2 Material und Methoden

Tab. 4: Antikörper-Präparate von Patienten. Über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten (siehe 2.2.9) ist die Aktivität vorhandener Autoantikörper ermittelt. Zur Präparation durch Ammoniumsulfatfällung siehe 2.2.1, Affinitätschromatografie siehe 2.2.2. (KHK: koronare Herzkrankheit, PHT: Pulmonale Hypertonie)

Tab. 5: Antikörper-Präparate von Kontrollpersonen. Tests auf verschiedene Antikörperspezifitäten über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten (siehe 2.2.9) sind negativ. Zur Präparation durch Ammoniumsulfatfällung siehe 2.2.

Die Immunglobuline wurden aus den Seren wie folgt präpariert: In einem 2 ml-Reaktionsgefäß werden zu 1 ml Serum tropfenweise 660 µl einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (Endkonzentration 40 %) unter Rühren zugegeben. Nach einer Inkubation bei 4°C für 18 h folgt eine Zentrifugation bei 6.000 × g bei 4°C für 15 min. Der Überstand wird entfernt. Das Pellet wird in 750 µl PBS-Dialysepuffer aufgenommen und mit Hilfe des Vortex-Gerätes vermischt. Anschließend wird tropfenweise 750 µl einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (Endkonzentration 50 %) zugegeben und mit dem Vortex-Gerät vermischt. Nach erneuter Zentrifugation (6.000 × g bei 4°C für 15 min) wird dieser Resuspendierungsschritt noch einmal wiederholt. Anschließend wird das Pellet in 700 µl PBS-Dialysepuffer gelöst und gegen einen PBS-Dialysepuffer drei Tage lang dialysiert. Das Volumenverhältnis von Probe zu Puffer ist 1:100. Die Dialyse erfolgt bei 4°C und der Puffer wird täglich zweimal gewechselt. Die erhaltene IgG-Fraktion wird bei –20°C gelagert.

Biotinylierte Peptide, deren Aminosäuresequenzen dem Epitop des zu reinigenden Antikörpers entsprechen (Tab. 6), werden in PBS gelöst (100 µg/ml). 1 ml IgG-Präparat wird mit 100 µl Peptidlösung gemischt und für eine Stunde bei 4°C inkubiert. In einem 2 ml-Reaktionsgefäß werden 150 µl Streptavidin-konjugierte Magnetobeads mit 1 ml PBS versetzt und gut vermischt. Mit Hilfe einer speziellen Halterung für die Reaktionsgefäße mit verschiebbarer Magnetrückwand (Dynal MPC^®-S) werden die Beads fixiert und der Überstand wird abpipettiert. Dieser Waschvorgang wird 2-mal wiederholt. Zu den Beads wird nun das mit dem Peptid vorinkubierte IgG-Präparat gegeben, die Suspension wird gut vermischt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Streptavidin-konjugierten Magnetobeads binden an das biotinylierte Peptid. Mit der Magnetrückwand werden die Beads mit den daran gekoppelten Antikörpern fixiert. Der Überstand wird abgenommen. Die Beads werden 6-mal mit PBS gewaschen. Die Elution der Antikörper erfolgt mit 400 µl einer 3 M KSCN-Lösung unter mehrmaligem Schwenken für 5 min. Dann werden 400 µl 6 M KSCN zugefügt und ebenfalls für 5 min inkubiert. Nach Zugabe von 400 µl PBS erfolgt eine weitere Inkubation für 5 min. Dieses Gemisch wird in BSA-blockierte (1 mg BSA/3 ml PBS) Dialyse-Gefäße gefüllt und für 2-3 Tage bei 4°C ohne Rühren dialysiert. Dabei wird der PBS-Dialysepuffer täglich 2-mal gewechselt. Zur Konzentrationsbestimmung wird die Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen.

