Ergebnisse

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3.1  Analyse der Darmflora bei T. gondii-induzierter Ileitis

3.1.1  Analyse der kultivierbaren planktonischen Ileumflora

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Um die Darmflora zu charakterisieren, die im gesunden Ileum und im Ileum bei einer T. gondii-induzierten Ileitis vorlag, wurde eine umfangreiche qualitative und quantitative Analyse der kultivierbaren Darmflora durchgeführt. Sie sollte aufzeigen, welche Bakteriengruppen im gesunden und entzündeten Dünndarm in welcher Menge vorhanden waren. Durch diese detaillierte kulturelle Analyse konnten sowohl aerobe als auch anaerobe Bakterien isoliert und durch eine anschliessende biochemische Leistungsprüfung bis zur Gattungs- bzw. Speziesebene identifiziert werden. Die Darmflora im gesunden Ileum setzte sich überwiegend aus Gram-positiven Bakterien der Gattungen Lactobacillus, Clostridium, Eubacterium und Enterococcus zusammen. Im gesunden Ileum waren aerobe Gram-positive Stäbchen mit 5,7 ± 6,6x108 und Gram-positive Kokken mit 5,9 ± 8,8x106 KBE/g Ileuminhaltnachweisbar. Der Anteil der anaeroben Gram-positiven Stäbchen betrug 1,1 ± 0,9x109 KBE/g (Abb.7; Tab.13, 3.1.4). Im gesunden Ileum betrug dagegen der Anteil aerober Gram-negativer Stäbchen (E. coli) 7,2 ± 9,0x104 KBE/g und anaerobe Gram-negative Stäbchen waren mit weniger als 1x103 KBE/g Ileuminhalt gerade noch nachweisbar. Während des Entzündungsprozesses nahm die Gesamtlast der Bakterien im Ileum von 1.6 ± 0.8x109 KBE/g Darminhalt am Tag null, auf 2,3 ± 2,5x1011 KBE/g Darminhalt am Tag acht p.i. zu. Die Menge der aeroben Darmbakterien stieg von 5,8 ± 6,6x108 auf 1,2 ± 0,9x1011 KBE/g und die Anzahl der anaeroben Darmbakterien nahm von 1,1 ± 0,9x109 auf 1,1 ± 1,8x1011 KBE/g zu (Abb.7; Tab.13). In Mäusen mit akuter Ileitis (Tag acht p.i.) stieg der Anteil aerober bzw. anaerober Gram-negativer Stäbchen Bakterien, die als E. coli bzw. Bacteroides/Prevotella spp. identifiziert wurden, um sechs bis acht logarithmische Stufen an (Abb.7). Es wurden aerobe Gram-negative Stäbchen mit 1,2 ± 0,9x1011 und anaerobe Gram-negative Stäbchen mit 1,1 ± 1,8x1011 KBE/g Ileuminhalt nachgewiesen. Die Anteile an den strikt anaeroben Gram-negativen Bakterien betrugen für Bacteroides spp. 59,1% und für Prevotella spp. 40,9%. Die Bacteroides-Population setzte sich aus den Arten B. ovatus (61,5%), B. merdae (23,1%), B. uniformis (7,7%) und B. thetaiotaomicron (7,7%) zusammen. Die Prevotella-Population setzte sich aus den Arten P. oralis (88,9%) und P. buccae (11,1%) zusammen. Das Überwuchern des Ileums mit Gram-negativen Bakterien begann am Tag sechs p.i., als die E. coli-Last bzw. Bacteroides/Prevotella spp. innerhalb von 24 Stunden von 1,0 ± 1,7x107 auf 6,3 ± 4,8x109 KBE/g für E. coli und von weniger als 1x103 auf 6,7 ± 7,8x108 KBE/g bei Bacteroides/Prevotella spp. anstieg. Im Verlauf der Entzündung nahm der Anteil der Gram-positiven Stäbchen, Laktobazillen und Clostridien, dagegen ab (Abb.7). Es konnten 5,5 ± 4,1x105 KBE/g aerobe Gram-positive Stäbchen, 6,8 ± 6,6x108 KBE/g aerobe Gram-positive Kokken und weniger als 1x103 KBE/g Ileuminhalt Gram-positive anaerobe Stäbchen nachgewiesen werden. Bei den Enterokokken bestehend aus den Arten E. faecalis, E. faecium und E. gallinarum war im Verlauf der Entzündung eine nicht signifikante Anstiegstendenz zu beobachten.

Abb. 7: Quantifizierung kultivierbarer Bakterien im gesunden und entzündeten Ileum. Die Bakterienanzahlen (log KBE/g Ileuminhalt) von gesunden (weisse Balken) und von Tieren mit Ileitis am Tag acht nach T. gondii-Infektion (schwarze Balken) wurden durch Kultivierung ermittelt. E. coli, Milchsäurebakterien (LAB, hauptsächlich Lactobacilli), Bacteroides/Prevotella spp. und Eubacterium/Clostridum spp. wurden mit biochemischer Leistungsprüfung identifiziert. Mittelwerte und Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten (*p<0,05 im Vergleich zu Bakterien in gesunden Mäusen).


Die Ergebnisse der detaillierten Bakterienanalyse zeigten, dass die Bakterienflora im Ileum am Tag acht nach T. gondii-Infektion durch aerobe und anaerobe Gram-negative Stäbchen Bakterien, E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. dominiert wurde.

3.1.2 Histopathologie und Populationsdynamik der Ileitis

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Es sollte untersucht werden, ob und wie sich die Darmflora im Verlauf der Dünndarmentzündung veränderte, und ob Zusammenhänge zwischen dem Entzündungsgrad und Veränderungen der Darmflora erkennbar waren. Dazu wurden Gewebeproben histopathologisch an den Tagen drei, fünf, sechs, sieben und acht nach T. gondii-Infektion untersucht. Zusätzlich wurde die Zusammensetzung der Population der Darmbakterien im Ileum an denselben Zeitpunkten durch PCR-DGGE analysiert. In Abb.9B ist die Kinetik der Histopathologie im terminalen Ileum gezeigt, wie sie sich nach oraler Infektion mit 100 Zysten T. gondii in suszeptiblen C57BL/6-Mäusen entwickelte. Die Analyse der Histopathologie des terminalen Ileums ergab, dass von Tag drei bis Tag fünf nach der Infektion eine nur geringgradige Entzündungsreaktion mit Punktwerten bis zwei im „Histo-Score“ nachweisbar war (Abb.8). Ab Tag fünf verstärkte sich die Entzündung zunehmend mit Puntwerten um ca. vier am Tag sechs p.i. Am Tag acht waren die Tiere mit einem Maximalwert von sechs im „Histo-Score“ schwer krank und wurden getötet.

Abb. 8: Kinetik der Histopathologie des terminalen Ileums nach T. gondii-Infektion. Das Ileum (n=4) wurde an den Tagen null, drei, fünf, sechs, sieben und acht nach Infektion mit 100 Zysten des T. gondii-Stamms ME49 analysiert


Die akute Phase des Entzündungsprozesses zwischen Tag sechs bis acht war von zellulärer Abschilferung, massiver Gewebezerstörung und Epithelnekrose begleitet (Zustand am Tag acht p.i, siehe Abb.9A). Die Darstellung der Darmflora mittels PCR-DGGE ergab, dass diese akute Phase der Ileitis mit grundlegenden Änderungen der Darmflora einherging (Abb.9B). Die Analyse der Anzahl der Banden im DGGE-Gel ergab, dass die bakterielle Diversität mit fortschreitender Entzündung und Gewebszerstörung abnahm. Im entzündeten Darm wiesen Veränderungen der Laufgeschwindigkeit der bakteriellen 16S rRNA-Genfragmente darauf hin, dass sich auch die Zusammensetzung der Artengemeinschaft verschoben hatte und nur noch wenige Bakteriengruppen die Darmflora (Tag acht p.i.) dominierten (Abb.9B). Dies unterstützte die Beobachtungen aus der kulturellen Florenanalyse (3.1.1).

↓26

Abb. 9 (A/B): Histopathologie der T. gondii-induzierten Ileitis und Populationsdynamik der Darmbakterien im Verlauf der Entzündungsreaktion. Dargestellt sind HE-gefärbte Schnitte von Ilea gesunder und T. gondii-infizierter Mäuse mit schweren Nekrose im Ileum am Tag acht p.i. (B) Darstellung des DGGE-basierten „Monitoring“ der Populationsdynamik der Darmflora im terminalen Ileum im Verlauf der Entzündung. Die genetischen Fingerabdrücke aus Gesamt-DNA vom Darminhalt nach Amplifikation von 16S rRNA-Genen (n=3) für Tag drei, fünf, sechs und acht nach T. gondii-Infektion mit den korrespondierende Histopathologie-Punktwerte (unten angezeigt). Die schwarzen und grauen Pfeile markieren Spezies, die während der Entzündung verschwinden bzw. erscheinen. Die zugrundeliegenden Daten stammen aus mindestens drei Mäusen/Gruppe/Experiment. Die Reproduktion erfolgte in zwei unabhängigen Experimenten.


Die Tatsache, dass drastische Änderungen der Darmflora dann auftraten, wenn ab Tag sechs nach der T. gondii-Infektion auch zunehmende Gewebeschäden vorlagen, wies darauf hin, dass die Florenveränderung im Sinne einer reduzeirten Diversität mit dem Schweregrad der Entzündungsreaktion assoziiert war.

3.1.3 Molekulargenetische Analyse der Darmflora

Die kulturelle Analyse wurde durch den Einsatz molekulargenetischer Methoden ergänzt. Die PCR-DGGE wurde als kulturunabhängiges Verfahren angewendet, um ein „Monitoring“ der bakteriellen Diversität des Ileuminhalts durchzuführen und um zusätzlich zu den kultivierbaren Spezeis möglicherweise vertretene nicht-kultivierbare Bakteriengruppen zu detektieren.

3.1.3.1  PCR-DGGE

↓27

Die PCR-DGGE und anschliessende Identifizierung von 16S rRNA aus ausgeschnittenen DGGE-Banden konnte die Ergebnisse aus der kulturellen Analyse bestätigen. Die bakterielle Gemeinschaft des gesunden Ileums bestand aus einer diversen Flora, die vor allem von Lactobacillus sp. dominiert wurde. Die Ergebnisse der 16S Sequenzanalyse aus ausgeschnittenen DGGE-Banden erlaubte keine genauere taxonomische Einordnung der Lactobacillus spp. bezogen auf die individuellen Banden, z.B. bei L. murinus/animalis oder L. gasseri/johnsonii, so dass diese hier jeweils in einer Gruppe dargestellt wurden (Abb.10). Daneben konnten auch 16S Gene für Eubacterium/Clostridium spp., Bifidobacterium spp. und Desulfovibrio sp. im gesunden Ileum nachgewiesen werden. Es fanden sich zudem Vertreter, die taxonomisch den Bacteroides/Prevotella spp. (Porphyromonadaceae) zugeordnet werden konnten. Im entzündeten Zustand war zunächst eine deutliche Reduktion von Banden im DGGE-Profil zu erkennen. Die Flora wurde darüber hinaus am Tag acht p.i., wenn die Tiere sich in einem präfinalem Zustand befanden, von Enterobacteriaceae dominiert (Abb.10). DNA-Banden, die Eubacterium/Clostridium spp. und Bifidobacterium spp. repräsentierten, verschwanden hingegen, ebenso konnten Lactobacillus spp. nicht mehr nachgewiesen werden. Desulfovibrio spp. waren sowohl im gesunden wie im entzündeten Darm nachweisbar.

Abb. 10: Identifikation von Darmbakterien im gesunden und entzündeten Ileum nach PCR-DGGE und 16S rRNA Sequenzanalyse ausgeschnittener Banden. Dargestellt sind die genetischen Fingerabdrücke zur Darstellung der ilealen Darmflora bei C57BL/6 Mäusen nach Amplifikation von 16S rRNA Genen. Die aufgetrennten Amplifikate wurden aus dem DGGE-Gel isoliert und sequenziert. Die taxonomische Zuordnung von 16S rRNA-Genen zu bakteriellen Taxa ist angezeigt. Schwarze bzw. graue Pfeile zeigen Spezies an, die während der Ileitis verschwinden bzw. erscheinen. Offene Pfeile markieren Bakteriengruppen, die sich bei Entzündung nicht verändern. Die Daten sind repräsentativ für mindestens drei Mäuse pro Gruppe aus drei unabhängigen Experimenten.

Die Tatsache, dass sich die Ergebnisse aus den DGGE-Profilen mit der detaillierten kulturellen Analyse deckten, wies darauf hin, dass die DGGE als „Monitoring“-Verfahren geeignet war, um Änderungen der bakteriellen Diversität im Mausdarm darzustellen, auch wenn eine Quantifizierung aufgrund des PCR-Schrittes nicht möglich war.

