Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie
der medizinischen Fakultät der Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Charakterisierung des dopaminergen Systems bei transgenen Ratten mit einem Antisensekonstrukt gegen die m–RNA der Tryptophanhydroxylase

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité der
Humboldt-Universität zu Berlin

von
Tom Fischer

geb. 17.03.1976 in Pirna

Dekan: Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. R. Morgenstern, Berlin
2. Prof. Dr. H. Fink, Berlin
3. Prof. Dr. W. H. Oertel, Marburg

Datum der Promotion: 01.08.2003

Zusammenfassung

Das dopaminerge und das serotonerge Transmissionssystem sind zwei wichtige Transmissionssysteme, die in eine Vielzahl von Krankheiten des ZNS involviert sind. Es ist gut bekannt, daß eine enge Interaktion zwischen beiden Systemen stattfindet. Krankheiten des ZNS, die sich auf umschriebene Veränderungen zurückführen lassen, haben durch die Interaktionen von Transmissionssystemen weitreichende Folgen auf verschiedene Bereiche des Gehirns. Neuere Therapien machen sich diese Interaktionen zunutze, um in das Krankheitsgeschehen einzugreifen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Reaktion des dopaminergen Systems auf eine genetische Veränderung im serotonergen System untersucht. Die untersuchten transgenen Tiere besaßen ein Gensequenz, die für eine Antisense-m-RNA gegen die m-RNA der TPH kodierte. Die TPH katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Serotoninbiosynthese. Zur Charakterisierung des dopaminergen Systems wurden die Freisetzung und die hochaffine Wiederaufnahme durch den DAT als Parameter ausgewählt.

Die Freisetzung aus Synaptosomenpräparationen war bei den transgenen Tieren signifikant gegenüber den nicht-transgenen Tieren erniedrigt. Bei der hochaffinen Wiederaufnahme ließen sich keine Unterschiede zwischen transgenen und nicht-transgenen Tieren feststellen. Die beobachtete Erniedrigung der Freisetzung bestätigt die Erkenntnisse einer Vielzahl von Studien, die einen stimulatorischen Einfluß von Serotonin auf das dopaminerge System beschreiben.

Abstract

The dopaminergic and the serotonergic transmission systems are two important systems that are involved in a great number of central nervous system (CNS) diseases. It has long been known that a close interaction exists between them. Due to the interactions of transmission systems diseases of the CNS located on a identifiable spot have far-reaching consequences on other systems. Newer therapies take advantage of these interactions in order to interfere with the pathologic process.

This study was performed to investigate how the dopaminergic system reacts to a alteration in the serotonergic system. The observed transgenic animals carried the gene for an antisense-construct against the m-RNA of tryptophahydroxylase (TPH). TPH catalyzes the rate limiting step in serotonin biosynthesis. In order to characterize the dopaminergic system 2 parameters were chosen: dopamine release and dopamine high affinity reuptake.

The following results were obtained: Release of dopamine from synaptosomal preparations was decreased significantly in comparison to non-transgenic control animals. No difference concerning high affinity dopamine reuptake measured by continuous potential amperometry was noted.

The findings concerning release of dopamine are in line with studies describing a facilitatory effect of serotonin on the dopaminergic system.

Eigene Schlagworte: dopaminerg, serotonerg, transgen, Ratte, Tryptophanhydroxylase, antisense, Kontinuierliche Amperometrie

Eigene Schlagworte: dopaminergic, serotonergic, transgenic, rat, antisense, tryptophanhydroxylase, continuous potential amperometry

