4 Diskussion

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4.1  Die T. gondii-induzierte Ileitis als Darmentzündungsmodell

4.1.1  Eigenschaften und Vorzüge des Modells

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Die T. gondii-induzierte Ileitis ist ein Modell für eine akute Dünndarmentzündung. Nach oraler Infektion mit 100 Zysten T. gondii (Stamm ME49) wird bei suszeptiblen C57BL-Mäusen eine akute terminale Ileitis ausgelöst. Aufgrund einer nachfolgenden ausgeprägten Immunreaktion gekennzeichnet durch den Anstieg von aktivierten CD4+ T-Zellen, IFN-gamma, TNF-alpha und induzierbarer NO-Synthase (iNOS) versterben diese Tiere acht bis neun Tagen nach der Infektion. Die Histopathologie des entzündeten terminalen Ileums ist durch eine massive Zerstörung der Villi und der Mukosa gekennzeichnet (Liesenfeld et al. 1996, 1999ab; Mordue et al. 2001; Liesenfeld 2002; Kasper et al. 2004; Mennechet et al. 2004; Robben et al. 2004). Die Daten der vorliegenden Arbeit konnten diese Ergebnisse in den hier untersuchten Parametern bestätigen. C57BL/6-Mäuse mit T. gondii-Infektion zeigten eine ausgeprägte Histopathologie mit transmuraler Zerstörung und Nekrosen (Abb.8). Bei T. gondii-infizierten C57BL-Mäusen konnten im Vergleich zu gesunden Mäusen reproduzierbar erhöhte IFN-gamma und NO-Werte (Abb.16,17C/D, 20A/B), sowie eine erhöhte Anzahl von aktivierten CD4+ T-Zellen detektiert werden (Heimesaat et al. 2006). RNA-Expressionsdaten des entzündeten Ileums im Vergleich zum gesunden Zustand deuteten an, dass Transkripte, sowohl proinflammatorisch wie z.T. auch antiinflammatorisch kategorisierter Gene bei T. gondii-infizierten C57BL10-Wildtyp Mäusen hochreguliert waren (siehe 3.2.6). Einige proinflammatorische Transkripte waren bei den TLR4-defizienten Tieren herunterreguliert, z.B. ein TNF-alpha Rezeptor oder die Matrixmetalloproteinase 13, was möglicherweise mit der geringeren Entzündungsausprägung bei TLR4-defizienten Tieren korreliert. In einem Übersichtsartikel von Buzoni-Gatel & Werts (2006) werden mögliche Mechanismen des Eindringens von T. gondii durch das Darmepithel und die Interaktionen mit Zellen des Immunsystems bzw. Komponenten der angeborenen Immunantwort genannt (Abb.29).

Abb. 29: Entnommen aus Buzoni-Gatel & Werts 2006; Toxoplasma gondii überwindet das intestinale Epithel des Wirtes durch direkte Infektion von Enterozyten (a), durch Eindringen in „tight junctions“ (b), oder nach Aufnahme durch DCs (c). Wenn Enterozyten mit dem Parasiten infiziert sind, treten physiologische und morphologische Veränderungen auf, die zur Freisetzung von zytotoxischen Molekülen wie NO führen können (d). Zusätzlich können Enterozyten auf die Infektion mit der Sekretion von Chemokinen und Zytokinen reagieren, die PMNs (e), Makrophagen (f) und DCs (g) anlocken. Diese Zellen können im aktivierten Zustand eine direkte abtötende Wirkung entfalten und als Quelle für Zytokine dienen, wie z.B. IL-12, welches die adaptive Immunantwort über CD4-Zellen anstösst (h). Für die Auslösung einer spezifischen Immunantwort wird eine Antigen-Präsentation benötigt, meist durch DCs. Aktivierte T-Zellen und NK und NKT (i) können nach Stimulation durch Zytokine, sekretiert von infizierten Enterozyten, IFN-gamma ausschütten. Dies aktiviert Makrophagen, DCs und Enterozyten zur Bekämpfung der Parasiten. IEL (j) wirken zytotoxisch auf Enterozyten und produzieren TGF-beta, was möglicherweise die IFN-gamma Produktion abschwächt. Die Replikation der Parasiten im Darm kombiniert mit der inflammatorischen Antwort führt zu einem Epithelschaden, der es kommensalen Bakterien, einschliesslich LPS-reicher Gram-negativer Spezies, ermöglicht, die Epithelbarriere zu überwinden (k). T. gondii blockiert offenbar einige LPS-induzierbare Zytokine (l) und zytokin-abhängige Gene von in vitro infizierten Makrophagen (Lee et al. 2006).


Die in Abb.29 beschriebene Translokation kommensaler Gram-negativer Bakterien und insbesondere die nachfolgende Wirkung des LPS als TLR4-Ligand konnte auch in der vorliegenden Arbeit beobachtet werden (siehe 4.1.2, 4.2). Der Nachweis von Bakterien im entzündeten subepithelialen Gewebe durch FISH hatte bereits in Vorarbeiten bestätigt, dass die T. gondii-induzierte Ileitis von einem ausgeprägten Barrieredefekt begleitet ist, der zur Translokation von Bakterien in subepitheliale Bereiche führt (Daten hier nicht gezeigt; Heimesaat et al. 2006). Die Beobachtung, dass lebende E. coli, nicht aber Bacteroides/Prevotella spp., durch Kultivierung in mehr als 80% der mesenterialen Lymphknoten und in 70% der Milzen von Mäusen mit schwerer Ileitis nachgewiesen werden konnten (Daten hier nicht gezeigt), deutet darauf hin, dass translozierende Darmbakterien die Gewebezerstörung und die Entzündung durch direkten Zellkontakt und Freisetzung von Immunmediatoren verstärken (Khan et al. 1997; Liesenfeld et al. 1999ab). Die bei der T. gondii-induzierten Ileitis beschriebenen histopathologischen Veränderungen während der Entzündung, die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IFN-gamma, die Sekretion von NO, die nachgewiesene Translokation von Bakterien und der Anstieg von aktivierten CD4+ T-Zellen (Heimesaat et al. 2006) bekräftigen, dass dieses Modell am ehesten einen M. Crohn im akuten Schub simuliert. Die Vorzüge der T. gondii-induzierten Dünndarmentzündung liegen in der über viele Versuchsreihen nachgewiesenen Reproduzierbarkeit der terminalen Ileitis und der damit verbundenen immunpathologischen Veränderungen. Da die Ileitis bei suszeptiblen C57BL-Mäusen, bei den hier verwendeten C57BL/6 und BL10 mit nur geringen Unterschieden, auslösbar war und auch fast identische Florenverschiebungen (4.1.2) bei beiden Wildtypen nachweisbar waren, können somit mögliche Auswirkungen von TLR-Defekten auf die Ileitis und Darmfloraveränderungen untersucht werden. In dieser Arbeit wurden Tiere mit einem TLR2- und/oder TLR4-Defekt untersucht, denkbar ist auch eine Analyse