3.1.3.2 16S rRNA Klonbibliotheken

↓28

Die Beobachtungen aus der Kultivierung und der DGGE-Profile wurden durch die Analyse von 16S rRNA-Klonbibliotheken, hergestellt aus Gesamt-DNA vom Darminhalt gesunder bzw. kranker Tiere (n=3 für jede Gruppe) unterstützt (Abb.11). Insgesamt wurden 156 16S rRNA-Sequenzen analysiert, davon 35 von Tieren mit Ileitis und 121 von gesunden Mäusen. Die Analyse der gesunden Darmflora ergab eine Dominanz von Firmicutes (Lactobacillus/Clostridium spp.) und Bacteroidetes (Bacteroides/Prevotella spp.) mit einem Anteil von 67% bzw. 28% am 16S rRNA Genpool. L. johnsonii war die am häufigsten vertretende Lactobacillus-Spezies (36,6% bezogen auf Firmicutes), gefolgt von L. murinus (20%), L. reuteri (9,9%), L. intestinalis (3,3%) und taxonomisch nicht näher identifizierbaren Lactobacillus spp. (30,2%). Proteobacteria (Desulfovibrionales, Burkholderiales) und Actinobacteria (Coriobacteriales, Bifidobacteriales) repräsentierten lediglich 5% der 16S rRNA-Klone. Im Gegensatz dazu, fanden sich in Klonbibliotheken aus DNA des entzündeten Ileums am Tag acht p.i. (nicht dargestellt in Abb.11) ausschliesslich 16S rRNA-Gene von Enterobacteriaceae (96,6%) und Bacteroides spp. (3,4%).

Abb. 11: Analyse der 16S rRNA-Gene in Klonbibliotheken aus bakterieller DNA vom Darminhalt gesunder C57BL/6 Mäuse mit relativer Verteilung am Gesamt-DNA-„Pool“. Die bakteriellen Taxa sind auf der Y-Achse, die korrespondierenden prozentualen Anteile auf der X-Achse dargestellt. Die Analyse wurde für 121 Klonsequenzen aus drei gesunden Tieren (je 30, 46 und 45 Klone/Tier) und für 35 Klonsequenzen aus zwei Ileitis-kranken Tieren (je 20 bzw. 15 Klone/Tier; in Abb. nicht gezeigt) durchgeführt. Für die taxonomische Einordnung wurden die Programme BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) und das „SeqMatch“-Modul des „Ribosomal Database Project II“ (http://rdp.cme.msu.edu) verwendet.

Im Zusammenhang mit der umfangreichen Analyse der Darmflora im gesunden und entzündeten Ileum deckten sich die Befunde aus den 16S rRNA-Klonbibliotheken und der DGGE mit den Ergebnissen der kulturellen Analyse. Die Darmflora im Ileum der gesunden Mäuse, bestand aus einer überwiegend Gram-positiven Bakteriengemeinschaft, die im Entzündungszustand durch Gram-negative Bakterienarten verdrängt wurde. Die Daten aus kultureller, molekulargenetischer und histologischer Analyse zeigten, dass das Auftreten der Gram-negativen Flora im entzündeten Ileum mit dem Schweregrad der Immunpathologie assoziiert war.

3.1.3.3 Typisierung von E. coli

3.1.3.3.1  RAPD-PCR

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Die Ergebnisse, die mittels der o.g. Analysen einen deutlichen Anstieg von E. coli im entzündeten Ileum ergaben, warfen die Frage auf, ob die im Entzündungszustand isolierten E. coli-Stämme endogener Natur oder exogen erworben waren und möglicherweise pathogene Eigenschaften aufwiesen. Die RAPD-PCR bot die Möglichkeit, mit einer einfachen PCR-basierten Methode zahlreiche Isolate in einem Parallelansatz genotypisch zu untersuchen. Bei dieser Technik zeigen Unterschiede in den zufällig generierten Bandenmustern an, dass Isolate genetisch nicht identisch sind und als separate Subpopulation aufgefasst werden können, die durch klonale Expansion expandiert sind. Um dies zu prüfen, wurden aus den Ilea von C57BL/6 Mäusen (n=5) mit T. gondii-induzierter Ileitis und gesunden Tieren (n=3) E. coli-Einzelkolonien isoliert. Insgesamt wurde die DNA von 140 E. coli-Isolaten aus Ileitis-Darminhalt und 60 E. coli-Isolate aus gesundem Ileum mit der RAPD-PCR untersucht. In Abb.12 sind jeweils zwei repräsentative Bandenmuster pro Tier dargestellt. Die Ergebnisse der RAPD-PCR zeigten, dass die Muster von E.coli-Isolaten aus dem entzündeten und gesunden Ileum identisch waren.

Abb. 12: RAPD-PCR Genotypisierung von DNA aus E. coli -Isolaten. Dargestellt sind die RAPD-Bandenmuster von Isolaten aus dem Ileum bei T. gondii-induzierter Ileitis (Nummer 1-10) und aus dem Ileum gesunder Tiere (Nummer 11-14). Dargestellt sind je zwei repräsentative Isolate pro Tier. Die Gesamtzahl der Isolate betrug: 140 Isolate aus 5 Tieren mit Ileitis bzw. 60 Isolate aus 3 Tieren. ohne Ileitis. Die Spuren 15 bzw. 16 zeigen die Leerkontrolle ohne DNA in der PCR bzw. einen DNA-Grössenmarker.


Nahezu identische genetische Fingerabdrücke (RAPD-PCR) von E. coli-Isolaten aus den Ilea von gesunden und kranken Tieren deuteten darauf hin, dass der im Entzündungsfall akkumulierende E. coli-Stamm höchstwahrscheinlich aus der normalen Darmflora der gesunden Maus stammte.

3.1.3.3.2 Pathotypisierung

↓30

Der Beitrag von E. coli zur Histopathologie wäre aufgrund des Anstiegs um mehrere logarithmische Stufen im entzündeten Ileum auch mit dem Vorhandensein von pathogen-assoziierten Genen erklärbar. Einige der bei E. coli bekannten pathogen-assoziierten Gene wurden daher in ausgewählten Isolaten aus den gesunden bzw. entzündeten Ilea von C57BL/10 und C57BL/6 Wildtyp-Mäusen und TLR-defizienten Tieren untersucht (siehe auch 3.2). Dabei wurden folgende Gene auf Vorhandensein oder Abwesenheit geprüft: Shiga-Toxin 1/2 (stx1/2), Intimin (eaeA), alpha-Hämolysin (hlyA), Serinprotease (espA), Katalase/ Peroxidase (katP) und hitze-stabiles Enterotoxin (astA). Es erfolgte eine stichprobenartige Auswahl von Isolaten, da die Ergebnisse der RAPD-PCR bereits eine klonale Expansion von E. coli nahelegten. Die Isolate 1-3-1, 8-1-1 und 8-2-1 (Abb.13) stammten aus den 60 Isolaten von gesunden Mäusen, die bereits in der RAPD-PCR untersucht worden waren.

Abb. 13: Pathotypisierung von E. coli-Isolaten. E. coli-Isolate aus dem Ileum naiver Wildtyp C57BL/10, BL6 und TLR4-defizienten Tieren und infizierter BL10/BL6 und TLR2-defizienten Mäusen. Die Laktose-Verwertung wird als +/- angezeigt. Nachweis von Shiga-Toxin Genen (stx1/stx2) mittels LightCycler; Gennachweis für eaeA, hlyA, espA, katP, astA, recA, tolC mit konventioneller PCR (s. 2.9.2).


Da keine pathogen-assoziierten Gene in den ausgewählten E. coli-Isolaten nachweisbar waren und von einer klonalen Expansion kommensaler E. coli ausgegangen wurde, waren die immunpathologischen Veränderungen bei der T. gondii-Ileitis wahrscheinlich nicht durch Toxine, Hämolysine, Proteasen oder andere Pathogenitätsfaktoren von E. coli verursacht worden.

3.1.4  Behandlung der Ileitis mit Antibiotika

3.1.4.1  Prophylaktische Behandlung mit Ciprofloxacin / Metronidazol

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Nachdem die Ileitis mit einem massiven Anstieg von E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. im Lumen entzündeter Dünndarmabschnitte verbunden war und die hohe Zahl von Gram-negativen Bakterien an der Mukosa auch den direkten Kontakt von Bakterien mit dem Epithel begünstigte, sollte überprüft werden, ob eine Eradiktion der Gram-negativen Flora eine positive Auswirkung auf die Histopathologie und die Überlebensrate der Tiere hatte. Dazu wurden die Mäuse mit Antibiotika behandelt, welche die entsprechenden Darmbakterien eradizierten. Die Mäuse wurden prophylaktisch, also vor der T. gondii-Infektion, bzw. therapeutisch, nach der Infektion mit Antibiotika behandelt (siehe 2.3.8). Während über 90% der Antibiotika-behandelten Tiere die akute Infektion überlebten, waren am Tag acht p.i. alle Placebo-behandelten Kontrolltiere verstorben. Die prophylaktische Behandlung mit Ciprofloxacin (Cf) und Metronidazol (Mtz) fünf Tage vor der T. gondii-Infektion resultierte in einer Überlebensrate von 60% am Tag zehn p.i. (Abb.14A). Am Tag 22 p.i. waren noch 25% dieser Tiere am Leben. Ciprofloxacin bzw. Metronidazol-Monobehandlung resultierte in einem Überleben von ca. 40% bzw. 30% an Tag zehn p.i. Von den Metronidazol-behandelten Tieren waren am Tag 22 alle verstorben, wohingegen zumselben Zeitpunkt von den Ciprofloxacin-behandelten Tiere noch 15% am Leben waren. Mäuse mit einer kombinierten Behandlung von Ciprofloxacin/Metronidazol zeigten eine leichtgradig bessere Histopathologie im Vergleich zu den jeweils monobehandelten Tieren, die nur eine milde bis moderate Dünndarmentzündung entwickelten. Alle Antibiotika-behandelten Tiere zeigten eine signifikant verbesserte Histopathologie des Dünndarms im Vergleich zu Placebo-behandelten Kotrolltieren (Abb.14B). Eine Antibiotikapropylaxe führte zu einer signifikanten Reduzierung der Darmlängenverkürzung, deren Ausmass den Entzündungsgrad widerspiegelte (in Colitismodellen beschrieben). Bei Mäusen mit schwerer Ileitis war die Dünndarmlänge um 19,0 ± 4,8% verkürzt im Vergleich zu nichtinfizierten Kontrolltieren. Signifikant weniger Dünndarmverkürzung konnte bei Tieren gemessen werden, die mit Ciprofloxacin (8,6 ± 6,1%, p<0,05), Metronidazol (9,3 ± 2,1%, p<0,01) oder einer Kombination aus Ciprofloxacin/Metronidazol (9,5 ± 3,4%, p<0,01) behandelt wurden im Vergleich zu Placebo-behandelten Tieren am Tag acht p.i.

Abb. 14: Überlebensraten und Histopathologie bei Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis und prophylaktischer Antibiotikabehandlung. (A) Dargestellt sind die Überlebensraten bei Behandlung ab Tag fünf vor T. gondii-Infektion mit Ciprofloxacin (Cf, schwarze Quadrate, n=19), Metronidazol (Mtz, offene Quadrate, n=16) Ciprofloxacin plus Metronidazol (Cf + Mtz, graue Quadrate, n=19), Kontrolle (w/o, schwarze Kreise, n=10). (B) Dargestellt ist die Histopathologie am Tag acht p.i. bei Ciprofloxacin-, Metronidazol- und Ciprofloxacin/Metronidazol-behandelten Tieren (n=5 pro Gruppe). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05 Cf+Mtz vs Monobehandlung;**p<0,01;***p<0,001 Antibiotikabehandlungen im Vergleich zur Kontrolle). Daten in Kooperation mit David Fuchs (med.Dissertationsschrift).


Eine parallel durchgeführte kulturelle Analyse der Darmflora bestätigte, dass aerobe und anaerobe Gram-negative Stäbchen durch die Behandlung mit Ciprofloxacin bzw. Ciprofloxacin/Metronidazol auf weniger als 103 KBE/g (Nachweisgrenze) Ileuminhalt gesenkt und damit fast vollständig eradiziert worden waren. Die Mengen von aeroben Gram-positiven Bakterien v.a. Enterokokken nahmen bei kombinierter Gabe von Ciprofloxacin/Metronidazol im Vergleich zu nichtbehandelten T. gondii-infizierten Kontrollen um vier bis fünf logarithmische Stufen ab, der Unterschied war aber nicht signifikant (Tab.13).

↓32

Tab. 13: Bakterienkonzentrationen (log KBE/g Ileuminhalt) nach Antibiotikabehandlung (Daten in Kooperation mit David Fuchs, medizinische Dissertationsschrift)

Behandlungsgruppe (Antibiotika)

Aerob

Anaerob

Gram-negative Stb.

Gram-positive Stb.

Gram-positive Kokken

Gram-negative Stb.

Gram-positive Stb.

