Dissertation

Wechselwirkungen der intestinalen Mikroflora und des angeborenen Immunsystems
bei entzündlichen Erkrankungen im Gastrointestinaltrakt

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

Von

Diplom-Biologe
André Fischer

geboren am 23.07.1970 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Christian Limberg

Gutachter:
1. Prof. Dr. Hannelore Hoch
2. Prof. Dr. Dr. Ulf B. Göbel
3. Prof. Dr. Michael Blaut

eingereicht:07.03.2007

Datum der Promotion:06.07.2007

Zusammenfassung

Die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulzerosa sind wiederkehrende, nicht heilbare, immunvermittelte Krankheiten unklarer Ursache. Genetische Prädisposition und Umweltfaktoren können die Barrierefunktion der Darmmukosa stören, so dass eine überschiessende Entzündungsreaktion folgt, die durch kommensale Bakterien der normalen Darmflora verstärkt wird. Die Infektion mit H. pylori im Magen kann zu Gastritis, Ulkuskrankheit und der Entstehung von MALT-Lymphomen und Magenkarzinomen führen. An der Erkennung von bakteriellen Bestandteilen im Gastrointestinaltrakt sind Toll-like-Rezeptoren (TLR), als Komponenten des angeborenen Immunsystems maßgeblich beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Bakterienflora bei Ileitis, Colitis und bei Vorliegen einer H. pylori-Infektion im Mausmodell untersucht. Durch eine globale Florenanalyse mit klassischen mikrobiologischen und molekularbiologischen Techniken konnte gezeigt werden, dass die Konzentrationen an Gram-negativen Stäbchenbakterien während der Entzündung in Ileum und Colon anstiegen. Die bakteriellen Faktoren, die eine Ileitis induzierten, wurden durch den Einsatz von gnotobiotischen TLR-defizienten Mäusen mit definierter bakterieller Rekolonisierung ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass eine Ileitis durch das LPS von akkumulierenden E. coli über die TLR4-vermittelte Signaltransduktion verstärkt wurde. Die Entzündungsreaktionen konnten durch Behandlung mit Antibiotika oder dem LPS-Antagonisten Polymyxin B gebessert werden. In Folge einer H. pylori-Infektion kam es im Mausmagen zu einer erhöhten Diversität der Bakterienflora durch die Besiedelung mit Bakterienarten, die normalerweise das Colon kolonisieren. Eine derartige Florenverschiebung konnte durch eine Vakzinierung gegen H. pylori verhindert werden. Da durch den Erhalt der kommensalen Laktobazillen-Flora im Magen der Maus potentiell nitrosaminbildende Bakterien nicht wachsen konnten, hat sich die Immunisierung gegen H. pylori im präklinischen Tiermodell als sinnvoll erwiesen. Die Tiermodelle zur T. gondii-induzierten Ileitis und DSS-Colitis erlauben eine reproduzierbare Analyse entzündungsrelevanter Komponenten und damit die Möglichkeit, therapeutische Ansatzpunkte, wie z.B. den Einsatz von Lipopolysaccharid-Inhibitoren, die Blockade von TLR4 oder dem LPS-Bindeprotein oder den Einsatz von Probiotika, unter definierten Bedingungen zu analysieren.