Tab. 6: Peptidsequenzen für die affinitätschromatografische Reinigung von Autoantikörpern

Neugeborene Ratten (1-3 Tage alt) werden in Gruppen von 5 bis 10 Tieren dekapitiert. Alle weiteren Schritte erfolgen unter sterilen Bedingungen. Mit Zellstoff und 70 % Ethanol wird der Brustkorb desinfiziert und anschließend mit einer Schere geöffnet. Das Herz wird mit zwei Skalpellen entnommen und in eine Petrischale mit PBS und Antibiotikum überführt. Nach der Entfernung der Atrien werden die Ventrikel mit dem Skalpell in 4-6 Stücke zerkleinert. Die Lösung mit den Ventrikelstücken wird in einen Erlenmeyerkolben pipettiert. Nach Absetzen der Stücke wird die PBS-Antibiotikum-Lösung abpipettiert und durch 10 ml frische Lösung ersetzt. Nach Schwenken und Absetzenlassen der Ventrikelstücken wird der Überstand wiederum entfernt. Nun erfolgt dieser Waschvorgang mit 10 ml PBS ohne Antibiotikum.

Zu Beginn der Trypsinierung werden die Ventrikelstücken in 15 ml 0,2 % Trypsinlösung im 37°C-Wasserbad für ca. 3 min unter Rühren inkubiert. Der Überstand wird abgesaugt und verworfen. Danach erfolgt die Isolierung der Kardiomyozyten. Für die erste Hauptfraktion werden die Ventrikelstücken in 30 ml Trypsinlösung im Wasserbad für 20 min inkubiert. Die Trypsinierung wird mit 10 ml eisgekühltem NKS abgestoppt. Die Zellsuspension wird in ein 50 ml-Röhrchen überführt und bei 130×g für 6 min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 10 ml SM20-I/50 % NKS aufgenommen. Dieser Vorgang wird für die zweite und gegebenenfalls für die dritte Hauptfraktion wiederholt. Die Fraktionen werden in einem 50 ml-Röhrchen vereint und erneut zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wird das Zellpellet in 20 ml SM20-I-Medium aufgenommen. Nach Vermischen von 100 µl Zellsuspension mit 100 µl Trypanblaulösung werden Zellzahl und –vitalität mit einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt. Pro Herz werden 1-2 Millionen Kardiomyozyten gewonnen. Zur Zellsuspension werden NKS (10 %), Glutamin (2 mM), FUDR (2 µM) und SM20-I zugesetzt, so dass 2 Millionen Zellen in 3 ml Medium vorliegen. In 12,5 cm²-Kulturflaschen werden 3 ml Zellsuspension eingesät und die Flaschen werden mit einem Gummistopfen verschlossen. In einem 37°C-Brutschrank werden die Zellen kultiviert. Das Medium wird am Tag nach der Isolierung und dann jeden dritten Tag gewechselt.

Zur Lagerung werden 500.000 Zellen pro Milliliter in SmGM-2-Medium mit 10 % FCS und 10 % DMSO aufgenommen und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Für die Kultur werden pro 25 cm²-Kulturflasche 90.000 Zellen in 5 ml SmGM-2-Medium (5 % FCS) eingesät. Die Zellen werden im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO₂ kultiviert. Der erste Mediumwechsel erfolgt am nächsten Tag, weitere Wechsel alle zwei bis drei Tage. Bei 70-90 % Konfluenz werden die Zellen unter Verwendung von TV-Lösung passagiert oder in Passagen 7 bis 10 für eine Stimulation verwendet.

Für die Versuche mit Thrombozyten und Monozyten wird Blut gesunder Spender aus den Blutspendezentren der Charité und von HAEMA (Marzahn) in Berlin verwendet. Mit mündlicher Einwilligung der diensthabenden Ärzte und schriftlicher Einwilligung der Spender wird zu Beginn der Spende im Zuge der Abfüllung von Röhrchen für die routinemäßigen Laboruntersuchungen zusätzliches Blut entnommen. Dieses wird gut verpackt umgehend zum Labor transportiert und sofort entsprechend den Versuchen aufbereitet.

Es wird unter sterilen Bedingungen gearbeitet.

Für die Blutentnahme von einem Plasmaspender werden zwei 60 ml-Spritzen mit je 20 ml Heparin (10.000 IE) in physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Die Spritzen werden mit Blut auf 50 ml aufgefüllt, geschwenkt und in Styropor verpackt zum Labor transportiert.

In vier Leucosep-Röhrchen werden je 15 ml Ficoll-Paque^TM Plus gegeben. Die Röhrchen werden 1 min bei 800×g zentrifugiert. Nun wird das Blut auf die Röhrchen verteilt und 10 min bei 1.000×g ohne Bremse zentrifugiert. Das Plasma wird mit einer Pipette abgesaugt. Die Buffy Coats (Lymphozyten und PBMCs) aus zwei Leucosep-Röhrchen werden in ein 50 ml-Röhrchen abgegossen.