Ohne Behandlung

Nicht infiziert

7,2 ± 9,0x104

5,7 ± 6,6x108

5,9± 8,8x106

<1x103

1,1 ± 0,9x109

Infiziert *

1,2 ± 0,9x1011

5,5 ± 4,1x105

6,8 ± 6,6x108

1,1 ± 1,8x1011

<1x103

Prophylaktische Behandlung

Infiziert (Ciprofloxacin)

<1x103

5,0 ± 6,9 x107

0,5 ± 1,1x109

3,2 ± 7,1x108

<1x103

Infiziert (Metronidazol)

5,3 ± 6,8x109

2,6 ± 2,7x108

3,5 ± 2,9x109

<1x103

<1x103

Infiziert (Ciprofloxacin + Metronidazol)

<1x103

1,1 ± 1,3x108

1,5 ± 3,1x104

<1x103

<1x103

Therapeutische Behandlung

Infiziert (Ciprofloxacin)

<1x103

3,7 ± 3,6x107

0,5 ± 1,1x105

3,7 ± 8,3x108

<1x103

Infiziert (Metronidazol)

3,3 ± 3,9x109

5,1 ± 6,1x105

5,1 ± 4,7x109

<1x103

<1x103

Infiziert (Ciprofloxacin + Metronidazol)

<1x103

1,1 ± 1,3x107

3,3 ± 5,1x103

<1x103

<1x103

*Mäuse mit schwerer Ileitis am Tag acht nach T. gondii-Infektion, n=5 pro Gruppe.

3.1.4.2 Behandlung einer bestehenden Ileitis mit Ciprofloxacin/Metronidazol

Um zu zeigen, wie sich eine Antibiotikabehandlung auf eine bereits bestehende Ileitis auswirkte, wurden die Tiere ab dem Tag fünf p.i. täglich mit den o.a. Antibiotika behandelt. Wie bereits erwähnt, waren am Tag fünf p.i. erste histopathologische Veränderungen und parallel dazu ein quantitativer Anstieg der Gesamtbakterienlast, sowie eine qualitative Verschiebung der Dünndarmflorenzusammensetzung erkennbar. Wie bei der prophylaktischen Antibiotikabehandlung wurde auch bei therapeutischen kombinierten Behandlung mit Ciprofloxacin/Metronidazol der Anteil der aeroben Gram-negativen Stäbchen Bakterien auf weniger als 1x103 KBE/g, also bis zur Nachweisgrenze, gesenkt (Tab.13). 20% der Tiere, die eine Kombinationsbehandlung aus Ciprofloxacin/Metronidazol erhalten hatten, überlebten die akuten Phase der Ileitis (Abb.15A) von Tag 14 p.i. bis zum Ende der Beobachtung am Tag 22 p.i. Eine Monobehandlung mit Ciprofloxacin bzw. Metronidazol ergab einen Überlebensvorteil von ca. drei Tagen bis Tag 10/11 p.i. gegenüber den Tieren der Placebo-behandelten Kontrollgruppe, die alle am Tag acht p.i. verstorben waren. Die Histopathologie war bei therapeutischer Antibiotikabehandlung unabhängig vom Antibiotikaregime im Vergleich zu unbehandelten Tieren signifikant verringert (Abb.15B), wobei sich zwischen den Behandlungsgruppen keine histopathologischen Unterschiede ergaben.

Abb. 15: Überlebensraten und Histopathologie bei Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis und therapeutischer Antibiotikabehandlung. (A) Dargestellt sind die Überlebensraten für Behandlung ab Tag fünf nach T. gondii-Infektion mit Ciprofloxacin (Cf, schwarze Quadrate, n=10), Metronidazol (Mtz, offene Quadrate, n=10), Ciprofloxacin plus Metronidazol (Cf + Mtz, graue Quadrate, n=10), Kontrolle (w/o, schwarze Kreise, n=8). (B) Dargestellt ist die Histopathologie bei Ciprofloxacin-, Metronidazol- und Ciprofloxacin/Metronidazol-behandelten Tieren (n=5 pro Gruppe). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05;**p<0,01 im Vergleich zur Kontrolle). Daten in Kooperation mit David Fuchs (med. Dissertationsschrift).

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Die prophylaktische Antibiotikabehandlung mit einer Kombination aus Ciprofloxacin und Metronidazol war effektiver als die jeweilige Monobehandlung bzw. der therapeutische Ansatz. Gesteigerte Überlebensraten und geringere Gewebeschäden waren in beiden Behandlungsschenkeln von einer reduzierten Immunantwort im Ileum begleitet. Dies wurde durch niedrigere in Ileum-Organkulturen gemessenen NO- und IFN-gamma Werte von behandelten Tieren im Vergleich zur Kontrolle deutlich (Abb.16), die den bei gesunden Tieren gemessenen Werten entsprachen.

Abb. 16: Messung von Immunmediatoren in Ileum-Organkulturüberständen nach prophylaktischer Gabe bzw. therapeutischer Antibiotikabehandlung einer bestehenden T. gondii-induzierten Ileitis. Dargestellt sind die NO- bzw. IFN-gamma Werte (pg/mg Protein) für die prophylaktische/ therapeutische Behandlung (Tag fünf vor bzw. nach T. gondii-Infektion). Cf = Ciprofloxacin, Mtz= Metronidazol, w/o=keine Antibiotika, Naive= keine Toxo-Infektion. (* p<0,05;**p<0,01;***p< 0,001).


Da IFN-gamma und NO als Marker für eine Th1-vermittelte Immunantwort gelten und an der Ausprägung des entzündlichen Gewebeschadens ursächlich mitbeteiligt sind, lässt sich aus den Ergebnissen schliessen, dass die erniedrigten Werte für IFN-gamma und NO in antibiotikabehandelten Tieren und die damit assoziierte bessere Histopathologie, sowie der Überlebensvorteil als Folge der Eradikation der Gram-negativen Flora zu werten sein könnte (siehe dazu 4.1.2).

3.1.5 Gnotobiotische C57BL/6-Tiere und definierte Rekolonisierung

↓34

Der spezifische Beitrag einzelner Bakteriengruppen zur T. gondii-induzierten Ileitis wurde bei sogenannten gnotobiotischen (griech.: gnōtós = definiertes; bios = Leben) C57BL/6-Wildtyptieren, bei denen keine kultivierbare Darmflora mehr nachweisbar war, analysiert. Zur Generierung gnotobiotischer Mäuse wurde die Darmflora mit einer fünffachen Antibiotikabehandlung über sechs Wochen eradiziert (siehe 2.3.9). Da sämtliche Tiere dieselbe Antibiotikabehandlung erhielten und sich lediglich durch ihren Kolonisierungsstatus unterschieden, sollte der Beitrag einzelner Bakterien zur Ausprägung der Dünndarmentzündung untersucht werden. Von den gnotobiotischen Tieren ohne Rekolonisierung mit Bakterien überlebten 80% die akute Phase der Infektion am Tag neun p.i. und 75% dieser Tiere überlebten bis zu Tag 28 nach T. gondii-Infektion. Im Gegensatz dazu verstarben alle Tiere, die mit Darminhalt von Ileitis-kranken Tieren oder SPF-Flora rekonstituiert waren, an Tag acht p.i. (Abb.17A). Die Überlebensraten korrelierten mit den im Ileum beobachteten entzündlichen Veränderungen. Während im Ileum gnotobiotischer Tiere keinerlei Entzündungszeichen am Tag acht p.i. nachweisbar waren, entwickelten SPF-Tiere und mit Darminhalt kranker Tiere rekonstituierte gnotobiotische Mäuse zumselben Zeitpunkt schwerwiegende histopathologische Schäden (Abb.17B). Wenn gnotobiotische Tiere mit einzelnen Bakterienarten rekolonisiert wurden, dann unterschied sich das inflammatorische Potenzial der einzelnen Bakterienarten deutlich voneinander. Mäuse, die mit E. coli monoassoziiert wurden, zeigten eine moderate Histopathologie mit drei Punktwerten im „Histo-Score“ des Ileums am Tag acht p.i., überlebten aber nicht nach Tag 13 p.i. (Abb.17A und B). Mit Bacteroides/Prevotella spp. kolonisierte Tiere unterschieden sich histopathologisch nicht signifikant von der E. coli Gruppe, es überlebten aber bis zu 22% der Tiere bis Tag 28 nach T. gondii-Infektion. Gnotobiotische Mäuse mit einer L. johnsonii-Monoassoziation entwickelten dagegen keine Ileitis. Mehr als 80% dieser Tiere überlebten bis Tag neun p.i. und 37.5% bis zum Ende des Beobachtungszeitraums (Abb.17A und B). Eine Rekolonisierung mit L. johnsonii, Bacteroides sp. oder Bacteroides/Prevotella spp. resultierte in einer leichten Erhöhung der NO-Werte gegenüber den gnotobiotischen Tieren. Nach Kolonisierung mit E. coli, SPF-Flora oder Darminhalt kranker Tiere stiegen die gemessenen NO-Werte in Ileum-Organkulturen nochmals deutlich an (Abb.17C). Gnotobiotische Mäuse und solche, die mit L. johnsonii, Bacteroides sp., Bacteroides/Prevotella spp. oder E. coli rekolonisiert waren, zeigten keine signifikanten Unterschiede der IFN-gamma-Werte untereinander. Eine Kolonisierung mit Darminhalt kranker Tiere oder SPF-Flora resultierte jedoch in einem signifikanten Anstieg gegenüber den anderen Gruppen (Abb.17D).

Abb. 17: Darstellung der Überlebensraten und Histopathologie bei rekolonisierten gnotobiotischen Tieren mit T. gondii-Ileitis. (A) Darstellung der Überlebensraten gnotobiotischer Tiere (n=15, offene Kreise, w/o), gnotobiotischer Tiere besiedelt mit: Ileitis-Darrminhalt kranker Tiere (n=7, schwarze Quadrate), E. coli (n=10, schwarze Kreise), Bacteroides/Prevotella spp. (n=9, graue Kreise) oder L. johnsonii (n=10, gestrichelte Kreise). Tiere mit konventioneller SPF-Flora (schwarze Dreiecke) dienten als Kontrolle. (B) Darstellung entzündungsbedingter Gewebeschäden in gnotobiotischen bzw. rekolonisierten Tieren. Analyse der Histopathologie am Tag acht p.i. bei gnotobiotischen Tieren besiedelt mit: Ileitis-Flora, E. coli, Bacteroides/Prevotella spp. oder L. johnsonii oder ohne Besiedelung. Die T. gondii-infizierten SPF-Tiere dienten als Kontrolle (je n=5). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (**p<0,01;***p<0,001 im Vergleich zu nichtkolonisierten gnotobiotischen Tieren). (C/D) Darstellung der NO- und IFN-gamma-Werte im Überstand von Ileum-Organkulturen von gnotobiotischen Tieren ohne Kolonisierung (w/o), nach Kolonisierung mit: L. johnsonii (Lj), Bacteroides spp. (B), Bacteroides/Prevotella spp. (B/P), E. coli (Ec) oder Darminhalt von Tieren mit Ileitis. SPF-Tiere als Kontrolle. Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (n=5/Gruppe; *p<0,05;**p<0,01 im Vergleich zu nichtkolonisierten gnotobiotischen Tieren). Daten in Kooperation mit David Fuchs (med. Dissertationsschrift).

Eine Assoziation von E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. verstärkte additiv die Ausprägung der T. gondii-Ileitis, so dass klar gezeigt werden konnte, dass diese beiden Gram-negativen Bakteriengruppen an der Induktion der Immunpathologie ursächlich beteiligt waren.

3.2  Einfluss von TLR-Defizienz auf die Darmflora bei T. gondii-induzierter Ileitis

↓35

Im T. gondii-Ileitis Modell mit C57BL/6 Mäusen konnte bereits gezeigt werden, dass ein massiver intraluminaler Konzentrationsanstieg von E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. die Entzündungsreaktion verstärkte. Um zu untersuchen, ob das Vorliegen einer TLR-Defizienz einen Einfluss auf die Zusammensetzung der Darmflora und die Entzündungsreaktion haben könnten, wurde die Darmflora bei C57BL/10-Wildtyp Mäusen und TLR-defizienten Tieren mit T. gondii-Ileitis analysiert. Das T. gondii-Ileitis Modell war ursprünglich für C57BL/6 Mäuse etabliert worden. Da die TLR-defizienten Tiere aber einen C57BL/10 genetischen Hintergrund aufwiesen, wurde in Vorversuchen getestet, wie sich eine T. gondii-Infektion auf die C57BL/10-Tiere in diesem Modell auswirkte. Die Florenvergleiche und die klinischen Daten zeigten, dass sich die beiden Mausstämme bezüglich der Florenzusammensetzung und Entwicklung der T. gondii-induzierten Ileitis nahezu gleich verhielten (Daten hier nicht gezeigt). Die C57BL/10-Tiere entwickelten den präfinalen Zustand bzw. eine den C57BL/6-Tieren vergleichbare schwere Histopathologie nach T. gondii-Infektion mit einem Tag Verzögerung, so dass die Probennahme am Tag neun p.i. erfolgte. Die TLR-defizienten Tiere waren entweder homozygot defizient für TLR2, einem Rezeptor zur Erkennung von Zellwandbestandteilen aus Gram-positiven Bakterien, oder für TLR4, einem spezifischen Rezeptor für LPS aus der Zellwand Gram-negativer Bakterien oder für beide.

