Um die Auswirkungen der Inaktivierung der beiden cyanobakteriellen Phytochrome in Synechocystis zu charakterisieren, wurde zunächst das Wachstum der einzelnen Phytochrommutanten sowie der Doppelmutante unter verschiedenen Lichtbedingungen untersucht. Dazu gehörten die Wachstumsanalyse unter verschiedenen Lichtintensitäten sowie Lichtqualitäten.

Die Untersuchung des Wachstums in Abhängigkeit von der Lichtqualität ergab, dass die phytochromrelevanten Spektralbereiche RL und FRL einen Einfluss auf das Wachstum der Phytochrommutanten ausübten. Hierbei verhielten sich die cph1 ^-- und die cph2 ^--Mutante gegensätzlich: Während cph1 ^- unter FRL eine gegenüber dem WT verminderte Wachstumsrate vorwies, wuchs cph2 ^- unter RL schlechter (Abb. 10). Die Doppelmutante zeigte jeweils das gleiche Wachstumsverhalten wie die Einzelmutanten.

Wie bereits erwähnt, liegen Phytochrome in zwei Konformationen vor: Im RL dominiert die FRL-absorbierende P_fr-Form, die RL-absorbierende P_r-Form hingegen ist die überwiegende Konformation im FRL. Für pflanzliche Phytochrome wird angenommen, dass P_fr die biologisch aktive Form darstellt (Sullivan und Deng, 2003). In Synechocystis zeigte die P_r-Form eines rekombinanten Cph1-Proteins aus E. coli eine höhere Phosphorylierungsrate und Phosphatübertragung auf den Response-Regulator Rcp1 als die P_fr-Form des Photorezeptorproteins (Yeh et al., 1997). Dies lässt vermuten, dass die P_r-Form von Cph1 die biologisch aktive Form ist. Ein ähnliches Bild ergibt sich auch für die beiden Phytochrome CphA und CphB aus Calothrix sp. PCC 7601. Hier wurde ebenfalls die im FRL vorliegende P_r-Form von CphA und CphB stärker autophosphoryliert, wobei jedoch im Gegensatz zu Cph1 der Transfer des Phosphats vom Sensorprotein auf den entsprechenden Response-Regulator unter RL nicht aufgehoben wurde (Hübschmann et al., 2001b). Unter Verwendung der Absorptionsspektren des rekombinanten, mit PCB assemblierten Cph1-Proteins (Lamparter et al., 1997) wurde der Anteil der P_r-Form an der Gesamtmenge an Phytochrom unter den für diese Arbeit genutzten FRL-Bedingungen mit 90 % berechnet (unter RL 42 %). Daher ist anzunehmen, dass unter diesen Lichtbedingungen Cph1 hauptsächlich in seiner aktiven Form vorliegt. Wenn die P_r-Konformation von Cph1 die biologisch aktive Form ist, sollte sich eine Mutante mit einem inaktivierten cph1-Gen unter FRL anders verhalten als der WT. Dies konnte durch die Aufnahme von Wachstumskurven beobachtet werden: Die cph1 ^--Mutante zeigte ein auf ca. 60 % vom WT vermindertes Wachstum im FRL, während RL keinen Einfluss auf das Wachstum von cph1 ^- ausübte (Abb. 10). Auch während des kompetitiven Wachstums von WT und cph1 ^- in einer Mischkultur wurden die Mutantenzellen nach 12 Tagen im FRL verdrängt. Somit sprechen die Daten aus der Wachstumsanalyse dafür, dass P_r tatsächlich die biologisch aktive Form ist. Jedoch ist nicht völlig auszuschließen, dass nicht auch die P_fr-Form von Cph1 am Beginn einer weiteren Signalkette stehen könnte. So existieren für pflanzliche Phytochrome Hinweise, dass die als biologisch inaktiv geltende Konformation, hier die P_r-Form, auch eine biologische Aktivität besitzen könnte (Reed, 1999; Shinomura et al., 2000). Resultate aus der Untersuchung der phytochromgesteuerten Hypokotyl-Elongation bei A. thaliana deuten auf eine Funktion der photozyklisierten P_r-Form von PhyA (Shinomura et al., 2000), d. h. die neu synthetisierte Grundform P_r muss eine Photokonversion in die P_fr- und zurück in die P_r-Form vollzogen haben.

Ein umgekehrtes Wachstumsverhalten zeigte die cph2 ^--Mutante. Diese wuchs unter RL-Bedingungen schlechter, während das Wachstum im FRL nicht beeinträchtigt war (Abb. 10). Auch während des kompetitiven Wachstums von WT und cph2 ^- im RL nahm eingigen Tagen der Anteil der Mutantenzellen im Vergleich zum WT ab (Abb. 11D). Dies spricht dafür, dass die im RL dominierende P_fr-Form von Cph2 die biologisch aktive Konformation ist, so wie es für pflanzliche Phytochrome angenommen wird. Das Ausmaß der Wachstumsreduktion (ca. 80 %) war geringer ausgeprägt als bei der cph1 ^--Mutante im FRL (ca. 60 %). Eine mögliche Ursache hierfür könnte im verhältnismäßig niedrigen Anteil von Cph2 in seiner P_fr-Form unter unseren RL-Bedingungen zu suchen sein. Der P_fr-Anteil wurde für die in dieser Arbeit beschriebenen RL-Bedingungen mit 58 % berechnet. Allerdings bezieht sich dieser Wert auf das Absorptionsspektrum des rekombinanten, mit PCB assemblierten Cph1-Proteins aus E. coli, welches dem Spektrum eines in Synechocystis überexprimiertem Cph1 entsprach (Hübschmann et al., 2001a). Die Absorptionseigenschaften des nativen Cph2 müssen nicht dem von Cph1 entsprechen. Vielmehr weisen bisherige Daten aus der spektrophotometrischen Analyse eines in E. coli rekombinant exprimierten Cph2-Proteins mit PCB als Chromophor auf eine Verschiebung der Maxima von P_fr und P_r um ca. 10 bzw. 16 nm in den kürzeren Wellenlängenbereich gegenüber Cph1 hin (Wu und Lagarias, 2000; Park et al., 2000). Dies würde bedeuten, dass der tatsächliche Anteil der P_fr-Form des Cph2-Photosensors höher gewesen sein kann. Eine genaue Berechnung des P_fr- und P_r-Anteils des Cph2-Proteins unter den untersuchten Lichtbedingungen war nicht möglich, da entsprechende Daten nicht verfügbar waren. Über die Natur des Chromophors und die Absorptionscharakteristika des nativen Cph2-Proteins ist bisher nichts bekannt.

Das Vorhandensein von zwei Phytochromen (AtBphP1, AtBphP2) mit gegensätzlichen photobiologischen Eigenschaften konnte für Agrobacterium tumefaciens beschrieben werden (Karniol und Vierstra, 2003). Die Analyse der rekombinanten Phytochrom-Proteine aus Agrobacterium tumefaciens deutete darauf hin, dass die Grundform von AtBphP1 der P_r-Form und die von AtBphP2 der P_fr-Konformation entspricht. Beide Sensorproteine sind Histidinkinasen. Während die P_r-Form von AtBphP1 eine höhere Histidinkinase-Aktivität besaß als die P_fr-Form, wurde für AtBphP2 eine höhere Histidinkinase-Aktivität der P_fr- im Vergleich zur dazugehörigen P_r-Form ermittelt. Aufgrund dieser gegensätzlichen photobiologischen Eigenschaften vermuten die beiden Autoren, dass AtBphP1 und AtBphP2 als gegensätzliche Photorezeptoren fungieren könnten.