Ab jetzt wird mit eisgekühltem PBS-HSA 0,1 % gearbeitet und Zentrifugations- und Inkubationsschritte erfolgen bei 4°C.

Mit PBS-HSA 0,1 % werden die zwei Röhrchen mit Buffy Coat auf jeweils 40 ml aufgefüllt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 250×g wird der Überstand abpipettiert. Das Zellpellet wird in 1 ml PBS-HSA 0,1 % resuspendiert und auf 30 ml aufgefüllt. Die Zellzahl wird bestimmt und die Zellsuspension erneut für 10 min bei 250×g zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert und das Zellpellet in 200 µl PBS-HSA 0,1 % pro 1×10⁷ Zellen aufgenommen. Es folgt eine Inkubation mit 20 µl Blocking- und 20 µl Antikörper-Lösung (monoklonale Mausantikörper spezifisch für T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Erythrozyten und Granulozyten) pro 1×10⁷ Zellen für 10 min auf dem Rollinkubator.

Während dieser Zeit werden 100 µl Magnetobeads (besetzt mit Anti-Maus-Antikörpern) pro 1×10⁷ Zellen in einem Glasröhrchen gewaschen. Dazu wird dieses für 1 min in den Magnetpartikelkonzentrator gestellt. Der Überstand wird abpipettiert und die Beads werden in 2 ml PBS-HSA 0,1 % aufgenommen. Mit dem Magnetpartikelkonzentrator werden die Beads erneut von der Flüssigkeit getrennt. Danach werden die Beads im Ausgangsvolumen PBS-HSA 0,1 % aufgenommen und auf Eis gelagert.

Nach der Inkubation mit den Antikörpern werden die Zellen gewaschen. Dazu wird zu der Zellsuspension pro 1-5×10⁷ Zellen 1 ml PBS-HSA 0,1 % hinzugegeben. Es folgt eine Zentrifugation für 10 min bei 250×g. Der Überstand wird abpipettiert und die Zellen werden in 0,9 ml PBS-HSA 0,1 % pro 1×10⁷ Zellen resuspendiert.

Danach erfolgen die Zugabe der Magnetobeads und eine Inkubation für 15 min auf dem Rollinkubator. Danach wird pro 1×10⁷ Zellen 1 ml PBS-HSA 0,1 % hinzupipettiert. Die Suspension wird auf Glasröhrchen verteilt und diese werden jeweils für 2 min in den Magnetpartikelkonzentrator gestellt. Dabei werden die an die Magnetobeads gebundenen Zellen abgetrennt. Die Monozyten-Suspension wird dann in ein 50 ml-Röhrchen überführt. Die Zellzahl und Vitalität werden bestimmt.

Nach einer Zentrifugation für 10 min bei 250×g und Entfernen des Überstandes werden die Monozyten in auf 37°C erwärmtem RPMI-Medium aufgenommen (1×10⁶ Monozyten/ml). Die Zellsuspension wird auf 25 cm²-KF verteilt und bis zur Stimulation 30 min im Brutschrank (37°C, 5 % CO₂) inkubiert.

Zum Zählen von Thrombozyten wird die Suspension zunächst 1:100 mit 0,9 % NaCl-Lösung in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß verdünnt. Die Zählung der Zellen erfolgt mit einer Neubauer-Zählkammer. Am Mikroskop werden fünf diagonale Kleinquadrate zu je 16 Kleinstquadraten ausgezählt. Die Summe multipliziert mit 5.000 ergibt die Thrombozytenzahl in der Suspension pro Mikroliter.

Bei allen anderen Zelltypen werden in einem 500 µl-Reaktionsgefäß 10 µl Zellsuspension mit 10 µl Trypanblaulösung gemischt. Die Zählung erfolgt ebenfalls mit einer Neubauer-Zählkammer. Nach Auszählung der lebenden und blau angefärbten toten Zellen in den vier Eckquadraten zu je 16 Kleinquadraten können Zellzahl und –vitalität berechnet werden. Die Summe wird dazu verdoppelt und mit dem Faktor 0,4 multipliziert. Das Ergebnis ist die Zellzahl in der Ausgangssuspension pro Mikroliter.

