Da durch die Rekolonisierungsexperimente gnotobiotischer Mäuse der Beitrag der Gram-negativen Flora, insbesondere von E. coli und Bacteroides/Prevotella spp. zur T. gondii-Ileitis erkennbar war (3.1.5), sollten die Mechanismen der Entzündungsverstärkung genauer untersucht werden. Die Hypothese, dass eine entzündungsverstärkende LPS/TLR4-Signaltransduktion an der Ausprägung der Immunpathologie beteiligt sein könnte, wurde analog durch Florenanalysen, Vergleich der Überlebensraten, der Bestimmung der Histopathologie und Immunmediatoren, sowie der RNA-Expression im Ileum bei C57BL/10 Wildtyp und TLR2-, TLR4-, bzw. TLR2+4-defizienten Tieren mit T. gondii-induzierter Ileitis untersucht. Gnotobiotische TLR4-defiziente Tiere mit definierter Rekolonisierung wurden eingesetzt, um das inflammatorische Potenzial einer E. coli-Monobesiedelung und von E. coli Lipid A auf die T. gondii-Ileitis zu untersuchen (siehe 3.2). Die umfangreiche kulturelle Florenanalyse, gestützt durch molekulare Methoden (Abb.18) ergab, dass bei allen Gruppen, Wildtyp und TLR-defizienten Tieren, ein signifikanter Anstieg von E. coli während der Entzündung stattfand. Der Anteil Gram-positiver Stäbchen, wie Laktobazillen und Clostridien, war bei allen Gruppen während der Entzündung geringgradig erniedrigt, während die Enterokokken und Bacteroides/Prevotella spp. geringgradig erhöht waren (Abb.18A). TLR4- bzw. TLR2+4-defiziente Mäuse zeigten nach T. gondii-Infektion eine verringerte Mortalität und Immunpathologie im Verlauf der Ileitis im Vergleich zu TLR2^-/- und Wildtyp-Tieren (Abb.19A/B). Die Werte für IFN-gamma und NO waren bei den TLR4-defizienten Tieren signifikant reduziert (Abb.20A/B). Eine möglicherweise ungleiche Parasitenlast zur Erkärung dieser Unterschiede, konnte durch den Nachweis, dass sich in allen Experimentalgruppen (Wildtyp und TLR-defiziente Tiere) eine nahezu identische Anzahl von Tachyzoiten im terminalen Ileum fand, widerlegt werden (Daten hier nicht gezeigt; Heimesaat, Fischer et al. 2007). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Ileitis im T. gondii-Infektionsmodell über den TLR4-Signalweg verstärkt wurde. Dies unterstreicht die Rolle des LPS Gram-negativer Bakterien für die Auslösung und Verstärkung von Darmentzündungen im allgemeinen und wird auch durch die Behandlung gnotobiotischer Tiere mit gereinigtem LPS bekräftigt, was einen ähnlichen Entzündungsgrad auslösen konnte wie eine E. coli-Monobesiedelung gnotobiotischer Tiere. Ein E. coli-Isolat aus dem entzündeten Mausdarm war in der Lage, eine ausgeprägte TLR4-abhängige Immunantwort in vivo und in vitro auszulösen (Abb.21B+C und Heimesaat, Fischer et al. 2007). Genotypisierungen von E. coli-Isolaten mittels RAPD-PCR aus gesundem und entzündetem Ileum (3.1.3.3.1) deuteten daraufhin, dass ein während der Ileitis akkumulierender E. coli-Stamm hochwahrscheinlich aus der gesunden Normalflora entstammte, wo er in nur geringer Zahl nachweisbar war (Abb.18A). Daten zu adhärenten invasiven E. coli (AIEC) Stämmen zeigen, dass diese in Makrophagen eindringen, dort überleben und eine starke TNF-alpha Antwort hervorrufen können (Boudeau et al. 1999; Glasser et al. 2001; Bringer et al. 2006; Barnich & Darfeuille-Michaud 2007). Interessante probiotische Therapieansätze gegen adhärent-invasive E. coli belegen die mögliche Bedeutung solcher Strategien bei der CED im Menschen (Boudeau et al. 2003; Ingrassia et al. 2005). Einige in der vorliegenden Arbeit isolierten