Die cph1 ^- /cph2 ^--Doppelmutante wuchs sowohl im RL als auch im FRL schlechter als der WT (Abb. 10), wobei sich das Ausmaß der Wachstumsreduktion nicht wesentlich von den Werten für die entsprechenden Einzelmutanten unterschied. Daher lässt zumindest die Analyse des Wachstumsverhaltens der Phytochrommutanten keine kompensatorischen oder überlappenden Funktionen von Cph1 und Cph2 erkennen. Das schließt nicht aus, dass die Untersuchung anderer physiologischer Parameter zu anderen Schlussfolgerungen führen kann.

Unter HL-Bedingungen wuchsen alle Phytochrommutanten schlechter als der WT (Abb. 10), wobei das Wachstum der einzelnen Phytochrommutanten in unterschiedlichem Ausmaß betroffen war. So hatte HL auf die cph1 ^--Mutante mit einer Wachstumsreduktion von ca.
40 % gegenüber dem WT einen größeren Einfluss als auf die cph2 ^--Mutante (ca. 20 % Wachstumsverminderung gegenüber dem WT). Somit scheint das Ausschalten des cph1-Gens einen stärkeren Effekt auf das Zell-Wachstum zu haben als das des cph2-Gens. Obwohl unter HL beide Einzelmutanten schlechter wuchsen, erreichte die prozentuale Wachstumsrate der cph1 ^-/cph2 ^--Doppelmutante keinen geringeren Wert als die der cph1 ^--Mutante.

Stärkere Beeinträchtigungen des Wachstums im WL waren nur unter hohen Lichtintensitäten zu beobachten: Mit abnehmender Lichtstärke verminderte sich auch die Wachstumsreduktion, so dass unter LL-Bedingungen keinerlei Unterschiede im Wachstum von WT und Phytochrommutanten zu erkennen war. Die Wachstumsverminderung aller Phytochrommutanten unter HL-Bedingungen zeigt, dass die Inaktivierung von cph1 und cph2 die Fähigkeit herabsetzte, Lichtstress zu bewältigen. Hierbei spielt die Anpassung des Photosyntheseapparats an überoptimales Licht eine große Rolle (siehe Kap. 4.2).

Cyanobakterien können sich auf verschiedene Weise an überschüssiges Licht in ihrer Umgebung anpassen. Welcher Regulationsweg zur Akklimatisierung an hohe Lichtintensitäten in Phytochrommutanten von Synechocystis betroffen ist, konnte jedoch nicht herausgefunden werden. Problematisch für photosynthetisch aktive Organismen ist die mit steigenden Lichtintensitäten einhergehende Gefahr der verstärkten Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies über den photosynthetischen Elektronentransport (Niyogi, 1999). Eine Möglichkeit, diese Gefahr zu vermindern, ist die Reduktion der lichtsammelnden Antennen sowie die verstärkte Bildung von photoprotektiv wirkenden Pigmenten. Derartige Anpassungsmechanismen konnten für den WT beobachtet werden. Dies zeigt auch, dass die für das Wachstum unter HL-Bedingungen eingesetzte Lichtmenge tatsächlich einer Stress-Situation entsprach. Laut Analyse der Pigmentzusammensetzung unterschieden sich jedoch WT und Phytochrommutanten nicht wesentlich voneinander (Tab. 10). Die Phytochrommutanten senkten den Chl-Gehalt auf einen ähnlichen Wert wie der WT. Im Gegenzug war die Chl-bezogene Karotinoidmenge wie im WT heraufgesetzt. Für das PC/Chl-Mengenverhältnis konnten ebenfalls keine signifikanten Differenzen zwischen WT und den einzelnen Phytochrommutanten erfasst werden.

Auch im RL und FRL konnten keine wesentlichen Unterschiede im Chl-Gehalt sowie im Car/Chl- und PC/Chl-Verhältnis zwischen dem WT und den Phytochrommutanten festgestellt werden (Tab. 10). Die höchsten Chl-Mengen wurden bei den im RL gewachsenen Synechocystis-Zellen gemessen. Unter FRL-Bedingungen waren die ermittelten Chl-Mengen leicht reduziert. Für Cyanobakterien bedeutet FRL, erkennbar an den sehr geringen Wachstumsraten unter diesen Bedingungen, eine extreme Lichtlimitation. Unter derartigen Bedingungen müssen photosynthetisch aktive Organismen den Aufbau des Photosyntheseapparates mit dem damit einhergehenden Energieaufwand für die Syntheseschritte ausbalancieren, um genügend Energie für andere Vorgänge in der Zelle sowie die Zellteilung bereitstellen zu können. Solche Reduktionen des Photosyntheseapparates unter Lichtmangelbedingungen wurden anhand von blattflächenbezogenen Pigmentanalysen auch bei höheren Pflanzen festgestellt (Hansen et al., 2002). Im Gegensatz zum Chl-Gehalt unterschied sich die Chl-bezogene Karotinoidmenge nicht wesentlich von den Werten im RL. Dies zeigt, dass die Karotinoide im gleichen Ausmaß wie das Chl reduziert waren. Das gegenüber HL und RL erhöhte PC/Chl-Verhältnis im FRL lässt schlussfolgern, dass die Phycobilisomenantenne vergrößert war. Mit einer Ausdehnung der lichtsammelnden Antennen vermögen Cyanobakterien unter Lichtmangelbedingungen das wenige ankommende Licht effizienter einzufangen und an die Photosysteme weiterzuleiten (Grossman et al., 1993). Ein weiteres Problem ist die im FRL verstärkt auftretende Überanregung des PSI. Die Phycobilisomen übertragen die Anregungsenergie hauptsächlich auf das PSII (Grossman et al., 1993). Mit der Vergrößerung der bei ca. 630 nm absorbierenden Phycobilisomen versuchen Cyanobakterien eine mögliche Ungleichverteilung der Elektronen über die Elektronentransportkette zu kompensieren. Im Gegensatz zum FRL war die Phycobilisomenantenne im RL verkleinert. Hier glichen die ermittelten PC/Chl-Werte denen aus dem HL oder lagen sogar geringfügig darunter (Tab. 10).

Cyanobakterien passen sich einem ungünstigen Lichtregime auch durch Änderung der PSI/PSII-Stoichiometrie an (Fujita, 1997). So verschiebt sich im FRL das PSI/PSII-Verhältnis zugunsten des PSII, um eine Überanregung des PSI zu reduzieren. Informationen über mögliche Verschiebungen in der Stoichiometrie der Photosysteme liefert die Aufnahme von 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren, bei der die Fluoreszenz erfasst wird, die von den Chl-Molekülen in den jeweiligen core-Komplexen der beiden Photosysteme ausgestrahlt wird. Jedoch weisen keine der aufgenommenen 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren von WT- oder Mutantenzellen, die im HL, RL oder FRL angezogen wurden, auf eine Änderung des PSI/PSII-Verhältnisses zwischen WT oder Phytochrommutanten hin, die die Wachstumsreduktion der Mutanten unter den genannten Lichtbedingungen erklären könnte (Kap. 3.3.3.3).