Alle Untersuchungen erfolgen unter sterilen Bedingungen.

Frisch isolierte Monozyten werden nach einer 30-minütigen Ruhephase im Brutschrank stimuliert.

Bei adhärenten Zellen in Kultur wird einen Tag vor der Stimulation das Medium gewechselt. Dazu werden Medien und ggf. PBS auf 37°C erwärmt. Nach dem Abpipettieren des Mediums werden die Zellen mit 2 ml (12,5 cm² KF) bzw. 4 ml (25 cm² KF) frischem Medium versetzt.

Bei Stimulationen unter serumfreien Bedingungen werden die Zellen nach Entfernen des serumhaltigen Mediums zwei Mal mit 2 ml (12,5 cm² KF) bzw. 4 ml (25 cm² KF) PBS gespült. Danach werden 2 ml (12,5 cm² KF) bzw. 4 ml (25 cm² KF) serumfreies Medium in die Flaschen pipettiert. Bis zur Stimulation werden die Zellen weiter im Brutschrank kultiviert.

Stimulanzien und gegebenenfalls Blocker werden mit A. dest. (Aqua ad iniectabilia) so verdünnt, dass sie im Volumenverhältnis 1:100 ins Zellmedium pipettiert werden können. Als Negativkontrolle wird A. dest. verwendet. Die Inkubation erfolgt unter normalen Kultivierungsbedingungen (im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO₂, bei Kardiomyozyten ohne CO₂-Einstellung).

Antagonisten werden 30 min vor Beginn der Stimulation zu den Zellen gegeben.

Neonatale Ratten-Kardiomyozyten werden am 3. oder 4. Tag der Kultivierung verwendet. Das Medium SM20-I mit 10 % NKS sowie der Objekttisch des Mikroskops werden auf 37°C erwärmt. Für eine Stunde werden die spontan pulsierenden Kardiomyozyten mit 2 ml frischem Medium im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Mit Hilfe einer gelöcherten Metallschablone auf dem Objekttisch werden zehn Messfelder mit synchron kontrahierenden Zellaggregaten ausgewählt. Die computergestützte Messung erfolgt über das Programm Imagoquant Fourieranalyse 100. Zunächst wird die basale Pulsationsrate der Zellen in den festgelegten Messfeldern ermittelt. Nach einer Inkubation mit dem Antikörper-Präparat (1:40, bei affinitätschromatografisch gereinigten Antikörpern 1:100) für eine Stunde bei 37°C folgt eine erneute Bestimmung der Pulsationsrate. Die Differenz aus beiden Bestimmungen wird in Schläge/min angegeben. Der ermittelte „cut off“-Wert liegt bei 7,2. Alle Antikörper-Präparate, bei denen die Differenz der Pulsationsraten größer als der „cut off“-Wert ist, werden als Autoantikörper-positiv bewertet.

Die Zellkulturflaschen, die Reaktionsgefäße, die D-PBS-Lösung und der Lysispuffer werden stets in Eis gekühlt. Das Medium wird aus der KF abgegossen. Die Flasche wird zwei Mal mit 2 ml (12,5 cm² KF) bzw. 4 ml (25 cm² KF) D-PBS gespült. Nach dem Abgießen wird das verbliebene D-PBS sorgfältig abpipettiert. Die Zellen werden in 50 µl Lysispuffer lysiert und mit einem Zellschaber vom Flaschenboden gelöst. Das Lysat wird in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert und 10 min inkubiert. Nach einer kurzen Durchmischung (Vortex) erfolgt eine Zentrifugation bei 16.000×g bei 4°C für 10 min. Ungelöste Zellbestandteile bilden ein Pellet. Der Überstand wird abpipettiert und in ein 0,5 µl-Reaktionsgefäß überführt. Der Zellextrakt wird bei –80°C gelagert.

In einem 0,5 ml-Reaktionsgefäß werden 4 µl Zellextrakt mit 16 µl Lysispuffer verdünnt (1:5). Dann werden 140 µl A. dest. zugegeben. Nach dem Vermischen werden davon dreifach 40 µl in eine 96-Well-Platte pipettiert.