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1  Chronisch–entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen
  • 1.2 Die Rolle der Darmflora bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen
  • 1.3 Tiermodelle für Darmentzündung (Ileitis und Colitis)
  • 1.4 Auswirkungen einer H. pylori-Infektion auf die Magenflora und Vakzinierungsmodelle gegen H. pylori bei Tier und Mensch
  • 1.5 Molekulargenetische Analyse der mikrobiellen Diversität in komplexen Habitaten
  • 1.6 Fragestellungen
• 2  Material und Methoden
  • 2.1  Material
    • 2.1.1  Chemikalien und Reagenzien
    • 2.1.2 Geräte, kommerzielle „Kits“ und andere Materialien
    • 2.1.3 Puffer und Lösungen
    • 2.1.4 Oligonukleotidprimer und –sonden
    • 2.1.5  DNA-Längenmarker, Enzyme, Plasmide, Zellen
    • 2.1.6 Mausstämme
    • 2.1.7  Nährmedien und biochemische Leistungsprüfung
  • 2.2 Versuchstiere
    • 2.2.1  Mausstämme und Genotypisierungen
    • 2.2.2 Haltungsbedingungen
  • 2.3  Tierversuche
    • 2.3.1  Induktion einer Ileitis durch orale T. gondii-Infektion
    • 2.3.2 Induktion der Colitis mit DSS
    • 2.3.3  Salmonella enterica als orale Lebendvakzine gegen H. pylori
    • 2.3.4 Übersicht zum Ablauf der Probennahme bei Ileitis und Colitis
    • 2.3.5 Beurteilung von Histopathologie in Ileum und Colon
    • 2.3.6 Beurteilung der Parasitenlast
    • 2.3.7 Kulturelle Analyse der Bakterienflora
    • 2.3.8 Antibiotische Behandlung der Ileitis
    • 2.3.9 Herstellung gnotobiotischer Mäuse, definierte Rekolonisierung und Gabe von E. coli Lipid A
    • 2.3.10 Statistik
  • 2.4  DNA-Isolierung und Polymerasekettenreaktion
    • 2.4.1  Isolierung von DNA
    • 2.4.2 Amplifikation der bakteriellen 16S rRNA-Gene
    • 2.4.3 Klonierung der amplizierten 16S rRNA
    • 2.4.4 Isolierung der bakteriellen Plasmid-DNA
    • 2.4.5 Reinigung und Überprüfung der PCR-Produkte
  • 2.5 Denaturierende Gradienten-Gel-Elektrophorese
    • 2.5.1  Herstellung der Gele für die DGGE
    • 2.5.2 Färbung von DNA
    • 2.5.3 DGGE-Bandenisolierung und direkte Sequenzierung
  • 2.6  DNA Sequenzierung
    • 2.6.1  Identifizierung von Bakterienisolaten
    • 2.6.2 Sequenzanalyse von 16S rRNA-Genbibliotheken
    • 2.6.3 Phylogenetische Einordnung der bakteriellen 16S rRNA-Sequenzen
  • 2.7 Identifikation von 16S rRNA-Genen in Klonbibliotheken durch Hybridisierung
  • 2.8 Quantitative Echtzeit-PCR der Lactobacillus-16S rRNA
  • 2.9  Typisierung von E. coli
    • 2.9.1  Typisierung von Bakterienisolaten mittels RAPD-PCR
    • 2.9.2 Pathotypisierung
  • 2.10 Analysen der RNA-Expression durch Hybridisierung von Microarrays
  • 2.11 Konzentrationsmessung von Immunmediatoren
• 3  Ergebnisse
  • 3.1  Analyse der Darmflora bei T. gondii-induzierter Ileitis
    • 3.1.1  Analyse der kultivierbaren planktonischen Ileumflora
    • 3.1.2 Histopathologie und Populationsdynamik der Ileitis
    • 3.1.3 Molekulargenetische Analyse der Darmflora
      • 3.1.3.1  PCR-DGGE
      • 3.1.3.2 16S rRNA Klonbibliotheken
      • 3.1.3.3 Typisierung von E. coli
        • 3.1.3.3.1  RAPD-PCR
        • 3.1.3.3.2 Pathotypisierung
    • 3.1.4  Behandlung der Ileitis mit Antibiotika
      • 3.1.4.1  Prophylaktische Behandlung mit Ciprofloxacin / Metronidazol
      • 3.1.4.2 Behandlung einer bestehenden Ileitis mit Ciprofloxacin/Metronidazol
    • 3.1.5 Gnotobiotische C57BL/6-Tiere und definierte Rekolonisierung
  • 3.2  Einfluss von TLR-Defizienz auf die Darmflora bei T. gondii-induzierter Ileitis
    • 3.2.1  Analyse der kultivierbaren Darmflora TLR-defizienter Tiere
    • 3.2.2 PCR-DGGE der Darmflora TLR-defizienter Tiere
    • 3.2.3 Überleben, Histopathologie und Immunantwort bei TLR-defizienten Tieren
    • 3.2.4  Einfluss von definierter Rekolonisierung und TLR-Liganden bei gnotobiotischen TLR4-defizienten Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis
      • 3.2.4.1  E. coli Monokolonisierung von TLR-defizienten gnotobiotischen Tieren  mit T. gondii-Ileitis
      • 3.2.4.2 Gabe von E. coli Lipid A bei TLR4-defizienten Tieren mit T. gondii-Ileitis
    • 3.2.5 Behandlung von T. gondii-infizierten C57BL/6 Tieren mit Polymyxin B
    • 3.2.6 RNA-Expressionsanalyse bei TLR-defizienten Tieren mit T. gondii-Ileitis
  • 3.3  DSS-Colitis bei TLR-defizienten Tieren
    • 3.3.1  Analyse der kultivierbaren Colonflora bei TLR-defizienten Tieren
    • 3.3.2 Schweregrad der DSS-Colitis bei TLR-defizienten Tieren
    • 3.3.3 Molekulare Charakterisierung der Colonflora in TLR-defizienten Mäusen mit DSS-Colitis
    • 3.3.4  Entwicklung einer komplexen Colonflora bei TLR-defizienten Tieren
  • 3.4  Veränderungen der Mausmagenflora bei H. pylori-Infektion
    • 3.4.1  Analyse der bakteriellen Diversität im Mausmagen bei H. pylori-Infektion
    • 3.4.2 Einfluss einer Salmonella-Lebendvakzine auf die H. pylori-induzierten Änderungen der Magenflora
• 4 Diskussion
  • 4.1  Die T. gondii-induzierte Ileitis als Darmentzündungsmodell
    • 4.1.1  Eigenschaften und Vorzüge des Modells
    • 4.1.2 Der Einfluss von Bakterien im T. gondii-induzierten Ileitis-Modell
  • 4.2 Die spezielle Bedeutung von Toll-Like Rezeptoren bei beiden Darmentzündungsmodellen
  • 4.3  Die DSS-Colitis als Darmentzündungsmodell
  • 4.4  Der Einfluss einer Salmonella-Lebendvakzine auf H. pylori-induzierte Änderungen der Mausmagenflora
• Literaturverzeichnis
• Anhang
• Abkürzungsverzeichnis
• Publikationsliste
• Danksagung