E. coli-Stämme blieben zwar ohne Nachweis für einige bekannte Pathogenitätsfaktoren (Shiga-Toxin stx1/2, Intimin eaeA, alpha-Hämolysin hlyA, Serinprotease espA, Katalase/Peroxidase katP, hitze-stabiles Enterotoxin astA), wurden aber nicht auf eine mögliche enteroinvasive Kompetenz hin untersucht (3.1.3.3.2). In vitro Daten (hier nicht gezeigt) konnten im übrigen zeigen, dass die E. coli-induzierte NO-Ausschüttung aus murinen Peritonealmakrophagen durch ein hitze-inaktiviertes Lysat von Lactobacillus johnsonii reduziert werden konnte, was schliessen lässt, dass der dominierende Anteil an Laktobazillen der gesunden Flora möglichweise eine durch E. coli verursachte Immunreaktion verhindern kann (Heimesaat, Fischer et al. 2007). Die Tatsache, dass am Tag acht/neun p.i. beim Wildtyp und TLR4-defizienten Mäusen lebende E. coli in mesenterialen Lymphknoten, Milz und Leber vergleichbar häufig nachgewiesen werden konnten (Daten hier nicht gezeigt; Heimesaat, Fischer et al. 2007), deutete an, dass weder TLR2, noch TLR4 die Translokation von Bakterien vermitteln, was in Folge zu einem direkten Kontakt von E. coli-Zellwandbestandteilen mit Immunzellen führen kann. Erniedrigte IFN-gamma und NO-Werte im entzündeten Ileum TLR4-defizienter Mäuse im Vergleich zum Wildtyp und TLR2^-/- (Abb.20), unterstützen die Hypothese, dass translozierende E. coli die intestinale Entzündungsreaktion über einen LPS-vermittelten Signalweg verstärken. In der Folge werden Entzündungsmediatoren aus Makrophagen und Granulozyten ausgeschüttet, welche die Gewebezerstörung verstärken und die ihrerseits eine sekundäre Immunantwort durch T-Zellen auslösen. Um die Hypothese des TLR4/LPS-vermittelten Mechanismus zur Auslösung der Entzündung noch weiter zu stützen, wurden C57BL/6-Mäuse mit T. gondii-Ileitis, die mit dem nicht-resorbierbaren LPS-Antagonisten Polymyxin B (Warren et al. 1985; Tsubery et al. 2000, 2000a, 2002; 2005) behandelt. Die in der vorliegenden Arbeit mit Polymyxin B behandelten Tiere wiesen eine abgemilderte Histopathologie (Abb.22A) und erniedrigte NO-Werte (Abb.22C) auf, im Vergleich zu Placebo-behandelten Kontrolltieren, wobei eine prophylaktische Gabe des Polymyxin B erffektiver war, als eine therapeutische Behandlung. Zudem war die Darmlänge bei prophylaktisch mit Polymyxin B behandelten Tieren signifikant weniger verkürzt als bei der Placebo-Kontrolle (Abb.22B). Eine Analyse der Flora zeigte, dass E. coli bei Polymyxin B behandelten Tieren selektiv eradiziert wurde (Heimesaat, Fischer et al. 2007). Die lässt auf eine mögliche zweiseitige Wirkung des Polymyxin B schliessen, eine antibiotische Wirkung und die Bindung von LPS. Neben einer antibiotischen Modulation der Darmflora über Antibiotika könnte somit auch eine Blockade des LPS-vermittelten Signalweges zu neuen Wegen in der Behandlung der Ileitis führen. So ist bereits eine Reihe von Substanzen bekannt, die z.B. als LPS-Antagonisten LPS-induzierbare Zytokinproduktion inhibieren können Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Polymyxin B belegen, dass Polymyxin B die LPS-induzierte Bildung von Zytokinen bei Monozyten aus peripherem Blut effektiv blockieren kann (Tsuzuki et al. 2001). Polymyxin B ist allerdings beim Menschen aufgrund toxischer Nebenwirkungen nicht systemisch anwendbar, weshalb chemische Abwandlungen des Grundgerüstes auf ihre Wirksamkeit und möglichen systemischen Einsatz beim Menschen untersucht werden (David 2001). Eine Senkung der Toxizität bei