Für die Eichreihe werden BSA-Standard (0,2 mg/ml), Lysispuffer und A. dest. dreifach nach folgendem Schema in die Platte pipettiert: BSA-Standard 2,5 µl bis 20,0 µl (entspricht 0,5 µg bis 4,0 µg), 5 µl Lysispuffer und mit A. dest. jeweils auf 40 µl auffüllen.

Pro 1 ml Lösung A werden 20 µl Lösung S des Bio-Rad-Proteinbestimmungskits in einem Reaktionsgefäß vermischt. Von diesem Gemisch werden 25 µl pro Well hinzupipettiert. Anschließend werden 200 µl Lösung B des Kits zugegeben. Es folgt eine Inkubation auf dem Mikrotiterplatten-Schüttler für 15 min. Die Platte wird im Mikroplatten-Absorptionsfotometer bei einer Wellenlänge von 650 nm gemessen.

Mit „blotten“ (engl.: to blot = klecksen) wird die Übertragung bestimmter Substanzen auf eine Membran bezeichnet. Im Western-Blot sind diese Substanzen Proteine. Fixiert auf der Membran können die Proteine detektiert und quantifiziert werden.

Zuvor wird ein Proteingemisch, z.B. ein Zellextrakt, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Dabei bewegen sich in einem elektrischen Feld kleine Proteine schnell und große Proteine langsam durch ein polymeres Netzwerk. Bei der diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) werden Acrylamid- und Bisacrylamidmonomere durch die Katalyse von TEMED (N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin) und Ammoniumpersulfat vernetzt. SDS (Natriumdodecylsulfat) ist negativ geladen und überdeckt bei der Anlagerung an die Proteine deren Eigenladung. Somit beeinflusst diese nicht den Lauf der Proteine im elektrischen Feld und alle Proteine bewegen sich entsprechend ihrer Molekularmasse in Richtung Anode. Bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese werden die Proteine zunächst in einem Sammelgel zu einer scharfen Bande fokussiert. Danach werden die Proteine im Trenngel der Größe nach aufgetrennt.

Beim Wet-Blot-Verfahren wird der gesamte Komplex aus Gel, anliegender Membran und fixierendem Filterpapier und Schwämmen eingeklemmt in einer Kunststoffkassette vollständig in Transferpuffer getaucht. Wieder bewegen sich die Proteine im elektrischen Feld in Richtung Anode, und zwar aus dem Gel auf die Membran.

Beim sogenannten Immunoblot wird für die Proteindetektion ein Antikörper verwendet, der spezifisch gegen ein Epitop eines Proteins gerichtet ist. Dieser Primärantikörper wird wiederum mit einem Sekundärantikörper detektiert, welcher mit einem Enzym markiert ist. Durch die Reaktion mit dem passenden Substrat entsteht ein direkt nachweisbares Produkt.

Bei der ECL (engl. enhanced chemiluminescence, verstärkte Lumineszenz)-Reaktion wird ein Meerrettich-Peroxidase-gekoppelter Sekundärantikörper verwendet. Das Enzym katalysiert die Oxidation des Substrats Luminol in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H₂O₂). Luminol wird dadurch in einen angeregten Zustand versetzt. Bei der Umkehr in den Grundzustand wird Licht emittiert. Diese Lichtemission wird verstärkt und kann mit einem radiografischen Film detektiert werden.

Zum Gießen des Gels werden zwei Glasplatten nach Anleitung des Herstellers der Elektrophorese-Kammer in einer Halterung fixiert. Die Geldicke beträgt 1,5 mm. Zunächst wird das Trenngel (10 % Acrylamid) zwischen die zwei Glasplatten der Kammer pipettiert und mit A. dest. überschichtet. Das Gel polymerisiert 1 h lang aus. Danach wird das A. dest. abgegossen und das Sammelgel (5 % Acrylamid) auf das Trenngel pipettiert. Nach Einsetzen des Kammes für die Geltaschen polymerisiert das Gel wieder 1 h lang aus.

In einem 0,5 ml-Reaktionsgefäß wird der Zellextrakt im Verhältnis 3:1 mit Probenpuffer (4-fach konzentriert) versetzt. Dieses Gemisch wird im Thermoschüttler bei 800 rpm für 5 min auf 95°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird kondensierte Flüssigkeit kurz mittels Tischzentrifuge herunterzentrifugiert.