Eine Verminderung des Wachstums als Folge eines beeinträchtigten Elektronenflusses über die Photosynthesekette, verbunden mit unzureichender Fixierung von anorganischem Kohlenstoff, konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Die für cph1 ^-, cph2 ^- und die Doppelmutante ermittelte Photosyntheserate, die hier als maximale Netto-Sauerstofffreisetzung gemessen wurde, hatte unter HL- und RL-Bedingungen nahezu WT-Niveau. Mögliche Unterschiede in der Photosyntheserate zwischen WT und Phytochrommutanten unter FRL-Bedingungen werden durch die sehr großen Standardabweichungen der Mittelwerte verdeckt, so dass sich hier keine eindeutige Aussage treffen lässt. Außerdem wies die cph2 ^--Mutante, wie die cph1 ^-- und die Doppelmutante, im FRL eine Reduktion der Chl-bezogenen maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsrate auf. Das Wachstum der cph2 ^--Mutante war jedoch im Gegensatz zu den beiden anderen Mutanten im FRL nicht vermindert.

Die Sauerstoffentwicklung variierte stark zwischen den verschiedenen Lichtbedingungen. Bei den im Vergleich zum HL verringerten Werten im RL spielen sicherlich die unter RL-Einfluss erhöhten Chl-Gehalte eine Rolle, die die Bezugsgröße für die Sauerstofffreisetzung darstellen. Im FRL hingegen lagen die für diese Lichtbedingung ermittelten Werte für die maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate weit über denen im HL und im RL. Da sich die Chl-Gehalte im FRL in einem Größenbereich zwischen HL und RL befinden, kann die Bezugsgröße Chl nicht als Erklärungsmöglichkeit für die hohe Sauerstoffentwicklung im FRL dienen. Vielmehr scheinen sich andere Anpassungsprozesse vollzogen zu haben, in deren Folge die Photosynthese mit einer höheren Effizienz arbeitete. Bedenkt man den im FRL herrschenden extremen Lichtmangel, ist eine Optimierung der Photosynthese zur verbesserten Bereitstellung von Photosyntheseprodukten nachvollziehbar.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass kein eindeutiger Zusammenhang zwischen den verschiedenen Aspekten der Photosynthese und dem verminderten Wachstum der Phytochrommutanten unter HL-, RL- oder FRL-Bedingungen hergestellt werden konnte. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass der Einfluss von Cph1 und Cph2 auf die Photosynthese in dieser Arbeit hauptsächlich auf physiologischer Ebene untersucht wurde. In anderen Eubakterien konnte eine Funktion der bakteriellen Phytochrome bzw. phytochromähnlichen Proteine bei der Regulation der Synthese des Photosyntheseapparates oder dem Aufbau von Schutzmechanismen zur Photoprotektion nachgewiesen werden (siehe unten). In Freymella diplosiphon, einem Cyanobakterium mit der Fähigkeit zur komplementären chromatischen Adaptation, ist der Photorezeptor RcaE über einen Phosphorelay in die Regulation die Genexpression von Operonen involviert, welche für lichtsammelnde Proteine der Phycobilisomen kodieren (Stowe-Evans und Kehoe, 2004). Dadurch ist Freymella diplosiphon in der Lage, die Anteile von PC und Phycoerythrin in den Phycobilisomen in Abhängigkeit vom GL bzw. RL zu variieren und so die für die Photosynthese essentielle Lichtsammlung zu optimieren. Terauchi et al. (2004) demonstrierten kürzlich die Fähigkeit des RcaE-Apoproteins, einen Chromophor zu binden. Jedoch konnte keine Photokonversion des RcaE-Holoproteins aus Freymella diplosiphon nach Anregung mit GL oder RL gezeigt werden. In dem nichtphotosynthetischen Bakterium Deinococcus radiodurans steuert das Phytochrom BphP die Biosynthese des Karotinoids Deinoxanthin (Davis et al., 1999). In dem symbiontisch lebenden Bradyrhizobium ORS278 wiesen Mutanten mit dem inaktivierten Phytochrom BrbphP, das nahe dem Photosynthese-Gencluster lokalisiert ist, einen stark reduzierten Photosyntheseapparat auf (Giraud et al., 2002). Für dieses Phytochrom nehmen die Autoren an, dass die P_r-Form von BrbphP als ein Antagonist für den Repressor der Genexpression des Photosynthese-Genclusters, PpsR, wirkt. Am C-Terminus befindet sich eine PAS/S-Box. Daher findet die Signalübertragung wahrscheinlich über Protein-Protein-Interaktionen statt (Giraud et al., 2002). Ähnliche Ergebnisse lieferte die Untersuchung des Phytochroms RpBphP aus dem Purpurbakterium Rhodopseudomonas palustris, welches mit Bradyrhizobium ORS278 nahe verwandt ist (Giraud et al., 2004).

Die Wirkung der Mutation von cph1 und cph2 auf die Transkriptmenge ausgewählter Photosynthesegene in Synechocystis wurde von Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe untersucht. Hier konnte jedoch kein deutlicher Einfluss der beiden Phytochrome auf das Transkriptniveau der untersuchten Gene festgestellt werden (unveröffentliche Resultate).

Beeinflussen Cph1 und Cph2 auf irgendeine Weise die Photosynthese, sollte die Zugabe von Glukose die Beeinträchtigung des Wachstums gegenüber dem WT aufheben. Synechocystis kann Glukose als Energie- und Kohlenstoffquelle nutzen und ist dadurch zu einem Wachstum ohne Licht befähigt, wenn den Zellen ein täglicher BL-Puls gegeben wird (Anderson und McIntosh, 1991).

Im RL und FRL stimulierte die Glukosezugabe das Wachstum sowohl des WTs als auch der Phytochrommutanten (Tab. 9). Der Unterschied in der Wachstumsrate zwischen cph2 ^- bzw. der Doppelmutante und dem WT wurde zwar reduziert, verschwand jedoch nicht völlig: Der durchschnittliche µ-Wert der beiden Mutanten betrug ca. 80 % vom WT in einer glukosefreien Kultur und ca. 90 % vom WT in einer glukosehaltigen Kultur. Hierbei verhielten sich cph2 ^- und die cph1 ^-/cph2 ^--Doppelmutante gleich. Unter mixotrophen Bedingungen im FRL wuchs cph1 ^- durchschnittlich mit der gleichen Geschwindigkeit wie der WT. Die Doppelmutante hingegen zeigte eine geringe Wachstumsreduktion gegenüber dem WT.

Im HL wirkte sich die Glukosezugabe negativ auf das Wachstum des WTs aus. Unter diesen Bedingungen ist Licht nicht der wachstumslimitierende Faktor. In dessen Folge herrscht bei ausreichender Versorgung mit anorganischem Kohlenstoff in der Zelle eher ein Überangebot an Zuckern. Ein Überschuss an Kohlenstoffmetaboliten bewirkt offenbar eine Runterregulierung der Photosynthese (Paul und Pellny, 2003). Diese feedback-Mechanismen stehen in engem Zusammenhang mit dem Kohlenstoff/Stickstoff-Balance sowie der Verfügbarkeit an anorganischem Phosphat in der Zelle.

Die durch die Synechocystis-Zelle aufgenommene Glukose kann entweder über die Glykolyse dem Stoffwechsel zugeführt oder zu Glykogen umgesetzt werden. Der Kohlenhydratspeicher Glykogen wird in der stationären Wachstumsphase (Lehmann und Wöber, 1976) sowie unter nährstofflimitierenden Bedingungen gebildet (Schneegurt et al. 1997). Die Regulation des Kohlenstoff-Stoffwechsels unter HL-Bedingungen ist für Synechocystis bisher nicht klar. Pelroy et al. (1976) analysierten am Cyanobakterium Aphanocapsa 6714 die Stoffwechselrouten von exogen zugefügter [¹⁴C]-Glukose. Hierbei ermittelten die Autoren, dass unter mixotrophen Bedingungen die aufgenommene Glukose zum überwiegenden Teil zu Proteinen und zum geringeren Teil in Glykogen umgesetzt wird. In Synechocystis sollte bei normalen Stickstoffangebot die Glukose überwiegend in den Baustoffwechsel eingeschleust werden. Inwieweit die Glukose beim WT unter HL-Bedingungen zu einer Hemmung des Wachstums führt, ist unklar.