Tabellen

• Tab. 1: Verwendete Chemikalien und Herstellerangaben
• Tab. 2: Verwendete Geräte und Materialien
• Tab. 3: Verwendete kommerzielle „Kits“
• Tab. 4: Verwendete Puffer und chemische Lösungen
• Tab. 5: M13-Primer, RAPD-PCR Primer und DIG-markierte Sonden
• Tab. 6: 16S rRNA PCR-Primer
• Tab. 7: Verwendete DNA Längenmarker, Enzyme, Plasmide, Zellen
• Tab. 8: Verwendete Versuchstiere mit Bezeichnung
• Tab. 9: Verwendete Fest- und Flüssigmedien zur Bakterienkultivierung
• Tab. 10: Methoden für die Extraktion von DNA aus verschiedenen Probenmaterialien
• Tab. 11: 16S rRNA PCR-DGGE Reaktionsbedingungen (T3 Thermocycler)
• Tab. 12: Durchführung der Dot-Blot-Hybridisierung
• Tab. 13: Bakterienkonzentrationen (log KBE/g Ileuminhalt) nach Antibiotikabehandlung (Daten in Kooperation mit David Fuchs, medizinische Dissertationsschrift)
• Tab. 14: Expression bei Ileitis (Tag acht p.i.) versus Tag null bei Wildtyp BL10, TLR2 ^-/- und TLR4 ^-/-. Hochregulierte RNA-Expression (Signal log-Verhältnis >3) und funktionelle Zuordnung (Auswahl; Gesamttabelle A, siehe Anhang).
• Tab. 15: Expression bei Ileitis (Tag acht p.i.) versus Tag null bei Wildtyp BL10, TLR2 ^-/- und TLR4 ^-/-. Herunterregulierte RNA-Expression (Signal log Verhältnis < minus 3) und funktionelle Zuordnung (Auswahl; Gesamttabelle B, siehe Anhang).
• Tab. 16: TLR4-abhängige Expression bei Ileitis (Tag acht p.i.) versus Tag null. Regulierte RNA-Expression; Signal log Verhältnis als Anstieg >1,5 (I=Increase) oder Abstieg < minus 3 (D=Decrease) und funktionelle Zuordnung (Auswahl; Gesamttabelle C, siehe Anhang).
• Tab. 17: Molekulare Identifikation von Bakterienspezies im Mausmagen.