z.B. bei TLR9-defizienten Tieren im BL6-Hintergrund. Ein weiterer Vorteil liegt in der kurzen Zeit, in der die pathologischen Veränderungen eintreten. Ab Tag sechs p.i. sind infektionsbedingte Veränderungen im Darm, histopathologisch und in der Darmflora, erkennbar, wobei die Tiere am Tag acht bis neun p.i. versterben. Beim Samp/Yit(Fc)-Modell (s.unten) treten pathologische Veränderungen dagegen erst nach Wochen auf (Kosiewicz et al. 2001; Bamias et al. 2002). Aufgrund der experimentellen Reproduzierbarkeit und der klar beschriebenen entzündungsbedingten Veränderungen der Darmflora (siehe auch 4.1.2) und der klinischen Parameter, ist die T. gondii-induzierte Ileitis als ein wertvolles Darmentzündungsmodell anzusehen für die Analyse pathogenetischer Faktoren und die Erprobung therapeutischer Ansätze z.B. durch Modulation der Darmflora über Probiotika oder Prebiotika oder die Anwendung von TLR4-Antagonisten. Es existieren nur wenige Tiermodelle, in denen eine Dünndarmentzündung beschrieben wird (Pizarro et al. 2003; Elson et al. 2005). Die bisher beschriebenen Modelle, z.B. die Entwicklung einer spontanen Dünndarmentzündung bei der Samp/Yit(Fc)-Maus (Kosiewicz et al. 2001; Bamias et al. 2002) konnten zwar belegen, dass sich ausschliesslich bei den mit SPF-Flora rekolonisierten Samp/Yit-Mäusen im Vergleich zur gnotobiotischen Kontrollgruppe eine Dünndarmentzündung entwickelte (Kosiewicz et al. 2001) bzw., dass die Behandlung mit Ciprofloxacin/Metronidazol eine Abschwächung der Immunreaktion herbeiführt (Bamias et al. 2002). Eine grundlegende Analyse der Darmflora ist bei diesem Modell aber nicht beschrieben, obwohl der essentielle Beitrag bestimmter Guppen der kommensalen Flora zur Induktion einer inflammatorischen Reaktion bei Tiermodellen zur Darmentzündung bekannt ist (Rath et al. 1996; Dianda et al. 1997; Sartor 1997; Sellon et el. 1998; Onderdonk et al. 1998; Schultz et al. 1999; Hans et al. 2000a; Waidmann et al. 2003; Schuppler et al. 2004; Lucke et al. 2006) und auch die Abmilderung von Darmentzündung durch die Gabe von probiotisch wirksamen Bakterien oder bakteriellen Produkten in neuesten Arbeiten beschrieben wurde (Madsen et al. 2001, Madsen 2001,2006; Gionchetti et al. 2000; Floch et al. 2006; Ewaschuk et al. 2006ab; Rioux et al. 2005; Rioux & Fedorak 2006; Bibiloni et al. 2005a). In dem in dieser Arbeit beschriebenen T. gondii-induzierten Dünndarmentzündungsmodell wurde daher eine umfassende Analyse der Darmflora durchgeführt und die Auswirkung einzelner kommensaler Bakterienspezies auf die Induktion einer Immunpathologie im Ileum untersucht.

4.1.2 Der Einfluss von Bakterien im T. gondii-induzierten Ileitis-Modell

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Die Dünndarmentzündung nach T. gondii-Infektion ist ein Modell bei dem es im Verlauf der Entzündung reproduzierbar zu einer erheblichen Einschränkung der bakteriellen Diversität und einem Anstieg der kommensalen Gram-negativen Darmflora in Form von E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. kommt. Andere Bakteriengruppen wie z.B. anaerobe Gram-positive Stäbchen waren im entzündeten Dünndarm kaum noch nachweisbar im Vergleich zum gesunden Zustand (Abb.8A). Diese Erkenntnisse werden durch die umfangreichen Ergebnisse dieser Arbeit zur kultivierbaren Darmflora, ergänzt durch molekulare Daten, bekräftigt. Eine reduzierte Diversität der Darmflora und erhöhte Anzahl an Gram-negativen Bakterien beim Menschen wurde in entzündeten Darmabschnitten von CED-Patienten beobachtet (Martin & Rhodes 2000; Masseret et al. 2001; Barnich et al. 2003; Seksik et al. 2003; Darfeuille-Michaud et al. 2004; Swidsinski et al. 2005). Dieselben Bakteriengruppen stehen im Verdacht, eine GvHD beim Menschen auszulösen (Beelen et al. 1999). Eine Überwucherung des Ileums mit Enterobakterien, wurde auch für den Zustand nach Leberresektion, bei Portalvenenobstruktion, bei längerer parenteraler Ernährung und bei reduzierter Darmmotilität beschrieben (Tarpila et al. 1993; Wang et al. 1994; Leveau et al. 1996; Kayama et al. 2000; Husebye 2005). Dies weist darauf hin, dass das Überwachsen mit Bakterien am ehesten als Folge einer gestörten Dünndarmphysiologie zu werten ist. Die Beobachtung, dass offensichtlich besonders Gram-negative Bakterien im Verdacht stehen, an der Entzündungsauslösung beteiligt zu sein, führte zur Idee der Gabe von Antibiotika, um diesen Effekt zu verringern. Unter Berücksichtigung des Wirkungspektrums der angewandten Antibiotika, konnten indirekt Rückschlüsse auf die an der inflammatorischen Antwort beteiligten Bakterien gezogen werden. Dieser Ansatz wurde nach der umfassenden Analyse der Darmflora im gesunden und entzündeten Darm auch bei der T. gondii-induzierten Ileitis verfolgt. Die Behandlung mit Ciprofloxacin/Metronidazol führte dabei zu einer signifikanten Reduktion von E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. (3.1.4; Tab.13), was von einer Steigerung der Überlebensrate der behandelten Tiere, niedrigeren Werten für IFN-gamma und NO und einer abgemilderten Histopathologie im Ileum begleitet war (Abb.14/15/16). Eine prophylaktische Gabe von Ciprofloxacin und Metronidazol fünf Tage vor der T. gondii-Infektion war dabei effektiver als eine therapeutische Intervention nach etablierter Ileitis (Abb.14). Die Abmilderung der T. gondii-Ileitis durch den Einsatz von Darmflora eradizierenden Antibiotika, wie Ciprofloxacin und Metronidazol, zeigte den Einfluss intestinaler Bakterien auf die Ausprägung der Immunpathologie. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Verbesserung der Ileitis bei Antibiotika-behandelten SAMP/Yit(Fc) Mäusen (Kosiewicz et al. 2001; Bamias et al. 2002). Der Schutz vor bzw. die Abmilderung der Ileitis durch antibiotische Behandlung, wie in dieser Arbeit dargestellt, zeigte, dass E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. den immunpathologischen Schweregrad dieser akuten murinen Ileitis verstärken können. Das vorherrschende Auftreten von E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. bei experimenteller Colitis bzw. bei Patienten mit CED wurde bereits beschrieben (Onderdonk et al. 1998; Schuppler et al. 2004; Swidsinski et al. 2005). Ein colitogenes Potential beider Bakteriengruppen (Rath et al. 1999ab, 2001; Waidmann et al. 2003) und der Beitrag Gram-negativer Bakterien zum Schweregrad der intestinalen Entzündung wird durch die erfolgreiche Behandlung mit Antibiotika bei experimenteller Colitis, und CED bzw. GvHD beim Menschen untertützt (Greenbloom et al. 1998; Madsen et al. 2000; Hoentjen et al. 2003; Beelen et al. 1999). Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass sich mögliche immunmodulatorische Wirkungen der Antibiotika bei der Behandlung der T. gondii-induzierten Ileitis günstig auf die Immunpathologie auswirkten, wie z.B. bei Fluorchinolonen (Ciprofloxacin). Diese können in vitro die Bildung von IL-2 induzieren und inhibierend auf die Synthese von Interleukin-1 und TNF-alpha wirken. In vitro können Fluorchinolone durch Abschwächung der Zytokinantwort Einfluss auf die zelluläre und humorale Immunantwort nehmen (Dalhoff & Shalit 2003). Der Anstieg Gram-negativer Bakterien und die Abmilderung der T. gondii-induzierten Ileitis vermutlich durch die Absenkung der Gram-negativen Bakterienlast, liess einen starken Einfluss dieser Bakteriengruppen auf die Darmentzündung erkennen. Um den Beitrag einzelner Bakterienspezies im Detail zu untersuchen, war es notwendig, zunächst gnotobotische Tiere ohne nachweisbare kultivierbare Flora zu generieren. Durch definierte Rekolonisierung mit E. coli, Bacteroides/Prevotella spp. Lactobacillus sp. oder SPF-Flora aus gesunden bzw. an Ileitis erkrankten Tieren, konnte das inflammatorische Potenzial der einzelnen Bakterienspezies darstellbar gemacht werden (3.1.5). Die sehr geringe Histopathologie nach T. gondii-Infektion bei nichtbesiedelten, gnotobiotischen Tieren zeigte klar, dass die Induktion einer Immunantwort bei der T. gondii-induzierten Ileitis von der Anwesenheit von Bakterien abhängig war (Abb.17B). Eine Ileitis konnte im T. gondii-Modell nur ausgelöst werden, wenn eine T. gondii-Infektion von suszeptiblen Mäusen UND eine Besiedelung mit Bakterien erfolgte. So war z.B. bei gnotobiotischen C57BL/6-Wildtyptieren ohne Rekolonisierung mit Bakterien, keine Ileitis nachweisbar (Abb.17B). Nach Monokolonisierung gnotobiotischer Mäuse mit E. coli bzw. Rekolonisierung mit Bacteroides/Prevotella spp. wurde zwar bei beiden Gruppen eine nur moderate Histopathologie beobachtet, aber die E. coli-monokolonisierten Tiere überlebten nicht nach Tag 13 p.i. (Abb.17A/B), während 22% der mit Bacteroides/Prevotella spp. rekolonisierten Mäuse bis Tag 22 p.i. überleben konnten. Dies zeigte, dass das inflammatorische Potenzial einzelner Arten unterschiedlich war, wobei E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. scheinbar additiv die Darmentzündung verstärken können (Abb.17B). Interessanterweise wurde ein unterschiedlich inflammatorisches Potenzial Gram-negativer Bakterien auch in anderen Untersuchungen beobachtet. In einer Studie mit gnotobiotischen IL-2-/- Mäusen wurde nach Monokolonisierung mit E. coli mpk, nicht aber nach Kolonisierung mit B. vulgatus mpk oder E. coli Nissle 1917, eine Colitis ausgelöst (Waidmann et al. 2003). Mittels Genexpressionanalyse konnte festgestellt werden, dass bestimmte mutmasslich antiinflammatorische Gene bei der Kolonisierung mit E. coli mpk vermindert, bei Kolonisierung mit E. coli Nissle oder B. vulgatus aber verstärkt exprimiert wurden (Bohn et al. 2006). Es wurde eine hohe IL-6 Expression in diesem Modell beschrieben, wenn die Tiere mit dem nicht-colitogenem Stamm B. vulgatus mpk besiedelt waren, was möglicherweise als ein protektiver Faktor gegen die Auslösung der E. coli mpk vermittelten Coilits anzusehen ist (Frick et al. 2006). Ein individuelles inflammatorisches Potenzial von Bakterienspezies wurde auch In einem spontanen Colitis-Modell mit IL-10-defizienten Mäusen beobachtet. Die Monoassoziation der kommensalen Spezies, Enterococcus faecalis bzw. E. coli, führte zu voneinander verschiedenen Entzündungsverläufen (Kim et al. 2005). Das gering ausgeprägte inflammatorische Potenzial der Laktobazillen im Rahmen der T. gondii-induzierten Ileitis (Abb.17B-D) steht im Einklang mit ähnlichen Beobachtungen bei experimenteller Colitis (Waidmann et al. 2003; Dieleman et al. 2003; Sartor 2005) und der GvHD beim Menschen (Gerbitz et al. 2004). Der genaue Mechanismus durch den Darmbakterien eine Ileitis auslösen, ist durch die o.a. Ergebnisse der vorliegenden Arbeit noch nicht voll erklärbar, wenngleich eine entzündungsauslösende und/oder –verstärkende Interaktion von Komponenten Gram-negativer Bakterien mit Epithel- bzw. Immunzellen naheliegt. Die Verdrängung einer durch Gram-positive Bakterien dominierten gegen eine Gram-negative Flora im entzündeten Ileum unterstützt dabei die Hypothese, dass spezifische bakterielle Antigene Gram-negativer Bakterien wie z.B. das Lipopolysaccharid (LPS) zum Entzündungsprozeß beitragen könnten (siehe dazu 4.3). Zusammengenommen unterstützen die Daten der vorliegenden Arbeit, die auch durch die Arbeiten anderer Autoren (Mordue et al. 2001; Liesenfeld 2002; Robben et al. 2004; Buzoni-Gatel & Werts 2006, Abb.29) formulierte Hypothese: T. gondii verursacht durch das Eindringen in Enterozyten und Makrophagen, eine lokale Immunantwort, die durch zytotoxische Effekte und der Sekretion inflammatorischer Zytokine zu einem Zusammenbruch der Barrierefunktion und der Physiologie des Darmepithels führt. Die darauffolgende Akkumulation von Gram-negativen Bakterien im Ileum und bakterielle Translokation verstärkt dann die Entzündung durch weitere Induktion von Zytokinen des Th1-Typs, wie z.B. IFN-gamma und IL-12, proinflammatorischer Entzündungsmediatoren wie NO und die Rekrutierung von Immunzellen an den Entzündungsort.