Nach Anleitung des Herstellers werden zwei Gele pro Kammer eingesetzt und diese wird in Eis gestellt. Die Kammer wird gefüllt mit auf 4°C gekühltem Elektrophoresepuffer. Die Kämme werden vorsichtig entfernt und die Geltaschen mittels einer Pasteurpipette mit dem Puffer ausgespült. In einer Tasche werden 4 µl des Molekulargewichtsmarkers aufgetragen. Von den Proben werden je nach Verfügbarkeit 10 oder 20 µg aufgetragen.

Bei konstanter Spannung erfolgt der Lauf zunächst für 15 min bei 50 V. Danach werden die Proteine für 100 min bei 120 V der Größe nach getrennt.

Die Nitrocellulose-Membran (9,0×6,0 cm) wird für mindestens 10 min in A. dest. inkubiert. Danach werden Membran, Filterpapier, Schwämme und das Gel mit den aufgetrennten Proteinen in auf 4°C gekühltem Blot-Puffer getränkt. Die Blot-Kammer wird nach Anleitung des Herstellers zusammengesetzt. Dabei werden Luftblasen zwischen Membran und Gel durch Rollen eines Glasstabes entfernt. Die Kammer wird in Eis gestellt. Bei konstanter Stromstärke (250 mA) erfolgt für 120 min der Transfer der Proteine auf die Membran.

Um unspezifische Proteinbindungsstellen der Nitrozellulose-Membran zu blockieren wird die Membran für 1 h mit einer Lösung aus 5 % Magermilchpulver in TBST auf einem Taumelschüttler inkubiert.

Die Inkubation der Membran mit dem Primärantikörper in Blocking-Lösung erfolgt über Nacht bei 4°C in einem 50 ml-Röhrchen auf dem Rollinkubator. Danach wird die Membran in einer Plastikschale dreimal kurz mit TBST gewaschen, dann einmal 15 min und weitere zweimal 5 min auf dem Taumelschüttler, jedes Mal mit frischem TBST. Danach erfolgt die Inkubation der Membran mit dem Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper in 30 ml TBST für 1 h auf dem Taumelschüttler. Die Membran wird erneut mit TBST gewaschen, dreimal kurz, einmal 15 min und viermal 5 min.

Die Membran wird kurz auf Papiertüchern abgetropft und in einer Petrischale mit 1,5 ml ECL-Lösung 1 min inkubiert. Das Substrat in dieser Lösung startet eine chemilumineszente Reaktion mit der Peroxidase. Ein Röntgenfilm wird mit der in einer Klarsichtfolie verpackten Membran in einer Fotokassette in der Dunkelkammer belichtet. Die Belichtungszeit beträgt je nach Intensität des Lumineszenzsignals 10 s bis zu 1 h. Mit der Entwicklungsmaschine wird der Röntgenfilm entwickelt. Die Quantifizierung der Intensität der Proteinbanden erfolgt am Computer mit dem Programm Quantity One.

Ein Nachweis über das Auftragen gleicher Proteinmengen erfolgt durch das Anfärben der Proteine auf der Membran mit Ponceau-S-Lösung. Abb. 4 zeigt ein Beispiel einer solchen Membran.

	Abb. 4: Ponceau-S-Färbung der Proteine auf einer Western-Blot-Membran zum Nachweis gleicher Proteinmengen

Luminophore sind Stoffe, die Energie aus chemischen Reaktionen in Form von Lichtenergie emittieren. Dieser Vorgang heißt Chemilumineszenz. Der Luminophor MCLA produziert Chemilumineszenz in Gegenwart von Superoxidanionen.

Bei Untersuchungen mit Antikörper-Präparationen (IgG) werden diese im Verhältnis 1:20 zur fertigen Monozytensuspension (3 Mio. Zellen/ml) und als Kontrolle zum Medium zugegeben. Davon werden 100 µl in die Wells einer weißen 96-Well-Mikrotiterplatte pipettiert. Die Platte wird im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO₂ inkubiert – 30 min lang bei Versuchen ohne IgG, 60 min bei Versuchen mit IgG.

PMA wird als 80 µM-Aliquot (gelöst in DMSO) bei –20°C gelagert. Mit Medium werden Verdünnungen hergestellt, die die 4-fache Endkonzentration haben. Für die Kontrolle ohne PMA wird DMSO genauso verdünnt wie die höchste zu verwendende PMA-Konzentration. Davon werden 50 µl zu den Monozyten in die Platte pipettiert.