z.T. verbesserter Wirkung beschreiben z.B. Tsubery et al. (2005). Chemisch modifizierte Konjugate des Polymyxin B waren demnach bis zu zehnmal weniger toxisch und konnten die Überlebensrate von Mäusen, die eine normalerweise letale Klebsiella-Infektion erhalten hatten, verbessern (Tsubery et al. 2005). In einer ex vivo Laborstudie konnte nachgewiesen werden, dass Eritoran (E5564) die LPS-induzierte Bildung von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6 und TNF-alpha in humanen Monozyten blockieren kann (Czeslick et al. 2006). In vitro kann z.B. eine LPS-vermittelte Aktivierung der TNF-alpha Ausschüttung aus Mausmakrophagen durch Eritoran inhibiert werden, sowie in vivo die LPS-induzierte Ausschüttung von Zytokinen blockiert bzw. eine erhöhte Letalität bei Mäusen nach Behandlung mit E. coli gesenkt werden (Mullarkey et al. 2003). Eritoran wurde am Menschen bereits auch auf seine Fähigkeit hin überprüft, einen Endotoxinschock zu verhindern (Rossignol et al. 2004). Ein weiterer potentieller Kandidat zum Einsatz gegen einen Endotoxinschock beim Menschen ist ein kürzlich entdecktes Produkt (CyP) aus dem Cyanobakterium Oscillatoria planktothrix FP1. Cyp hat sich als ein effektiver kompetitiver Inhibitor von LPS in vitro und im in vivo-Mausmodell herausgestellt (Macagno et al. 2006). Das Lipid A-Mimetikum CRX-526 besitzt eine antagonistische TLR4-Aktivität und kann die Interaktion von LPS mit dem Immunsystem blockieren. Bei einem DSS-Colitis-Modell und spontaner Colitis bei MDR1a-defizienten Mäusen (engl.: multidrug resistence gene 1a) konnte mit CRX-526 eine Verminderung der gastrointestinalen Entzündung herbeigeführt werden (Fort et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde die Ausprägung der T. gondii-induzierten Ileitis bei TLR2-, TLR4- bzw. TLR2+4-defizienten Tieren untersucht. Dabei wurde besonders die Wechselwirkung kommensaler Darmbakterien und einzelner Bakterienspezies bei TLR4-defizienten Tieren beschrieben. Es sind neben TLR4 noch andere TLRs und Adaptermoleküle bzw. TLR-Liganden bekannt, die im Rahmen einer T. gondii-Infektion an der Ausprägung der Immunpathologie beteiligt sein können (Scanga et al. 2002; Mun et al. 2003, 2005; Yarovinsky et al. 2005; Bennouna et al. 2006; Minns et al. 2006; Yarovinsky & Sher 2006; Khan et al. 2007). Die Widerstandsfähigkeit des Wirtes gegen eine T. gondii-Infektion und die T. gondii-infektionsbedingte Bildung von IL-12 sind von dem Adaptermolekül MyD88 abhängig. Bei MyD88-defizienten Tieren konnten sich die Parasiten unkontrolliert vermehren, während bei TLR2- bzw- TLR4-defizienten Tieren eine normale IL-12 Antwort von DCs auf STAg (lössliches Tachyzoiten-Antigen) zu beobachten war (Scanga et al. 2002). Die Auslösung einer inflammatorischen Antwort nach oraler T. gondii-Infektion scheint von TLR9 abhängig zu sein, da die Expansion von DCs in mesenterialen Lymphknoten infizierter Mäuse von einer TLR9-Expression abhängig ist. Die angeborene Immunantwort auf die orale T. gondii-Infektion wird somit u.a. über TLR9 vermittelt (Minns et al. 2006). Weiterhin ist eine möglicher Einfluss einer T. gondii-Infektion auf den LPS/TLR4-Signalweg beschrieben, da auf der Oberfläche von T. gondii-infizierten murinen peritonealen neutrophilen Granulozyten nach LPS-Induktion die Mobilisierung von TNF-alpha abgeschwächt ist, was auf einen möglichen immunsuppressiven Effekt von T. gondii hinweisen könnte (Bennouna et al. 2006). Eine Signalweiterleitung über ein