3.2.1  Analyse der kultivierbaren Darmflora TLR-defizienter Tiere

Eine detaillierte Analyse der kultivierbaren luminalen Darmflora im Ileum zeigte, dass die Konzentrationen der identifizierten Bakteriengruppen, sowohl im gesunden wie auch im Zustand der T. gondii-Ileitis TLR-unabhängig waren. Bei Wildtypen sowie TLR-defizienten Mäusen war der Grad der Ileitis (Tag neun p.i.) von einer Veränderung der Darmflora begleitet. Während der Ileitis stieg sowohl im Wildtyp, als auch bei den TLR-defizienten Tierendie Menge von E. coli signifikant an. Der Anstieg betrug bei den Wildtypen und den TLR2+4-/- Tieren fünf bis sechs logarithmische Stufen, bei den TLR2-/- und TLR4-/- drei bis vier Stufen (Abb.18A). Während der Ileitis (Tag neun p.i.) war eine nicht signifikanter Anstieg der strikt anaeroben Gram-negativen Stäbchen (Bacteroides/Prevotella spp.) um 2-3 logarithmische Größenordnungen im Vergleich zum gesunden Zustand zu beobachten (Abb.18B). Die Bacteroides-Population setzte sich aus B. ovatus, B. merdae, B. uniformis, B. vulgatus und B. thetaiotaomicron, die Prevotella-Population aus P. oralis und P. buccae zusammen. Die Anzahl der Gram-positiven Stäbchen im luminalen Ileuminhalt war bei Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu TLR-defizienten Tieren allenfalls leicht reduziert. Die Zahl der Enterokokken (Enterococcus faecalis, E. faecium, E. gallinarum) zeigte einen im Vergleich zum gesunden Zustand nicht signifikanten Anstieg (Abb.18A).

Abb. 18: Analyse der kultivierbaren Darmflora in TLR-defizienten Tieren mit und ohne T. gondii-Ileitis.
(A) Dargestellt sind die Bakterienkonzentrationen im Ileum von gesunden (n=6) und Tieren mit ausgeprägter Ileitis am Tag neun p.i. (n=9). E. coli (Ec), Milchsäurebakterien (LAB, hauptsächlich Lactobacillus spp.), Bacteroides / Prevotella spp. (B/P). Die Identifikation einzelner Isolate wurde durch 16S rRNA-Sequenzierung bestätigt. Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05). Die Daten wurden in Kooperation mit Julia Niebergall (med. Dissertationsschrift) erhoben. (B) PCR-DGGE Analyse (16S rRNA variable Regionen V6-V8) der Darmflora bei TLR-defizienten Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis. Der Darminhalt von gesunden Mäusen (n=3) und an Ileitis erkrankten Tieren (je n=5) wurde am Tag neun p.i analysiert. Dargestellt sind die Ergebnisse für Wildtyp BL10 (WT, n=3), TLR2-/-, TLR4-/- und TLR2+4-/- (je n=3). Im Rahmen des Entzündungsprozess verschwindende Lactobacillus spp. (offener Pfeil) bzw. erscheinende Enterobacteriaceae (schwarzer Pfeil) DNA-Banden wurden mittels 16S Sequenzanalyse identifiziert.

3.2.2 PCR-DGGE der Darmflora TLR-defizienter Tiere

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Die Ergebnisse der kultivierbaren Flora konnten durch genetische Fingerabdrücke mittels PCR-DGGE bestätigt werden (Abb.18B). Die Sequenzierung von 16S rRNA-Genen aus den korrespondierenden DNA-Banden der DGGE-Profile bestätigte, dass Laktobazillen, die im gesunden Ileum dominant waren (weisser Pfeil, Abb.18B), im entzündeten Ileum durch Enterobacteriaceae verdrängt wurden. Diese akkumulierten im Ileum bei Tieren mit schwerer Entzündung (schwarzer Pfeil, Abb.18B). Es war weder im gesunden noch im entzündeten Ileum ein signifikanter Einfluß einer TLR-Defizienz auf die Zusammensetzung der Darmflora erkennbar.

3.2.3 Überleben, Histopathologie und Immunantwort bei TLR-defizienten Tieren

Da sich in den kulturellen und molekularen Analysen der Florenzusammensetzungen von bzw. bei Wildtyp und TLR-defizienten Tieren nur minimale Unterschiede gezeigt hatten, sollte anschliessend die Frage beantwortet werden, ob ähnlich zusammengesetzte Bakteriengemeinschaften bei TLR-defizienten Tieren auch ähnliche Auswirkungen auf die Entzündungsausprägung nach T. gondii-Infektion hatten. Dazu wurden die Überlebensraten der Tiere, die Histopathologie des Ileums und die Konzentrationen von IFN-gamma und NO in Überständen von Ileum-Organkulturen analysiert. Die klinischen Parameter der Darmentzündung unterschieden sich signifikant zwischen dem Wildtyp und den TLR4-defizienten Tieren. Verglichen zum Wildtyp und den TLR2-/- Tieren wiesen die TLR4-/- und TLR2+4-/- Tiere eine verringerte Mortalität und Histopathologie auf, erkennbar an höheren Überlebensraten (Abb.19A) und verringerten Punktwerten in der Histopathologie (Abb.19B). Die Analyse zeigte, dass es zwischen Wildtyp und TLR2-/- (p<0,88) und zwischen TLR4-/- und TLR2+4-/- (p<0,73) keine signifikanten Unterschiede im kumulativen Überleben gab. Die Überlebensraten (Abb.19A) zeigten, dass die TLR2+4-/- Tiere zu 80% am Tag zehn p.i. überlebten und zu 60% bis Tag 22 p.i. Die TLR4-/- Tiere überlebten zu ca. 65% am Tag zehn p.i. und zu 55% bis Tag 22 p.i. Deutlich davon abgesetzt waren die TLR2-/- Mäuse, die am Tag zehn p.i. nur 20% Überleben zeigten, welches sich vom Tag 14 p.i. bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes auf 10% absenkte (Log Rank Test p<0,0012 TLR2-/- versus TLR4-/-). Die C57BL/10-Wildtypen waren nach Tag 10 p.i. alle verstorben und zeigten damit ein signifikant schlechteres Überleben als TLR4-defiziente Tiere (Log Rank Test p<0,0004 WT versus TLR2+4-/-) (Abb. 19A).

Abb. 19: Überlebensraten bei TLR2-/-, TLR4-/- oder TLR2+4-/- Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis.
(A) Dargestellt ist das Überleben von C57BL/10-Wildtyp (WT, schwarz, n=10), TLR2-/- (dunkelgrau, n=11), TLR4-/- (hellgrau, n=11) und TLR2+4-/- (n=8). Die Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten. Das Uberleben wurde bis Tag 22 p.i. beobachtet. Die Überlebensraten wurde mit dem Kaplan-Meier-Test analysiert. Die Signifikanzen wurden mit dem „Log Rank“ Test berechnet und sind in schwarz bzw. hellgrau dargestellt. (B) Dargestellt ist Histopathologie des terminalen Ileums bei C57BL/10-Wildtyp (WT, n=5), TLR2-/- (n=5), TLR4-/- (n=5) oder TLR2+4-/- (n=5) am Tag neun p.i. (**p<0,01;***p<0,001 im Vergleich zum Wildtyp). Daten aus Abb.19A/B in Kooperation mit Julia Niebergall (med.Dissertationsschrift).

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Die Histopathologie des Dünndarms war zwischen TLR2-/- Mäusen und Wildtypen nicht unterschiedlich, jedoch zeigten die TLR4-/- und TLR2+4-/- Tiere mit Punktwerten zwischen eins bis zwei eine signifikant verminderte Histopathologie im Vergleich zum Wildtyp (Abb.19B).
Eine verminderte Immunpathologie bei TLR4-defizienten Mäusen war assoziiert mit signifikant niedrigeren Werten für IFN-gamma und NO aus Organkulturüberständen entzündeter Ilea (Abb.20). Die IFN-gamma Werte waren beim Wildtyp und allen TLR-defizienten Tieren im entzündeten Ileum immer signifikant erhöht im Vergleich zum gesunden Ileum. IFN-gamma war jedoch im Ileum der TLR4-defizienten Tiere signifikant gegenüber dem Wildtyp und den TLR2-/- Mäusen erniedrigt (Abb.20A). Die für NO gemessenen Werte zeigten, dass es nur bei Wildtyp und TLR2-/- zwischen gesundem und entzündeten Ileum einen signifikanten Anstieg des NO im entzündeten Dünndarm gab. Die NO-Werte aus Ileum-Organkulturüberständen der TLR4-/- und TLR2+4-/- Mäuse waren im entzündeten Ileum dagegen signifikant gegenüber Wildtyp und TLR2-/- erniedrigt, und erreichten damit das niedrige Niveau der gesunden TLR4-/- bzw. TLR2+4-/- Kontrollgruppen (Abb.20B). Als Ergänzung zu diesen Daten war die T. gondii-Infektion und die Dissemination der Parasiten im Dünndarm nicht TLR2- oder TLR4-abhängig. Die Anzahl der Tachyzoiten war in Schnitten vom terminalen Ileum bei Wildtyp und TLR-defizienten Tieren vergleichbar (Daten hier nicht gezeigt; Heimesaat, Fischer et al. 2007).

Abb. 20: Proinflammatorische Mediatoren im Ileum von BL10-WT, TLR2-/-, TLR4-/- und TLR2+4-/- Mäusen. Dargestellt sind IFN-gamma- (A) und NO-Konzentrationen (B) in Überständen aus Ileum-Organkulturen (pg/mg Ileum) von C57BL/10-Wildtyp (WT n=5), TLR2-/- (n=5), TLR4-/- (n=5) oder TLR2+4-/- (n=3). Die Analyse erfolgte von Mäusen mit Ileitis am Tag neun p.i. im gesunden Zustand. Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen (*p<0,05; **p<0,01).

Die Immunpathologie im terminalen Ileum bei einer T. gondii-induzierten Ileitis wurde damit eindeutig durch das Vorhandensein von TLR4 verstärkt.

3.2.4  Einfluss von definierter Rekolonisierung und TLR-Liganden bei gnotobiotischen TLR4-defizienten Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis

↓38

Die Ergebnisse aus den o.a. Versuchen zeigten, dass die bei der T. gondii-induzierten Ileitis beobachtete Immunpathologie durch eine im Entzündungsverlauf akkumulierende Gram-negative Bakterienflora, massgeblich durch E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. bedingt war. Zum anderen verstärkte das Vorhandensein von TLR4 die Dünndarmentzündung. Dies liess darauf schliessen, dass Komponenten Gram-negativer Bakterien ursächlich an der Immunpathologie beteiligt waren.

3.2.4.1  E. coli Monokolonisierung von TLR-defizienten gnotobiotischen Tieren
mit T. gondii-Ileitis

Gnotobiotische C57BL/10 Wildtyp- und TLR2-, TLR4- und TLR2+4-defiziente Tiere wurden sechs Tage vor der T. gondii-Infektion mit einem E. coli-Isolat aus einer Ileitis-kranken Maus monokolonisiert (siehe 2.3.9). Die Herstellung gnotobiotischer Tiere erfolgte durch Behandlung mit fünf verschiedenen Antibiotika über sechs Wochen, wonach keine kultivierbare Darmflora mehr nachgewiesen werden konnte (siehe 2.3.9; 3.1.5). Am Tag neun p.i. erreichten die E. coli-Konzentrationen bei allen Gruppen eine Höhe von 109-1010 KBE/g Ileuminhalt wie auch in konventionellen (nicht gnotobiotischen) Tieren beobachtet. Gnotobiotische TLR-defiziente Tiere erreichten nach Monokolonisierung damit also die gleiche E. coli-Last wie der Wildtyp (Abb.21A). Eine E. coli-Monokolonisierung verstärkte die Ileitis bei gnotobiotischen Wildtyp- und TLR2-defizienten Tieren. Dagegen zeigten TLR4- und TLR2+4-defiziente Tiere nur geringgradige Entzündungsreaktionen, erkennbar an Punktwerten von eins, und wiesen damit eine signifikant geringere Histopathologie im Vergleich zum Wildtyp bzw. TLR2-/- Tieren auf (Abb.21B).

3.2.4.2 Gabe von E. coli Lipid A bei TLR4-defizienten Tieren mit T. gondii-Ileitis

Da die konservierte Lipid A-Komponente des bakteriellen LPS hochspezifisch an TLR4 bindet, wurden gnotobiotische Wildtyp- und TLR4-defiziente Tiere sechs Tage vor der T. gondii-Infektion bis Tag neun p.i. mit gereinigtem E. coli Lipid A im Trinkwasser behandelt (2.3.9). Es sollte analysiert werden, ob eine Gabe von Lipid A ursächlich für die Auslösung einer immunpathologischen Reaktion bei T. gondii-Ileitis sein kann. Die Histopathologie dieser Tiere wurde mit der von E. coli monokolonisierten und konventionellen SPF-Mäusen verglichen (Abb.21C). Die Histopathologie der E. coli Lipid A-behandelten und der E. coli-monokolonisierten Wildtyp-Tiere war am Tag neun p.i. mit Punktwerten von vier im „Histo-Score“ nahezu identisch und damit signifikant erhöht im Vergleich zu den gleich behandelten TLR4-/- Mäusen. Die TLR4-defizienten Tieren entwickelten dagegen keine Ileitis, denn es war keine Histopathologie, sowohl nach Gabe von E. coli Lipid A als auch nach E. coli-Monokolonisierung erkennbar. Wildtyp-Mäuse mit SPF-Flora zeigten mit Punktwerten von fünf eine ausgeprägte Histopathologie signifikant erhöht im Vergleich zu den TLR4-defizienten Tieren mit SPF-Florenbesiedelung (Abb.21C).