Der Lumineszenzfarbstoff MCLA wird als 10 mM-Aliquot (gelöst in A. dest.) in lichtundurchlässigen Reaktionsgefäßen bei –20°C gelagert. In lichtgeschützten Röhrchen werden auch hiervon mit Medium Verdünnungen hergestellt, die die 4-fache Endkonzentration haben. 50 µl werden in die Wells pipettiert und die Platte wird sofort in den Fluoroskan eingelegt.

Die Messung der Emission erfolgt bei der Wellenlänge 546 nm. Jedes Well wird 1 s lang gemessen, die gesamte Platte 40-mal (entspricht 70 min).

Bei einer durchflusscytometrischen Messung werden Zellen in Form eines laminaren Probenstroms durch eine Messküvette geleitet. Das auftreffende monochromatische Licht eines Lasers wird von jeder einzelnen Zelle gestreut und reflektiert. Außerdem können Zellen spezifisch detektiert werden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, welche Licht emittieren. Über verschiedene Spiegel und Filter wird die von der Zelle abgehende Strahlung nach Wellenlängen getrennt und von Detektoren registriert. Das Vorwärtsstreulicht („forward scatter“) ist ein Maß für die Größe der Zelle, während das Seitwärtsstreulicht („side scatter“) ein Maß für die Zellgranularität ist. Mit diesen Informationen lassen sich die Zellen in der Probe charakterisieren.

Sieben 1,5 ml-Reaktionsgefäße mit je 500 µl Monozytensuspension (1×10⁶ Zellen/ml) werden für 3 min bei 3.000×g zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert und das Zellpellet in 100 µl FACS-Puffer resuspendiert. Antikörper werden nach folgendem Schema zugesetzt:

1. ohne Antikörper
2. Maus-IgG_2a-Isotypkontrolle, PE-konjugiert (3 µl)
3. Maus-IgG_2a-Isotypkontrolle, FITC-konjugiert (5 µl)
4. Maus-IgG_2a-Isotypkontrolle, PE-konjugiert (3 µl) und Maus-IgG_2a-Isotypkontrolle, FITC-konjugiert (5 µl)
5. Maus-anti-human-HLA-DR, PE-konjugiert (3 µl)
6. Maus-anti-human-CD14, FITC-konjugiert (5 µl)
7. Maus-anti-human-HLA-DR, PE-konjugiert (3 µl) und Maus-anti-human-CD14, FITC-konjugiert (5 µl)

Es folgt eine Inkubation für 30 min bei 4°C. Anschließend werden die Zellen zweimal durch Zentrifugation bei 3.000×g für 3 min und Resuspendieren in 500 µl FACS-Puffer gewaschen. Die Zellsuspension wird in ein Röhrchen überführt und am FACS-Gerät gemessen.

Bei der Aggregometrie wird die Veränderung der Lichtdurchlässigkeit einer Thrombozytensuspension gemessen. Einer Transmission von 0 % entspricht eine Suspension mit vollständig vereinzelt vorliegenden Thrombozyten. Hingegen nimmt die Transmission den Wert 100 % an, wenn die Messung ohne Thrombozyten durchgeführt wird. Diese Grenzwerte werden für jede Blutprobe individuell eingestellt durch Eichung des Aggregometers mit PRP (plättchenreiches Plasma) oder Thrombozyten-Suspension (0 %) bzw. mit PPP (plättchenarmes Plasma) oder Suspensionspuffer (100 %).

Durch Stimulanzien wie Kollagen und ADP aggregieren Thrombozyten. Zur gleichmäßigen Durchmischung der Flüssigkeit rotiert ein Stahlstäbchen in der Messküvette. Eine Aggregation bewirkt eine zunehmende Transmission der Thrombozytensuspension.

Alle Puffer werden frisch angesetzt. Die Apyrase (1 U/µl in 0,9 % NaCl) und das Prostaglandin (PGE₁, 10 µM in 0,9 % NaCl) werden auf Eis gelagert. Zur Inkubation und Zentrifugation werden die Röhrchen mit Parafilm^® verschlossen.

In ein 13 ml-Polystyrolröhrchen werden 1,6 ml ACD-A und 10 µl der PGE₁-Gebrauchslösung eingefüllt. Das Röhrchen wird mit Blut auf 10 ml aufgefüllt und vorsichtig gemischt. Es folgt eine Ruheinkubation für 30-60 min.