Bilder

• Abb. 1: Morbus Crohn und Colitis ulzerosa. Lokalisationen von Entzündungsprozessen im Gastrointestinaltrakt. M. Crohn kann sich im gesamten Verdauungstrakt manifestieren, die Colitis ulzerosa ist zu 95% auf das Colon beschränkt (Quelle: Kompetenznetz Darmerkrankungen; www.kompetenznetz-ced.de).
• Abb. 2: Immunregulatorische Zellen und Prozesse im Darm. Das darmassoziierte lymphoide Gewebe (engl.: gut-associated lymphoid tissue, GALT) enthält spezialisierte M-Zellen, die kontinuierlich bakterielle Antigene vom Lumen ins lymphoide Gewebe aufnehmen. Dendritische Zellen (DC) in der Lamina propria (LP) können zwischen den Epithelzellen ebenfalls Bakterien aus dem Darmlumen aufnehmen. Das Epithel ist angefüllt mit CD8⁺ T-Zellen (Intraepitheliale Lymphozyten, IEL), die Lamina propria enthält CD4⁺ T-Zellen, Makrophagen und IgA-Antikörper-produzierende Plasmazellen. T-Zell-initiierte Gewebeschädigungen können durch immunsuppressive Zytokine (IL-10 und TGF-beta) und regulatorische T-Zellen (Treg) inhibiert werden. (nach MacDonald & Monteleone 2005).
• Abb. 3: Signalweiterleitung durch TLRs in der Mukosa. Kommensale Darmbakterien haben i.d.R. einen schützenden Effekt oder werden vom Immunsystem toleriert. Bei Störungen der intestinalen Barriere können Antigene aus kommensalen und/oder pathogenen Bakterien entzündliche Immunantworten auslösen (entnommen aus Strober 2004)
• Abb. 4: Membranständige und intrazelluläre TLR- und CARD15/NOD2-Signalweiterleitung von intestinalen Epithelzellen mit Liganden und Signalwegen. (A) Die TLR-4 und MD-2 Expression ist in intestinalen Epithelzellen niedriger als in Immunzellen. Eine Intrazelluläre Erkennung von LPS via TLR-4, assoziiert mit dem Golgi-Apparat, wurde beschrieben. TLR-2 wird möglicherweise an der Oberfläche nur schwach exprimiert und beeinflußt inhibitorische Moleküle (Tollip, SIGIRR). TLR-5 kann basolateral und apikal exprimiert werden. NOD2 und TLR-9 sind intrazelluläre Rezeptoren. (B) Modell für TLR-2 und CARD15/NOD2 Interaktionen in der Lamina propria. M. Crohn assoziierte Mutationen in CARD15/NOD2 (in Abb.4B; Blitzzeichen bei LRR) resultieren in verminderter NF-kappaB Aktivierung durch Muramyldipeptid (MDP) und verminderter IL-10 Freisetzung als Antwort auf eine TLR-2 Signalweiterleitung (entnommen aus Abreu et al. 2005).
• Abb. 5: Versuchsvorbereitung, Probennahme und Auswertung bei der T. gondii-induzierten Ileitis und DSS-Colitis (Modifiziert nach Julia Niebergall, medizinische Dissertationsschrift).
• Abb. 6: Kontrollhybridisierungen mit der für Lactobacillus gasseri/johnsonii-spezifischen (DIG)-markierten Sonde Lac-141 (Tab.5). Die Spezifität wurde durch Hybridisierung von 16S rRNA aus Referenzstämmen nachgewiesen (L. gasseri, L. johnsonii und andere Lactobacillus Arten, s. o.). Die Sonde hybridisierte nicht mit der 16S rRNA anderer Lactobacillus-Arten (5-7, Klonsequenzen identifiziert als L. delbrückii, L. reuteri, L. murinus) oder anderer nicht-Lactobacillus Arten (9-16, DSMZ Referenzstämme).
• Abb. 7: Quantifizierung kultivierbarer Bakterien im gesunden und entzündeten Ileum. Die Bakterienanzahlen (log KBE/g Ileuminhalt) von gesunden (weisse Balken) und von Tieren mit Ileitis am Tag acht nach T. gondii-Infektion (schwarze Balken) wurden durch Kultivierung ermittelt. E. coli, Milchsäurebakterien (LAB, hauptsächlich Lactobacilli), Bacteroides/Prevotella spp. und Eubacterium/Clostridum spp. wurden mit biochemischer Leistungsprüfung identifiziert. Mittelwerte und Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten (*p<0,05 im Vergleich zu Bakterien in gesunden Mäusen).
• Abb. 8: Kinetik der Histopathologie des terminalen Ileums nach T. gondii-Infektion. Das Ileum (n=4) wurde an den Tagen null, drei, fünf, sechs, sieben und acht nach Infektion mit 100 Zysten des T. gondii-Stamms ME49 analysiert
• Abb. 9 (A/B): Histopathologie der T. gondii-induzierten Ileitis und Populationsdynamik der Darmbakterien im Verlauf der Entzündungsreaktion. Dargestellt sind HE-gefärbte Schnitte von Ilea gesunder und T. gondii-infizierter Mäuse mit schweren Nekrose im Ileum am Tag acht p.i. (B) Darstellung des DGGE-basierten „Monitoring“ der Populationsdynamik der Darmflora im terminalen Ileum im Verlauf der Entzündung. Die genetischen Fingerabdrücke aus Gesamt-DNA vom Darminhalt nach Amplifikation von 16S rRNA-Genen (n=3) für Tag drei, fünf, sechs und acht nach T. gondii-Infektion mit den korrespondierende Histopathologie-Punktwerte (unten angezeigt). Die schwarzen und grauen Pfeile markieren Spezies, die während der Entzündung verschwinden bzw. erscheinen. Die zugrundeliegenden Daten stammen aus mindestens drei Mäusen/Gruppe/Experiment. Die Reproduktion erfolgte in zwei unabhängigen Experimenten.