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
• 2  Das serotonerge und das dopaminerge Transmissionssystem
  • 2.1 Das serotonerge Transmissionssystem
    • 2.1.1 Bedeutung
    • 2.1.2 Entwicklung und Organisation
    • 2.1.3 Serotoninmetabolismus
    • 2.1.4  Die Tryptophanhydroxylase
  • 2.2  Das dopaminerge Transmissionssystem
    • 2.2.1 Bedeutung
    • 2.2.2 Entwicklung und Organisation
    • 2.2.3 DA-Synthese und Speicherung
    • 2.2.4 DA-Freisetzung
    • 2.2.5  DA-Wiederaufnahme und Abbau
  • 2.3 Einflüsse des serotonergen auf das dopaminerge Transmissionssystem
  • 2.4 Einflüsse des dopaminergen auf das serotonerge Transmissionssystem
• 3  Aufgabenstellung der Arbeit
• 4 Materialien und Methoden
  • 4.1 Material und Chemikalien
  • 4.2  Tiere und Haltungsbedingungen
  • 4.3  Methoden
    • 4.3.1 Vermehrung der transgenen Ratten
    • 4.3.2 Genotypisierung der Ratten
      • 4.3.2.1 Gewinnung der genomischen DNA
      • 4.3.2.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
      • 4.3.2.3 Gelelektrophorese
    • 4.3.3  DA-Freisetzung in vitro an Synaptosomenpräparationen
      • 4.3.3.1 Prinzip
      • 4.3.3.2 Synaptosomenpräparation
      • 4.3.3.3 Synaptosomensuperfusion
      • 4.3.3.4 Proteinbestimmung
      • 4.3.3.5 Probenmessung mittels HPLC und elektrochemischer Detektion
      • 4.3.3.6 Auswertung
    • 4.3.4 Bestimmung der DA-Wiederaufnahme in vivo
      • 4.3.4.1 Prinzip amperometrischer Meßverfahren
      • 4.3.4.2 Continuous Potential Amperometry (CPA) mit unbehandelter Kohlefaserelektrode
      • 4.3.4.3 Versuchsaufbau
      • 4.3.4.4 Elektrodenherstellung
      • 4.3.4.5 Eichung
      • 4.3.4.6  Stereotaktische Implantation der Elektroden
      • 4.3.4.7  Messung
      • 4.3.4.8 Auswertung
        • 4.3.4.8.1 Modell 1
        • 4.3.4.8.2 Modell 2
• 5  Ergebnisse
  • 5.1 Genotypisierung der Ratten
  • 5.2 Untersuchungen zur synaptosomalen DA-Freisetzung in vitro
    • 5.2.1 Vergleich der Absolutwerte
  • 5.3  Untersuchungen zur DA-Wiederaufnahme in vivo
    • 5.3.1 k-Werte
      • 5.3.1.1 k-Werte für alle DA-Eliminationsvorgänge
        • 5.3.1.1.1 9 Wochen
        • 5.3.1.1.2 10 Monate
      • 5.3.1.2  k-Werte für hochaffine Wiederaufnahme
        • 5.3.1.2.1 9 Wochen
        • 5.3.1.2.2 10 Monate
    • 5.3.2  vmax-Werte
      • 5.3.2.1 vmax-Werte für alle DA-Eliminationsvorgänge
      • 5.3.2.2  vmax-Werte für hochaffine Wiederaufnahme
    • 5.3.3 Altersvergleich
      • 5.3.3.1 Kontrolltiere
      • 5.3.3.2  Heterozygote Tiere
    • 5.3.4 Zusammenfassung
• 6  Diskussion
  • 6.1 Wirkung des Transgens
  • 6.2 Methodik
    • 6.2.1 Untersuchungen zur DA-Freisetzung in vitro
    • 6.2.2 Untersuchungen zur DA-Wiederaufnahme in vivo
  • 6.3  Ergebnisse
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Curriculum vitae
• Selbständigkeitserklärung

Tabellen

• Tab. 1 : Chemikalien
• Tab. 2 : Zusammensetzung der McIlwain-Puffer für die Synaptosomensuperfusion (Normalpuffer)
• Tab. 3 : Zusammensetzung der McIlwain-Puffer für die Synaptosomensuperfusion (Stimulationspuffer)
• Tab. 4 : Zusammensetzung der McIlwain-Puffer für die Synaptosomensuperfusion (Aufnahmepuffer)
• Tab. 5 : Zusammensetzung des Laufmittels für die HPLC (Angaben beziehen sich auf 1l Aqua dest.)
• Tab. 6 : Zusammensetzung der PCR-Reaktionsgemische
• Tab. 7 : Ablauf der qualitativen PCR
• Tab. 8 : Koordinaten zur Plazierung der Elektroden
• Tab. 9 : Stimulationsparameter
• Tab. 10 : p-Werte der einzelnen Fraktionen

