The signalling pathway of BimL and BimS, two isoforms of the BH3-only protein Bim, in apoptosis

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat)

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biochemikerin Gabriella   Forro

geboren in Budapest

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Dr. h.c. Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Schön

Gutachter:
1. Prof. Dr. P. Daniel
2. Prof. Dr. A. Leutz
3. PD Dr. M. Lipp

Tag der mündlichen Prüfung: 2. Dezember, 2009

Widmung:

anyu- és apunak

sok szeretettel

Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle des pro-apoptotischen Proteins Bim am endoplasmatischen Retikulum (ER) und an den Mitochondrien zu untersuchen um den apoptotischen Signalweg dieses Mitgliedes der Bcl-2 Proteinfamilie näher aufzuklären.

Für diese Untersuchungen wurden zwei Isoformen von Bim verwendet, zum einen BimL, eine lange Version von Bim welches an den Motor Dynein Komplex gebunden ist, zum anderen die kürzere Form BimS, welches im Zytosol lokalisiert ist.

Um eine konditionale Expression von Bim zu erreichen, wurde Myc-markierte humane cDNA unter der Kontrolle des Tet-Off Systems in einen adenoviralen Vector kloniert.

Eine Überexpression von BimL und BimS induzierte in der Prostatakarzinomzelllinie DU145 unter Beteiligung der Proteine Bax und Bak apoptotischen Zelltod. Sowohl BimL , als auchBimSführte in stabil exprimierenden DU145-GFP-Bax und DU145-GFP-Bak Zellen zu einer Konformationsänderung und zu einem Zusammenclustern von Bax und von Bak. Eine Überexpression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 in DU145 Zellen lokalisiert am endoplasmatischen Retikulum zeigte eine vollständige Hemmung der Bim-induzierten Apoptose, während Überexpression von Bcl-2 an den Mitochondrien nur eine partielle Hemmung herbeiführte. Bim Expression induzierte in DU-145-Bax und in DU145-Bak überexpremierenden Zellen den Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials. Dieses wurde ebenso in mit am ER lokalisiertem Bcl-2 in DU145 Zellen beobachtet. Bcl-2 lokalisiert an den Mitochondrien vermindert dagegen den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials. Interessanterweise, war aber keines der beiden Bim Isoformen in der Lage Zelltod zu induzieren wenn Bcl-2 am ER exprimiert wurde, was die Wichtigkeit des endoplasmatischen Retikulums im Bim- vermittelten Apoptosesignalweg unterstreicht.

Um die durch Bim induzierten Prozesse am ER näher zu charakterisieren, wurde die Kalzium Freisetzung aus dem ER untersucht. Eine erhöhte zytosolische Kalzium Freisetzung konnte durch BimS Überexpression induziert werden und ging zeitlich einem Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials voraus. Proteinanalysen mittels Western Blot zeigten eine Hochregulierung von ER-Stress Proteinen nach Bim Überexpression. Die Bim-induzierte DNA-Fragmentierung wurde von einer Cytochrom c Freisetzung aus den Mitochondrien und der Prozessierung und Aktivierung von Caspase-9, -3 und -8 begleitet. Die Spaltprodukte dieser Caspasen wurden einerseits im Western Blot, andererseits durch fluoreszenzmarkierte Peptide,  die an die Spaltform der erwähnten Caspasen binden, bestimmt. Mit einem Breitband-Caspase Hemmer konnte der Bim-induzierte Zelltod vollständig gehemmt werden, was zeigt, dass Caspasen für die Exekution der Apoptose essentiell sind.

Durch Verwendung eines spezifischen Hemmers der Initiator Caspase-8 konnte der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials nach BimS Induktion gehemmt werden, was auf eine wichtige Rolle der Caspase-8 oberhalb des Mitochondriums hindeutet.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Bim, parallel zum mitochondrialen Signalweg, ER-Stress auslöst. Die Ergebnisse lassen darauf schliessen, dass Bim eine effektive Apoptose durch die Interaktion des endoplasmatischen Retikulums der Aktivierung von Caspasen und der Mitochondrien induziert.

Inhaltsverzeichnis

Bilder



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
03.04.2012