4.2 Die spezielle Bedeutung von Toll-Like Rezeptoren bei beiden Darmentzündungsmodellen

Da durch die Rekolonisierungsexperimente gnotobiotischer Mäuse der Beitrag der Gram-negativen Flora, insbesondere von E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. zur T. gondii-Ileitis erkennbar war (3.1.5), sollten die Mechanismen der Entzündungsverstärkung genauer untersucht werden. Die Hypothese, dass eine entzündungsverstärkende LPS/TLR4-Signaltransduktion an der Ausprägung der Immunpathologie beteiligt sein könnte, wurde analog durch Florenanalysen, Vergleich der Überlebensraten, der Bestimmung der Histopathologie und Immunmediatoren, sowie der RNA-Expression im Ileum bei C57BL/10 Wildtyp und TLR2-, TLR4-, bzw. TLR2+4-defizienten Tieren mit T. gondii-induzierter Ileitis untersucht. Gnotobiotische TLR4-defiziente Tiere mit definierter Rekolonisierung wurden eingesetzt, um das inflammatorische Potenzial einer E. coli-Monobesiedelung und von E. coli Lipid A auf die T. gondii-Ileitis zu untersuchen (siehe 3.2). Die umfangreiche kulturelle Florenanalyse, gestützt durch molekulare Methoden (Abb.18) ergab, dass bei allen Gruppen, Wildtyp und TLR-defizienten Tieren, ein signifikanter Anstieg von E. coli während der Entzündung stattfand. Der Anteil Gram-positiver Stäbchen, wie Laktobazillen und Clostridien, war bei allen Gruppen während der Entzündung geringgradig erniedrigt, während die Enterokokken und Bacteroides/Prevotella spp. geringgradig erhöht waren (Abb.18A). TLR4- bzw. TLR2+4-defiziente Mäuse zeigten nach T. gondii-Infektion eine verringerte Mortalität und Immunpathologie im Verlauf der Ileitis im Vergleich zu TLR2-/- und Wildtyp-Tieren (Abb.19A/B). Die Werte für IFN-gamma und NO waren bei den TLR4-defizienten Tieren signifikant reduziert (Abb.20A/B). Eine möglicherweise ungleiche Parasitenlast zur Erkärung dieser Unterschiede, konnte durch den Nachweis, dass sich in allen Experimentalgruppen (Wildtyp und TLR-defiziente Tiere) eine nahezu identische Anzahl von Tachyzoiten im terminalen Ileum fand, widerlegt werden (Daten hier nicht gezeigt; Heimesaat, Fischer et al. 2007). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Ileitis im T. gondii-Infektionsmodell über den TLR4-Signalweg verstärkt wurde. Dies unterstreicht die Rolle des LPS Gram-negativer Bakterien für die Auslösung und Verstärkung von Darmentzündungen im allgemeinen und wird auch durch die Behandlung gnotobiotischer Tiere mit gereinigtem LPS bekräftigt, was einen ähnlichen Entzündungsgrad auslösen konnte wie eine E. coli-Monobesiedelung gnotobiotischer Tiere. Ein E. coli-Isolat aus dem entzündeten Mausdarm war in der Lage, eine ausgeprägte TLR4-abhängige Immunantwort in vivo und in vitro auszulösen (Abb.21B+C und Heimesaat, Fischer et al. 2007). Genotypisierungen von E. coli-Isolaten mittels RAPD-PCR aus gesundem und entzündetem Ileum (3.1.3.3.1) deuteten daraufhin, dass ein während der Ileitis akkumulierender E. coli-Stamm hochwahrscheinlich aus der gesunden Normalflora entstammte, wo er in nur geringer Zahl nachweisbar war (Abb.18A). Daten zu adhärenten invasiven E. coli (AIEC) Stämmen zeigen, dass diese in Makrophagen eindringen, dort überleben und eine starke TNF-alpha Antwort hervorrufen können (Boudeau et al. 1999; Glasser et al. 2001; Bringer et al. 2006; Barnich & Darfeuille-Michaud 2007). Interessante probiotische Therapieansätze gegen adhärent-invasive E. coli belegen die mögliche Bedeutung solcher Strategien bei der CED im Menschen (Boudeau et al. 2003; Ingrassia et al. 2005). Einige in der vorliegenden Arbeit isolierten E. coli-Stämme blieben zwar ohne Nachweis für einige bekannte Pathogenitätsfaktoren (Shiga-Toxin stx1/2, Intimin eaeA, alpha-Hämolysin hlyA, Serinprotease espA, Katalase/Peroxidase katP, hitze-stabiles Enterotoxin astA), wurden aber nicht auf eine mögliche enteroinvasive Kompetenz hin untersucht (3.1.3.3.2). In vitro Daten (hier nicht gezeigt) konnten im übrigen zeigen, dass die E. coli-induzierte NO-Ausschüttung aus murinen Peritonealmakrophagen durch ein hitze-inaktiviertes Lysat von Lactobacillus johnsonii reduziert werden konnte, was schliessen lässt, dass der dominierende Anteil an Laktobazillen der gesunden Flora möglichweise eine durch E. coli verursachte Immunreaktion verhindern kann (Heimesaat, Fischer et al. 2007). Die Tatsache, dass am Tag acht/neun p.i. beim Wildtyp und TLR4-defizienten Mäusen lebende E. coli in mesenterialen Lymphknoten, Milz und Leber vergleichbar häufig nachgewiesen werden konnten (Daten hier nicht gezeigt; Heimesaat, Fischer et al. 2007), deutete an, dass weder TLR2, noch TLR4 die Translokation von Bakterien vermitteln, was in Folge zu einem direkten Kontakt von E. coli-Zellwandbestandteilen mit Immunzellen führen kann. Erniedrigte IFN-gamma und NO-Werte im entzündeten Ileum TLR4-defizienter Mäuse im Vergleich zum Wildtyp und TLR2-/- (Abb.20), unterstützen die Hypothese, dass translozierende E. coli die intestinale Entzündungsreaktion über einen LPS-vermittelten Signalweg verstärken. In der Folge werden Entzündungsmediatoren aus Makrophagen und Granulozyten ausgeschüttet, welche die Gewebezerstörung verstärken und die ihrerseits eine sekundäre Immunantwort durch