Profilin-artiges Molekül aus T. gondii als Ligand für TLR11 und eine nachfolgende deutliche Ausschüttung von proinflammatorischen IL-12 aus DCs ist im murinen Modell beschrieben (Yarovinsky et al. 2005, Yarovinsky & Sher 2006). Beim Menschen ist TLR11 allerdings nicht funktional wegen des Vorhandenseins eines Stop-Codons im entsprechenden Gen (Zhang et al. 2004). Möglicherweise führt dieser TLR11-vermittelte Signalweg, der in der Folge hochwahrscheinlich durch die Auswirkungen der TLR4-LPS Signalinduktion überdeckt wird, zu einem initialen lokalen Epithelschaden in Ergänzung zu den o.a. Auswirkungen einer T. gondii-Infektion auf die Enterozyten (Abb.29). Die o.a. Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum Beitrag Gram-negativer Bakterien zur T. gondii-induzierten Dünndarmentzündung decken sich mit Beobachtungen bei experimentellen Colitismodellen. Hierbei ist bekannt, dass eine ausgeprägte Colitis mit einer erhöhten Enterobakterien-Last einhergeht, und dass Mäuse, die auf LPS kaum reagieren, eine weniger ausgeprägte Colitis entwicklen (Lange et al. 1996). Es konnte bei einem DSS-Colitis-Modell mit TLR9-defizienten Mäusen gezeigt werden, dass die DNA kommensaler Bakterien eine chronische Dickdarmentzündung verstärkt (Obermeier et al. 2005). Weiterhin soll eine experimentelle Dickdarmentzündung durch TLR4-Antagonisten und präbiotisch wirkenden bakteriellen Substanzen erfolgreich unterdrückt werden können (Fort et al. 2005; Okada et al. 2006). Jedoch wird in den verschiedenen Colitis-Modellen die Rolle bakterieller Komponenten und angeborener Immunität bei der Auslösung einer Entzündung kontrovers diskutiert, da sich z.B. bei Ohkawara et al. (2005) zwischen kranken TLR4-defizienten und Wildtypmäusen weder klinische Parameter noch histopathologische Veränderungen unterschieden. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, dass bei Tieren mit einer TLR(4)-Defizienz der Schweregrad von T. gondii-Ileitis bzw. DSS-Colitis verringert war, haben andere Untersucher (Rakoff-Nahoum et al. 2004; Araki et al. 2005) gezeigt, dass MyD88^-/-- bzw. TLR4- oder TLR2-defiziente Tiere eine stärker ausgeprägte Colitis entwickelten als die Wildtypen. Dies wird damit erklärt, dass die Wechselwirkung von TLRs mit kommensalen Antigenen den Differenzierungsgrad von intestinalen Epithelzellen und damit die intestinale Homöostase aufrecht erhält, was zum Schutz gegen toxische Substanzen wie z.B. dem DSS wichtig sein könnte (Rakoff-Nahoum et al. 2004). Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit, dass intestinale Entzündung erheblich von der Zusammensetzung der Darmflora abhängt, und insbesondere Gram-negative Bakterien zum ilealen Entzündungsprozess beitragen. Dies unterstützt bereits vorhandene Strategien zur Behandlung der CED durch Modulation der Flora über Antibiotika oder Probiotika, sowie den möglichen Einsatz von LPS-blockierenden Substanzen. Die Verstärkung der Ileitis durch ein Überwuchern mit E. coli macht die Notwendigkeit einer detaillierten Analyse der Darmflora deutlich, um den Beitrag individueller bakterieller Gruppen oder Spezies zum Krankheitsgeschehen einzuordnen.