↓39

Abb. 21: Abhängigkeit von TLR4 für die Induktion einer T. gondii-Ileitis in E. coli-monokolonisierten oder mit LPS (Lipid A) behandelten gnotobiotischen Mäusen. (A) E. coli-Konzentrationen im terminalen Ileum bei WT (n=3), TLR2-/- (n=3), TLR4-/- (n=3) und TLR2+4-/- (n=3). Mittelwerte+Standardabweichung (nicht signifikant für alle Gruppen). (B) Dargestellt ist der Schweregrad der Ileitis in gnotobiotischen Mäusen (Gb) ohne Besiedelung (weisse Balken) oder mit E. coli-Monokolonisierung (graue Balken) am Tag neun p.i. bei Wildtyp-Mäusen (WT, n=3) und TLR2-/- (n=3), TLR4-/- (n=3) und TLR2+4-/- (n=3) Tieren. Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05 im Vergleich zum Wildtyp und TLR2-/-). (C) Dargestellt ist der Einfluss oraler Gabe von Lipid A (LPS) auf den Schweregrad der Ileitis bei gnotobiotischen (Gb) Wildtyp- (schwarze Balken, n=4) und TLR4-/--Tieren (weisse Balken, n=4) am Tag neun p.i. Im Vergleich dazu PBS-behandelte (WT n=22; TLR4-/- n=7), E. coli-monokolonisierte (WT n=16; TLR4-/- n=7) und SPF-Tiere (WT n=22; TLR4-/- n=9). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (***p<0,001 Wt versus TLR4-/-). Daten in Kooperation mit Julia Niebergall (med. Dissertationsschrift).

Die Gabe von E. coli Lipid A konnte in Wildtyp-Tieren im Rahmen der T. gondii-Ileitis eine Immunpathologie auslösen, die der von E. coli-monokolonisierten Tieren entsprach (Abb.21C). Die Beobachtung, dass TLR4-/--Mäuse vor schwerer Entzündung geschützt waren, bestätigte, dass sehr wahrscheinlich Komponenten Gram-negativer Bakterien, im besonderen die Lipid A-Komponente des bakteriellen LPS die Ileitis über den Mechanismus einer LPS/TLR4-vermittlelten Signaltransduktion verstärkte.

3.2.5 Behandlung von T. gondii-infizierten C57BL/6 Tieren mit Polymyxin B

Um zu untersuchen, ob die oben beschriebene LPS/TLR4-Interaktion als therapeutischer Ansatzpunkt für die Behandlung einer T. gondii-induzierte Ileitis dienen könnte, wurden C57BL/6-Wildtyp Mäuse mit dem nicht resorbierbaren LPS-Antagonisten Polymyxin B behandelt. Die Tiere erhielten dazu, wie oben bereits erwähnt, eine prophylaktische oder therapeutische Gabe von Polymyxin B (siehe 2.3.8). Beide Behandlungsregime mit Polymyxin B konnten die Ileitis abmildern. Das war erkennbar an signifikant höheren Überlebensraten an Tag acht p.i. von 63% bei prophylaktischer bzw. 48% bei therapeutischer Behandlung im Vergleich zu Placebo-behandelten Kontrolltieren, die alle an Tag acht p.i. verstorben waren. In der prophylaktischen Behandlungsgruppe überlebten 5% und in der therapeutischen Gruppe 4% der Tiere bis Tag 22 p.i. Die Histopathologie war signifikant geringer bei prophylaktisch (Punktwerte von drei bis vier) bzw. therapeutisch (Punktwerte vier bis fünf) behandelten Tieren im Vergleich zu Placebo-behandelten Kontrolltieren mit Werten von fünf bis sechs (Abb.22A). Da der Schweregrad der Ileitis mit einer signifikanten Verkürzung des kleinen Intestinums korreliert (Heimesaat et al. 2006), wurde die Dünndarmlänge der behandelten Tiere hier gemessen. Bei Placebo-behandelten Tieren mit schwerer Ileitis (Tag acht p.i.) war das Intestinum signifikant um 19,0 ± 4,8% verkürzt im Vergleich zu gesunden Kontrollen, wohingegen prophylaktisch mit Polymyxin B behandelte Tiere eine geringere Verkürzung von weniger als 10% aufwiesen (Abb.22B). Eine Abmilderung der Entzündungsreaktion im Dünndarm durch die prophylaktische Gabe von Polymyxin B spiegelte sich auch in den erniedrigten NO-Konzentrationen in Ileum-Organkulturüberständen wider. Prophylaktisch behandelte Tiere wiesen vergleichbar niedrige NO-Werte auf wie gesunde Kontrolltiere (Abb.22C). Eine mikrobiologische Analyse der Darmflora von Polymyxin B behandelten Tieren am Tag acht p.i. zeigte, dass der Anteil von E. coli durch Polymyxin B von 1,2 ± 1011 KBE/g Ileuminhalt auf weniger als 103 KBE/g gesenkt und damit selektiv eradiziert wurden. Bei den anderen Bakteriengruppen, den aeroben Gram-positiven Stäbchen bzw. Kokken und den anaeroben Gram-negativen bzw. Gram-positiven Stäbchen konnte kein signifikantes Absenken der Bakterienmengen durch die Behandlung mit Polymyxin B nachgewiesen werden (Heimesaat, Fischer et al. 2007).

↓40

Abb. 22: Histopathologie, Dünndarmverkürzung und NO-Konzentrationen bei C57BL/6-Mäusen mit T. gondii-induzierter Ileitis nach Behandlung mit Polymyxin B. (A) Dargestellt sind die Histopathologie-Punktwerte nach prophylaktischer bzw. therapeutischer Polymyxin B Behandlung (*p<0,05;**p<0,01). (B) Dargestellt ist die prozentuale Dünndarmverkürzung nach prophylaktischer bzw. therapeutischer Polymyxin B Behandlung (n=5/Gruppe) im Vergleich zu Placebo-behandelten Tieren. Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen (*p<0,05 im Vergleich zur Placebogruppe). (C) Dargestellt sind die NO-Konzentrationen in Ileum-Organkulturüberständen nach prophylaktischer Polymyxin B Behandlung (n=4) und bei Placebo-behandelten Tieren (n=5). Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (*p<0,05 im Vergleich zur Placebogruppe). Daten in Kooperation mit Julia Niebergall (med. Dissertationsschrift). Die orale Gabe von Polymyxin B führte zu einer Abmilderung einer T. gondii-induzierten Ileitis. Das Polymyxin B hatte dabei vermutlich zwei Effekte, zum einen die nachgewiesene selektive Eradizierung von E. coli und möglicherweise auch die Abschwächung des TLR4/LPS-vermittelten Signalweges durch Bindung des bakteriellen LPS. Damit konnte in Ergänzung zu den o.a Ergebnissen bestätigt werden, dass die T. gondii-induzierte Dünndarmentzündung durch diesen Signalweg verstärkt wurde. TLR4-Antagonisten könnten demanch einen therapeutischen Ansatzpunkt für die Behandlung der Ileitis bieten (s. Diskussion).

3.2.6 RNA-Expressionsanalyse bei TLR-defizienten Tieren mit T. gondii-Ileitis

Um nachzuweisen, ob die Ileitis auch mit der verstärkten Expression entzündungsspezifischer Gene assoziiert war, wurden mRNA-Arrayanalysen von Gesamt-RNA-Extrakten aus dem Ileum jeweils eines C57BL/10-Wildtyp Tieres, eines TLR2- bzw. TLR4-defizienten Tieres im gesunden Zustand und bei T. gondii-induzierter Ileitis (Tag acht p.i.) durchgeführt. Zunächst wurden die Expressionsdaten von Wildtyptieren im gesunden im Vergleich zum entzündeten Ileum analysiert. Desweiteren wurden die Expressionsdaten insbesondere auf eine TLR4-abhängige Regulierung hin untersucht. Dies bedeutet, dass nur die TLR4-defizienten Tiere eine Expressionsregulation aufwiesen, während im Wildtyp bzw. TLR2-/- keine Änderung erfolgte („No Change“, siehe 2.10). Da aus Kostengründen zunächst nur jeweils ein gesundes bzw. T. gondii-infiziertes Tier (Wildtyp BL10, TLR2-/- und TLR4-/-) untersucht wurde, war keine statistische Analyse möglich. Im Ileum von Wildtyp-Tieren mit schwerer Ileitis war die Expression von Genen für proinflammatorische, z.B. Lipocalin, Chitinase-3-like 3-Protein, CXCL9 oder Calgranulin, als auch antiinflammatorische Faktoren, z.B. Gp49, Timp1 und Suppressoren des Zytokin-Signalweges hochreguliert (Tab.14/15). Die erhöhte bzw. erniedrigte RNA-Expression ausgewählter Transkripte im Wildtyp (Tab.14/15) deckte sich mit den Beobachtungen zur Immunpathologie der Ileitis aus den vorangegangenen Experimenten (3.1.1 bis 3.1.5). Einige regulierte Transkripte werden imfolgenden exemplarisch aufgeführt (Gesamttabellen siehe Anhang Tab.A-C). Das Lipocalin 2 (Lcn2) hindert Bakterien dadurch am Wachstum, dass es die Eisenbindung durch Bakterien über Siderophore verhindert. Die Bildung von Lipocalin 2 (Lcn2) in Immunzellen wird durch TLR4 nach Stimulation mit Bakterien induziert (Flo et al. 2004; Fischbach et al. 2006). Lcn2 war im Wildtyp deutlich stärker erhöht, als in den TLR-defizienten Tieren. Das Signal log Verhältnis betrug beim Wildtyp 8,25, bei TLR4-defizienten Tieren nur 2,21 (Tab.14). Proteine der Chitinase-Familie sind mit Entzündung assoziiert (Chang et al. 2001; Nio et al. 2004). Das Makrophagenprotein (Lectin) Ym1 hat eine 30%ige Homologie zur bakteriellen Chitinase und wird bei Entzündungen gebildet (Chang et al. 2001). Das in diese Familie gehörende „Chitinase-3-like-3“-Protein, war im Wildtyp mit einem Signal log Verhältnis von 7,25 stärker hochreguliert als bei den TLR2-/- (5,06) bzw. TLR4-/- (5,08). Die heterodimeren S100-Calcium-Bindeproteine A8 und A9 (Calgranulin A/B) sind in Entzündungsherden und im Cytoplasma von neutrophilen Granulozyten zu finden. Nach Stimulation mit LPS kommt es zur Sekretion von Calgranulin A/B aus neutrophilen Granulozyten und Makrophagen und in Folge zur weiteren Migration von neutrophilen Granulozyten (Ryckman et al. 2003; Vandal et al. 2003; Sunahori et al. 2006; Anceriz et al. 2007). Da dieser Prozess über LPS stimuliert werden kann, ist er hochwahrscheinlich TLR4-abhängig. Dies konnte z.B. in der Expressionsstärke von S100 A8 (Calgranulin A) im Wildtyp nachvollzogen werden, die gegenüber TLR4-/--Tieren deutlich erhöht war (Tab.14). Der Chemokin-Ligand 9 (CXCL9) war in Wildtyp-Tieren ebenfalls sehr deutlich (6,26) im Vergleich zu TLR2-/- (2,37) und TLR4-/- (2,75) hochreguliert. In einem Colitismodell mit adoptiven Transfer von CD4+CD25- T-Zellen in SCID-Mäuse konnte z.B. gezeigt werden, dass in Tieren, die durch den Erhalt von CD4+CD25+ (Treg)-Zellen vor Colitis geschützt waren, die mRNA-Werte für den entzündungsassoziierten Chemokinrezeptor CXCR3 und dessen Ligand CXCL9 deutlich vermindert waren (Kristensen et al. 2006). Die RNA-Expression von Gp49A(B), Timp1, Serpina3n und dem Protein Nummer 9 der C-Typ Lectin-Superfamilie wurden z.B. als anti-inflammatorisch kategorisiert. Das auf der Oberfläche von neutrophilen Granulozyten konstitutiv exprimierte Protein Gp49B1 verhindert neutrophil-abhängige Gefäßschäden, die als Antwort auf LPS-Stimulation folgen (Zhou et al. 2003). Timp1 (engl.: tissue inhibitor of metalloproteinase 1) ist einer der intrinsischen Inhibitoren von Matrix-Metallo-Proteinasen, die als Haupteffektoren des T-Zell vermittelten Gewebeschadens gelten. In einer cDNA-Makroarray Studie bei Patienten mit ulzerativer Colitis wurde Timp1 als eines der hochregulierten Gene in entzündeten Gewebeabschnitten identifiziert (Okahara et al. 2005). In den hier vorliegenden Daten war klar erkennbar, dass im Wildtyp eine verstärkte Aktivierung von Timp1 im entzündeten Ileum vorlag, während die TLR-defizienten Tiere eine Herunterregulation zeigten. Serinprotease-Inhibitoren, z.B. Serpina3 (Antichymotrypsin) nehmen Einfluss auf die Regulation von Proteasen in Leukozyten im Verlauf von Entzündungsvorgängen. Sie gelten als Plasma-Proteinase-Inhibitoren der akuten Phase und kontrollieren überschiessende entzündlich bedingte Gewebeschäden (Dickson & Alper 1974). Proteine der C-Typ Lectin Superfamilie sind an verschiedenen anti-inflammatorischen Antworten beteiligt, beispielsweise an der verstärkten Aggregation von Bakterien (Iovanna & Dagorn 2005). Die Expression von Serpina3 und C-Typ Lectin Nr.9 war im Wildtyp gegenüber TLR4-/- erhöht (Tab.14). Weiterhin waren Transkripte der Gene für Proteine der Zell-Zell-Interaktionen von Lymphozyten wie Selectin, Protocadherin und Phosphoprotein 1 bei T. gondii-Ileitis im Wildtyp ebenso hochreguliert, wie das der Komplement-Komponente 1. Die Hochregulierung von Interleukin 1-beta und die Gegenregulation durch einen Suppressor des Zytokin-Signalweges entsprach dem erwarteten Entzündungsprozeß vom Th1-Typ nach T. gondii-Infektion ebenso wie die Hochregulierung eines Rezeptors für einen koloniestimulierenden Faktor („CSF-Receptor 2“), der die Migration neutrophiler Granulozyten an den Entzündungsherd steuert (Tab.14).