Die Wachstumsraten von cph1 ^- und cph2 ^- in einer photoheterotroph im HL wachsenden Kultur entsprachen nahezu dem Wert des unter gleichen Bedingungen gewachsenen WTs (Tab. 9). Für die beiden Phytochrommutanten bedeutete die Glukosezugabe eine leichte Förderung des Wachstums gegenüber einer glukosefreien Kultur unter den gleichen Lichtbedingungen, wobei sich die stärkste Wachstumsstimulation bei der cph1 ^--Mutante beobachten ließ. Das Zusetzen von Glukose zum Medium wirkte sich zwar auch positiv auf das Wachstum der cph1 ^-/cph2 ^--Doppelmutante aus, jedoch nicht im gleichen Maß wie bei cph1 ^-.

Die wachstumsfördernde Wirkung der Glukose im HL lässt vermuten, dass die Phytochrommutanten durch die Glukosezugabe eine verminderte Energieproduktion ausgleichen können. Dies verweist auf eine mögliche Störung der Photosyntheseleistung in den Mutantenzellen. Jedoch deuten die Daten aus der Pigmentanalyse, der Aufnahme von 77K-Fluoreszenz-Emissionsspektren und der Bestimmung der maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsrate nicht auf eine Beeinträchtigung der Photosynthese hin.

Ist die Aufnahme von anorganischem Kohlenstoff bei den Phytochrommutanten vermindert, könnten die Zellen das beim Glukoseabbau frei werdende CO₂ im Calvin-Zyklus nutzen. Wäre im HL die Kohlenstoffaufnahme oder die CO₂-konzentrierenden Mechanismen in den Mutanten herabgesetzt, hätte sich dies in einer reduzierten maximalen Netto-Sauerstofffreisetzungsrate der Phytochrommutanten gegenüber dem WT niederschlagen müssen. Dies konnte jedoch nicht gezeigt werden. Weiterhin liegen keine Informationen über die tatsächliche Produktion von ATP und den Reduktionsäquivalenten NADH und NADPH sowie deren Umsetzung in den Zellen vom WT und den Phytochrommutanten vor. Yang et al. (2002) ermittelten eine überschüssige Produktion von NADH/NADPH in einer mixotroph unter normalen Lichtbedingungen wachsenden Synechocystis-Kultur. So könnte einerseits die ATP-Synthese oder die Bereitstellung an Reduktionsäquivalenten über die Photosynthesekette in den Mutantenzellen nicht mit dem gleichen Ertrag stattfinden wie in den WT-Zellen. Andererseits könnten die Phytochrommutanten auch einen erhöhten ATP- oder NADH/NADPH-Bedarf besitzen, um durch die Mutation von cph1 und cph2 entstandene Effekte auszugleichen. Durch die Glukose-Zugabe würde den Mutantenzellen eine zusätzliche Möglichkeit zur ATP- bzw. NADH/NADPH-Synthese über die Glukose-Abbauwege, die in Synechocystis auch im Licht aktive Atmungskette (Yang et al., 2002) oder einen alternativen nichtrespiratorischen Weg der Energiegewinnung zur Verfügung stehen. Ähnliches lässt sich auch zu dem photoheterotrophen Wachstum von cph1 ^- und cph1 ^-/cph2 ^- im FRL sowie cph2 ^- und cph1 ^-/cph2 ^- im RL sagen (Tab. 9), wobei bei der cph2 ^--Mutante im RL und der Doppelmutante im HL, RL und FRL noch andere Prozesse betroffen sein müssen, da die Glukosezugabe für keine vollständige Angleichung der Wachstumsrate an die des WTs unter den genannten Kulturbedingungen sorgte.

Glukose besitzt vermutlich eine vielfältige Wirkung auf die Zelle. García-Domínguez et al. (2000) fanden einen Einfluss der Glukose auf die cph1-mRNA-Akkumulation: Der starke Anstieg der cph1-Transkriptmenge beim Übergang vom Licht ins Dunkel wurde durch die exogene Zugabe von Glukose vollständig aufgehoben. Somit beinflusst die Glukose die Transkription des cph1-Gens oder die Stabilität der cph1-mRNA. Die Transkriptakkumulation von cph1 und cph2 in mixotroph wachsenden Synechocystis-Kulturen unter unseren Lichtbedingungen wurden nicht untersucht. Daher ist nicht bekannt, ob cph1 im FRL unter Einfluss von Glukose im Medium transkribiert wird.

In dieser Arbeit wurde die lichtabhängige Akkumulation der cph1- und cph2-mRNA im WT mittels quantitativer real time RT-PCR untersucht. Für cph1 konnte ein Einfluss von Lichtintensität und Lichtfarbe auf die Transkriptmenge gezeigt werden (Abb. 9A). So war die cph1-mRNA-Menge im HL gegenüber ML vermindert, während im Dunkeln, GL sowie im FRL ein Anstieg der Transkriptakkumulation von cph1 gegenüber dem ML-Wert ermittelt wurde. Den stärksten Einfluss auf die cph1-mRNA-Menge übte HL mit 15 % und FRL mit 650 % der Transkriptmenge vom Wert unter ML-Bedingungen aus. Der Abfall der Transkriptmenge von cph1 ^- im HL könnte mit einem verminderten Bedarf des Cph1-Proteins unter dieser Lichtbedingung zusammenhängen. Jedoch wurde gerade im HL eine Wirkung der Inaktivierung des cph1-Gens auf das Wachstum festgestellt (Abb. 10). Die Transkriptakkumulation lässt jedoch keine Aussage über die tatsächliche Menge an Cph1-Protein in der Zelle zu. Hübschmann et al. (2001a) berechneten aus Absorptionsspektren 23 Moleküle Cph1 pro Zelle in einem Synechocystis-Stamm, der ein His-tag-Cph1-Fusionsprotein überexprimiert. Erfolgte die Expression von cph1 unter der Kontrolle des starken, lichtregulierten psbA2-Promotors, wurde ein Anstieg der Cph1-Moleküle pro Zelle auf nur 200 kalkuliert, obwohl eine wesentlich höhere cph1-Transkriptionsmenge gemessen wurde. Diese Diskrepanz zwischen der cph1-mRNA-Transkriptakkumulation des unter der Kontrolle des psbA2-Promotors stehenden Gens und der Zahl an Cph1-Molekülen in der Zelle deuten entweder auf eine geringe Translation des Transkripts oder auf einen raschen Umsatz dieses Proteins. Hübschmann et al. (2001a) vermuten, dass Cph1 als Holoprotein stabil und als Apoprotein instabil sein könnte, was in diesem Fall für einen Mangel an freiem PCB für die Bindung als Chromophor sprechen würde.