T-Zellen auslösen. Um die Hypothese des TLR4/LPS-vermittelten Mechanismus zur Auslösung der Entzündung noch weiter zu stützen, wurden C57BL/6-Mäuse mit T. gondii-Ileitis, die mit dem nicht-resorbierbaren LPS-Antagonisten Polymyxin B (Warren et al. 1985; Tsubery et al. 2000, 2000a, 2002; 2005) behandelt. Die in der vorliegenden Arbeit mit Polymyxin B behandelten Tiere wiesen eine abgemilderte Histopathologie (Abb.22A) und erniedrigte NO-Werte (Abb.22C) auf, im Vergleich zu Placebo-behandelten Kontrolltieren, wobei eine prophylaktische Gabe des Polymyxin B erffektiver war, als eine therapeutische Behandlung. Zudem war die Darmlänge bei prophylaktisch mit Polymyxin B behandelten Tieren signifikant weniger verkürzt als bei der Placebo-Kontrolle (Abb.22B). Eine Analyse der Flora zeigte, dass E. coli bei Polymyxin B behandelten Tieren selektiv eradiziert wurde (Heimesaat, Fischer et al. 2007). Die lässt auf eine mögliche zweiseitige Wirkung des Polymyxin B schliessen, eine antibiotische Wirkung und die Bindung von LPS. Neben einer antibiotischen Modulation der Darmflora über Antibiotika könnte somit auch eine Blockade des LPS-vermittelten Signalweges zu neuen Wegen in der Behandlung der Ileitis führen. So ist bereits eine Reihe von Substanzen bekannt, die z.B. als LPS-Antagonisten LPS-induzierbare Zytokinproduktion inhibieren können Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Polymyxin B belegen, dass Polymyxin B die LPS-induzierte Bildung von Zytokinen bei Monozyten aus peripherem Blut effektiv blockieren kann (Tsuzuki et al. 2001). Polymyxin B ist allerdings beim Menschen aufgrund toxischer Nebenwirkungen nicht systemisch anwendbar, weshalb chemische Abwandlungen des Grundgerüstes auf ihre Wirksamkeit und möglichen systemischen Einsatz beim Menschen untersucht werden (David 2001). Eine Senkung der Toxizität bei z.T. verbesserter Wirkung beschreiben z.B. Tsubery et al. (2005). Chemisch modifizierte Konjugate des Polymyxin B waren demnach bis zu zehnmal weniger toxisch und konnten die Überlebensrate von Mäusen, die eine normalerweise letale Klebsiella-Infektion erhalten hatten, verbessern (Tsubery et al. 2005). In einer ex vivo Laborstudie konnte nachgewiesen werden, dass Eritoran (E5564) die LPS-induzierte Bildung von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6 und TNF-alpha in humanen Monozyten blockieren kann (Czeslick et al. 2006). In vitro kann z.B. eine LPS-vermittelte Aktivierung der TNF-alpha Ausschüttung aus Mausmakrophagen durch Eritoran inhibiert werden, sowie in vivo die LPS-induzierte Ausschüttung von Zytokinen blockiert bzw. eine erhöhte Letalität bei Mäusen nach Behandlung mit E. coli gesenkt werden (Mullarkey et al. 2003). Eritoran wurde am Menschen bereits auch auf seine Fähigkeit hin überprüft, einen Endotoxinschock zu verhindern (Rossignol et al. 2004). Ein weiterer potentieller Kandidat zum Einsatz gegen einen Endotoxinschock beim Menschen ist ein kürzlich entdecktes Produkt (CyP) aus dem Cyanobakterium Oscillatoria planktothrix FP1. Cyp hat sich als ein effektiver kompetitiver Inhibitor von LPS in vitro und im in vivo-Mausmodell herausgestellt (Macagno et al. 2006). Das Lipid A-Mimetikum CRX-526 besitzt eine antagonistische TLR4-Aktivität und kann die Interaktion von LPS mit dem Immunsystem blockieren. Bei einem DSS-Colitis-Modell und spontaner Colitis bei MDR1a-defizienten Mäusen (engl.: multidrug resistence gene 1a) konnte mit CRX-526 eine Verminderung der gastrointestinalen Entzündung herbeigeführt werden (Fort et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde die Ausprägung der T. gondii-induzierten Ileitis bei TLR2-, TLR4- bzw. TLR2+4-defizienten Tieren untersucht. Dabei wurde besonders die Wechselwirkung kommensaler Darmbakterien und einzelner Bakterienspezies bei TLR4-defizienten Tieren beschrieben. Es sind neben TLR4 noch andere TLRs und Adaptermoleküle bzw. TLR-Liganden bekannt, die im Rahmen einer T. gondii-Infektion an der Ausprägung der Immunpathologie beteiligt sein können (Scanga et al. 2002; Mun et al. 2003, 2005; Yarovinsky et al. 2005; Bennouna et al. 2006; Minns et al. 2006; Yarovinsky & Sher 2006; Khan et al. 2007). Die Widerstandsfähigkeit des Wirtes gegen eine T. gondii-Infektion und die T. gondii-infektionsbedingte Bildung von IL-12 sind von dem Adaptermolekül MyD88 abhängig. Bei MyD88-defizienten Tieren konnten sich die Parasiten unkontrolliert vermehren, während bei TLR2- bzw- TLR4-defizienten Tieren eine normale IL-12 Antwort von DCs auf STAg (lössliches Tachyzoiten-Antigen) zu beobachten war (Scanga et al. 2002). Die Auslösung einer inflammatorischen Antwort nach oraler T. gondii-Infektion scheint von TLR9 abhängig zu sein, da die Expansion von DCs in mesenterialen Lymphknoten infizierter Mäuse von einer TLR9-Expression abhängig ist. Die angeborene Immunantwort auf die orale T. gondii-Infektion wird somit u.a. über TLR9 vermittelt (Minns et al. 2006). Weiterhin ist eine möglicher Einfluss einer T. gondii-Infektion auf den LPS/TLR4-Signalweg beschrieben, da auf der Oberfläche von T. gondii-infizierten murinen peritonealen neutrophilen Granulozyten nach LPS-Induktion die Mobilisierung von TNF-alpha abgeschwächt ist, was auf einen möglichen