Einleitung

1.1  Chronisch–entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen

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Morbus Crohn und Colitis ulzerosa sind chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED), die in Schüben verlaufen und bisher nicht heilbar sind. Beide Krankheitsbilder werden durch überschiessende Immunreaktionen vermittelt, deren genaue Ursache nicht bekannt ist. Bei beiden Erkrankungen bestehen ulzerative Entzündungen im Gastrointestinaltrakt. Beim M. Crohn ist die Entzündungsreaktion meist am Übergang zwischen Dünndarm und Dickdarm lokalisiert, doch die Entzündungen können im gesamten Verlauf des Verdauungstrakts auftreten. Gesunde und entzündete Darmabschnitte können nebeneinander liegen. Der Entzündungsprozess erfasst hierbei alle Schichten der Darmwand, so dass es häufig zur Bildung von Fisteln, Fissuren, eitrigen Abszessen und Stenosen kommt. Die Colitis ulzerosa ist im Gegensatz zum M. Crohn auf die Darmschleimhaut (Mukosa) des Colons beschränkt. Zu Beginn der Erkrankung haben ca. 25-55% der Patienten nur einen Befall des Mastdarms. Im Verlauf der Krankheit breitet sich die Colitis aufsteigend unterschiedlich weit ins Colon aus (www.dccv.de; Internetseite: Deutsche Morbus Crohn / Colitis ulzerosa Vereinigung e.V.).

Abb. 1: Morbus Crohn und Colitis ulzerosa. Lokalisationen von Entzündungsprozessen im Gastrointestinaltrakt. M. Crohn kann sich im gesamten Verdauungstrakt manifestieren, die Colitis ulzerosa ist zu 95% auf das Colon beschränkt (Quelle: Kompetenznetz Darmerkrankungen; www.kompetenznetz-ced.de).

Die Inzidenz von M. Crohn beträgt etwa 10-200 / 100.000 pro Jahr weltweit, wobei es seit den 1960er Jahren einen 8-10fachen Anstieg gibt. Die Inzidenz ist in Nordeuropa und Nordamerika weit höher als in Ländern der südlichen Hemisphäre. Der Lebensstandard, verbunden mit bestimmten Ernährungsgewohnheiten, könnte damit zur Krankheitsentstehung beitragen. Bei der Colitis ulzerosa beobachtet man eine stabile weltweite Inzidenz von 10-20/100.000 pro Jahr und keine eindeutige Abhängigkeit vom Lebensstandard (MacDonald & Monteleone 2005). In Deutschland sind etwa 130.000 Menschen an M. Crohn und ca. 165.000 an Colitis ulzerosa erkrankt. Meist erkranken junge Menschen, Männer und Frauen zu etwa gleichen Teilen, im Alter zwischen 20-35 Jahren, wobei aber auch Kinder und ältere Menschen betroffen sein können. Die Krankheitsausprägung kann bei M. Crohn und Colitis ulzerosa unterschiedlich stark sein. Bei beiden Erkrankungen kommt es in der Regel zu Durchfällen und Schmerzen. Bei beiden Krankheitsformen können weiterhin Folgeerscheinungen wie z.B. Stenosen durch rezidivierende Entzündungen, Ernährungsmängel, Gewichtsverlust, erhöhtes Krebsrisiko und häufige diagnostische und chirurgische Eingriffen, sowie extraintestinale Manifestationen wie z.B. schmerzhafte Gelenkentzündungen die Lebensqualität der CED-Patienten zusätzlich beeinträchtigen (Kompetenznetz Darmerkrankungen; www.kompetenznetz-ced.de). Forschungsergebnisse aus der Grundlagenforschung, der Humangenetik und aus klinischen Studien legen nahe, dass eine genetische Disposition, die Darmflora und Umwelteinflüsse bei Auslösung und Ausprägung der CED eine Rolle spielen können. Vermutlich kommt es nach einer Störung der intestinalen Epithelbarriere zu einem Kontakt von natürlichweise im Darm lebenden Bakterien (Kommensalen) mit Immunzellen, die in einem genetisch prädisponierten Wirt eine überschiessende Immunantwort auslösen. Sowohl M. Crohn und Colitis ulzerosa zeigen eine aktivierte angeborene (über Makrophagen und neutrophile Granulozyten) und erworbene (über T-und B-Zellen) Immunantwort und einen Zusammenbruch der Toleranz gegenüber kommensalen Darmbakterien. Die Toleranz gegenüber der eigenen Bakterienflora wird normalerweise durch regulatorische T-Zellen (Treg), natürliche Killer (NK) T-Zellen, B-Lymphozyten und dendritische Zellen und deren Sekretion von Zytokinen wie z.B. TGF-beta (engl.:Transforming Growth Factor-beta), Interleukin 10 (IL-10) und Interferon-alpha/beta erreicht. Bei beiden Erkrankungen ist die Menge an aktivierten Makrophagen und dendritischen Zellen in der Lamina propria erhöht, und es kommt zu einer gesteigerten Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen, sowie zu einer verstärkten Expression von Adhäsions- und ko-stimulatorischen Molekülen (Sartor 2006; MacDonald & Monteleone 2005).

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Abb. 2: Immunregulatorische Zellen und Prozesse im Darm. Das darmassoziierte lymphoide Gewebe (engl.: gut-associated lymphoid tissue, GALT) enthält spezialisierte M-Zellen, die kontinuierlich bakterielle Antigene vom Lumen ins lymphoide Gewebe aufnehmen. Dendritische Zellen (DC) in der Lamina propria (LP) können zwischen den Epithelzellen ebenfalls Bakterien aus dem Darmlumen aufnehmen. Das Epithel ist angefüllt mit CD8+ T-Zellen (Intraepitheliale Lymphozyten, IEL), die Lamina propria enthält CD4+ T-Zellen, Makrophagen und IgA-Antikörper-produzierende Plasmazellen. T-Zell-initiierte Gewebeschädigungen können durch immunsuppressive Zytokine (IL-10 und TGF-beta) und regulatorische T-Zellen (Treg) inhibiert werden. (nach MacDonald & Monteleone 2005).