Nach 1 h im Dunkeln stieg die Menge an cph1-mRNA in den Zellen an. Dies wurde auch durch andere Arbeitsgruppen gezeigt (García-Domínguez et al., 2000; Park et al., 2000). Die Zunahme der cph1-mRNA-Akkumulation im FRL korreliert mit dem verminderten Wachstum der cph1 ^--Mutante im Vergleich zum WT in diesem Licht (Abb. 10). Das beeinträchtigte Wachstum der cph1 ^--Mutante im FRL deutet auf eine Funktion des Cph1-Photorezeptors bei der Anpassung an eine Umgebung mit erhöhtem FRL-Anteil. Ein verstärkter Bedarf an Cph1-Protein unter diesen Lichtbedingungen ist daher denkbar. Es liegen jedoch keine Informationen darüber vor, ob der Anstieg der cph1-Transkriptmenge im FRL auch mit einer Zunahme an funktionstüchtigem Cph1-Protein einhergeht. Bezüglich des FRL unterscheiden sich die Resultate anderer Arbeitsgruppen von den hier vorgestellten Daten, wobei deren experimentelle Ansätze von den unsrigen abwichen. Park et al. (2000) konnte kein cph1-Transkript in einer mixotroph im FRL wachsenden Kultur finden. García-Domínguez et al. (2000) belichtete aus dem Dunkeln kommende Zellen mit einem kurzen FRL-Puls und ermittelte eine starke Abnahme der cph1-mRNA-Menge.

Auch hinsichtlich des RL-Einflusses auf die Transkriptakkumulation ergaben sich unterschiedliche Ergebnisse. In dieser Arbeit war nach 1 h im RL die cph1-Transkriptmenge gegenüber dem Wert im ML unverändert (Abb. 9A). Park et al. (2000) jedoch konnten unter dieser Lichtbedingung die höchsten Signale für das cph1-Transkript überhaupt messen, während García-Domínguez et al. (2000), wie auch schon für FRL, eine drastische Abnahme der Transkriptmenge beobachteten. Letztere Arbeitsgruppe demonstrierte eine starke Lichtregulation der cph1-Transkriptmenge mit einer starken Zunahme im Dunkeln und einem entsprechenden Absinken des Transkripts im Licht, unabhängig von der Spektralfarbe. Hierbei spielte eine verminderte Stabilität des cph1-Transkripts im Licht eine Rolle. Die Autoren sehen daher eine Funktion des Cph1-Photosensors bei der Regulation von Prozessen bei Licht-Dunkel- bzw. Dunkel-Licht-Übergängen. Der Einfluss eines Kurztagsrhythmus (10 h WL, 14 h Dunkel) auf das Wachstum der Phytochrommutanten im ML wurde ebenfalls untersucht, ohne einen Unterschied zu finden (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise hätten sich kurze Lichtpulse stärker auf das Wachstum der Mutanten ausgewirkt als der Kurztagsrhythmus, andererseits konnten in dieser Arbeit nicht die von García-Domínguez et al. (2000) beschriebenen drastischen Änderungen in der cph1-Transkriptakkumulation zwischen Licht und Dunkel festgestellt werden. Diese Änderungen fielen deutlich geringer aus (Abb. 9A). Auch führten García-Domínguez et al. (2000) keine Untersuchungen zur Menge an Cph1-Protein pro Zelle durch. Somit ist nicht bekannt, ob das cph1-Transkript in dem Ausmaß translatiert wurde, wie dessen Akkumulation im Dunkeln zunahm.

Neben dem Anstieg der cph1-mRNA-Menge im FRL und im Dunkeln wurde auch eine Zunahme des Transkripts im GL beobachtet (Abb. 9A). Der verwendete GL-Filter besitzt die Eigenschaft, im Wellenlängenbereich oberhalb von 730 nm Licht zu transmittierten. Jedoch ist die in diesem Bereich ankommende Lichtintensität sehr gering und entspricht nicht den FRL-Bedingungen, unter denen ein Anstieg des cph1-Transkriptniveaus gemessen wurde. Daher ist anzunehmen, dass die Zunahme der cph1-Transkriptakkumulation im GL nicht auf den geringen Infrarot-Anteil des GL-Filters zurückzuführen ist.

GL bedeutet für Synechocystis in Hinblick auf die Nutzbarkeit für die Photosynthese Schwachlicht, da in diesem Wellenlängenbereich Chl und PC kaum Licht absorbieren. Daher stellt sich die Frage, ob der Reizauslöser für den Anstieg der cph1-Transkriptakkumulation im GL die geringe Lichtintensität oder die Lichtfarbe Grün darstellt. Die Transkriptmenge von cph1 unter geringen Lichtintensitäten wurde zwar nicht selbst gemessen, trotzdem ist eine erhöhte cph1-mRNA-Akkumulation im Schwachlicht vorstellbar, da sich hohe Lichtintensitäten negativ und Dunkel positiv auf die Transkriptmenge auswirkten. Würde diese Erklärung zutreffen, dann müsste die photosynthetische Elektronentransportkette die cph1-Transkription oder die Stabilität des Transkripts beeinflussen. García-Domínguez et al. (2000) konnten jedoch keinen Einfluss der Inhibitoren des photosynthetischen Elektronentransports DCMU und DBMIB auf die cph1-Transkriptmenge feststellen. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit für die Zunahme des cph1-Transkriptniveaus im GL wäre ein potentieller GL-Photorezeptor. Dieser müsste einem bisher unbekannten Typ von GL-Rezeptoren angehören, da das Synechocystis-Chromosom im Gegensatz zu Anabaena sp. PCC 7120 (Jung et al., 2003) kein Gen enthält, das für das Apoprotein des GL-Rezeptors Rhodopsin kodiert.

Die Analyse der lichtabhängigen cph1-Transkriptakkumulation deutet auf das Wirken eines oder mehrerer Photorezeptoren oder auch eines Redoxsensors hin, die zum einen die Lichtstärke zum anderen FRL und vielleicht auch GL wahrnehmen. Das Phytochrom Cph2 könnte eines dieser Photorezeptoren sein, da in der cph2 ^--Mutante eine gegenüber dem WT veränderte Lichtregulation des cph1-Transkriptniveaus festgestellt werden konnte (Abb. 9A). Im Gegensatz zum WT wurde bei der cph2 ^--Mutante kein Anstieg der cph1-Transkriptakkumulation nach dem Übergang von ML zum Dunkel gemessen. Dies verweist auf eine mögliche Funktion des Photorezeptors Cph2 bei der Wahrnehmung des Umweltreizes Dunkel bzw. bei der Wahrnehmung von Licht-Dunkel-Übergängen. Hierbei ist jedoch nicht bekannt, ob Cph2 die cph1-Transkriptakkumulation über die Stabilität des cph1-Transkripts oder die Transkription des cph1-Gens reguliert.

Die cph2-Inaktivierung zeigte auch einen Einfluss auf die Höhe der cph1-Transkriptakkumulation im GL und FRL (Abb. 9A). Unter diesen Lichtbedingungen war die beim WT beobachtete Zunahme des cph1-Transkriptniveaus in der cph2 ^--Mutante gegenüber dem WT verringert, aber noch vorhanden. Somit spielt zwar das Cph2-Protein beim Anstieg der cph1-Transkriptmenge nach dem Wechsel vom ML zu GL und FRL eine Rolle, jedoch müssen weitere Photorezeptoren in die Lichtregulation der cph1-Transkriptakkumulation involviert sein.

Die Wirkung eines Phytochroms auf die Photoregulation der Transkriptmenge eines anderen Phytochroms konnte für PhyA und PhyB aus A. thaliana gezeigt werden (Cantón und Quail, 1999). Die Autoren ermittelten eine Abnahme der phyA-Transkriptakkumulation nach dem Übergang vom Dunkel zu RL. Diese Reduktion des phyA-Transkriptniveaus verschwand jedoch in der phyB ^--Mutante.

Im Gegensatz zu cph1 ließ sich kein klarer Einfluss von Licht auf die cph2-Transkriptakkumulation erkennen (Abb. 9B). Unter den verschiedenen Lichtbedingungen fanden sich teilweise große Schwankungen in der cph2-mRNA-Menge zwischen den einzelnen Versuchen.