immunsuppressiven Effekt von T. gondii hinweisen könnte (Bennouna et al. 2006). Eine Signalweiterleitung über ein Profilin-artiges Molekül aus T. gondii als Ligand für TLR11 und eine nachfolgende deutliche Ausschüttung von proinflammatorischen IL-12 aus DCs ist im murinen Modell beschrieben (Yarovinsky et al. 2005, Yarovinsky & Sher 2006). Beim Menschen ist TLR11 allerdings nicht funktional wegen des Vorhandenseins eines Stop-Codons im entsprechenden Gen (Zhang et al. 2004). Möglicherweise führt dieser TLR11-vermittelte Signalweg, der in der Folge hochwahrscheinlich durch die Auswirkungen der TLR4-LPS Signalinduktion überdeckt wird, zu einem initialen lokalen Epithelschaden in Ergänzung zu den o.a. Auswirkungen einer T. gondii-Infektion auf die Enterozyten (Abb.29). Die o.a. Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum Beitrag Gram-negativer Bakterien zur T. gondii-induzierten Dünndarmentzündung decken sich mit Beobachtungen bei experimentellen Colitismodellen. Hierbei ist bekannt, dass eine ausgeprägte Colitis mit einer erhöhten Enterobakterien-Last einhergeht, und dass Mäuse, die auf LPS kaum reagieren, eine weniger ausgeprägte Colitis entwicklen (Lange et al. 1996). Es konnte bei einem DSS-Colitis-Modell mit TLR9-defizienten Mäusen gezeigt werden, dass die DNA kommensaler Bakterien eine chronische Dickdarmentzündung verstärkt (Obermeier et al. 2005). Weiterhin soll eine experimentelle Dickdarmentzündung durch TLR4-Antagonisten und präbiotisch wirkenden bakteriellen Substanzen erfolgreich unterdrückt werden können (Fort et al. 2005; Okada et al. 2006). Jedoch wird in den verschiedenen Colitis-Modellen die Rolle bakterieller Komponenten und angeborener Immunität bei der Auslösung einer Entzündung kontrovers diskutiert, da sich z.B. bei Ohkawara et al. (2005) zwischen kranken TLR4-defizienten und Wildtypmäusen weder klinische Parameter noch histopathologische Veränderungen unterschieden. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, dass bei Tieren mit einer TLR(4)-Defizienz der Schweregrad von T. gondii-Ileitis bzw. DSS-Colitis verringert war, haben andere Untersucher (Rakoff-Nahoum et al. 2004; Araki et al. 2005) gezeigt, dass MyD88-/-- bzw. TLR4- oder TLR2-defiziente Tiere eine stärker ausgeprägte Colitis entwickelten als die Wildtypen. Dies wird damit erklärt, dass die Wechselwirkung von TLRs mit kommensalen Antigenen den Differenzierungsgrad von intestinalen Epithelzellen und damit die intestinale Homöostase aufrecht erhält, was zum Schutz gegen toxische Substanzen wie z.B. dem DSS wichtig sein könnte (Rakoff-Nahoum et al. 2004). Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit, dass intestinale Entzündung erheblich von der Zusammensetzung der Darmflora abhängt, und insbesondere Gram-negative Bakterien zum ilealen Entzündungsprozess beitragen. Dies unterstützt bereits vorhandene Strategien zur Behandlung der CED durch Modulation der Flora über Antibiotika oder Probiotika, sowie den möglichen Einsatz von LPS-blockierenden Substanzen. Die Verstärkung der Ileitis durch ein Überwuchern mit E. coli macht die Notwendigkeit einer detaillierten Analyse der Darmflora deutlich, um den Beitrag individueller bakterieller Gruppen oder Spezies zum Krankheitsgeschehen einzuordnen.

4.3  Die DSS-Colitis als Darmentzündungsmodell

Die umfangreiche Florenanalyse der Colonflora konnte in der vorliegenden Arbeit zeigen, dass nach siebentägiger Behandlung mit DSS am Tag acht ein signifikanter Anstieg von E. coli bei C57BL/10-Wildtyp Tieren, aber nicht bei TLR-defizienten Tieren nachweisbar war. Bei anderen Bakteriengruppen wie Laktobazillen und Clostridien, bzw. Enterokokken und Bacteroides/Prevotella spp. waren keine signifikanten entzündungsbedingten Veränderungen zu erkennen (Abb.23). Eine hohe E. coli-Last war dabei offenbar mit einer klinischen Verschlechterung beim Wildtyp im Vergleich zu den TLR-defizienten Tieren assoziiert (Abb.24A). Durch die Kombination einer umfangreichen Florenanalyse, der Aufnahme klinischer Parameter, sowie der Bestimmung von IFN-gamma in Organkulturüberständen ergänzt durch eine Charakterisierung der Florenmuster mittels PCR-DGGE, konnte hier gezeigt werden, dass die DSS-induzierte Colitis reproduzierbar durch einen deutlichen Verlust der bakteriellen Diversität gekennzeichnet war. Sie ging mit einem Anstieg der kommensalen Gram-negativen Bakterien, die als E. coli identifiziert werden konnten, einher. Wie bereits oben beschrieben, wird eine Überwucherung der Darmflora mit Enterobakterien bei verschiedenen Erkrankungen beobachtet (Husebye 2005) und geht vermutlich auf einen Zusammenbruch der mukosalen Physiologie und damit der Barrierefunktion zurück. Dies wird auch weitgehend durch die Ergebnisse dieser Arbeit zur T. gondii-Ileitis unterstützt. Die bei Entzündung vorherrschenden E. coli sind demnach assoziiert mit Entzündung im Colon von IL-2-/- Mäusen (Schuppler et al. 2004). Die Akkumulation von Enterobakterien im entzündeten Colon DSS-behandelter Mäuse konnte zusätzlich zur kulturellen Analyse mittels DGGE in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Zusätzlich zu den akkumulierenden E. coli wurden mittels DGGE bisher nicht-kultivierbare