Die zelluläre adaptive Immunantwort wird über T-Helferzellen (CD4+) vermittelt. Nach dem Kontakt mit antigenpräsentierenden Zellen (APZ) kommt es zur Aktivierung naiver T-Helferzellen mit einer anschliessenden Differenzierung in verschiedene Untergruppen und zur klonalen Expansion (Murphy & Reiner 2002). Generell wird eine Differenzierung von aktivierten CD4+ T-Helferzellen zum Typ1 (Th1) oder Typ2 (Th2) beschrieben. Th1-Zellen produzieren überwiegend IFN-gamma, TNF-beta und IL-2. Diese Zytokine werden einerseits zur Überwindung intrazellulärer Infektionen benötigt, sind aber andererseits auch mitverantwortlich für die Gewebezerstörung bei chronisch entzündlichen Erkrankungen. Th2-Zellen produzieren vor allem IL-4, IL-5 und IL-13 und sind zur Bekämpfung parasitärer Erkrankungen notwendig, spielen aber auch eine wichtige Rolle in der Pathogenese allergischer Erkrankungen (Abbas et al. 1996; Kamradt & Burmester 1998; Infante-Duarte & Kamradt 1999). IL-4 führt z.B. zur Sensibilisierung basophiler Mastzellen, IL-5 zur Aktivierung eosinophiler Granulozyten, IL-10, IL-13 und TGF-beta wirken inhibierend auf IFN-gamma. Die vorherrschenden Zytokine IL-12 aus Th1-Zellen bzw. IL-4 aus Th2-Zellen wirken inhibierend auf den jeweiligen anderen Aktivierungsweg.

Ob sich aus einer undifferenzierter Vorläuferzelle entweder eine Th1- oder einer Th2-Zelle entwickelt, wird im besonderem durch Zytokine gesteuert (Murphy et al. 2000). Die Sekretion von IL-12 und IL-18 aus APZ resultiert z.B. in einer Differenzierung von aktivierten CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen, die ihrerseits IFN-gamma ausschütten. Th-Zellen, die andere als die o.g. typischen Th1- oder Th2-Zytokine produzieren, sind beschrieben als Th0 (Firestein et al. 1989), Th3 (Chen et al. 1994) oder Tr1 (Groux et al. 1997). Th0-Zellen können sowohl Typ 1- als auch Typ 2-Zytokine produzieren. Der Status der Th0-Zellen als eine stabil differenzierte Subpopulation ist allerdings noch nicht voll geklärt (Abbas et al. 1996; Firestein et al. 1989; Löhning et al. 1999). Th3-Zellen produzieren vor allem TGF-beta und verhindern möglicherweise die Differenzierung von Th1- und Th2-Zellen (Chen et al. 1994). In vitro polarisierten Tr1-Zellen, gekennzeichnet durch die Produktion von IL-10 und IL-5, wird eine immunsupprimierende Wirkung zugeschrieben (Groux et al. 1997). Regulatorische T-Zellen (Treg), die Einfluss auf die Modulation entzündlicher Prozesse haben, sind durch Ausprägung verschiedener Marker voneinander abgrenzbar. Dass sind z.B. CD4+CD25+ auf natürlich vorkommenden regulatorischen T-Zellen (N-Tregs), CD4+CD25- bei induzierbaren naiven T-Zellen (Tr1), CD4-CD25+DX5+ bei natürlichen Killer T-Zellen (TrNKT) und CD4-CD25+CD8+ bei zytotoxischen T-Zellen (TrCTC) (McGee & Agrawal 2006). Der Unterschied zwischen M. Crohn und Colitis ulzerosa hinsichtlich immunpathologischer Antwort besteht darin, dass beim M. Crohn eine vom Th1-Typ vermittelte Antwort vorliegt. Dabei differenzieren aktivierte CD4+ T-Helferzellen nach Stimulation durch IL-12 und IL-18 aus Makrophagen und DCs zu T-Zellen vom Typ1 (Th1-Zellen), die eine starke IFN-gamma Produktion bewirken. Isolierte CD4+ T-Zellen von Crohn-Patienten produzieren wie für eine Th1-Antwort typisch IFN-gamma und IL-12p40. Makrophagen von M. Crohn Patienten können grosse Mengen an Th1-induzierendem IL-12 und IL-18 produzieren. Die sich daraus differenzierenden Th1-Zellen sind durch diese Zytokine gegen Apoptose geschützt und können so den Entzündungsprozess in Gang halten (Monteleone et al. 1999; MacDonald & Monteleone 2001, 2005). Das Zytokinprofil der Colitis ulzerosa wird dagegen als Th2-Antwort eingestuft. Der bei einer Th2-Antwort vorliegende Anstieg von IL-4 und IL-5 ist aber in ulzerierten Geweben nicht permanent erkennbar. Somit wird die T-Zell Antwort bei der Colitis ulzerosa als eine eher atypische Th2-Antwort beschrieben, bei der natürliche Killer T-Zellen IL-13 ausschütten, in deren Folge ein zytotoxischer Epithelschaden im Colon herbeigeführt wird (Fuss et al. 1996, 2004).