Tab. 14: Expression bei Ileitis (Tag acht p.i.) versus Tag null bei Wildtyp BL10, TLR2 -/- und TLR4 -/-. Hochregulierte RNA-Expression (Signal log-Verhältnis >3) und funktionelle Zuordnung (Auswahl; Gesamttabelle A, siehe Anhang).

Bezeichnung

Signal log Verhältnis / Genotyp

Molekulare FunktionBiologischer Prozeß

(MGI Database)

WT BL10

TLR2-/-

TLR4-/-

Lipocalin 2

8,25

4,14

2,21

Binding, transporter activity

Chitinase3-like3

7,25

5,06

5,08

Inflammatory response

S100 calcium binding protein / A8 (Calgranulin A)

6,07

3,13

1,49

Chemotaxis, calcium ion binding

S100 / A9 (Calgranulin B)

7,08

5,3

4,84

Leukocyte chemotaxis, Calcium ion binding

CXCL9 Chemokine (C-X-C motif) ligand 9

6,26

2,37

2,75

Inflammatory response, Chemokine/cytokine activity

Inflammatory response, Chemokine/cytokine activity

Glycoprotein gp49A

6,69

3,5

1,73

Leukocyte immunoglobulin-like receptor, subfamily B

Serin peptidase inhibitor Serpina3n

6,07

4,32

1,55

Acute phase response, Serine-type endopeptidase inhibitor activity

C-type lectin superfamily, Nr. 9

6,6

4,06

3,6

Immune response, Heterophilic cell adhesion

Tissue inhibitor of metalloproteinase Timp1

6,16

-0,18

-0,15

Metalloendopeptidase inhibitor activity

Selectin lymphocyte

5,42

0,13

1,32

Cell adhesion of lymphocytes

Protocadherin alpha family

4,2

0,39

-3,78

Calcium dependent cell-cell adhesion

Platelet derived growth factor receptor, alpha polypeptide

5,49

-0,9

0,19

Protein-tyrosine kinase activity, Receptor activity

Protein-tyrosine kinase activity, Receptor activity

Complement component 1, subcomponent

4,1

-0,41

0,95

Innate immune response, Proteolysis, Complement activationInnate immune response, Proteolysis, Complement activation

Secreted phosphoprotein 1

5,39

-0,73

2,94

T-helper 1 type immune response, Integrin binding, Cytokine activity

T-helper 1 type immune response, Integrin binding, Cytokine activity

Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage)

5,49

2,33

0,25

Interleukin receptor activity, Cytokine and chemokine mediated signaling pathway

Interleukin 1 beta

4,66

-1,5

-0,56

Interleukin-1 receptor binding, Inflammatory response, Leukocyte migration, Neutrophil chemotaxis

Suppressor of cytokine signaling 1

5,4

2,48

2,76

Negative regulation of JAK-STAT cascade, Cytokine and chemokine mediated signaling pathway

↓41


Während der T. gondii-induzierten Ileitis waren beim Wildtyp Gene herunterreguliert, die Kinaseaktivität aufweisen, z.B. die LPS-induzierbare Thymidinkinase, „met proto-oncogene“ und „V-erb-b2“ (Tab.15). „Bcl2-like1“ und das Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-Protein 4 sind mit Anti-Apoptose-Aktivität assoziiert (MGI Database) und führten durch die Herunterregulierung im Wildtyp wahrscheinlich zu einer verstärkten Apoptose-Aktivität. Resistin steht in Verbindung zur angeborenen Immunantwort und Homeostaseaktivität. Hogan et al. (2006) konnten in einem DSS-Colitis Modell zeigen, dass ein Resistin-ähnliches Molekül (RELM-beta) wesentlich an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des Colonepithels beteiligt war. Im Wildtyp und TLR2-/- war die Expression von Resistin deutlich vermindert, nicht aber bei TLR4-/-.

Tab. 15: Expression bei Ileitis (Tag acht p.i.) versus Tag null bei Wildtyp BL10, TLR2 -/- und TLR4 -/-. Herunterregulierte RNA-Expression (Signal log Verhältnis < minus 3) und funktionelle Zuordnung (Auswahl; Gesamttabelle B, siehe Anhang).

Bezeichnung

Signal log Verhältnis / Genotyp

Molekulare Funktion /

Biologischer Prozeß

(MGI Database)

WT BL10

TLR2-/-

TLR4-/-

Insulin-like growth factor binding protein 4

-4,98

-0,35

-0,52

Insulin-like growth factor binding protein 4, Regulation of cell growth

Max dimerization protein

-5,76

-2,3

0,11

Transcription regulator activity

Thymidylate kinase family LPS-inducible member

-4,62

-1,43

0,04

Thymidylate kinase activity

Met proto-oncogene

-5,34

-1,01

-1,53

Activation of MAPK activity, Protein kinase activity

Bcl2-like 1

-4,57

-1,85

-0,26

Anti-apoptosis activity

Resistin

-4,88

-3,52

0,38

Innate immune response, Homeostasis activity

Gap junction membrane channel protein beta 1

-5

-1,32

-0,24

Gap-junction forming channel activity, Cell-cell signalling

V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 (avian)

-5,51

-2,61

-0,57

Transmembrane receptor protein Tyrosine kinase signaling pathway

Purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel 4

-4,77

-1,9

-0,13

ATP-gated cation channel activity

Integrin alpha 3

-5,77

-0,68

-0,08

Receptor activity, Integrin-mediated signaling pathway

Für die TLR4-abhängig regulierte Expression (Tab.16) konnten Gene identifiziert werden, die mit T-Zell Interaktionen assoziiert sind. TLR4-abhängig hochreguliert war hier beispielsweise der „Killer cell lectin-like receptor“, der die durch natürliche Killerzellen vermittelte Zytotoxizität negativ reguliert. Transkripte, mit einer entzündungsverstärkenden T-Zell Assoziation, wie z.B. das CD80-Antigen und das Endomucin (CD43), waren dagegen herunterreguliert. Eine negative Regulation der Endozytose ist mit einer Proteinkinase C assoziiert, die TLR4-abhängig hochreguliert war. Das Hitzeschockprotein Hsp60 hat viele Funktionen und wird bei Streß, aber auch bei immunologischen Prozessen vermehrt gebildet (Wallin et al. 2002). Hsp60 war in der vorliegenden Arbeit gering TLR4-abhängig hochreguliert, jedoch beim Wildtyp und TLR2-/- deutlich erniedrigt. In einem Hepatitis-Modell wurde beschrieben, dass Hsp60 die Th1-vermittelte Immunantwort inhibieren kann (Zanin-Zhorov et al. 2005). Als Kostimulator kann es auf regulatorische T-Zellen (Treg, CD4+CD25+) wirken und somit die adaptive Immunantwort herunterregulieren (Zanin-Zhorov et al. 2006). Proinflammatorisch assoziierte Transkripte waren dagegen herunterreguliert, z.B. ein TNF-alpha Rezeptor, eine Procollagen C-Proteinase, ein Integrin und eine 12-Lipooxygenase. Sehr interessant war auch die Herunterregulation der Matrixmetalloproteinase 13, die durch IFN-gamma aktiviert wird und damit erheblich zur Gewebezerstörung beitragen kann (Ahmad et al. 2006).

↓42

Tab. 16: TLR4-abhängige Expression bei Ileitis (Tag acht p.i.) versus Tag null. Regulierte RNA-Expression; Signal log Verhältnis als Anstieg >1,5 (I=Increase) oder Abstieg < minus 3 (D=Decrease) und funktionelle Zuordnung (Auswahl; Gesamttabelle C, siehe Anhang).

Bezeichnung

Signal log Verhältnis / Genotyp

Molekulare Funktion /

Biologischer Prozeß

(MGI Database)

I / D*

 

WT BL10

TLR2-/-

TLR4-/-

Killer cell lectin-like receptor subfamily B member 1D

-4,08

0,97

4,46

Negative regulation of natural killer cell mediated cytotoxicity, Receptor activity

Heat shock protein, A

-2,49

-4,04

1,82

Protein folding, Response to heat

Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1

-0,86

-2,54

3,08

Negative regulation of endocytosis, Cytoskeletal protein binding, Kinase activity

Matrix metalloproteinase 13

-0,69

1,52

-5,73

Collagen catabolic process, Metalloendopeptidase activity

Hyaluronan and proteoglycan link protein 2

-0,49

-2,56

-4,08

Hyaluronic acid binding, cell adhesion

Arachidonate 12-lipoxygenase

4,19

1,32

-5,1

Arachidonate 12-lipoxygenase activity, Leukotriene biosynthetic process

Transducin (beta)-like 1X-linked receptor 1

2,92

-0,63

-3,27

GTPase activity, Signal transduction

Endomucin

1,28

-3,64

-4,51

Cell adhesion, T cell binding

Integrin beta 1 (fibronectin receptor beta)

0,14

-1,04

-3,36

Integrin binding, Integrin-mediated signaling pathway

Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a

-0,13

0,36

-3,53

Lymph node development, Receptor activity

Procollagen C-proteinase enhancer protein

0,45

-1,33

-3,91

Nucleic acid binding, Proteolysis

Latent transforming growth factor beta binding protein 3

0,13

-0,22

-3,48

Transforming growth factor beta receptor signaling pathway, Growth factor binding

CD80 antigen

1,11

2,05

-3,38

Receptor activity, T cell costimulation

Beta-site APP cleaving enzyme 1

-0,44

0,07

-4,53

Aspartic-type endopeptidase activity, Proteolysis

*I/D = "Increase" oder "Decrease" (siehe 2.10); MGI Database: http://www.informtics.jax.org/

3.3  DSS-Colitis bei TLR-defizienten Tieren

3.3.1  Analyse der kultivierbaren Colonflora bei TLR-defizienten Tieren

Da es sich bei der DSS-induzierten Colitis um ein anderes Organsystem und ein chemisch induziertes Entzündungsmodell, anders als bei der T. gondii-induzierten Ileitis handelte, sollte hier eine globale Analyse der Colonflora durchgeführt werden. Das Ziel hierbei war, mögliche entzündungsassoziierte Änderungen bakterieller Gruppen herauszuarbeiten. Die umfangreiche kulturell-mikrobiologische Analyse vom Darminhalt des Colons wurde analog durch molekulargenetische Methoden ergänzt. Die Konzentration von kommensalen E. coli im Colon stieg bei kranken Wildtyp-Tieren im Vergleich zu gesunden signifikant um vier logarithmische Stufen an (*p <0.05; Abb.23A). Hingegen stieg die E. coli-Last bei TLR-defizienten Tieren mit DSS-Colitis weniger als bei Wildtyp-Mäusen an. Die Anzahl der Enterokokken, Laktobazillen, Bacteroides/Prevotella spp. und Clostridien unterschieden sich nicht signifikant zwischen Wildtyp und TLR-defizienten Tieren weder im gesunden, noch im entzündeten Zustand. Enterococcus spp. und Bacteroides/Prevotella spp. stiegen zwar tendenziell an, der Unterschied war aber nicht signifikant (Abb.23B). Die Bacteroides-Population setzte sich nach biochemischer Analyse und Bestätigung über 16S rRNA-Sequenzanalyse folgendermassen zusammen: Bacteroides ovatus, B. merdae, B. uniformis, B. vulgatus und B. thetaiotaomicron. Die Prevotella spp. setzten sich aus P. oralis und P. buccae, und die Enterococcus spp. aus E. faecalis, E. faecium und E. gallinarum zusammen (Abb.23).

