proteins vergleichbar. Insgesamt deuten die beschriebenen Resultate auf eine mögliche duale Funktion des Photorezeptors Cph2 sowohl als BL- als auch als RL-Sensor hin. Ein weiterer Photorezeptor mit einer potentiell dualen Funktion als RL/FRL- sowie BL-Sensor ist Phy3 aus dem Farn Adiantum capillus-veneris (Nozue et al., 1998). Ob die RL- und BL-Sensorfunktion des Cph2-Photorezeptors tatsächlich auf das Vorhandensein von zwei chromophorbindenden GAF-Domänen mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften zurückzuführen ist, soll in Zukunft geklärt werden. Dafür wird das inaktivierte cph2-Gen mit Konstrukten komplementiert, bei denen - wie bei den in dieser Arbeit beschriebenen pVZ321-Konstrukten - jeweils eines der chromophorbindenden Cysteine durch eine andere AS ausgetauscht wird. Diese Varianten des cph2-Konstrukts werden in das Chromosom integriert. Dadurch werden stabilere Phänotypen bei der Untersuchung der BL-gesteuerten Motilität erwartet. Weiterhin soll mit diesen Mutanten das Wachstum im RL analysiert werden.

In Zukunft werden die spektralen Eigenschaften eines in Synechocystis überexprimierten Cph2-Proteins analysiert und mit den Eigenschaften von rekombinant in E. coli exprimierten Cph2-Holoproteinen verglichen. Dadurch soll die Natur des Chromophors (oder der Chromophoren) des nativen Cph2-Proteins charakterisiert werden. Wie bereits erwähnt, konnte kürzlich eine c-diGMP-Zyklase-Aktivität der GGDEF-Domäne des Response-Regulators PleD gezeigt werden (Paul et al., 2004). Tischler und Camilli (2004) demonstrierten für Inaktivierungsmutanten des Response-Regulators VieA in Vibrio cholerae, dass dieses Protein den c-diGMP-Spiegel in der Zelle vermindern kann. Aus diesen Daten schlussfolgerten die Autoren, dass die in diesem Response-Regulator vorhandene EAL-Domäne c-diGMP-Phosphodiesterase-Aktivität besitzt. Da das Cph2-Protein diese beiden Domänentypen enthält, liegt die Vermutung nahe, dass Cph2 die BL-gesteuerte Motilität und das Wachstum im RL über eine Modifikation des c-diGMP-Spiegels reguliert. Daher soll der Einfluss von Cph2 auf die c-diGMP-Menge unter verschiedenen Lichtbedingungen, insbesondere BL, RL und FRL, untersucht werden.


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01.11.2005