1.2 Die Rolle der Darmflora bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen

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In der Darmflora des Menschen finden sich mindestens 50 Bakteriengattungen mit einigen hundert Arten (Finegold et al. 1983; Salfinger et al. 1980; Simon et al. 1984), wobei die Bakteriendichte und Diversität vom Magen zum Dickdarm konstant zunimmt. Die Bakterienkonzentration im Colon beträgt etwa 1010–1012 Bakterien pro Gramm Darminhalt. Die dominanten Gruppen sind Bacteroidales, Bifidobacterium, Enterobacteriaceae, Clostridiales und Lactobacillales. Mehr als 90% der Darmflora sind obligate Anaerobier. Im gesunden Zustand machen Escherichia coli und andere, nahe verwandte Enterobakterienarten nur einen geringen Teil der Flora aus (Donskey et al. 2003). Bakterien der normalen Darmflora, die durch Rezeptoren des angeborenen Immunsystems (siehe unten) erkannt werden, sind an der Auslösung und Ausprägung chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (CED) beim Menschen und im Tiermodell (Wirtz & Neurath 2000; Thompson-Chagoyan et al. 2005; Tlaskalova-Hogenova et al. 2004, 2005; Sartor 2006) ursächlich beteiligt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind trotz zahlreicher Untersuchungen noch weitgehend unklar, und insbesondere für das Ileum ist nicht bekannt, wie sich definierte Bakterienarten auf die Entzündungsreaktion auswirken. Das immunologische Sensor-Effektorsystem des Gastrointestinaltraktes reagiert auf die Bakterien normalerweise tolerant. Man nimmt deshalb an, dass genetische Prädisposition und/oder Veränderungen der Darmflora die Auslösung und Ausprägung entzündlicher Darmerkrankungen determinieren (MacDonald & Monteleone 2005).

Abb. 3: Signalweiterleitung durch TLRs in der Mukosa. Kommensale Darmbakterien haben i.d.R. einen schützenden Effekt oder werden vom Immunsystem toleriert. Bei Störungen der intestinalen Barriere können Antigene aus kommensalen und/oder pathogenen Bakterien entzündliche Immunantworten auslösen (entnommen aus Strober 2004)

Individuelle und altersspezifische Variabilitäten der Darmflora (Franks et al. 1998; Sghir et al. 2000; Hopkins et al. 2001) weisen darauf hin, dass das angeborene Immunsystem auch auf die Zusammensetzung der Darmflora Einfluß nehmen könnte (van de Merwe et al. 1983; Medzhitov & Janeway 1997). Es sollte demnach möglich sein CED, wie M. Crohn oder Colitis ulzerosa durch gezielte Immunmodulation und/oder Veränderung der Darmflora therapeutisch zu beeinflussen oder im Idealfall den Ausbruch der Erkrankung zu verhindern bzw. schwere klinische Verläufe durch geeignete Massnahmen abzumildern. Eine krankheitsauslösende und/oder –unterhaltende Rolle der „normalen“ Darmflora bei der CED ist inzwischen gut belegt (Sartor 1995, 1997a, 2004, 2006; Elson et al. 2001; Swidsinski et al. 2002; Campieri & Gionchetti 2001; MacDonald & Monteleone 2005). Verschiedene Tiermodelle haben einen wesentlichen Beitrag zur Aufklärung der Pathogenese dieser Erkrankungen geleistet (Pizarro et al. 2003; Elson et al. 2005). Das bisher einzige detaillierte Modell für eine spontan-chronische Ileitis ist die SAMP1/Yit(Fc) Maus, die nach mehreren Monaten eine chronische Entzündung im Dünndarm entwickelt (Matsumoto et al. 1998; Kosiewicz et al. 2001; Bamias et al. 2002). Für die chronische Colitis, die sich in dem Mausstamm C3H/HejBir ausbildet konnte erstmals gezeigt werden, dass bakterielle Antigene der kommensalen Bakterienflora an der Ausbildung von aggressiven T- und B-Zellantworten beteiligt sind (Sundberg et al. 1994, Elson et al. 2004). Durch definierte Besiedelung keimfrei gehaltener Tiere konnte gezeigt werden, dass mehrere Bakterienarten im Darm von Nagetieren, die durch Deletion oder Überexpression von Genen Immundefekte aufweisen, eine experimentelle Colitis hervorrufen können (Rath et al. 1996, 1999ab, 2001). Ausserdem gibt es Hinweise, dass die Diversität der Darmflora im Verlauf der Entzündung stark eingeschränkt wird. Sowohl bei der CED des Menschen (Boudeau et al. 1999; Seksik et al. 2003; Darfeuille-Michaud 1998; Martin et al. 2004; Barnich et al. 2003), als auch bei der experimentellen Darmentzündung im Tiermodell (Schuppler et al. 2004) konnte gezeigt werden, dass Enterobacteriaceae und Bacteroides-Arten der Darmflora im Darm akkumulieren und mit Entzündungsherden assoziiert sind (Ott et al. 2004). Der initiale Kontakt zwischen Darmbakterien und Immunzellen erfolgt über die Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die mikrobielle Zellbestandteile erkennen und Immunantworten auslösen (Medtzhitov & Janeway 2000; Gewirtz & Mandara 2001; Pulendran et al. 2001). Über die sog. „Toll-like Rezeptoren“ (TLR) kann das Immunsystem extrazelluläre Mikroorganismen detektieren (Akira et al.. 2001; Kaisho & Akira 2003; Takeda et al. 2003; Takeda 2005), während die Proteine der Caspase recruitment domain (CARD)/ nucleotide binding and oligomerization domain (NOD)-Familie (intrazelluläre Bakterien erkennen (Inohara et al. 2001; Silverman & Maniatis 2001; Ogura et al. 2001; Hugot et al. 2001, Hugot 2006; Rescigno & Nieuwenhuis 2007). Die TLR- bzw- CARD/NOD-abhängige Aktivierung des Immunsystems geschieht über Signalkaskaden, an denen verschiedene Adapterproteine, wie z.B. das MyD88-Protein (myeloid differentiation primary response protein), beteiligt sind (Kaisho & Akira 2003; Uematsu & Akira 2006).