Abb. 23: Zusammensetzung der kultivierbaren Darmflora von gesunden (G, weiße Punkte) und Tieren mit schwerer Colitis (K, graue Punkte) am Tag acht nach siebentägiger DSS-Behandlung angegeben in log KBE/g Coloninhalt. (A) Dargestellt sind die Werte für E. coli und Enterococcus spp. und in (B) für Lactobacillus spp., Bacteroides/Prevotella spp. und Clostridium spp. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Mäuse mit Bakteriennachweis pro Anzahl aller Versuchstiere dieser Gruppe an. Angegeben sind Einzelwerte (Punkte) und Mittelwertbalken (*p< 0,05 im Vergleich zu gesunden Tieren). Daten in Kooperation mit Julia Niebergall (med. Dissertationsschrift).

↓43


Der signifikante Anstieg von E. coli im Wildtyp zeigte, dass auch bei der DSS-Colitis wie schon bei der T. gondii-Ileitis beobachtet, eine entzündungsbedingte Erhöhung der Gram-negativen Bakterienlast zu finden war.

3.3.2 Schweregrad der DSS-Colitis bei TLR-defizienten Tieren

Um den möglichen Einfluss von TLR2 und TLR4 auf die Ausprägung einer Colitis zu untersuchen, wurden C57BL/10 Wildtyp, TLR2-, TLR4- und TLR2+4-defiziente Tiere im DSS-induzierten Colitismodell untersucht. Nach siebentägiger DSS-Behandlung, entwickelten die Wildtyptiere ausgeprägte Symptome einer Colitis bis zu einem klinischen Gesamtindex von 11 Punkten (0-12, siehe 2.3.5). Die TLR-defizienten Tiere jedoch zeigten signifikant niedrigere Werte von sieben (TLR2-/- und TLR4-/-) bzw. vier (TLR2+4-/-) im klinischen Gesamtindex und signifikant erniedrigte IFN-gamma Werte gegenüber dem Wildtyp in Organkulturüberständen aus mesenterialen Lymphknoten (MLN). Es wurden hier die Daten für MLN dagestellt, weil sich im Colon keine signifikanten histopathologischen Unterschiede zwischen Wildtyp und TLR-defizienten Tieren ergeben hatten (siehe auch 3.3.4) und nur in den MLN signifikante Unterschiede bezüglich IFN-gamma darstellbar waren (Abb.24B).

Abb. 24: Klinischer Colitisschweregrad und IFN-gamma-Werte bei Wildtyp, TLR2-/-, TLR4-/- und TLR2+4-/- Mäusen. (A) Dargestellt ist der klinische Gesamtindex am Tag acht nach siebentägiger DSS-Behandlung: Wildtyp C57Bl/10 (schwarze Balken, n=10), TLR2-/- (dunkelgraue Blaken, n=10), TLR4-/- (hellgraue Balken, n=12) und TLR2+4-/- (weisse Balken, n=11). Die Daten stammen aus zwei unabhängigen Experimenten. (B) Dargestellt sind die IFN-gamma Konzentrationen aus Organkulturüberständen von MLN. Die MLN stammten von Wildtyp (WT, schwarze Balken, n=3), TLR2-/- (dunkelgrau, n=4), TLR4-/- (hellgrau, n=4) und TLR2+4 -/- (weiss, n=4) Mäusen mit Colitis an Tag acht (nach siebentägiger DSS-Behandlung). Die Daten stammen aus (***p<0,001 im Vergleich zum Wildtyp).

↓44


Die reduzierten Colitissymptome waren mit verminderter entzündlicher Aktivität assoziiert, wie an den erniedrigten IFN-gamma Werten aus den MLN der TLR-defizienten Tiere im Vergleich zum Wildtyp zu erkennen war (Abb.24B). Unter Berücksichtigung der Ergebnisse zur kultivierbaren Colonflora, kann man schliessen, dass die hohen E. coli-Konzentrationen bei Colitis an den klinischen Schweregrad gekoppelt waren.

3.3.3 Molekulare Charakterisierung der Colonflora in TLR-defizienten Mäusen mit DSS-Colitis

Mittels PCR-DGGE wurden molekulare Fingerabdrücke der Colonflora bei gesunden und an Colitis erkrankten C57BL/10 und TLR-defizienten Tieren erstellt (Abb.25). Da bei der Colitis ausschliesslich ein signifikanter Anstieg der kultivierbaren Gram-negativen Bakterien (E. coli) bei Wildtyp-Tieren im Vergleich zu den TLR-defizienten Tieren beobachtet werden konnte, wurden auch molekulare Muster aus dem Coloninhalt TLR2+4-defizienter Tiere erstellt, um möglicherweise noch andere Bakteriengruppen zu detektieren, die mit dem Schweregrad der Colitis assoziiert waren. Die DGGE-Profile zeigten, dass die akute Phase der Colitis von starken Veränderungen der Darmflora begleitet wurde. Die Sequenzanalyse einzelner Banden aus den DGGE-Profilen bestätigte eine Verschiebung der Bakterienzusammensetzung zur Familie der Enterobacteriaceae (Abb.25A). Zudem war in den DGGE-Profilen von Mäusen mit Colitis eine reduzierte Diversität der Darmflora zu erkennen. Sequenzanalysen von DGGE-Banden deuteten an, dass nicht-kultivierbare Spezies aus der Gruppe Bacteroidales, Bryantella spp., Tannerella spp. und einige Clostridien und Laktobazillen im entzündeten Colon verschwanden (Abb.25A). Zum anderen war eine Bande, die 16S rRNA-Gene der Clostridiales repräsentierte, im entzündeten Colon im Wildtyp deutlich dominanter (Abb.25A), als im gesunden Zustand zu erkennen, was auf eine mögliche Akkumulation der entsprechenden Bakteriengruppe bei Colitis hinwies. Mit der PCR-DGGE-Analyse aus dem Coloninhalt von TLR-defizienten Tieren konnten ebenfalls Änderungen der Darmflora bei Colitis nachgewiesen werden (Abb.25B repräsentativ für TLR2-/- und TLR4-/-, Daten hier nicht gezeigt). Die 16S Sequenzanalyse entsprechender DNA-Banden des DGGE-Profils bestätigte, dass Laktobazillen, die normalerweise im gesunden Colon zu finden waren, bei Entzündung durch Enterobacteriaceae verdrängt wurden. Ein Anstieg von nicht-kultivierbaren Clostridien, wie bei der DSS-Colitis im Wildtyp beobachtet, konnte allerdings bei den TLR-defizienten Tieren nicht verzeichnet werden (Abb.25B).

Abb. 25: DGGE (Variable 16S rRNA-Region V6-8, 16S Primer 968F-GC und 1378R) von Bakteriengemeinschaften von Wildtyp und TLR2+4-defizienten Tieren im gesunden Colon und mit Colitis. (A) Dargestellt sind die DGGE-Profile der gesunden Flora und bei Colitis (Tag acht nach siebentägiger DSS-Gabe) beim C57BL/10 Wildtyp. Die taxonomische Einordnung nach 16S rRNA-Sequenzanalyse der korrespondierenden DNA-Banden aus den DGGE-Profilen von gesunden bzw. Wildtyp-Tieren mit Colitis ist links bzw. rechts angezeigt. (B) Dargestellt sind die DGGE-Profile der Colonflora von gesunden bzw. TLR2+4-/- mit Colitis. Die DGGE-Profile aus Gesamt-DNA von Coloninhalten der TLR2-/- und TLR4-/- Tiere ergaben nahezu identische Muster. Die Daten von TLR2+4-/- sind daher repräsentativ. Die DGGE-Profile sind repräsentativ für 3 Mäuse/Gruppe/Experiment. Die Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten.

↓45


Die molekularen Daten konnten die Ergebnisse der kulturellen Analyse bestätigen, dass die DSS-Colitis von einem Anstieg der Enterobacteriaceae begleitet war. Zudem ist in der DGGE erkennbar, dass möglicherweise bestimmte nicht-kultivierbare Clostridien im entzündeten Colon des Wildtyps verstärkt auftraten.

3.3.4  Entwicklung einer komplexen Colonflora bei TLR-defizienten Tieren

Es sollte analysiert werden, ob eine TLR-Defizienz einen erkennbaren Einfluss auf die Zusammensetzung einer komplexen Darmflora im gesunden Colon hat. Dazu wurde die Colonflora von gesunden TLR2-/-, TLR4-/--und TLR2+4-/--Tieren mit PCR-DGGE und mittels 16S rRNA-Klonbibliotheken analysiert (Abb.26). Die Versuchstiere (n=3 pro Gruppe) wurden im gleichen Alter von drei Monaten getötet und der Coloninhalt (ein Pellet) aus distalem Coloninhalt entnommen. Die bakteriellen Gemeinschaften wurden über die Erstellung und Analyse von 16S rRNA-Klonbibliotheken und 16S PCR-DGGE charakterisiert. Die Sequenzanalyse der Klonbibliotheken mit 16S rRNA-Genen und die Speziesidentifikation durch Vergleich mit Datenbankeinträgen zeigte, dass die Zusammensetzung der Darmflora in den dargestellten taxonomischen Einheiten zwischen TLR-defizienten Tieren und dem Wildtyp nicht signifikant unterschiedlich war (Abb. 26A). Dies wurde auch durch die Ergebnisse der DGGE-Analysen bestätigt. Die entsprechenden genetischen Fingerabdrücke der Colonflora von TLR2-, TLR4- und TLR2+4-defizienten Tieren waren annähernd identisch mit dem Wildtypmuster (Abb.26B). Der Vergleich von Anzahl und Bandenpositionen zwischen TLR2-/-, TLR4-/- und TLR2+4-/- Mustern zeigte, dass das TLR2-Muster zu 100% dem Wildtypmuster entsprach. Die DGGE-Bandenmuster vom Coloninhalt TLR4- bzw. TLR2+4-defizienter Tiere waren beide zu 92% identisch im Vergleich zum Referenz-Wildtypmuster. Zwei auftretende DGGE-Banden in TLR4-defizienten Tieren waren allerdings nicht oder allenfalls schwach vorhanden (weisser bzw. grauer Pfeil links in Abb.26B). Eine Sequenzanalyse der entsprechenden 16S rRNA-Gene zeigte, dass diese DNA der Bacteroidales-Gruppe zugeordnet werden konnte. Um zu überprüfen, ob diese bakterielle Gruppe, repräsentiert durch diese DGGE-Banden, möglicherweise tatsächlich TLR4-abhängig abwesend war, wurde zusätzlich die Colonflora von Wildtyp und TLR-defizienten Tieren aus einer anderen Haltungseinrichtung (Einrichtung B) auf die gleiche Weise mit PCR-DGGE untersucht. Einige Bakterien im Wildtyp, repräsentiert durch die obere „Bacteroides“-Bande (weisser Pfeil links in Abb.26B) fehlten komplett in TLR4-/- Tieren aus Einrichtung A. Im Colon von TLR4-/- Tieren der Einrichtung B war diese Bande aber klar nachweisbar (weisser Pfeil rechts in Abb.26B). Dass die untere „Bacteroidales“-Bande (grauer Pfeil, Abb.26B) im Wildtyp-Muster auch in einem TLR4-/- Tier schwach sichtbar war, wies darauf hin, dass diese Unterschiede eher auf interindividuelle Variabilitäten, als auf eine mögliche TLR4-Abhängigkeit zurückzuführen waren.

Abb. 26: Zusammensetzung der Normalflora im Colon bei Wildtyp und TLR-defizienten Tieren. (A) Dargestellt ist die Zusammensetzung der Colonflora bei gesunden C57BL/10, TLR2-/-, TLR4-/- und TLR2+4-/- Mäusen (drei Monate alt) mittels Analyse von 16S rRNA-Genbibliotheken. Die kompletten 16S rRNA-Gene wurden aus der Gesamt-DNA des Coloninhalts amplifiziert (n=3 pro Gruppe; 100 Klonsequenzen pro Gruppe). Die Balken repäsentieren den prozentualen Anteil der taxonomischen Gruppen auf der Y-Achse. Angegeben sind Mittelwerte+Standardabweichung (nicht signifikant). (B) Dargestellt sind die individuellen 16S rRNA DGGE-Profile (Primer HDA1GC und HDA2, 16S rRNA V2-3 Region) aus der Colonflora bei Wildtyp-, TLR2-/-- TLR4-/-- und TLR2+4-/--Mäusen (n=2/Gruppe). Die Mäuse stammten aus zwei unterschiedlichen Tierhaltungen (Einrichtung A/B). Angezeigt ist die korrespondierende 16S rRNA-Sequenzanalyse schwach sichtbarer oder fehlender DNA-Banden aus den DGGE-Profilen von TLR4-/- und TLR2+4-/- Tieren (weisse, graue Pfeile) mit % Ähnlichkeit zum nächsten Datenbankeintrag (links angezeigt). Auf der X-Achse ist % Ähnlichkeit zur Wildtyp-Referenz (=100%) angegeben. Die DGGE-Profile sind repräsentativ für drei Tiere/Gruppe/Experiment. Die Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten.