• Abb. 10: Identifikation von Darmbakterien im gesunden und entzündeten Ileum nach PCR-DGGE und 16S rRNA Sequenzanalyse ausgeschnittener Banden. Dargestellt sind die genetischen Fingerabdrücke zur Darstellung der ilealen Darmflora bei C57BL/6 Mäusen nach Amplifikation von 16S rRNA Genen. Die aufgetrennten Amplifikate wurden aus dem DGGE-Gel isoliert und sequenziert. Die taxonomische Zuordnung von 16S rRNA-Genen zu bakteriellen Taxa ist angezeigt. Schwarze bzw. graue Pfeile zeigen Spezies an, die während der Ileitis verschwinden bzw. erscheinen. Offene Pfeile markieren Bakteriengruppen, die sich bei Entzündung nicht verändern. Die Daten sind repräsentativ für mindestens drei Mäuse pro Gruppe aus drei unabhängigen Experimenten.
• Abb. 11: Analyse der 16S rRNA-Gene in Klonbibliotheken aus bakterieller DNA vom Darminhalt gesunder C57BL/6 Mäuse mit relativer Verteilung am Gesamt-DNA-„Pool“. Die bakteriellen Taxa sind auf der Y-Achse, die korrespondierenden prozentualen Anteile auf der X-Achse dargestellt. Die Analyse wurde für 121 Klonsequenzen aus drei gesunden Tieren (je 30, 46 und 45 Klone/Tier) und für 35 Klonsequenzen aus zwei Ileitis-kranken Tieren (je 20 bzw. 15 Klone/Tier; in Abb. nicht gezeigt) durchgeführt. Für die taxonomische Einordnung wurden die Programme BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) und das „SeqMatch“-Modul des „Ribosomal Database Project II“ (http://rdp.cme.msu.edu) verwendet.
• Abb. 12: RAPD-PCR Genotypisierung von DNA aus E. coli -Isolaten. Dargestellt sind die RAPD-Bandenmuster von Isolaten aus dem Ileum bei T. gondii-induzierter Ileitis (Nummer 1-10) und aus dem Ileum gesunder Tiere (Nummer 11-14). Dargestellt sind je zwei repräsentative Isolate pro Tier. Die Gesamtzahl der Isolate betrug: 140 Isolate aus 5 Tieren mit Ileitis bzw. 60 Isolate aus 3 Tieren. ohne Ileitis. Die Spuren 15 bzw. 16 zeigen die Leerkontrolle ohne DNA in der PCR bzw. einen DNA-Grössenmarker.
• Abb. 13: Pathotypisierung von E. coli-Isolaten. E. coli-Isolate aus dem Ileum naiver Wildtyp C57BL/10, BL6 und TLR4-defizienten Tieren und infizierter BL10/BL6 und TLR2-defizienten Mäusen. Die Laktose-Verwertung wird als +/- angezeigt. Nachweis von Shiga-Toxin Genen (stx1/stx2) mittels LightCycler; Gennachweis für eaeA, hlyA, espA, katP, astA, recA, tolC mit konventioneller PCR (s. 2.9.2).
• Abb. 14: Überlebensraten und Histopathologie bei Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis und prophylaktischer Antibiotikabehandlung. (A) Dargestellt sind die Überlebensraten bei Behandlung ab Tag fünf vor T. gondii-Infektion mit Ciprofloxacin (Cf, schwarze Quadrate, n=19), Metronidazol (Mtz, offene Quadrate, n=16) Ciprofloxacin plus Metronidazol (Cf + Mtz, graue Quadrate, n=19), Kontrolle (w/o, schwarze Kreise, n=10). (B) Dargestellt ist die Histopathologie am Tag acht p.i. bei Ciprofloxacin-, Metronidazol- und Ciprofloxacin/Metronidazol-behandelten Tieren (n=5 pro Gruppe). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05 Cf+Mtz vs Monobehandlung;**p<0,01;***p<0,001 Antibiotikabehandlungen im Vergleich zur Kontrolle). Daten in Kooperation mit David Fuchs (med.Dissertationsschrift).
• Abb. 15: Überlebensraten und Histopathologie bei Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis und therapeutischer Antibiotikabehandlung. (A) Dargestellt sind die Überlebensraten für Behandlung ab Tag fünf nach T. gondii-Infektion mit Ciprofloxacin (Cf, schwarze Quadrate, n=10), Metronidazol (Mtz, offene Quadrate, n=10), Ciprofloxacin plus Metronidazol (Cf + Mtz, graue Quadrate, n=10), Kontrolle (w/o, schwarze Kreise, n=8). (B) Dargestellt ist die Histopathologie bei Ciprofloxacin-, Metronidazol- und Ciprofloxacin/Metronidazol-behandelten Tieren (n=5 pro Gruppe). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05;**p<0,01 im Vergleich zur Kontrolle). Daten in Kooperation mit David Fuchs (med. Dissertationsschrift).
• Abb. 16: Messung von Immunmediatoren in Ileum-Organkulturüberständen nach prophylaktischer Gabe bzw. therapeutischer Antibiotikabehandlung einer bestehenden T. gondii-induzierten Ileitis. Dargestellt sind die NO- bzw. IFN-gamma Werte (pg/mg Protein) für die prophylaktische/ therapeutische Behandlung (Tag fünf vor bzw. nach T. gondii-Infektion). Cf = Ciprofloxacin, Mtz= Metronidazol, w/o=keine Antibiotika, Naive= keine Toxo-Infektion. (* p<0,05;**p<0,01;***p< 0,001).