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Abb. 4: Membranständige und intrazelluläre TLR- und CARD15/NOD2-Signalweiterleitung von intestinalen Epithelzellen mit Liganden und Signalwegen. (A) Die TLR-4 und MD-2 Expression ist in intestinalen Epithelzellen niedriger als in Immunzellen. Eine Intrazelluläre Erkennung von LPS via TLR-4, assoziiert mit dem Golgi-Apparat, wurde beschrieben. TLR-2 wird möglicherweise an der Oberfläche nur schwach exprimiert und beeinflußt inhibitorische Moleküle (Tollip, SIGIRR). TLR-5 kann basolateral und apikal exprimiert werden. NOD2 und TLR-9 sind intrazelluläre Rezeptoren. (B) Modell für TLR-2 und CARD15/NOD2 Interaktionen in der Lamina propria. M. Crohn assoziierte Mutationen in CARD15/NOD2 (in Abb.4B; Blitzzeichen bei LRR) resultieren in verminderter NF-kappaB Aktivierung durch Muramyldipeptid (MDP) und verminderter IL-10 Freisetzung als Antwort auf eine TLR-2 Signalweiterleitung (entnommen aus Abreu et al. 2005).

Nach Bindung der Bakterienbestandteile an TLRs bzw. NOD-Proteine, resultiert eine Aktivierung des Immunmediators NF-κ(kappa)B, der die Zytokinsynthese induziert (Hallmann et al. 2001). Polymorphismen der TLR- und CARD/NOD-Proteine führen zu immunologischen Fehlregulationen und sind offenbar an der Immunpathogenese der CED beteiligt. So wurde gezeigt, dass Mutationen in TLR4 (Franchimont et al. 2004; Torok et al. 2004) und CARD15/NOD2 (Ogura et al. 2001; Hugot et al. 2001; Hampe et al. 2001) signifikant mit der CED beim Menschen assoziiert sind. Aktuelle Ergebnisse belegen, dass Mutationen im CARD15/NOD2-Gen auch mit entzündlichen Veränderungen der Darmmukosa bei Knochenmark- oder Stammzell-transplantierten Patienten in Zusammenhang stehen (Holler et al. 2004). In entsprechenden gendefizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass NOD2 als negativer Regulator von TLR2-vermittelten Immunantworten wirkt (Watanabe et al. 2004) und diese Funktion könnte erklären, warum Mutationen in CARD15/NOD2 auch im Menschen mit der Entstehung von Darmentzündung assoziiert sind. So findet sich mindestens eine von drei bekannten Mutationen in der CARD15 Region bei 25-30% der europäisch-stämmigen, allerdings nicht bei asiatisch-afrikanisch-stämmigen M. Crohn Patienten (Newmann & Siminovitch 2005). Die CARD15/NOD2 Mutation ist demnach eher als Prädisposition zu sehen und steht vielleicht nicht in direktem, kausalem Zusammenhang mit dem M. Crohn, da eine erhöhte Inzidenz von M. Crohn bei Trägern der CARD15/NOD2 Mutation nicht gefunden werden konnte (Rescigno & Nieuwenhuis 2007). Erkennungsmoleküle des angeborenen Immunsystems werden zell- bzw. gewebsspezifisch exprimiert. Im Mausdarm werden die für Bakterien relevanten TLRs konstitutiv exprimiert, wobei die Produktion im Colon am stärksten ist (Ortega-Cava et al. 2003). Studien mit Colonepithelzellen des Menschen zeigten, dass TLR4 und der Ko-Rezeptor MD-2 in bestimmten Zelllinien nur in geringem Maß exprimiert werden und somit eine verminderte Reaktion auf Lipopolysaccharid (LPS) stattfindet (Abreu et al. 2001, Naik et al. 2001, Suzuki et al. 2003). Auch die Antwort auf TLR2-Liganden ist bei intestinalen Epithelzellen nur schwach ausgeprägt (Melmed et al. 2003) und eine längere Gabe von LPS oder Lipoteichonsäure (LTA) kann eine Kreuztoleranz von TLR2- bzw. TLR4-Liganden induzieren (Otte et al. 2004). Das angeborene Immunsystem kann demnach über TLRs vermutlich nicht zwischen pathogenen und kommensalen Bakterien diskriminieren, wenn keine Invasion ins subepitheliale Gewebe erfolgt oder bestimmte Pathogenitätsfaktoren vorliegen (Abreu et al. 2005). Die Tatsache, dass bei der durch Dextransodiumsulfat-(DSS) induzierten Colitis eine verstärkte TLR-Expression zu beobachten war, weist darauf hin, dass die TLRs bei entzündlichen Prozessen des Darms eine wichtige Rolle spielen. Es wird auch vermutet, dass TLRs und CARD15/NOD2 bei der durch dendritische Zellen vermittelten immunologischen Toleranz gegenüber Darmbakterien beteiligt sind (Gewirtz & Mandara 2001; Pulendran et al. 2001; Akira et al. 2001; Kaisho & Akira, 2003; Medvedev et al. 2001; Rescigno et al. 2001; Michelsen et al. 2001; Strober 2004; Rescigno & Chieppa 2005). Die Interaktionen zwischen Darmflora und mukosalem Immunsystem sind derzeit Gegenstand intensiver Forschungstätigkeiten. Neueste Arbeiten am Menschen und im Mausmodell belegen, dass die Modulation der Darmflora entzündliche Prozesse im Colon mildern kann. Bei Patienten mit allogener Knochenmark-Transplantation führte die Gabe eines probiotisch wirkenden Lactobacillus rhamnosus GG zu einem Rückgang der akuten GvHD (Gerbitz et al. 2004). Im einem DSS-Colitismodell mit Mäusen konnte gezeigt werden, dass die Erkennung bakterieller DNA (aus einer probiotischen Formulierung; VSL-3) durch TLR9 eine Reduktion der entzündlichen Aktivität bewirkt (Rachmilewitz et al. 2004). In diesem Zusammenhang ist auch die Beobachtung von Bedeutung, dass die Erkennung von Darmbakterien durch TLRs für die Differenzierung von Enterozyten essentiell zu sein scheint. Differenzierte Enterozyten der Darmmukosa können vor der toxischen Wirkung von DSS besser schützen als wenig differenzierte Zellen (Rakoff-Nahoum et al. 2004). Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Experimente bauen direkt auf den beschriebenen aktuellen Befunden auf und sollten den Erkenntnisstand durch Aufklärung der beteiligten Mechanismen sowohl auf Wirtsseite, als auch durch eine umfassende Analyse der Darmflora sinnvoll erweitern. So sollte festgestellt werden, welche Mechanismen der Interaktion zwischen Darmbakterien und dem Immunsystem in der entzündeten Darmmukosa zugrundeliegen und ob eine Modulation der Darmflora zur Milderung des Entzündungsgeschehens beitragen kann.