↓46


Die Ergebnisse der molekularen Analysen gaben keinen Hinweis darauf, dass die Zusammensetzung der normalen Colonflora im Vergleich zum Wildtyp durch eine TLR2- oder TLR4-Defizienz beeinflußt wurde.

3.4  Veränderungen der Mausmagenflora bei H. pylori-Infektion

3.4.1  Analyse der bakteriellen Diversität im Mausmagen bei H. pylori-Infektion

Um den Einfluss einer H. pylori-Infektion auf die Diversität der bakteriellen Magenflora zu untersuchen, wurden 16S rRNA-Klonbibliotheken analysiert. Die Klonbibliotheken wurden durch Klonierung amplifizierter 16S rRNA-Gene aus Gesamt-DNA-Extrakten der Mägen von je einer H. pylori-infizierten bzw. PBS-behandelten Maus erstellt und über Hybridisierung mittels spezies-/gattungsspezifischer Sonden analysiert (siehe 2.7). Die bakterielle Diversität im Mausmagen stieg bei einer etablierten H. pylori-Infektion an. Der Anteil von Laktobazillen war im gesunden Zustand mit über 60% von 30 Klonsequenzen deutlich höher als in H. pylori-infizierten Tiere mit 33% von 35 Klonsequenzen (Abb.27).

Abb. 27: Florenveränderung nach H. pylori-Infektion im Magen von Balb/c Mäusen. Dargestellt ist die Analyse von 16S rRNA-Klonbibliotheken durch Dot-Blot-Hybridisierung mit spezies-/gattungsspezifischen Sonden bei einer H. pylori-infizierten Maus (n=35 Klonsequenzen) und von einem PBS-behandelten Kontrolltier (n=30 Klonsequenzen). Angegeben ist der Prozentanteil der 16S-Klonsequenzen am Gesamt-„Pool“ nach Detektion durch Lactobacillus-spezifischer (Lac-141, schwarze Balken) und H. pylori-spezifischer Sonde (Hpy-1, graue Balken) oder keine Hybridisierung mit Lac-141 und Hpy-1 (weisse Balken).

↓47


Die bei einer gesunden Normalflora prädominanten Laktobazillen wurden nach einer H. pylori-Infektion im Magen durch eine Vielfalt anderer Spezies verdrängt (Abb.27/28, Tab.17).

3.4.2 Einfluss einer Salmonella-Lebendvakzine auf die H. pylori-induzierten Änderungen der Magenflora

Um den Effekt der H. pylori-Infektion auf die Mausmagenflora zu bestätigen und den möglichen Einfluss einer prophylaktischen Vakzinierung zu untersuchen, wurde die Magenflora analog bei H. pylori-infizierten Mäusen untersucht, die mit der Lebendvakzine Salmonella enterica typhimurium Stamm SL3261 (pYZ97) immunisiert worden waren. Diese gentechnisch veränderten Salmonellen exprimierten die H. pylori-Urease-Untereinheiten A und B. Die kultivierbare H. pylori-Last war bei immunisierten Tieren signifikant reduziert (Daten hier nicht gezeigt, Aebischer et al. 2006). Es wurden vier Gruppen untersucht: mit H.p.-Infektion, immunisiert mit bzw. ohne H.p.-Infektion und Tiere nach Gabe des plasmidfreien (pYZ97) Salmonella Träger-Stamms mit anschliessender H.p.-Infektion. Der Effekt der Vakzinierung auf die Diversität der Magenflora wurde über die Analyse der 16S rRNA-Klonbibliotheken bestimmt. Aus jeder Behandlungsgruppe wurde eine Klonbibliothek konstruiert und der Anteil von Lactobacillus-16S Genen über Dot-Blot-Hybridisierung mit einer Lactobacillus-spezifischen Sonde ermittelt. Die Analyse zufällig ausgewählter Klone aus einer individuellen Klonbibliothek jeder Behandlungsgruppe ergab, dass Lactobacillus sp. mit einem Anteil von 97% die Magenflora immunisierter bzw. nicht-H. pylori-infizierter Mäusen dominierte (Abb.28 und vergleiche Abb.27). In den nicht-immunisierten H. pylori-infizierten Mäusen wurde der Anteil von Lactobacillus sp. dagegen auf weniger als 30% am Gesamt-Genpool gesenkt. Die Frequenz von H. pylori bzw. anderen Bakterienspezies, stieg auf einen Anteil von 32% bzw 46% am Gesamt-Pool (Abb.28).

Abb. 28: Auswirkungen der Immunisierung auf die H. pylori-induzierten Änderungen der Magenflora. (A) Dargestellt sind die Daten aus 16S rRNA-Klonbibliotheken von einem Tier pro Versuchsgruppe (n=1). Die Analyse von 16S rRNA-Klonbibliotheken durch Dot-Blot-Hybridisierung mit spezies-/gattungsspezifischen Sonden ist als relativer Prozentanteil der 16S Klonsequenzen am Gesamt-Genpool nach Detektion durch Lactobacillus-spezifische (schwarze Balken) und H. pylori-spezifischer Sonde (graue Balken) bzw. ohne Hybridisierung mit Lac-141 und Hpy-1 (weisse Balken) dargestellt. Angegeben ist die Anzahl analysierter Klone aus 16S rRNA-Klonbibliotheken von Tieren mit/nach: Immunisierung ohne H.p.-Infektion (n=67), H. pylori-Infektion (n=60), Gabe des SL3261-Trägerstamms und H. pylori-Infektion (n=77), Immunisierung mit H. pylori-Infektion (n=75). (B) Analyse des relativen Anteils von Lactobacillus spp. 16S rRNA durch quantitative Echtzeit PCR. Auf der Y-Achse ist die Signalintensität von Lactobacillus (in %) im Verhältnis zum eubakteriellen Signal (=100%) dargestellt. Die quantitative RT-PCR erfolgte aus Gesamt-DNA Extrakten von Mägen (jeweils n=2 pro Gruppe) (***p<0,001; 2-Wege-ANOVA)

↓48


Nach prophylaktischer Immunisierung gegen die H. pylori-Urease A/B konnten H. pylori-infektionsinduzierte Änderungen der Magenflora verhindert werden. Der Anteil der ursprünglich vorherrschenden Laktobazillen in der Magenflora blieb somit erhalten. Um die Bakterien zu identifizieren, die den Magen von H. pylori-infizierten Mäusen kolonisierten, wurden alle klonierten 16S rRNA-Gene aus den Klonbibliotheken der verschiedenen Behandlungsgruppen (siehe Abb.28), die weder mit der Lactobacillus-spezifischen noch mit der H. pylori-spezifischen Sonde hybridisierten, sequenziert (91 von 279 Klonsequenzen). Es wurden 69 (von insgesamt 91) eindeutige Sequenzen generiert. Der Vergleich von Datenbankeinträgen mit öffentlichen Datenbanken zeigte, dass sich die Magenflora von H. pylori-infizierten Mäusen aus folgenden Bakteriengruppen zusammensetzte: Clostridium coccoides Gruppe, Clostridium spp., Bacteroides/Prevotella spp., Eubacterium spp., Ruminococcus spp., E. coli, Streptococcus spp. and Lactococcus spp. (Tab.17). Sequenzen von bisher nicht kultivierbaren Bakterien stellten einen Anteil von 59 % dar. Zwei einzelne Sequenzen aus der Klonbibliothek von nicht-immunisierten (mit dem Salmonella Trägerstamm SL3261 behandelten) Mäusen mit H.p.-Infektion mit 99% eine Übereinstimmung mit einer neu beschriebenen Helicobacter-Spezies. Diese ist in der Lage, Colitis und Typhlitis in IL-10 defizienten Mäusen auszulösen (Fox et al. 1999). Die Sequenzanalyse der 16S rRNA-Klonbibliotheken ergab, dass aus den Klonbibliotheken von immunisierten bzw. nicht–H.p.-infizierten Mäusen, Lactobacillus-Sequenzen identifiziert werden konnten, die nicht mit der Lactobacillus-spezifischen Sonde hybridisierten. Die korrespondierenden 16S rRNA-Gene wiesen Einzelnukleotidveränderungen in der Bindungsstelle der Sonde auf. Die Ergebnisse zeigten, daß die H. pylori-induzierten Veränderungen der bakteriellen Diversität im Mausmagen durch eine Präsenz von Spezies charakterisiert wurde, die normalerweise auf distale Abschnitte des Intestinaltraktes beschränkt sind.

Tab. 17: Molekulare Identifikation von Bakterienspezies im Mausmagen.

Mausgruppe

DatenbankNummer

Datenbankeintrag

Sequenz

[%]

Identische Klone

Eng verwandte Gruppe /Gattung / Spezies

Infiziert,Nicht immunisiert *

AF371582

Uncultured bacterium clone p-57-a5

92

8

Clostridium coccoides group OTU-70

AF371633

Uncultured bacterium clone p-2186-s959-3

95

2

Clostridium coccoides group OTU-61

AF371583

Uncultured bacterium clone p-389-o3

93

1

Clostridium coccoides group OTU-215

AF371673

Uncultured bacterium clone p-1321-a5

91

1

Clostridium coccoides group OTU-293

AJ418949

Uncultured bacterium clone k010.

98

1

Clostridium coccoides group OTU-390

AF371579

Uncultured bacterium clone p-4162-6Wa5

93

1

Clostridium coccoides group OTU-343

AJ419018

Uncultured bacterium clone kl046

99

4

Clostridium coccoides group OTU-235

Eubacterium hallii

AB062773

Uncultured bacterium BCf1-16

90

1

Ruminococcus sp. OUT-227

AF371888

Uncultured bacterium clone p-828-a5

93

1

Prevotella sp. OTU-19

AJ400242

Uncultured bacterium clone S30-5

95

2

Bacteroides distasonis S30-5

AJ400236

Uncultured bacterium clone F3.

90

3

Bacteroides forsythus F3

AJ419055

Uncultured bacterium clone kl115

98

1

Bacteroides forsythus F3

AJ408963

Uncultured bacterium clone HuCA7.

96

2

Bacteroides putredinis adhufec73

AJ408997

Uncultured bacterium clone HuCB23.

95

2

Bacteroides putredinis adhufec73

AB094160

Uncultured bacterium clone HuCA19

96

1

Ruminococcus productus

Aj408969

Uncultured bacterium clone HuCA17

90

1

Clostridium indolis

AF157054

Eubacterium plexicaudatum ASF492

92

1

Eubacterium plexicaudatum ASF492

AF157051

Bacterium ASF500 16S ribosomal RNA

98

1

Clostridium sp. ASF500

AF157052

Clostridium sp. ASF356

91

1

Clostridium sp. ASF356

AJ011522

Eubacterium ramulus

92

3

Eubacterium ramulus

AF202259

Eubacterium oxidoreducens strain G2-2

90

1

Eubacterium oxidoreducens strain G2-2

Y10584

Clostridium sp. 16S rRNA

89

1

Clostridium sp. 16S rRNA

X76163

Clostridium aerotolerans 16S

92

1

Clostridium aerotolerans

AF127912

Helicobacter sp.

99

2

Helicobacter sp.

Mausgruppe

Datenbank
Nummer

Datenbankeintrag

Sequenz
[%]

Identische Klone

Eng verwandte Gruppe /
Gattung / Spezies

Infiziert
Immunisiert

AJ308392

Uncultured bacterium clone S25-5

99

1

Lactobacillus reuteri S25-5

X76328

Lactobacillus reuteri (DSM 20016 T)

98

1

Lactobacillus reuteri S25-5

AF371506

Uncultured bacterium clone p-29-a5

94

1

Streptococcus alactolyticus OTU-180

AY017059

Lactobacillus sp. CLE-4

99

1

Lactobacillus sp.

Nicht-infiziert
Immuniziert

AF157049

Lactobacillus murinus 16S

99

1

Lactobacillus murinus

AJ308392

Uncultured bacterium clone S25-5

96

1

Lactobacillus reuteri

Infiziert

AF352166

Lactococcus garvieae strain FLG12 16S

97

2

Lactococcus garvieae

AF233451

E.coli 16S rRNA gene

98

5

E. coli

U01331

Helicobacter pylori isolate MC937

99

2

Helicobacter pylori

AF127912

Helicobacter sp.

98

1

Helicobacter sp.

AF157049

Lactobacillus murinus 16S

99

5

Lactobacillus murinus

AF371575

Uncultured bacterium clone p-1921-s962-3

91

1

Clostridium coccoides group OTU-40

AF371875

Uncultured bacterium clone p-2190-s959-3

92

1

Clostridium coccoides group OTU-61

AJ400242

Uncultured bacterium clone S30-5

95

1

Bacteroides distasonis S30-5

AJ400241

Uncultured bacterium clone S30-4

95

1

Bacteroides distasonis S30-4

AJ400236

Uncultured bacterium clone F3

91

1

Bacteroides forsythus F3

Nicht-immunisierte Tiere wurden mit dem Salmonella-Träger-Stamm SL3261 behandelt. Das Plasmid trug dabei
keine Gene für die Untereinheit der H. pylori Urease.


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10.01.2008