Bilder

• Abb. 1 : Schematische Darstellung der wichtigsten serotonergen Projektionen im ZNS der Ratte [Marsden, 1993 #88]
• Abb. 2 : Schematische Darstellung des dopaminergen mesotelenzephalen Systems [Dunnett and Robbins, 1992 #95] (PF:präfrontaler Kortex; AC: vorderer cingulärer Kortex; NS: Striatum; S: Septum; NA: Nucleus accumbens; OT: Tuberculum olfactorium; A: amygdala; MFB: Mediales Vorderhirnbündel; VTA: ventrale tegmentale Area; SN: Substantia nigra)
• Abb. 3 : Schematische Darstellung der Transmitterpools in der dopaminergen Nervenendigung [Arbuthnott, 1991 #38] (HVA = Homovanillinsäure, DOPAC = Dihydroxyphenylalanin)
• Abb. 4 : Ultraviolett-Photographie einer Gelelektrophorese der PCR-Reaktionsgemische. Jede Gelkammer enthielt die Probe einer Ratte.
• Abb. 5 : Schematische Darstellung des präsynaptischen Anteils eines Synaptosoms
• Abb. 6 : Schematischer Versuchsaufbau bei den Versuchen zur DA-Freisetzung
• Abb. 7 : Schematische Darstellung von DA-Peaks wie sie bei der HPLC der Perfusate erhalten wurden.
• Abb. 8 : Oxidation von DA
• Abb. 9 : Schematischer Versuchsaufbau für die Versuche zur hochaffinen DA-Wiederaufnahme
• Abb. 10 : Schematische Darstellung einer Meßelektrode.
• Abb. 11 : Übereinanderprojektion der verschiedenen bei der Eichung erhaltenen Konzentrationsverläufe (rot: 125 nmol DA, grün: 250 nmol DA, blau: 500 nmol DA, schwarz: 1 µmol DA)
• Abb. 12 : Schematische Darstellung der bei der Stimulation des MFB applizierten Pulse
• Abb. 13 : Meßkurve nach Stimulation mit 200 Impulsen nach der Gabe von GBR 12909.
• Abb. 14 : Schematische Darstellung einer Meßkurve.
• Abb. 15 : Aufeinanderprojektion vom unteren Bereich der Meßkurve (starke Streuung) und mit Modell 1 berechneter Kurve (glatte Kurve).
• Abb. 16 : Aufeinanderprojektion von berechneter und Meßkurve (exponentieller und linearer Anteil) bei Berechnung mit Modell 2.
• Abb. 17 : DA-Freisetzung aus Synaptosomen, Vergleich der einzelnen Perfusatfraktionen von transgenen Tieren (n=7) mit Kontrolltieren (n=9), (*: P < 0,05 Mann-Whithney-U-Test), aufgetragen sind jeweils die Mittelwerte mit Standardfehler (SEM)
• Abb. 18 : Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten der 9 Wochen alten Versuchsgruppen für die Gesamtheit der Eliminationsvorgänge von DA aus dem Extrazellulärraum. Es liegt kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen vor.
• Abb. 19 : Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten der 10 Monate alten Versuchstiere für die Gesamtheit der Eliminationsvorgänge von DA aus dem Extrazellulärraum. Es liegt kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen vor.
• Abb. 20 : Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten der 9 Wochen alten Versuchstiere für die hochaffine DA-Wiederaufnahme. Es liegt kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen vor.
• Abb. 21 : Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten der 10 Monate alten Versuchstiere für die hochaffine DA-Wiederaufnahme. Es liegt kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen vor.
• Abb. 22 : Vergleich der vmax-Werte der 9 Wochen alten Versuchstiere. Es liegt kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen vor.
• Abb. 23 : Vergleich der vmax-Werte der 9 Wochen alten Versuchstiere. Es liegt kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen vor.
• Abb. 24 : Vergleich der beiden Altersgruppen der Kontrollgruppen. Es liegt kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen vor.
• Abb. 25 : Vergleich der beiden Altersgruppen der heterozygoten Tiere. Es liegt kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen vor.