1.3 Tiermodelle für Darmentzündung (Ileitis und Colitis)

In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Oliver Liesenfeld am Institut für Infektionsmedizin, Abt. Medizinische Mikrobiologie und Infektionsimmunologie (Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin) wurden in Vorarbeiten Mausmodelle für verschiedene Formen der Darmentzündung entwickelt. Da sich die Colitis ulzerosa fast ausschliesslich im Colon manifestiert und der M. Crohn im Gegensatz dazu auch proximal höher gelegene Darmabschnitte befallen kann, wurden für Colitis und Ileitis zwei separate Mausmodelle etabliert. Die durch orale Infektion mit dem Parasiten Toxoplasma gondii (Eimeriida, Sarcocystidae) induzierte terminale Ileitis (Liesenfeld 2002) ist ein Modellsystem, in dem die Wechselwirkungen der Darmflora mit der entzündeten Dünndarm-Mukosa untersucht werden können. Die orale Gabe von 100 Zysten T. gondii (Stamm ME49) führt bei empfänglichen Mäusen mit dem Haplotyp 2b zu einer massiven Entzündung des terminalen Ileums. Darmpathologie und das Zytokinprofil entsprechen einer Th1-Immunantwort und sind ähnlich wie beim M. Crohn im akuten Schub (Liesenfeld 2002). Am Tag sieben nach oraler T. gondii-Infektion findet sich bei infizierten Tieren in der Fraktion der mononukleären Zellen in der Lamina propria des kleinen Intestinums (engl.: lamina propria mononuclear cells, LPC) eine erhöhte Anzahl von CD4+ T-Zellen im Vergleich zu nicht-infizierten Tieren. Die Mengen an mRNA für IFN-gamma, TNF-alpha und iNOS (induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase) sind im Ileum infizierter Tieren signifikant erhöht. Da die Gabe von Antikörpern gegen TNF-alpha und der iNOS-Inhibitor Aminoguanidin Nekrosen verhindern und die Überlebenszeit verlängern können, trägt die Aktivierung von iNOS durch IFN-gamma und TNF-alpha über eine starke NO-Ausschüttung sicherlich zur hohen Mortalität in diesem Modell bei (Liesenfeld et al. 1996, 1999ab). Da suszeptible Mäuse spätestens acht Tage nach Infektion mit T. gondii zu 100% verstorben sind, simuliert das in der vorliegenden Arbeit verwendete akute Modell am ehesten CED im akuten Schub. Die mit dem M. Crohn vergleichbaren Zytokinprofile, die CD4+ T-Zell-vermittelten histopathologischen Veränderungen und erkennbare protektive Effekte durch IL-10 und TGF-beta (Suzuki et al. 2000; Buzoni-Gatel et al. 2001; Mennechet et al. 2004) stellen die T. gondii-induzierte Ileitis als ein Modell zur Untersuchung Th1-vermittelter Pathomechanismen bei entzündlichen Darmerkrankungen dar. In der vorliegenden Arbeit wurden in diesem Modell, sowohl die Veränderungen der Darmflora während der Entzündung, als auch die Beteiligung von Bakterien bzw. Bakterienkomponenten an der Entzündungsreaktion im Darm untersucht. Die akute Dextransodiumsulfat-induzierte Colitis (DSS-Colitis) entwickelt sich nach sechs bis acht Tagen Behandlung mit 3-4% DSS im Trinkwasser (Rath et al. 1996, 1999ab; Siegmund et al. 2001). Histologisch ist die DSS-Colitis durch die Infiltration von Entzündungszellen in die Lamina propria mit fokaler Kryptenzerstörung, lymphoider Hyperplasie und epithelialen Ulzerationen charakterisiert (Okayasu et al. 1990; Cooper et al. 1993; Dieleman et al. 1998). Diese Schäden sind vermutlich auf einen toxischen Effekt von DSS zurückzuführen, der einen Epithelschaden verursacht, verstärkt über Phagozytose von DSS durch Zellen der Lamina propria (LPC) und die Ausschüttung von IFN-gamma und TNF-alpha (Okayasu et al. 1990). Die DSS-Colitis kann auch T-Zell-unabhängig ausgelöst werden, da sie auch in SCID-Mäusen beobachtet wird, die über keine funktionalen T- und B-Zellen verfügen (Axelsson et al. 1996; Dieleman et al. 1994). Neben der akuten DSS-Colitis gibt es auch Modelle zur Induktion einer chronischen DSS-Colitis (Dieleman et al. 1998; Kojouharoff et al. 1997; Obermeier et al. 1999; Hans et al. 2000ab; Melgar et al. 2005). In dem Modell von Melgar et al. erreichten die Mäuse in der Erholungsphase ihr ursprüngliches Gewicht, wobei vier Wochen nach Absetzen des DSS histopathologische Veränderungen und erhöhte Werte von IL-1beta, IL-12p70 und IL-17 nachweisbar waren. Möglicherweise folgt nach der akuten entzündlichen Antwort durch Makrophagen/Neutrophile, eine Th-Zellen-vermittelte Immunantwort, die zu einer chronischen Colitis führt (Hans et al. 2000b). Die Herstellung keimfreier Tiere durch Antibiotikabehandlung und die anschliessende orale Besiedlung mit definierten Bakterienarten wurde im Laufe dieser Arbeit in Kooperation mit Dr. Markus M. Heimesaat am Forschungsinstitut für Experimentelle Medizin (FEM) etabliert. Um einen möglichen Einfluß des Immunsystems auf die Ausbildung der Darmflora und die Auslösung und Ausprägung der Entzündungsreaktion zu untersuchen, wurden Mausstämme eingesetzt, die für bakterielle Rezeptormoleküle defizient waren. In den Tierexperimenten zur Ileitis kamen TLR2-, TLR4- und TLR2+4-defiziente Mäuse zum Einsatz. Für Vorversuche zu den Colitisexperimenten wurden auch Tiere verwendet, die das Lipopolysaccharid-bindende Protein (LBP) nicht produzieren können (LBP-/-). Die Untersuchungen zum Einfluß einer H. pylori-Infektion auf die Magenflora wurden mit Balb/c-Mäusen in Kooperation mit Dr. Toni Aebischer am Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie (Prof. T.F. Meyer, Berlin) durchgeführt.