• Abb. 17: Darstellung der Überlebensraten und Histopathologie bei rekolonisierten gnotobiotischen Tieren mit T. gondii-Ileitis. (A) Darstellung der Überlebensraten gnotobiotischer Tiere (n=15, offene Kreise, w/o), gnotobiotischer Tiere besiedelt mit: Ileitis-Darrminhalt kranker Tiere (n=7, schwarze Quadrate), E. coli (n=10, schwarze Kreise), Bacteroides/Prevotella spp. (n=9, graue Kreise) oder L. johnsonii (n=10, gestrichelte Kreise). Tiere mit konventioneller SPF-Flora (schwarze Dreiecke) dienten als Kontrolle. (B) Darstellung entzündungsbedingter Gewebeschäden in gnotobiotischen bzw. rekolonisierten Tieren. Analyse der Histopathologie am Tag acht p.i. bei gnotobiotischen Tieren besiedelt mit: Ileitis-Flora, E. coli, Bacteroides/Prevotella spp. oder L. johnsonii oder ohne Besiedelung. Die T. gondii-infizierten SPF-Tiere dienten als Kontrolle (je n=5). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (**p<0,01;***p<0,001 im Vergleich zu nichtkolonisierten gnotobiotischen Tieren). (C/D) Darstellung der NO- und IFN-gamma-Werte im Überstand von Ileum-Organkulturen von gnotobiotischen Tieren ohne Kolonisierung (w/o), nach Kolonisierung mit: L. johnsonii (Lj), Bacteroides spp. (B), Bacteroides/Prevotella spp. (B/P), E. coli (Ec) oder Darminhalt von Tieren mit Ileitis. SPF-Tiere als Kontrolle. Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (n=5/Gruppe; *p<0,05;**p<0,01 im Vergleich zu nichtkolonisierten gnotobiotischen Tieren). Daten in Kooperation mit David Fuchs (med. Dissertationsschrift).
• Abb. 18: Analyse der kultivierbaren Darmflora in TLR-defizienten Tieren mit und ohne T. gondii-Ileitis.  (A) Dargestellt sind die Bakterienkonzentrationen im Ileum von gesunden (n=6) und Tieren mit ausgeprägter Ileitis am Tag neun p.i. (n=9). E. coli (Ec), Milchsäurebakterien (LAB, hauptsächlich Lactobacillus spp.), Bacteroides / Prevotella spp. (B/P). Die Identifikation einzelner Isolate wurde durch 16S rRNA-Sequenzierung bestätigt. Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05). Die Daten wurden in Kooperation mit Julia Niebergall (med. Dissertationsschrift) erhoben. (B) PCR-DGGE Analyse (16S rRNA variable Regionen V6-V8) der Darmflora bei TLR-defizienten Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis. Der Darminhalt von gesunden Mäusen (n=3) und an Ileitis erkrankten Tieren (je n=5) wurde am Tag neun p.i analysiert. Dargestellt sind die Ergebnisse für Wildtyp BL10 (WT, n=3), TLR2^-/-, TLR4^-/- und TLR2+4^-/- (je n=3). Im Rahmen des Entzündungsprozess verschwindende Lactobacillus spp. (offener Pfeil) bzw. erscheinende Enterobacteriaceae (schwarzer Pfeil) DNA-Banden wurden mittels 16S Sequenzanalyse identifiziert.
• Abb. 19: Überlebensraten bei TLR2^-/-, TLR4^-/- oder TLR2+4^-/- Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis.  (A) Dargestellt ist das Überleben von C57BL/10-Wildtyp (WT, schwarz, n=10), TLR2^-/- (dunkelgrau, n=11), TLR4^-/- (hellgrau, n=11) und TLR2+4^-/- (n=8). Die Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten. Das Uberleben wurde bis Tag 22 p.i. beobachtet. Die Überlebensraten wurde mit dem Kaplan-Meier-Test analysiert. Die Signifikanzen wurden mit dem „Log Rank“ Test berechnet und sind in schwarz bzw. hellgrau dargestellt. (B) Dargestellt ist Histopathologie des terminalen Ileums bei C57BL/10-Wildtyp (WT, n=5), TLR2-/- (n=5), TLR4^-/- (n=5) oder TLR2+4^-/- (n=5) am Tag neun p.i. (**p<0,01;***p<0,001 im Vergleich zum Wildtyp). Daten aus Abb.19A/B in Kooperation mit Julia Niebergall (med.Dissertationsschrift).
• Abb. 20: Proinflammatorische Mediatoren im Ileum von BL10-WT, TLR2^-/-, TLR4^-/- und TLR2+4^-/- Mäusen. Dargestellt sind IFN-gamma- (A) und NO-Konzentrationen (B) in Überständen aus Ileum-Organkulturen (pg/mg Ileum) von C57BL/10-Wildtyp (WT n=5), TLR2^-/- (n=5), TLR4^-/- (n=5) oder TLR2+4^-/- (n=3). Die Analyse erfolgte von Mäusen mit Ileitis am Tag neun p.i. im gesunden Zustand. Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen (*p<0,05; **p<0,01).
• Abb. 21: Abhängigkeit von TLR4 für die Induktion einer T. gondii-Ileitis in E. coli-monokolonisierten oder mit LPS (Lipid A) behandelten gnotobiotischen Mäusen. (A) E. coli-Konzentrationen im terminalen Ileum bei WT (n=3), TLR2^-/- (n=3), TLR4^-/- (n=3) und TLR2+4^-/- (n=3). Mittelwerte+Standardabweichung (nicht signifikant für alle Gruppen). (B) Dargestellt ist der Schweregrad der Ileitis in gnotobiotischen Mäusen (Gb) ohne Besiedelung (weisse Balken) oder mit E. coli-Monokolonisierung (graue Balken) am Tag neun p.i. bei Wildtyp-Mäusen (WT, n=3) und TLR2^-/- (n=3), TLR4^-/- (n=3) und TLR2+4^-/- (n=3) Tieren. Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05 im Vergleich zum Wildtyp und TLR2^-/-). (C) Dargestellt ist der Einfluss oraler Gabe von Lipid A (LPS) auf den Schweregrad der Ileitis bei gnotobiotischen (Gb) Wildtyp- (schwarze Balken, n=4) und TLR4^-/--Tieren (weisse Balken, n=4) am Tag neun p.i. Im Vergleich dazu PBS-behandelte (WT n=22; TLR4^-/- n=7), E. coli-monokolonisierte (WT n=16; TLR4^-/- n=7) und SPF-Tiere (WT n=22; TLR4^-/- n=9). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (***p<0,001 Wt versus TLR4^-/-). Daten in Kooperation mit Julia Niebergall (med. Dissertationsschrift).