Die umfangreiche Florenanalyse der Colonflora konnte in der vorliegenden Arbeit zeigen, dass nach siebentägiger Behandlung mit DSS am Tag acht ein signifikanter Anstieg von E. coli bei C57BL/10-Wildtyp Tieren, aber nicht bei TLR-defizienten Tieren nachweisbar war. Bei anderen Bakteriengruppen wie Laktobazillen und Clostridien, bzw. Enterokokken und Bacteroides/Prevotella spp. waren keine signifikanten entzündungsbedingten Veränderungen zu erkennen (Abb.23). Eine hohe E. coli-Last war dabei offenbar mit einer klinischen Verschlechterung beim Wildtyp im Vergleich zu den TLR-defizienten Tieren assoziiert (Abb.24A). Durch die Kombination einer umfangreichen Florenanalyse, der Aufnahme klinischer Parameter, sowie der Bestimmung von IFN-gamma in Organkulturüberständen ergänzt durch eine Charakterisierung der Florenmuster mittels PCR-DGGE, konnte hier gezeigt werden, dass die DSS-induzierte Colitis reproduzierbar durch einen deutlichen Verlust der bakteriellen Diversität gekennzeichnet war. Sie ging mit einem Anstieg der kommensalen Gram-negativen Bakterien, die als E. coli identifiziert werden konnten, einher. Wie bereits oben beschrieben, wird eine Überwucherung der Darmflora mit Enterobakterien bei verschiedenen Erkrankungen beobachtet (Husebye 2005) und geht vermutlich auf einen Zusammenbruch der mukosalen Physiologie und damit der Barrierefunktion zurück. Dies wird auch weitgehend durch die Ergebnisse dieser Arbeit zur T. gondii-Ileitis unterstützt. Die bei Entzündung vorherrschenden E. coli sind demnach assoziiert mit Entzündung im Colon von IL-2^-/- Mäusen (Schuppler et al. 2004). Die Akkumulation von Enterobakterien im entzündeten Colon DSS-behandelter Mäuse konnte zusätzlich zur kulturellen Analyse mittels DGGE in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Zusätzlich zu den akkumulierenden E. coli wurden mittels DGGE bisher nicht-kultivierbare Lactobacillus- bzw. Clostridium-Arten detektiert, die im Verlauf der Entzündung zurückgingen bzw. anstiegen (Abb.25A/B). Die DGGE wurde bereits bei der Identifizierung von Florenveränderungen im Rahmen von spontanen Colitismodellen mit HLA/B27-transgenen Ratten (Hoentjen et al. 2005) und IL-10 defizienten Mäusen (Bibiloni et al. 2005b), aber auch bei der Charakterisierung von bakterien-assoziierter CED im Menschen (Bibiloni et al. 2006) angewendet. Der wichtige Beitrag der Colonflora zur Ausprägung einer Colitis konnte durch Abmilderung der Entzündung nach antibiotischer Behandlung gezeigt werden (Hans et al. 2000a, Rath et al. 2001). Das entzündliche Potential individueller Bakterienspezies kann dabei sehr variabel sein (siehe dazu 4.1.2). Dem colitogenen Potential von E. coli nach Rekonstitution mit einem E. coli-Isolat bei keimfreien IL2-defizienten Mäusen, steht der protektive Effekt von B. vulgatus mpk gegenüber, der die Auslösung einer E. coli-bedingten Colitis verhindern kann. Der Stamm E. coli Nissle 1917 konnte dagegen keine Colitis induzieren (Waidmann et al. 2003). Dies wird auch gestützt durch die Beobachtung, dass eine Behandlung mit E. coli Nissle 1917 eine DSS-Colitis abschwächen kann (Schultz et al. 2004) und der protektive Effekt dieses E. coli Stammes TLR2 und TLR4 abhängig zu sein scheint (Grabig et al. 2006). Dies deutet auch an, dass das entzündliche Potential von E. coli stammabhängig ist. Definierte Mechanismen, durch die akkumulierende E. coli die Colitis verschlimmern, sind bisher nicht bekannt. Dass bei bei TLR2-, TLR4-, TLR2+4-defizienten Tieren die Colitis weniger ausgeprägt war, wie in den Untersuchungen der vorliegenden Arbeit beobachtet, belegt die wichtige Funktion von LPS und TLR2-Liganden, wie Peptidoglykan und Lipoprotein für die Auslösung und Ausprägung der Colitis. Bekräftigt wird dies auch durch die erniedrigten IFN-gamma in