Park et al. (2000) fanden die höchste Menge an cph2-Transkriptin heterotroph gewachsenen Kultur und kaum Transkript in einer mixotroph im WL gewachsenen Kultur. Unter photoheterotrophen Bedingungen im RL wurde ebenfalls eine starke Akkumulation des cph2-Transkripts festgestellt. Die für die Untersuchung der Lichtwirkung auf das cph2-Transkript gewählten Bedingungen dieser Autorengruppe sind jedoch kaum mit den hier vorgestellten Belichtungsexperimenten vergleichbar. In dieser Arbeit wurde der kurzzeitige Lichteinfluss unter photoautotrophen Kulturbedingungen auf die cph2-mRNA-Akkumulation untersucht und nicht der langfristige Lichteinfluss bei Synechocystis-Zellen mit Glukose im Anzuchtmedium.

Eine mögliche Autoregulation der cph1- und der cph2-Transkription wurde untersucht, indem die lichtabhängige Änderung der Transkriptmenge in der cph1 ^--Mutante sowie in der cph2 ^--Mutante analysiert wurde. Dabei wurde festgestellt, dass die Inaktivierung der beiden phytochromkodierenden Gene die Menge an cph1- bzw. cph2-mRNA nicht beeinflusste (Daten nicht gezeigt). Somit wird weder die cph1- noch die cph2-Transkription durch das entsprechende Phytochrom selbst reguliert. In Dikotyledonen hingegen ist das Phytochrom PhyA in die FRL-induzierte Abnahme der phyA-mRNA-Akkumulation involviert (Cantón und Quail, 1999).

Neben Cph2 könnten phytochromähnliche Proteine an der Regulation der cph1-Transkriptakkumulation beteiligt sein. Ein GL-Sensor in Synechocystis ist bisher nicht gefunden worden. Ein Gen, welches für das Apoprotein des GL-perzipierenden Rhodopsins kodiert, ist laut Cyanobase-Datenbank nicht vorhanden. Jedoch liegen verstärkt Hinweise auf einen bisher unbekannten potentiellen GL-Rezeptor bei Pflanzen (Folta, 2004) sowie auch bei Synechocystis (Choi et al., 2003) vor. Auch die für diese Arbeit durchgeführten Untersuchungen der lichtinduzierten Motilität deuteten auf das mögliche Vorhandensein eines GL-Sensors in Synechocystis. So behielten Synechocystis-Zellen ihre Fähigkeit zum GL zu laufen, wenn den Phototaxisplatten 10 µM DCMU enthielten (Abb. 20B). Somit kann zumindest die lineare, photosynthetische Elektronentransportkette bei der GL-Wahrnehmung ausgeschlossen werden.

Studien zum Einfluss der Spektralfarbe auf die Motilität zeigten, dass Synechocystis eine positive Phototaxis im gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich aufwies (Choi et al., 1999). Dieses phototaktische Verhalten ließ sich nicht durch Inhibitoren der Photosynthesekette hemmen. Dies deutet daraufhin, dass die Steuerung der lichtabhängigen Motilität unabhängig von der linearen photosynthetischen Elektronentransportkette wahrscheinlich durch mehrere Photorezeptoren erfolgt.

Die lichtinduzierte Motilität von cph1 ^-, cph2 ^- und der Doppelmutante wurde im WL sowie in verschiedenen Spektralbereichen untersucht und mit dem Verhalten des WTs verglichen. Im WL bewegten sich die Phytochrommutanten wie auch der WT in Richtung Lichtquelle. Die gleichen Beobachtungen ließen sich auch für die Motilität im FRL, RL und GL festhalten (Abb. 13A-C). Somit ließ sich keine Funktion von Cph1 und Cph2 bei der Steuerung der Zellbewegung unter diesen Lichtbedingungen nachweisen.

Anders verhielten sich die Synechocystis-Zellen im BL. Hier konnte keine Bewegung des WT induziert werden, während die cph2 ^--Mutante in Richtung BL-Quelle lief (Abb. 13D). Die Inaktivierung des cph1-Gens bewirkte keine Änderung im phototaktischen Verhalten im BL gegenüber dem WT. Die cph1 ^-/cph2 ^--Doppelmutante hingegen wies das gleiche Verhalten wie cph2 ^- auf, d. h. die Mutantenzellen wanderten zum BL. Somit deutet die Analyse der BL-abhängigen Motilität auf eine Funktion des Photosensors Cph2 bei der Inhibierung der Bewegung von Synechocystis. Dieses Resultat ist insofern ungewöhnlich, da Cph2 ein echtes Phytochrom darstellt, d. h. eine RL/FRL-Photokonversion zeigt und daher wie ein pflanzliches Phytochrom als RL/FRL-Photorezeptor angesehen werden kann. Eine Erklärung des beobachteten Phänotyps von cph2 ^- im BL könnte aus der für Phytochrome ungewöhnlichen Domänenarchitektur von Cph2 hervorgehen. Dieser Lichtrezeptor enthält neben der N-terminalen Chromophorbindungsstelle eine zweite am C-Terminus (Wu und Lagarias, 2000). Diese besitzt nicht die für echte Phytochrome charakteristische Fähigkeit zur Photokonversion, entspricht also eher dem Domänentyp von phytochromähnlichen Proteinen. Stattdessen ist die Absorption dieser Bindungsdomäne mit PCB als Chromophor im blauen Wellenlängenbereich gegenüber der Absorption im roten Wellenlängenbereich deutlich verstärkt (Abb. 30A). Daraus lässt sich eine mögliche Rolle von Cph2 als BL-Rezeptor ableiten.

Die Funktion eines phytochromähnlichen Proteins als potentieller BL-Sensor konnte bereits für PlpA aus Synechocystis nachgewiesen werden (Wilde et al., 1997). Hierbei zeigte eine Mutante mit einem inaktivierten plpA-Gen unter photoautotrophen Bedingungen im BL ein verzögertes Wachstum. Bei Cph2 beschränkte sich die Wirkung des BL auf die Phototaxis. Es konnten keine Wachstumsunterschiede zwischen WT und cph2 ^- im BL unter photoautotrophen Bedingungen festgestellt werden (Daten nicht präsentiert).

Insgesamt konnte für das Phytochrom Cph1 keine Funktion in der lichtinduzierten Motilität nachgewiesen werden. Das Cph2-Protein hingegen besitzt eine Rolle bei der Inhibition der Zellbewegung im BL. Auf Agarplatten angezogene Synechocystis-Zellen zeigen oftmals eine vom Licht unabhängige Bewegung. In Phototaxisexperimenten im BL konnte eine solche Bewegung beim WT und der cph1 ^--Mutante nicht beobachtet werden. Daher ist zu vermuten, dass nicht nur die Phototaxis sondern die Motilität generell inhibiert ist.

In Phototaxisexperimenten mit einer bidirektionalen Einstrahlung von BL und einer weiteren Lichtfarbe (GL, RL und FRL) ließ sich die Motilität des WTs und der cph1 ^--Mutante induzieren. Dies hing jedoch vom Verhältnis von BL und der zweiten Lichtfarbe an der jeweiligen Position auf der Agarplatte ab, auf der die Zellen aufgetragen wurden. Sinkt der BL-Anteil, gewinnt der WT und cph1 ^- die Fähigkeit zur lichtgerichteten Zellbewegung zurück. Hierbei spielte es keine Rolle, ob die zweite Lichtfarbe GL, RL oder FRL war (Abb. 14A-C). Zeigten der WT und die cph1 ^--Mutante an den BL-fernen Positionen Motilität, wanderten die Zellen stets in Richtung GL, RL oder FRL. Anhand der photokinetischen Reaktion der Zellen lässt sich die beobachtete Bewegung eher einer positiven Phototaxis zur GL-, RL- bzw. FRL-Quelle zuordnen als einer Fortbewegung von der BL-Quelle (negative Phototaxis): Die Zellen an der Position mit der höchsten Intensität an GL, RL oder FRL zeigten eine höhere Laufgeschwindigkeit als die an Positionen mit einer geringeren Lichtintensität (Abb. 14A-C).