1.4 Auswirkungen einer H. pylori-Infektion auf die Magenflora und Vakzinierungsmodelle gegen H. pylori bei Tier und Mensch

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Die bakterielle Besiedlung des Magens ist mit einer Vielzahl von gastrointestinalen Störungen assoziiert. Dabei stellt die Infektion mit Helicobacter pylori ein besonderes Risiko dar (Peek & Blaser 2002). H. pylori ist ein Gram-negatives Stäbchen Bakterium (Proteobacteria; Campylobacterales), das sich im Magen ansiedeln kann (Marshall & Warren 1984). Die weltweite Infektionsrate mit H. pylori beträgt etwa 50% (Goodman & Cockburn 2001), wobei die Prävalenz der H. pylori-Infektion Abhängigkeit von der geographischen Region, dem Alter und dem sozioökonomischen Status variieren kann (Brown 2000). In Ländern mit niedrigen hygienischen Standards kann die Infektionsrate über 90% betragen (Pounder et al. 1995; Brown 2000). Neuinfektionen finden besonders im Kindes- bzw. Jugendalter statt (Bodhidatta et al. 1993) und es wurde beobachtet, dass Infektionen z.B. auch familiär gehäuft auftreten können (Drumm et al. 1990; Rowland & Drumm 1998; Drumm & Rowland 2003). Als Übertragungsmodus der Infektion wird eine fäkal-orale aber auch eine oral-orale Übertragung diskutiert (Megraud 1995). Normalerweise können Bakterien im sauren Magenmilieu des Menschen bei einem pH von 2 nicht überleben. H. pylori ist als einziges Bakterium in der Lage, den menschlichen Magen dauerhaft zu kolonisieren. Als Schutz gegen die Magensäure dient ein Pathogenitätsfaktor von H. pylori, das Enzym Urease. Sie spaltet den im Magensaft enthaltenen Harnstoff zu Ammoniak und CO2, wobei als Endprodukte Ammonium-Ionen (NH4+) und Bikarbonat-Ionen HCO3-) vorliegen. Die Bikarbonat-Ionen schützen die Bakterien vor dem Angriff durch die Magensäure. Für eine Kolonisierung der Magenschleimhaut ist die Produktion von Urease daher absolut notwendig (Segal et al. 1992; Solnick et al. 1995; Stingl & De Reuse 2005). Weitere Pathogenitätsfaktoren und Eigenschaften, die das Überleben von H. pylori im Magen ermöglichen und zur Entstehung akuter wie auch chronischer Verlaufsformen beitragen sind: Flagellen, Adhärenzfaktoren, cag-Pathogenitätsinseln (cag PAI), vakuolisierendes Zytotoxin (VacA), LPS und hohe genetische Variabilität (Kraft & Suerbaum 2005; Lee & Josenhans 2005; Naumann 2005; Odenbreit 2005). Flagellen und Adhärenzfaktoren befähigen H. pylori, sich durch die Mukusschicht des Magens zu bewegen und sich an Magenepithelzellen anzuheften (Odenbreit 2005). Nach erfolgreicher Kolonisierung von H. pylori, kann es bei den Patienten zu einer akuten Gastritis kommen. Dies ist aber nur in etwa 10-20% aller Fälle so, obwohl bei allen H. pylori-infizierten histopathologische Änderungen der Magenmukosa nachweisbar sind. Die akute H. pylori-induzierte Gastritis kann in eine chronische Form übergehen. Die Ulkuskrankheiten, z.B. das Ulcus duodenale bzw. ventriculi sind durch Substanzdefekte der Schleimhaut gekennzeichnet und können schmerzhaft, aber auch symptomfrei verlaufen. Die aus einer chronischen Form resultierenden Gewebeveränderungen und das Vorliegen entsprechender Pathogenitätsfaktoren z.B. cag-Pathogenitätsinsel und VacA können zum MALT-(mucosa-associated lymphoid tissue) Lymphom oder zur Entstehung eines Magenkarzinoms beitragen (Ernst & Gold 2000; Suerbaum & Michetti 2002). Eine H. pylori-Infektion führt möglicherweise eine