• Abb. 22: Histopathologie, Dünndarmverkürzung und NO-Konzentrationen bei C57BL/6-Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis nach Behandlung mit Polymyxin B. (A) Dargestellt sind die Histopathologie-Punktwerte nach prophylaktischer bzw. therapeutischer Polymyxin B Behandlung (*p<0,05;**p<0,01). (B) Dargestellt ist die prozentuale Dünndarmverkürzung nach prophylaktischer bzw. therapeutischer Polymyxin B Behandlung (n=5/Gruppe) im Vergleich zu Placebo-behandelten Tieren. Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen (*p<0,05 im Vergleich zur Placebogruppe). (C) Dargestellt sind die NO-Konzentrationen in Ileum-Organkulturüberständen nach prophylaktischer Polymyxin B Behandlung (n=4) und bei Placebo-behandelten Tieren (n=5). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05 im Vergleich zur Placebogruppe). Daten in Kooperation mit Julia Niebergall (med. Dissertationsschrift). Die orale Gabe von Polymyxin B führte zu einer Abmilderung einer T. gondii-induzierten Ileitis. Das Polymyxin B hatte dabei vermutlich zwei Effekte, zum einen die nachgewiesene selektive Eradizierung von E. coli und möglicherweise auch die Abschwächung des TLR4/LPS-vermittelten Signalweges durch Bindung des bakteriellen LPS. Damit konnte in Ergänzung zu den o.a Ergebnissen bestätigt werden, dass die T. gondii-induzierte Dünndarmentzündung durch diesen Signalweg verstärkt wurde. TLR4-Antagonisten könnten demanch einen therapeutischen Ansatzpunkt für die Behandlung der Ileitis bieten (s. Diskussion).
• Abb. 23: Zusammensetzung der kultivierbaren Darmflora von gesunden (G, weiße Punkte) und Tieren mit schwerer Colitis (K, graue Punkte) am Tag acht nach siebentägiger DSS-Behandlung angegeben in log KBE/g Coloninhalt. (A) Dargestellt sind die Werte für E. coli und Enterococcus spp. und in (B) für Lactobacillus spp., Bacteroides/Prevotella spp. und Clostridium spp. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Mäuse mit Bakteriennachweis pro Anzahl aller Versuchstiere dieser Gruppe an. Angegeben sind Einzelwerte (Punkte) und Mittelwertbalken (*p< 0,05 im Vergleich zu gesunden Tieren). Daten in Kooperation mit Julia Niebergall (med. Dissertationsschrift).
• Abb. 24: Klinischer Colitisschweregrad und IFN-gamma-Werte bei Wildtyp, TLR2^-/-, TLR4^-/- und TLR2+4^-/- Mäusen. (A) Dargestellt ist der klinische Gesamtindex am Tag acht nach siebentägiger DSS-Behandlung: Wildtyp C57Bl/10 (schwarze Balken, n=10), TLR2^-/- (dunkelgraue Blaken, n=10), TLR4^-/- (hellgraue Balken, n=12) und TLR2+4^-/- (weisse Balken, n=11). Die Daten stammen aus zwei unabhängigen Experimenten. (B) Dargestellt sind die IFN-gamma Konzentrationen aus Organkulturüberständen von MLN. Die MLN stammten von Wildtyp (WT, schwarze Balken, n=3), TLR2^-/- (dunkelgrau, n=4), TLR4^-/- (hellgrau, n=4) und TLR2+4 ^-/- (weiss, n=4) Mäusen mit Colitis an Tag acht (nach siebentägiger DSS-Behandlung). Die Daten stammen aus (***p<0,001 im Vergleich zum Wildtyp).
• Abb. 25: DGGE (Variable 16S rRNA-Region V6-8, 16S Primer 968F-GC und 1378R) von Bakteriengemeinschaften von Wildtyp und TLR2+4-defizienten Tieren im gesunden Colon und mit Colitis. (A) Dargestellt sind die DGGE-Profile der gesunden Flora und bei Colitis (Tag acht nach siebentägiger DSS-Gabe) beim C57BL/10 Wildtyp. Die taxonomische Einordnung nach 16S rRNA-Sequenzanalyse der korrespondierenden DNA-Banden aus den DGGE-Profilen von gesunden bzw. Wildtyp-Tieren mit Colitis ist links bzw. rechts angezeigt. (B) Dargestellt sind die DGGE-Profile der Colonflora von gesunden bzw. TLR2+4^-/- mit Colitis. Die DGGE-Profile aus Gesamt-DNA von Coloninhalten der TLR2^-/- und TLR4^-/- Tiere ergaben nahezu identische Muster. Die Daten von TLR2+4^-/- sind daher repräsentativ. Die DGGE-Profile sind repräsentativ für 3 Mäuse/Gruppe/Experiment. Die Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten.