Die im BL motile cph2 ^-- sowie die Doppelmutante zeigten bei der bidirektionalen Einstrahlung von BL und einer weiteren Lichtfarbe eine unterschiedliche Bevorzugung der Bewegungsrichtung, die davon abhängig war, ob diese weitere Lichtfarbe GL, RL oder FRL war. In einem BL-GL- und einem BL-FRL-Feld wanderten cph2 ^- und cph1 ^- /cph2 ^- zu der Lichtquelle, die den Zellen am nächsten war (Abb. 14A und C). In einem BL-RL-Feld hingegen bewegten sich die beiden Mutanten auf allen Positionen in Richtung RL-Quelle (Abb. 14B). Wurde jedoch bei einer bidirektionalen Einstrahlung von BL und RL die Intensität des RL durch eine zusätzlich angebrachte Graufolie stark reduziert, konnte Motilität bei den Zellen von cph2 ^- und cph1 ^- /cph2 ^- induziert werden, die sich dicht an der BL-Quelle befanden (Daten nicht gezeigt). Somit zeigte die cph2 ^-- und die Doppelmutante eine Bevorzugung von Spektralfarben in Hinblick auf die Laufrichtung mit folgender Reihenfolge: RL, FRL und GL. Bei der Festlegung der Reihenfolge von FRL und GL wurde berücksichtigt, dass die eingestrahlte FRL-Intensität geringer war als die des GL.

Der in dieser Arbeit verwendete WT-Stamm zeigte im BL keine Motilität. Diese Eigenschaft unterscheidet sich von den Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen. So berichtete Choi et al. (1999) von einer postiven Phototaxis bei 460 nm, wobei allerdings die Geschwindigkeit der Zellen gegenüber anderen Wellenlängen herabgesetzt war. Auch der WT-Stamm aus der Arbeit von Ng et al. (2003) bewegte sich im BL-Feld, wobei die Bewegungsrichtung von der Intensität des eingestrahlten BL abhing. Bei einem anderen Cyanobakterium, dem thermophilen Synechococcus elongatus, konnte auch bei erhöhten Lichtintensitäten keine Phototaxis im Spektralbereich zwischen 350 und 470 nm induziert werden (Kondou et al., 2001). Synechococcus elongatus und die für diese Arbeit genutzte WT-Variante ähneln sich somit hinsichtlich ihrer im BL inhibierten Motilität, wobei jedoch noch keine Daten über das phototaktische Verhalten des hier analysierten WTs bei sehr hohen BL-Intensitäten vorliegen. Von sicherlich vorhandenen Unterschieden im experimentellen Ansatz abgesehen, deutet das variable Verhalten der verschiedenen WT-Stämme von Synechocystis darauf hin, dass es im Verlaufe der langen Kultivierung dieses Cyanobakteriums in diversen Laboratorien zu Änderungen im Genotyp gekommen sein kann.

Das phototaktische Verhalten der in diesem Labor vorhandenen Sammlung an WT-Varianten von Synechocystis sp. PCC 6803 wurde im BL sowie unter anderen Lichtbedingungen untersucht. Im Ergebnis dessen zeigte sich, dass einige Stamm-Varianten die Fähigkeit zur Motilität im WL verloren hatten. Weiterhin stellte sich heraus, dass von den motilen Stämmen nur der WT aus unserem Labor nicht die Fähigkeit zur lichtgerichteten Bewegung im BL besaß (Nr. 6 in Abb. 25A). Da die Inaktivierung des cph2-Gens in diesem WT die Phototaxis zum BL induzierte, wurde das Vorhandensein von cph2 in den verschiedenen WT-Varianten über RFLP-Analyse geprüft. In allen WT-Varianten konnte ein Signal für cph2 im richtigen Größenbereich registriert werden (Abb. 25B). Jedoch können über die RFLP-Analyse nur umfangreichere Änderungen im Genom erfasst werden. Punktmutationen, die zu einem Ausfall eines funktionstüchtigen Cph2-Proteins führen würden, können mit dieser Methode nur dann registriert werden, wenn sie die Erkennungsstelle des verwendeten Restriktionsenzyms modifiziert haben. Das cph2-Gen wurde im Chromosom der WT-Variante sequenziert, die für die Inaktivierung von Cph1 und Cph2 verwendet wurde. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Gensequenz der in der Cyanobase-Datenbank veröffentlichten Sequenz entsprach (Daten nicht gezeigt). Da kein Antikörper gegen das Cph2-Protein vorhanden war, war es nicht möglich, die Produktion des Proteins in den einzelnen Synechocystis-Stämmen zu testen. Weiterhin ist nicht völlig auszuschließen, dass in den im BL motilen Stämmen die von Cph2 ausgehende Signalkette aufgrund einer Mutation unterbrochen ist. Da diese Signalkette bis zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht aufgeklärt wurde, konnten entsprechende Untersuchungen nicht durchgeführt werden.

Es besteht die Möglichkeit, dass einer der ORFs, die für potentielle BL-Rezeptoren in Syne cho cystis kodieren, in unserem WT defekt ist. Um dies auszuschließen, wurden das cry-, lov- und das bluf-Gen in den im BL motilen WT-Stämmen Nr. 2 und 4 inaktiviert. Da die entsprechenden Mutanten ihre Fähigkeit zur Motilität im BL behielten (Tab. 16), lässt sich ein inaktives Cry-, LOV- oder BLUF-Protein als Ursache für die fehlende Motilität in WT-Nr. 6, dem in unserer Arbeitsgruppe am intensivsten untersuchten WT, ausschließen.

Bei der Entstehung von Mutationen spielen neben externen Faktoren sogenannte IS-Elemente eine große Rolle, die über enzymatische Transpositionsereignisse an einen beliebigen Ort im Genom integriert werden können. Im Synechocystis-Genom sind eine große Anzahl dieser IS-Elemente vorhanden, die in Abhängigkeit von ihrer Sequenz in verschiedene Gruppen eingeteilt werden (Ikeuchi und Tabata, 2001). Für den vollständig sequenzierten Kazusa-Stamm konnten im Vergleich zu anderen WT-Varianten bereits drei zusätzlich vorhandene IS-Elemente ermittelt werden, die alle der ISY203-Gruppe zuzurechnen sind (Okamoto et al., 1999). Eines dieser IS-Elemente befindet sich im ORF sll1473, der für ein phytochromähnliches Protein kodiert. Die Verteilung der IS-Elemente im Genom des WTs unserer Arbeitsgruppe wurde über eine RFLP-Analyse untersucht und mit dem Bandenmuster anderer WT-Stämme verglichen. Die meisten Unterschiede wurden hierbei zwischen dem sequenzierten Kazusa-Stamm und den übrigen Stämmen gefunden. Aber auch die im BL nichtmotile WT-Variante wies mindestens eine Änderung im Genom auf (Spur Nr. 6 in Abb. 26 und Abb. 27). Hier wurde ein Teil des pSYSG-Plasmids in den Genombereich eingebaut, in dem sich die IS-Elemente des ISY100-Typs sll1257/sll1256 befinden (Abb. 28). Die Sequenzanalyse ergab, dass sich die pSYSG-DNA unmittelbar nach dem ORF sll1257 anschließt. Sucht man sich den Bereich auf dem pSYSG-Plasmid, der die höchste Ähnlichkeit seiner Sequenz mit der Sequenz der in das Chromosom inserierten DNA hat, findet man in direkter Umgebung ebenfalls ein IS-Element des ISY100-Typs. Somit könnte die DNA über homologe Rekombination in das Chromosom eingebaut worden sein.