Lactobacillus- bzw. Clostridium-Arten detektiert, die im Verlauf der Entzündung zurückgingen bzw. anstiegen (Abb.25A/B). Die DGGE wurde bereits bei der Identifizierung von Florenveränderungen im Rahmen von spontanen Colitismodellen mit HLA/B27-transgenen Ratten (Hoentjen et al. 2005) und IL-10 defizienten Mäusen (Bibiloni et al. 2005b), aber auch bei der Charakterisierung von bakterien-assoziierter CED im Menschen (Bibiloni et al. 2006) angewendet. Der wichtige Beitrag der Colonflora zur Ausprägung einer Colitis konnte durch Abmilderung der Entzündung nach antibiotischer Behandlung gezeigt werden (Hans et al. 2000a, Rath et al. 2001). Das entzündliche Potential individueller Bakterienspezies kann dabei sehr variabel sein (siehe dazu 4.1.2). Dem colitogenen Potential von E. coli nach Rekonstitution mit einem E. coli-Isolat bei keimfreien IL2-defizienten Mäusen, steht der protektive Effekt von B. vulgatus mpk gegenüber, der die Auslösung einer E. coli-bedingten Colitis verhindern kann. Der Stamm E. coli Nissle 1917 konnte dagegen keine Colitis induzieren (Waidmann et al. 2003). Dies wird auch gestützt durch die Beobachtung, dass eine Behandlung mit E. coli Nissle 1917 eine DSS-Colitis abschwächen kann (Schultz et al. 2004) und der protektive Effekt dieses E. coli Stammes TLR2 und TLR4 abhängig zu sein scheint (Grabig et al. 2006). Dies deutet auch an, dass das entzündliche Potential von E. coli stammabhängig ist. Definierte Mechanismen, durch die akkumulierende E. coli die Colitis verschlimmern, sind bisher nicht bekannt. Dass bei bei TLR2-, TLR4-, TLR2+4-defizienten Tieren die Colitis weniger ausgeprägt war, wie in den Untersuchungen der vorliegenden Arbeit beobachtet, belegt die wichtige Funktion von LPS und TLR2-Liganden, wie Peptidoglykan und Lipoprotein für die Auslösung und Ausprägung der Colitis. Bekräftigt wird dies auch durch die erniedrigten IFN-gamma in Organkulturüberständen aus MLN von TLR-defizienten Tieren (Abb. 24B). Voruntersuchungen zur Colitis bei LBP-defizienten Mäusen hatten gezeigt, dass auch bei Balb/c-Wildtypen im Vergleich zu den LBP-/--Tieren ein signifikanter Anstieg der E. coli-Last im Verlauf der Entzündung zu beobachten war (Heimesaat, Fischer et al. 2007b, PloS ONE). Den LBP-/- Mäusen ging es dabei klinisch signifikant besser, als den Wildtypen. Diese Daten wiesen darauf hin, dass der Anstieg von E. coli nicht vom genetischen Hintergrund der Tiere abhängig war, sondern als ein genereller entzündungsbedingter Effekt zu werten ist. In der vorliegenden Arbeit wurden detaillierte histologische Analysen der Colonepithelarchitektur in DSS-behandelten Tieren durchgeführt. Der Gewebeschaden wurde doppel-blind nach einem international evaluierten standartisierten Punktesystem bewertet. Demnach waren die Gewebeschäden im Colon sehr ähnlich bei Wildtyp und TLR2-, TLR4- bzw. TLR2+4-Tieren (Daten hier nicht gezeigt, Heimesaat, Fischer et al. 2007b, PloS ONE ). In den hier durchgeführten Untersuchungen konnte somit histopathologisch kein TLR-bedingter protektiver Effekt auf die DSS-Colitis nachgewiesen werden. Dies steht im Gegensatz zu den Daten anderer Untersucher, dass der bei TLR-defizienten Tieren beobachtete DSS-bedingte Epithelschaden vermutlich auf eine defekte Gewebeproliferation und Wundheilfunktionen zurückzuführen ist (Rakoff-Nahoum et al. 2004, Araki et al. 2005). Die abweichenden Ergebnisse könnten aber auch mit den unterschiedlichen genetischen Hintergründen der Tiere in beiden Arbeitsgruppen zusammenhängen. Eine mögliche TLR5-Flagellin Signaltransduktion könnte bei der Auslösung der Entzündungsantwort im Colon bei der vorliegenden Arbeit ebenfalls beteiligt sein. In einem C3H/HejBir Colitismodell wurde eine spezielle Form des Flagellins aus kommensalen Clostridium spp. als dominantes Antigen identifiziert (Lodes et al. 2004). Interessanterweise sind ca. 50% der M. Crohn- aber nicht Colitis ulzerosa-Patienten seropositiv für genau diesen Flagellintyp (Targan et al. 2005). Im DSS-Colitis Modell der vorliegenden Arbeit trat eine der Clostridien-Gruppe zuzuordnende Bande bei der DGGE-Analyse von Wildtyptieren mit Colitis deutlich hervor (Abb.26A), was auf einen möglichen Zusammenhang hinweisen könnte. Eine Identifizierung von Clostridien-Flagellin und ein eindeutiger Nachweis, dass dies im vorliegenden DSS-Modell, im Vergleich zum klar erwiesenen TLR4-LPS Effekt, eine entzündungsfördernde Rolle spielt, wurde allerdings hier nicht näher untersucht. Zusammengefasst, unterstützt die vorliegende Arbeit die Ansicht, dass eine DSS-Behandlung einen Zusammenbruch der mukosalen Physiologie nach sich zieht, was eine Akkumulation von E. coli im entzündeten Colon zur Folge hat. Die Tatsache, dass ähnliche Prozesse bei humaner CED beobachtet werden können, hebt die DSS-Colitis als geeignetes Modell zum Studium der Wechselwirkungen der kommensalen Darmflora und dem Darmepithel bzw. mit Immunzellen des Darms hervor. In diesem Modell kann die Funktion von Darmbakterien beim Entzündungsgeschehen, der Beitrag bakterieller Komponenten zur Entzündung und die Potenz neuer therapeutischer Ansätze untersucht werden, die auf die Modulation der Flora durch Antibiotika oder Probiotika abheben.