Änderung der mikrobiellen Besiedelung des Magens herbei, die ein zusätzliches Risiko für assoziierte Erkrankungen nach sich zieht. Aktuell wurden in H. pylori-infizierten Patienten, die mit Protonenpumpeninhibitoren behandelt wurden, erhöhte gastrische Konzentrationen an Bakterien gefunden, die nitrosaminhaltige Verbindungen produzieren können (Correa 1992; Mowat et al. 2000; Mowat & McColl 2001). So könnte eine Überwucherung der Magenmukosa mit kommensalen Bakterien des Colons das Krebsrisiko steigern. Die klassische Therapie von Patienten mit klinischen Symptomen und nachgewiesener H. pylori-Infektion besteht in einer Kombination aus den Antibiotika Clarithromycin und Metronidazol und einem Protonenpumpeninhibitor. Dieser Ansatz ist kostenintensiv und oftmals schlägt die Behandlung wegen mangelnder Kooperation der Patienten fehl (Vakil 2005). Zudem wird eine steigende Antibiotikaresistenz gegen Clarithromycin und Metronidazol in H. pylori-Stämmen beobachtet (McLoughlin et al. 2005). Der Aspekt der Resistenzentwicklung und möglicherweise auch ökonomische Aspekte haben zur Entwicklung verschiedener Vakzinierungsmodelle gegen H. pylori am Tier und am Menschen geführt (Michetti et al.1994, 1999; Radcliff et al. 1997; Ferrero et al. 1995; Marchetti et al 1995; Gomez-Duarte et al. 1998; Del Giudice et al. 2001). Neben der klassischen Therapie könnte eine Vakzinierung gegen H. pylori einen neuen Therapieansatz darstellen (Kleanthous et al. 1998, Del Giudice et al. 2001; Aebischer et al. 2005). Ein wirksames Zielantigen für eine Vakzinierung scheint die Urease zu sein (Michetti et al. 1994; Ferrero et al. 1995; Gomez-Duarte et al. 1998). Die Anwendung einer oralen attenuierten Lebendvakzine, bestehend aus einer H. pylori-Urease-Untereinheit exprimierenden Salmonella, scheint eine wirksame Immunisierungmethode darzustellen, da die H. pylori-Last damit um zwei logarithmische Größenordnungen reduziert werden kann. Eine Eradikation des Erregers wird aber durch eine Vakzinierung nicht immer erreicht (Ermak et al. 1998, Gomez-Duarte et al. 1998, Lucas et al. 2001). Dennoch ist die Entwicklung einer oralen Vakzine gegen H. pylori eine vielversprechende Möglichkeit, die momentan weiterentwickelt wird (Aebischer et al. 2005). Um den Einfluß der H. pylori-Infektion auf die Magenflora und einen möglichen Einfluß eines oralen Vakzins zu untersuchen, kam in dieser Arbeit eine H. pylori-Infektion im Mausmodell (Balb/c) zum Einsatz. Frühere kulturelle Analysen der Magenflora hatten einen Hinweis auf eine erhöhte bakterielle Diversität in H. pylori-infizierten Tieren gegenüber PBS-behandelten Kontrolltieren gegeben (T. Aebischer; persönliche Mitteilung). Um den relativen Anteil einzelner Bakterien an der Gesamt-Flora einschliesslich bisher nicht-kultivierbaren Bakterien darzustellen, wurde die Magenflora infizierter und nichtinfizierter, sowie immunisierter und nichtimmunisierter Tiere mit vergleichender Sequenzanalyse der 16S rRNA-Gene in Klonbibliotheken und mit quantitativer Echtzeit-PCR untersucht. Dabei sollten H. pylori-induzierte Änderungen und der Einfluss der Vakzinierung auf die Diversität der Magenflora analysiert werden. Für die Darstellung komplexer mikrobieller Gemeinschaften einschliesslich der bisher nicht-kultivierbaren Bakterienarten ist dies ein leistungsfähiger Ansatz (von Wintzingerode et al. 1997; Vaughan et al. 2000; Zoetendal et al. 2004ab).