Organkulturüberständen aus MLN von TLR-defizienten Tieren (Abb. 24B). Voruntersuchungen zur Colitis bei LBP-defizienten Mäusen hatten gezeigt, dass auch bei Balb/c-Wildtypen im Vergleich zu den LBP^-/--Tieren ein signifikanter Anstieg der E. coli-Last im Verlauf der Entzündung zu beobachten war (Heimesaat, Fischer et al. 2007b, PloS ONE). Den LBP^-/- Mäusen ging es dabei klinisch signifikant besser, als den Wildtypen. Diese Daten wiesen darauf hin, dass der Anstieg von E. coli nicht vom genetischen Hintergrund der Tiere abhängig war, sondern als ein genereller entzündungsbedingter Effekt zu werten ist. In der vorliegenden Arbeit wurden detaillierte histologische Analysen der Colonepithelarchitektur in DSS-behandelten Tieren durchgeführt. Der Gewebeschaden wurde doppel-blind nach einem international evaluierten standartisierten Punktesystem bewertet. Demnach waren die Gewebeschäden im Colon sehr ähnlich bei Wildtyp und TLR2-, TLR4- bzw. TLR2+4-Tieren (Daten hier nicht gezeigt, Heimesaat, Fischer et al. 2007b, PloS ONE ). In den hier durchgeführten Untersuchungen konnte somit histopathologisch kein TLR-bedingter protektiver Effekt auf die DSS-Colitis nachgewiesen werden. Dies steht im Gegensatz zu den Daten anderer Untersucher, dass der bei TLR-defizienten Tieren beobachtete DSS-bedingte Epithelschaden vermutlich auf eine defekte Gewebeproliferation und Wundheilfunktionen zurückzuführen ist (Rakoff-Nahoum et al. 2004, Araki et al. 2005). Die abweichenden Ergebnisse könnten aber auch mit den unterschiedlichen genetischen Hintergründen der Tiere in beiden Arbeitsgruppen zusammenhängen. Eine mögliche TLR5-Flagellin Signaltransduktion könnte bei der Auslösung der Entzündungsantwort im Colon bei der vorliegenden Arbeit ebenfalls beteiligt sein. In einem C3H/HejBir Colitismodell wurde eine spezielle Form des Flagellins aus kommensalen Clostridium spp. als dominantes Antigen identifiziert (Lodes et al. 2004). Interessanterweise sind ca. 50% der M. Crohn- aber nicht Colitis ulzerosa-Patienten seropositiv für genau diesen Flagellintyp (Targan et al. 2005). Im DSS-Colitis Modell der vorliegenden Arbeit trat eine der Clostridien-Gruppe zuzuordnende Bande bei der DGGE-Analyse von Wildtyptieren mit Colitis deutlich hervor (Abb.26A), was auf einen möglichen Zusammenhang hinweisen könnte. Eine Identifizierung von Clostridien-Flagellin und ein eindeutiger Nachweis, dass dies im vorliegenden DSS-Modell, im Vergleich zum klar erwiesenen TLR4-LPS Effekt, eine entzündungsfördernde Rolle spielt, wurde allerdings hier nicht näher untersucht. Zusammengefasst, unterstützt die vorliegende Arbeit die Ansicht, dass eine DSS-Behandlung einen Zusammenbruch der mukosalen Physiologie nach sich zieht, was eine Akkumulation von E. coli im entzündeten Colon zur Folge hat. Die Tatsache, dass ähnliche Prozesse bei humaner CED beobachtet werden können, hebt die DSS-Colitis als geeignetes Modell zum Studium der Wechselwirkungen der kommensalen Darmflora und dem Darmepithel bzw. mit Immunzellen des Darms hervor. In diesem Modell kann die Funktion von Darmbakterien beim Entzündungsgeschehen, der Beitrag bakterieller Komponenten zur Entzündung und die Potenz neuer therapeutischer Ansätze untersucht werden, die auf die Modulation der Flora durch Antibiotika oder Probiotika abheben.