• Abb. 26: Zusammensetzung der Normalflora im Colon bei Wildtyp und TLR-defizienten Tieren. (A) Dargestellt ist die Zusammensetzung der Colonflora bei gesunden C57BL/10, TLR2^-/-, TLR4^-/- und TLR2+4^-/- Mäusen (drei Monate alt) mittels Analyse von 16S rRNA-Genbibliotheken. Die kompletten 16S rRNA-Gene wurden aus der Gesamt-DNA des Coloninhalts amplifiziert (n=3 pro Gruppe; 100 Klonsequenzen pro Gruppe). Die Balken repäsentieren den prozentualen Anteil der taxonomischen Gruppen auf der Y-Achse. Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (nicht signifikant). (B) Dargestellt sind die individuellen 16S rRNA DGGE-Profile (Primer HDA1GC und HDA2, 16S rRNA V2-3 Region) aus der Colonflora bei Wildtyp-, TLR2^-/-- TLR4^-/-- und TLR2+4^-/--Mäusen (n=2/Gruppe). Die Mäuse stammten aus zwei unterschiedlichen Tierhaltungen (Einrichtung A/B). Angezeigt ist die korrespondierende 16S rRNA-Sequenzanalyse schwach sichtbarer oder fehlender DNA-Banden aus den DGGE-Profilen von TLR4^-/- und TLR2+4^-/- Tieren (weisse, graue Pfeile) mit % Ähnlichkeit zum nächsten Datenbankeintrag (links angezeigt). Auf der X-Achse ist % Ähnlichkeit zur Wildtyp-Referenz (=100%) angegeben. Die DGGE-Profile sind repräsentativ für drei Tiere/Gruppe/Experiment. Die Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten.
• Abb. 27: Florenveränderung nach H. pylori-Infektion im Magen von Balb/c Mäusen. Dargestellt ist die Analyse von 16S rRNA-Klonbibliotheken durch Dot-Blot-Hybridisierung mit spezies-/gattungsspezifischen Sonden bei einer H. pylori-infizierten Maus (n=35 Klonsequenzen) und von einem PBS-behandelten Kontrolltier (n=30 Klonsequenzen). Angegeben ist der Prozentanteil der 16S-Klonsequenzen am Gesamt-„Pool“ nach Detektion durch Lactobacillus-spezifischer (Lac-141, schwarze Balken) und H. pylori-spezifischer Sonde (Hpy-1, graue Balken) oder keine Hybridisierung mit Lac-141 und Hpy-1 (weisse Balken).
• Abb. 28: Auswirkungen der Immunisierung auf die H. pylori-induzierten Änderungen der Magenflora. (A) Dargestellt sind die Daten aus 16S rRNA-Klonbibliotheken von einem Tier pro Versuchsgruppe (n=1). Die Analyse von 16S rRNA-Klonbibliotheken durch Dot-Blot-Hybridisierung mit spezies-/gattungsspezifischen Sonden ist als relativer Prozentanteil der 16S Klonsequenzen am Gesamt-Genpool nach Detektion durch Lactobacillus-spezifische (schwarze Balken) und H. pylori-spezifischer Sonde (graue Balken) bzw. ohne Hybridisierung mit Lac-141 und Hpy-1 (weisse Balken) dargestellt. Angegeben ist die Anzahl analysierter Klone aus 16S rRNA-Klonbibliotheken von Tieren mit/nach: Immunisierung ohne H.p.-Infektion (n=67), H. pylori-Infektion (n=60), Gabe des SL3261-Trägerstamms und H. pylori-Infektion (n=77), Immunisierung mit H. pylori-Infektion (n=75). (B) Analyse des relativen Anteils von Lactobacillus spp. 16S rRNA durch quantitative Echtzeit PCR. Auf der Y-Achse ist die Signalintensität von Lactobacillus (in %) im Verhältnis zum eubakteriellen Signal (=100%) dargestellt. Die quantitative RT-PCR erfolgte aus Gesamt-DNA Extrakten von Mägen (jeweils n=2 pro Gruppe) (***p<0,001; 2-Wege-ANOVA)
• Abb. 29: Entnommen aus Buzoni-Gatel & Werts 2006; Toxoplasma gondii überwindet das intestinale Epithel des Wirtes durch direkte Infektion von Enterozyten (a), durch Eindringen in „tight junctions“ (b), oder nach Aufnahme durch DCs (c). Wenn Enterozyten mit dem Parasiten infiziert sind, treten physiologische und morphologische Veränderungen auf, die zur Freisetzung von zytotoxischen Molekülen wie NO führen können (d). Zusätzlich können Enterozyten auf die Infektion mit der Sekretion von Chemokinen und Zytokinen reagieren, die PMNs (e), Makrophagen (f) und DCs (g) anlocken. Diese Zellen können im aktivierten Zustand eine direkte abtötende Wirkung entfalten und als Quelle für Zytokine dienen, wie z.B. IL-12, welches die adaptive Immunantwort über CD4-Zellen anstösst (h). Für die Auslösung einer spezifischen Immunantwort wird eine Antigen-Präsentation benötigt, meist durch DCs. Aktivierte T-Zellen und NK und NKT (i) können nach Stimulation durch Zytokine, sekretiert von infizierten Enterozyten, IFN-gamma ausschütten. Dies aktiviert Makrophagen, DCs und Enterozyten zur Bekämpfung der Parasiten. IEL (j) wirken zytotoxisch auf Enterozyten und produzieren TGF-beta, was möglicherweise die IFN-gamma Produktion abschwächt. Die Replikation der Parasiten im Darm kombiniert mit der inflammatorischen Antwort führt zu einem Epithelschaden, der es kommensalen Bakterien, einschliesslich LPS-reicher Gram-negativer Spezies, ermöglicht, die Epithelbarriere zu überwinden (k). T. gondii blockiert offenbar einige LPS-induzierbare Zytokine (l) und zytokin-abhängige Gene von in vitro infizierten Makrophagen (Lee et al. 2006).