4.4  Der Einfluss einer Salmonella-Lebendvakzine auf H. pylori-induzierte Änderungen der Mausmagenflora

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Eine H. pylori-Infektion beim Menschen kann gastrointestinale Beschwerden hervorrufen und im Verlauf einer chronischen Infektion die Entstehung von MALT-Lymphomen und Magen-Karzinomen begünstigen (siehe Einleitung 1.4). Da eine Kombinationstherapie mit Antibiotika und Protonenpumpeninhibitoren teuer (Rupnow et al. 1999, 2001) und von der Mitwirkung des Patienten abhängig ist, gibt es Bestrebungen, eine einfach zu verabreichende, wirksame orale Einmalimpfung z.B. in Form einer attenuierten Salmonella-Lebendvakzine gegen H. pylori zu entwickeln (Aebischer et al. 2005). Es wurden bereits präklinische Studien im Tiermodell basierend auf der Helicobacter-Urease als Antigen (Ferrero et al. 1995; Michetti et al. 1994; Gomez-Duarte et al. 1998) und klinische Studien am Menschen durchgeführt (Kreiss et al. 1996; Michetti et al. 1999; Angelakopoulos & Hohmann 2000; DiPetrillo et al. 1999; Bumann et al. 2001; Metzger et al. 2004). Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf der molekularen Analyse der Florenveränderung, die nach einer H. pylori-Infektion bzw. nach Immunisierung mit einer Salmonella-Lebendvakzine und anschliessender H. pylori-Infektion im Magen der Maus stattfand. Dabei soll insbesondere der möglicherweise pathologische Effekt dieser Florenverschiebung diskutiert werden. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine H. pylori-Infektion von einem Anstieg der bakteriellen Diversität in der Magenflora begleitet war. Die Ergebnisse der 16S rRNA-Klonbibliotheksanalysen (Abb.27/28) zeigten, dass der Anteil residenter Laktobazillen der gesunden Magenflora nach H. pylori-Infektion gesenkt wurde, während der Anteil anderer Bakterienspezies anstieg. Dieser Anteil bestand neben Laktobazillen und H. pylori aus Arten der Clostridium coccoides Gruppe, Clostridium spp., Bacteroides/Prevotella spp., Eubacterium spp., Ruminococcus spp., E. coli, Streptococcus spp., Lactococcus spp. und taxonomisch zuzuordnenden Vertretern aus dem Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides Phylum (Tab.17). Der H. pylori-infektionsbedingte Anstieg der Diversität konnte durch eine prophylaktische Immunisierung mit der Salmonella-Lebendvakzine (siehe 2.3.3) verhindert werden. Der Anteil der Laktobazillen im Magen der immunisierten Gruppe entsprach dem der nicht H. pylori-infizierten Tieren (Abb.28). Der Anteil von residenten Laktobazillen der Magenflora als mögliches Kolonisierungshindernis für H. pylori und die Anwendung molekularer Methoden zur Charakterisierung der Magenflora wurde z.B. bei Gerbilen beschrieben (Sun et al. 2003, 2005; Monstein et al. 2000). Beim Menschen wurde ein signifikanter Anstieg der Bakterienlast im Magen nach H. pylori-Infektion und Behandlung mit dem Protonenpunmpeninhibitor Omeprazol beobachtet (Mowat et al. 2000). Die erhöhte Anzahl an Bakterien korrelierte mit erhöhten Nitrit und erniedrigten Vitamin C Werten im Magensaft, was möglicherweise dazu führt, dass nitrifizierende Bakterien aufgrund hoher Nitritwerte für den Menschen karzinogene Nitrosamine (NOC, engl.: N-nitroso compounds) produzieren können. Unter physiologischen Bedingungen kann bei einem niedrigen pH-Wert im Magen, Nitrit mit Hilfe von Vitamin C zu Nitritoxid umgewandelt werden (Williams 2001, Mowat et al. 2000; Mowat & McColl 2001). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass eine H. pylori-Infektion grundlegende Änderungen der Magenflora bei Mäusen induziert. Dies führt möglicherweise zur Entstehung neuer Nischen für Bakterienarten, die sich normalerweise nur transient im Magen befinden. Dass Bakterien, die natürlicherweise in distaleren Darmabschnitten lokalisiert sind, den Magen von H. pylori-infizierten Mäusen kolonisieren können, deutet an, dass sich diese kommensalen Darmbakterien nach H. pylori-Infektion an veränderte physiologische Bedingungen im Magen anpassen können (Salzman et al. 2002). Daher könnten in H. pylori-infizierten Mäusen, neben H. pylori selbst, auch andere Bakterien aus distaleren Darmabschnitten zur Pathologie beitragen, da z.B. Laktobazillen, die Nitrat nicht zu Nitrit umwandeln können, durch nitrifizierende Bakterien wie z.B. Clostridien verdrängt werden. Zusätzlich zu H. pylori besitzen auch andere Spezies inflammatorisches Potential wie z.B. bei der Acinetobacter lwoffii-induzierten Gastritis im Mausmodell (Zavros et al. 2002a). Ein erhöhter Magen-pH ist offenbar mit Entzündung korreliert (Feldmann et al. 1996, El Omar et al. 1997, Zavros et al. 2002b). Verminderte Magensäureproduktion oder Gewebeschäden induziert durch H. pylori-Infektion könnten als Erklärung für eine erhöhte bakterielle Diversität dienen. Beide Parameter, Magen-pH bzw. Gewebeschaden, konnten in der vorliegenden Arbeit aber nicht als Erklärung der Florenverschiebung nach H. pylori-Infektion dienen. Bei H. pylori-infizierten Tieren war keine erkennbare Histopathologie der Magenschleimhaut nachzuweisen und die pH-Messungen des Magens ergaben, dass sich die Werte bei H. pylori-infizierten Tieren im Vergleich zu immunisierten bzw. PBS-behandelten Mäusen nicht signifikant unterschieden (Aebischer et al. 2006, Daten hier nicht gezeigt). Obwohl die Gründe für die H. pylori-induzierte Diversitätserhöhung der Magenflora unklar bleiben, unterstützt H. pylori vermutlich die Wachstumsbedingungen für Darmbakterien durch die Produktion von Ammonium und Bikarbonat aus Harnstoff. Beide Substanzen könnten als Substrat für andere Bakterien dienen. Es ist weiterhin bekannt, dass Stress als Folge von Hunger den Anteil der Laktobazillen im Mausmagen verringert (Tannock & Savage 1974), wobei die H. pylori-Infektion auch als eine Art von „Stress“ gewertet werden kann. Der Nachweis kommensaler Darmbakterien im Magen von H. pylori-infizierten Tieren könnte neben dem Aufstieg von Bakterien aus distaleren Darmabschnitten auch mit dem koprophagen Verhalten der Tiere zusammenhängen. Die Gründe für den beobachteten Anstieg der bakteriellen Diversität im Magen nach H. pylori-Infektion bleiben damit also nicht vollständig geklärt. Zusammengefasst, begünstigt eine H. pylori-Infektion durch die o.g. Faktoren offenbar die Ausbildung neuer ökologischer Nischen für Bakterien, die im Magen physiologischerweise nicht vorkommen. Die Tatsache, dass durch die Immunisierung die H. pylori-Last gesenkt und der physiologische Anteil der Laktobazillen im Magen erhalten werden konnte, gibt einen Hinweis darauf, dass mit der Anwendung dieser Vakzine beim Menschen möglicherweise pathologische Schäden durch eine dauerhaft hohe H. pylori-Last im Magen vermieden werden können. Dass viele 16S rRNA-Sequenzen mit Spezies korrespondierten, die als bisher unkultivierbar galten, rechtfertigt den molekulargenetischen Ansatz zur komplexen Analyse der Magenflora in der vorliegenden Arbeit. Da histopathologische Mukosaveränderungen des Magenepithels weitere Änderungen des Ökosystems induzieren könnten, wäre es lohnend, die Techniken zur Analyse der H. pylori-induzierten Änderungen der Magenflora in anderen Mausstämmen zu untersuchen, in denen sich stärkere Anzeichen einer Immunpathologie im Magen entwickeln (Sakagami et al. 1996).


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10.01.2008