In welchem Ausmaß der Einbau der Plasmid-DNA zu Fehlern in der Sequenz in dieser Genomregion führte und ob in Folge dieser Insertion das beobachtete Verhalten unseres WTs im BL auftrat, konnte noch nicht ermittelt werden. Die RFLP-Analyse des Gens slr1336 zeigte (Abb. 27C), dass der Einbau wahrscheinlich zwischen diesem Gen und sll1257 erfolgte (Abb. 28). Das Autoradiogramm in Abb. 27C belegt zwar, dass slr1336 im Chromosom der WT-Variante Nr. 6 vorhanden ist, nicht aber, ob das Gen in seiner gesamten Länge im Genom vorhanden ist. Das Gen slr1336 kodiert für einen Ca²⁺/H⁺-Antiporter. Moon et al. (2004) beschrieben den Einfluss von Kalzium in der Motilität. Wurde slr1336 durch den Einbau der Plasmid-DNA inaktiviert, könnte dies eine mögliche Ursache für die fehlende Motilität der WT-Variante Nr. 6 im BL sein. Der Nachweis, dass die Integration der pSYSG-DNA in die Genomregion, in der sich die IS-Elemente sll1256 und sll1257 sowie slr1336 befinden, der Grund für das beobachtete Verhalten unserer WT-Variante im BL ist, erfordert jedoch weitere Untersuchungen. Dies beinhaltet eine Sequenzanalyse der Insertionsregion im Genom sowie eine Inaktivierungsanalyse der betroffenen Gene in einer anderen Variante von Synechocystis sp. PCC 6803, die eine BL-induzierte Zellbewegung zeigte.

Neben der beschriebenen Insertion einer Plasmid-DNA in das Genom der WT-Variante Nr. 6 können weitere, noch nicht identifizierte Veränderungen im Chromosom dieses WTs entstanden sein, die die tatsächliche Ursache für die fehlende Photobewegung unserer WT-Variante im BL ist. Derzeit wird versucht, diesen Ort über Komplementation mit einer Cosmidbank zu lokalisieren, die mit der genomischen DNA des Kazusa-Stamms angefertigt wurde (Shibata et al., 2001). Mit der Cosmidbank, die uns von T. Ogawa zur Verfügung gestellt wurde und ein auf Tn7-basierendes Transposon mit einer Cm-Resistenzgen-Kassette enthält, wurden Zufallsmutanten in der WT-Variante unserer Arbeitsgruppe erzeugt. Derzeit werden die erzielten Klone auf ihr phototaktisches Verhalten im BL untersucht. Hierbei werden die Klone selektiert, welche sich - wie die cph2 ^--Mutante bzw. die anderen Stamm-Varianten von Synechocystis - in Richtung BL bewegen. Bei der anschließenden Analyse des Insertionsorts des Transposons ist sowohl der durch das Transposon unterbrochene ORF von Interesse - als mögliche Komponente der vom Cph2-Protein ausgehenden Signalkette - als auch die übrigen auf dem Cosmid befindlichen Gene, die einen defekten ORF auf dem Genom des für diese Arbeit verwendeten WTs komplementiert haben könnten. Eine genauere Zuordnung der Funktion ist nur über weitere Mutagenisierungen der entsprechenden ORFs in diesem WT möglich.

Die beiden Phytochrome Cph1 und Cph2 beeinflussen das Wachstum unter bestimmten Lichtbedingungen. Die Inaktivierung des cph1-Gens wirkte sich negativ auf das Wachstum der Mutante im FRL aus, die Inaktivierung des cph2-Gens hingegen auf das Wachstum im RL. Beide Mutanten wuchsen im HL schlechter. Desweiteren ließ sich dem Cph2-Photorezeptor eine Funktion bei der Inhibierung der Motilität in Richtung BL zuordnen, da die WT-Zellen unter den in dieser Arbeit verwendeten BL-Bedingungen nicht motil waren, während die cph2 ^--Mutanten eine postive Phototaxis zeigten. Diese Beobachtung konnte nicht auf eine Interaktion des RL/FRL-Sensors Cph2 mit einem bekannten BL-Photorezeptor in Synechocystis zurückgeführt werden, da eine Inaktivierung der BL-Sensoren (Cry, LOV, BLUF) keine Änderung im phototaktischen Verhalten im BL gegenüber dem WT bewirkte. Vielmehr waren die Daten aus der Aufnahme eines Aktionsspektrums der BL-gesteuerten Motilität mit den Absorptionseigenschaften der mit PCB assemblierten C-terminalen GAF-Domäne des Cph2-Proteins vergleichbar. Insgesamt deuten die beschriebenen Resultate auf eine mögliche duale Funktion des Photorezeptors Cph2 sowohl als BL- als auch als RL-Sensor hin. Ein weiterer Photorezeptor mit einer potentiell dualen Funktion als RL/FRL- sowie BL-Sensor ist Phy3 aus dem Farn Adiantum capillus-veneris (Nozue et al., 1998). Ob die RL- und BL-Sensorfunktion des Cph2-Photorezeptors tatsächlich auf das Vorhandensein von zwei chromophorbindenden GAF-Domänen mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften zurückzuführen ist, soll in Zukunft geklärt werden. Dafür wird das inaktivierte cph2-Gen mit Konstrukten komplementiert, bei denen - wie bei den in dieser Arbeit beschriebenen pVZ321-Konstrukten - jeweils eines der chromophorbindenden Cysteine durch eine andere AS ausgetauscht wird. Diese Varianten des cph2-Konstrukts werden in das Chromosom integriert. Dadurch werden stabilere Phänotypen bei der Untersuchung der BL-gesteuerten Motilität erwartet. Weiterhin soll mit diesen Mutanten das Wachstum im RL analysiert werden.

In Zukunft werden die spektralen Eigenschaften eines in Synechocystis überexprimierten Cph2-Proteins analysiert und mit den Eigenschaften von rekombinant in E. coli exprimierten Cph2-Holoproteinen verglichen. Dadurch soll die Natur des Chromophors (oder der Chromophoren) des nativen Cph2-Proteins charakterisiert werden. Wie bereits erwähnt, konnte kürzlich eine c-diGMP-Zyklase-Aktivität der GGDEF-Domäne des Response-Regulators PleD gezeigt werden (Paul et al., 2004). Tischler und Camilli (2004) demonstrierten für Inaktivierungsmutanten des Response-Regulators VieA in Vibrio cholerae, dass dieses Protein den c-diGMP-Spiegel in der Zelle vermindern kann. Aus diesen Daten schlussfolgerten die Autoren, dass die in diesem Response-Regulator vorhandene EAL-Domäne c-diGMP-Phosphodiesterase-Aktivität besitzt. Da das Cph2-Protein diese beiden Domänentypen enthält, liegt die Vermutung nahe, dass Cph2 die BL-gesteuerte Motilität und das Wachstum im RL über eine Modifikation des c-diGMP-Spiegels reguliert. Daher soll der Einfluss von Cph2 auf die c-diGMP-Menge unter verschiedenen Lichtbedingungen, insbesondere BL, RL und FRL, untersucht werden.