Eine H. pylori-Infektion beim Menschen kann gastrointestinale Beschwerden hervorrufen und im Verlauf einer chronischen Infektion die Entstehung von MALT-Lymphomen und Magen-Karzinomen begünstigen (siehe Einleitung 1.4). Da eine Kombinationstherapie mit Antibiotika und Protonenpumpeninhibitoren teuer (Rupnow et al. 1999, 2001) und von der Mitwirkung des Patienten abhängig ist, gibt es Bestrebungen, eine einfach zu verabreichende, wirksame orale Einmalimpfung z.B. in Form einer attenuierten Salmonella-Lebendvakzine gegen H. pylori zu entwickeln (Aebischer et al. 2005). Es wurden bereits präklinische Studien im Tiermodell basierend auf der Helicobacter-Urease als Antigen (Ferrero et al. 1995; Michetti et al. 1994; Gomez-Duarte et al. 1998) und klinische Studien am Menschen durchgeführt (Kreiss et al. 1996; Michetti et al. 1999; Angelakopoulos & Hohmann 2000; DiPetrillo et al. 1999; Bumann et al. 2001; Metzger et al. 2004). Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf der molekularen Analyse der Florenveränderung, die nach einer H. pylori-Infektion bzw. nach Immunisierung mit einer Salmonella-Lebendvakzine und anschliessender H. pylori-Infektion im Magen der Maus stattfand. Dabei soll insbesondere der möglicherweise pathologische Effekt dieser Florenverschiebung diskutiert werden. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine H. pylori-Infektion von einem Anstieg der bakteriellen Diversität in der Magenflora begleitet war. Die Ergebnisse der 16S rRNA-Klonbibliotheksanalysen (Abb.27/28) zeigten, dass der Anteil residenter Laktobazillen der gesunden Magenflora nach H. pylori-Infektion gesenkt wurde, während der Anteil anderer Bakterienspezies anstieg. Dieser Anteil bestand neben Laktobazillen und H. pylori aus Arten der Clostridium coccoides Gruppe, Clostridium spp., Bacteroides/Prevotella spp., Eubacterium spp., Ruminococcus spp., E. coli, Streptococcus spp., Lactococcus spp. und taxonomisch zuzuordnenden Vertretern aus dem Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides Phylum (Tab.17). Der H. pylori-infektionsbedingte Anstieg der Diversität konnte durch eine prophylaktische Immunisierung mit der Salmonella-Lebendvakzine (siehe 2.3.3) verhindert werden. Der Anteil der Laktobazillen im Magen der immunisierten Gruppe entsprach dem der nicht H. pylori-infizierten Tieren (Abb.28). Der Anteil von residenten Laktobazillen der Magenflora als mögliches Kolonisierungshindernis für H. pylori und die Anwendung molekularer Methoden zur Charakterisierung der Magenflora wurde z.B. bei Gerbilen beschrieben (Sun et al. 2003, 2005; Monstein et al. 2000). Beim Menschen wurde ein signifikanter Anstieg der Bakterienlast im Magen nach H. pylori-Infektion und Behandlung mit dem Protonenpunmpeninhibitor Omeprazol beobachtet (Mowat et al. 2000). Die erhöhte Anzahl an Bakterien korrelierte mit erhöhten Nitrit und erniedrigten Vitamin C Werten im Magensaft, was möglicherweise dazu führt, dass nitrifizierende Bakterien aufgrund hoher Nitritwerte für den Menschen karzinogene Nitrosamine (NOC, engl.: N-nitroso compounds) produzieren können. Unter physiologischen Bedingungen kann bei einem niedrigen pH-Wert im Magen, Nitrit mit Hilfe von Vitamin C zu Nitritoxid umgewandelt werden (Williams 2001, Mowat et al. 2000; Mowat & McColl 2001). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass eine H. pylori-Infektion grundlegende Änderungen der Magenflora bei Mäusen induziert. Dies führt möglicherweise zur Entstehung neuer Nischen für Bakterienarten, die sich normalerweise nur transient im Magen befinden. Dass Bakterien, die natürlicherweise in distaleren Darmabschnitten lokalisiert sind, den Magen von H. pylori-infizierten Mäusen kolonisieren können, deutet an, dass sich diese kommensalen Darmbakterien nach H. pylori-Infektion an veränderte physiologische Bedingungen im Magen anpassen können (Salzman et al. 2002). Daher könnten in H. pylori-infizierten Mäusen, neben H. pylori selbst, auch andere Bakterien aus distaleren Darmabschnitten zur Pathologie beitragen, da z.B. Laktobazillen, die Nitrat nicht zu Nitrit umwandeln können, durch nitrifizierende Bakterien wie z.B. Clostridien verdrängt werden. Zusätzlich zu H. pylori besitzen auch andere Spezies inflammatorisches Potential wie z.B. bei der Acinetobacter lwoffii-induzierten Gastritis im Mausmodell (Zavros et al. 2002a). Ein erhöhter Magen-pH ist offenbar mit Entzündung korreliert (Feldmann et al. 1996, El Omar et al. 1997, Zavros et al. 2002b). Verminderte Magensäureproduktion oder Gewebeschäden induziert durch H. pylori-Infektion könnten als Erklärung für eine erhöhte bakterielle Diversität dienen. Beide Parameter, Magen-pH bzw. Gewebeschaden, konnten in der vorliegenden Arbeit aber nicht als Erklärung der Florenverschiebung nach H. pylori-Infektion dienen. Bei H. pylori-infizierten Tieren war keine erkennbare Histopathologie der Magenschleimhaut nachzuweisen und die pH-Messungen des Magens ergaben, dass sich die Werte bei H. pylori-infizierten Tieren im Vergleich zu immunisierten bzw. PBS-behandelten Mäusen nicht signifikant unterschieden (Aebischer et al. 2006, Daten hier nicht gezeigt). Obwohl die Gründe für die H. pylori-induzierte Diversitätserhöhung der Magenflora unklar bleiben, unterstützt H. pylori vermutlich die Wachstumsbedingungen für Darmbakterien durch die Produktion von Ammonium und Bikarbonat aus Harnstoff. Beide Substanzen könnten als Substrat für andere Bakterien dienen. Es ist weiterhin bekannt, dass Stress als Folge von Hunger den Anteil der Laktobazillen im Mausmagen verringert (Tannock & Savage 1974), wobei die H. pylori-Infektion auch als eine Art von „Stress“ gewertet werden kann. Der Nachweis kommensaler Darmbakterien im Magen von H. pylori-infizierten Tieren könnte neben dem Aufstieg von Bakterien aus distaleren Darmabschnitten auch mit dem koprophagen Verhalten der Tiere zusammenhängen. Die Gründe für den beobachteten Anstieg der bakteriellen Diversität im Magen nach H. pylori-Infektion bleiben damit also nicht vollständig geklärt. Zusammengefasst, begünstigt eine H. pylori-Infektion durch die o.g. Faktoren offenbar die Ausbildung neuer ökologischer Nischen für Bakterien, die im Magen physiologischerweise nicht vorkommen. Die Tatsache, dass durch die Immunisierung die H. pylori-Last gesenkt und der physiologische Anteil der Laktobazillen im Magen erhalten werden konnte, gibt einen Hinweis darauf, dass mit der Anwendung dieser Vakzine beim Menschen möglicherweise pathologische Schäden durch eine dauerhaft hohe H. pylori-Last im Magen vermieden werden können. Dass viele 16S rRNA-Sequenzen mit Spezies korrespondierten, die als bisher unkultivierbar galten, rechtfertigt den molekulargenetischen Ansatz zur komplexen Analyse der Magenflora in der vorliegenden Arbeit. Da histopathologische Mukosaveränderungen des Magenepithels weitere Änderungen des Ökosystems induzieren könnten, wäre es lohnend, die Techniken zur Analyse der H. pylori-induzierten Änderungen der Magenflora in anderen Mausstämmen zu untersuchen, in denen sich stärkere Anzeichen einer Immunpathologie im Magen entwickeln (Sakagami et al. 1996).