1.5 Molekulargenetische Analyse der mikrobiellen Diversität in komplexen Habitaten

Die Bakteriengemeinschaften in komplexen Habitaten unterliegen stetigen Anpassungsprozessen (Übersichten dazu von: Hunter-Cevera 1998, Bull 2000). Der Gastrointestinaltrakt von Säugetieren stellt aufgrund seiner funktionellen und anatomischen Gliederung eine Vielzahl von Lebensräumen für Bakterien bereit. Die Aktivität und Zusammensetzung der Darmflora ist von vielen Parametern wie z.B. der Verfügbarkeit von Substraten, dem pH-Wert, dem Redoxpotential oder dem Sauerstoffpartialdruck abhängig (Cummings et al. 1987). Von den dominanten Gruppen der menschlichen Darmflora gelten etwa 80% als bisher nicht kultivierbar. Ein wesentlicher Nachteil der kulturabhängigen Verfahren liegt sicher in der wechselseitigen physiologischen Abhängigkeit von Bakterien in einem komplexen Habitat (Hattori et al. 1997). Deshalb können mit kulturabhängigen Verfahren zwar weitreichende Aussagen zur qualitativen und quantitativen Zusammensetzung komplexer Florengemeinschaften getroffen werden, alleine sind sie aber möglicherweise nicht geeignet, um die Diversität eines Habitats komplett zu erfassen (Ward et al. 1990; Amann 1995, Torsvik et al. 1990ab, 1998; Torsvik & Oreas 2002; Dykhuizen 1998). Durch die Etablierung von kultivierungsunabhängigen Methoden konnten in den letzten Jahren viele bisher nicht kultivierbare Bakterienarten beschrieben werden. Einige Studien, die auf Sequenzanalysen des Gens für die bakterielle 16S rRNA basieren, schätzen den Anteil kultivierbarer Bakterien in diversen Habitaten sogar auf nur 0.1% der Gesamtpopulation (Hugenholtz et al. 1998ab, Ward et al. 1998, Dojka et al. 2000, DeLong & Pace 2001). Bakterien können anhand spezifischer Markermoleküle identifiziert und phylogenetisch klassifiziert werden. Über vergleichende Sequenzanalysen dieser Markermoleküle werden phylogenetische Zuordnungen getroffen (Altschul et al. 1997, Cole et al. 2006, Ludwig et al. 2004), wobei für molekulare Taxonomie von Bakterien z. B. Elongationsfaktoren, ATPasen, RNA Polymerase B (rpoB) und die 16S/23S rRNA angewendet werden (Ludwig et al. 1998). Die Arbeiten der letzten Jahre haben gezeigt, dass die ssrRNA-Sequenzen (16S für Prokaryoten, 18S für Eukaryoten) für die Taxonomie besonders geeignet sind, was zu einem schnellen Ansteieg der 16S rRNA-Sequenzinformationen in Datenbanken geführt hat. In der Datenbank der Michigan State Universität („Ribosomal Database Project“, Cole et al. 2005, Version 9.44; 31.10.2006) sind momentan 273.300 Einzelsequenzen verzeichnet. Ausgangspunkt zur Herstellung repräsentativer 16S rRNA Klonbibliotheken ist die Extraktion genomischer DNA aus einer Mischprobe eines komplexen Habitats. Das Gemisch an 16S rRNA-Genen wird in einer Polymerasekettenreaktion mit eubakteriellen Konsensus-Primern amplifiziert (Weisburg et al. 1991), die Amplifikate in Vektoren ligiert und in E. coli transformiert. Die anschliessende Sequenzanalyse redundanter Klonsequenzen kann mittels Hybridisierung gruppen–spezifischer rDNA-Oligonukleotidsonden (Liesack & Stackebrandt 1992, Moter et al. 1998) vereinfacht werden. Die Analyse der gastrointestinalen Flora bei Mensch und Tier basierend auf 16S rRNA-Gensequenzen wird seit einigen Jahren von verschiedenen Arbeitsgruppen angewendet (Zoetendal et al. 1998,2002ab; Leser et al. 2002, Eckburg et al. 2005, Bik et al. 2006; Sokol et al. 2006ab, Martinez-Medina et al. 2006; Übersichten dazu: Tannock 1999, 2001; Dahllöf 2002; Zoetendal et al. 2004ab, 2006). Zur Darstellung der bakteriellen Diversität zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem definierten Abschnittt werden Methoden genutzt, die einen sogenannten „Fingerprint“, einen genetischen Fingerabdruck erstellen (Muyzer & Smalla 1998; Vaughan et al. 2000; Konstantinov et al. 2002). Dazu gehören die Denaturierende--Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE, Muyzer et al. 1993), Temperatur Gradienten, die Temporäre Temperatur Gelelektrophorese (TGGE/TTGE, Muyzer & Smalla 1998), die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus Detektion (SSCP, Lee et al. 1996), die amplifizierte rDNA-Restriktionsanalyse (ARDRA, Massol-Deya et al. 1995) oder die zufallsmediierte Amplifikation von DNA-Polymorphismen (RAPD, Xia et al. 1995). Bei der DGGE ist im Gegensatz zur Klonbibliothek kein Klonierungsschritt erforderlich. Es handelt sich um eine Methode, bei der 16S rRNA-Amplifikate in einem Polyacrylamidgel mit denaturierendem Gradienten elektrophoretisch aufgetrennt werden. Neben den kulturellen Verfahren haben auch biochemische und molekularbiologische Identifizierungsverfahren Limitationen. Mögliche Fehlerquellen liegen z.B. in der Kontamination von Probenmaterial, der DNA-Extraktion, der Primerauswahl für die PCR, der Bildung von Sequenzchimären (von Wintzingerode et al. 1997, Zoetendal et al. 2001) und in der Kombination von PCR und Klonierungsschritten zur Erstellung von 16S rRNA Klonbibliotheken (von Wintzingerode et al. 1997, Leser et al. 2002). In Bakterien können ausserdem mehrere unterschiedliche Kopien des 16S rRNA Moleküls vorliegen (Nübel et al. 1996) und die Menge der 16S rRNA bzw. die Menge an Ribosomen pro Zelle hängt von der Bakterienspezies und von der Wachstumsphase ab.

1.6 Fragestellungen

Da die Aufklärung der Rolle von Komponenten des angeborenen Immunsystems und von definierten Bakterienarten der Darmflora bei CED im Mittelpunkt dieser Arbeit stand, wurden Ileitis und Colitis in gut etablierten Mausmodellen untersucht, die sowohl die Analyse der Darmflora als auch die Untersuchung immunologischer Parameter unter gut kontrollierten, definierten Bedingungen erlaubten. Zunächst wurden molekulare Wechselwirkungen zwischen Darmbakterien und Komponenten des angeborenen Immunsystems in Tieren untersucht, die eine normale Darmflora besitzen, denen aber bestimmte Gene der angeborenen Immunität fehlen. Parallel sollte der Einfluss der Darmflora auf entzündliche Prozesse in keimfreien Tieren analysiert werden, die mit definierten Bakterienarten assoziiert wurden. Schliesslich ermöglichte die Gabe gereinigter TLR-Liganden die Feststellung, welche bakteriellen Komponenten auf Molekülebene Darmentzündung auslösen. Bei der H. pylori-induzierten Veränderung der Mausmagenflora, sollte die Frage beantwortet werden, wie sich die H. pylori-Infektion auf die Diversität der Magenflora auswirkt und wie eine orale Immunisierung mit einer attenuierten Salmonella-Lebendvakzine gegen H. pylori die Magenflora beeinflusst.

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Ziele der vorliegenden Arbeit:


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10.01.2008