Durch Zentrifugation für 20 min bei 120xg (ohne Bremse) wird PRP gewonnen. In ein neues Polystyrolröhrchen werden 2 ml Waschpuffer, 20 µl PGE₁-Lösung, 10 µl Apyraselösung und 222 µl ACD-A vorgelegt. Dazu kommen 2 ml PRP. Es folgt eine Inkubation von 15 min. Das Thrombozytenpellet wird durch Zentrifugation für 10 min bei 1.200xg gewonnen. Nach dem Dekantieren des Überstandes wird das Pellet in 2 ml Waschpuffer, 60 µl PGE₁-Lösung und 20 µl Apyraselösung vorsichtig resuspendiert. Die Thrombozytensuspension wird auf 6 ml mit Waschpuffer aufgefüllt. Auf eine 15 minütige Inkubation folgt eine erneute Zentrifugation von 10 min bei 1.200xg. Der Überstand wird entfernt und das Pellet in 1 ml Waschpuffer resuspendiert. Eine Probe für die Zellzählung wird abgenommen.

Danach werden 60 µl PGE₁-Lösung und 5 ml Waschpuffer zu den Thrombozyten im Röhrchen gegeben. Nach einer Inkubation von 15 min folgt die Zentrifugation für 10 min bei 1.200×g. Der Überstand wird dekantiert und das Thrombozytenpellet in Tyrodepuffer resuspendiert (250.000 Thrombozyten/µl). Die fertige Thrombozytensuspension wird für 30 min im Wasserbad bei 37°C inkubiert.

Das in Citrat-Röhrchen abgenommene Blut wird umgefüllt in 13 ml-Polystyrolröhrchen und für 30 min stehen gelassen. Um für einen stabileren pH-Wert der Suspension zu sorgen wird vor dem Verschließen der Röhrchen mit Parafilm^® CO₂-angereicherte Atemluft in die Röhrchen geblasen.

Für die Herstellung von PRP wird das Blut 20 min bei 120×g (ohne Bremse) zentrifugiert. Das PRP wird vorsichtig in ein neues Röhrchen abpipettiert. Zum Zählen der Thrombozyten wird eine Probe entnommen. Für 30 min wird das PRP im Wasserbad bei 37°C inkubiert.

Durch Zentrifugation der Blutröhrchen für 15 min bei 1.500×g (ohne Bremse) wird PPP erhalten. Dieses wird in ein neues Röhrchen überführt. Mit Hilfe des PPP wird die Thrombozytenzahl des PRP auf 250.000/µl eingestellt.

Nach dem Aufheizen des Inkubatorblocks des Aggregometers auf 37°C werden in die silikonisierten Glasküvetten 500 µl Tyrodepuffer bzw. PPP eingefüllt und der 100 %-Transmissionswert bestimmt. Dann erfolgt durch 450 µl Thrombozytensuspension bzw. PRP zusammen mit einem Magnetrührer die Bestimmung des 0 %-Transmissionswertes. Die gefüllten Küvetten werden für 10 min in den Inkubatorblock gestellt und mit Parafilm^® abgedeckt.

Danach werden die Küvetten in die Messkanäle platziert und das Gerät wird geeicht. Zum Start der Aggregation werden 50 µl der Stimulanzien zur Thrombozytensuspension bzw. zum PRP hinzupipettiert. Die Lichttransmission wird 5 min lang aufgezeichnet.

Für die Stimulation der Aggregation werden Collagen und ADP in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen eingesetzt (190 µg/ml bzw. 20 µM). Als Negativkontrolle dient 0,9 % NaCl.

Mit der Chromatografie lassen sich verschiedenartige Moleküle eines Probengemisches auftrennen und analysieren. Das Probengemisch wird als mobile Phase über ein Material geleitet, das als stationäre Phase bezeichnet wird. Unterschiedliche Wechselwirkungen der Moleküle der mobilen Phase mit den Molekülen der stationären Phase bewirken entsprechend unterschiedliche Retentionszeiten, so dass die einzelnen Komponenten der Probe aufgetrennt werden. Die Retentionszeiten sowie die anschließende Detektion physikalischer oder chemischer Eigenschaften der Komponenten ermöglichen deren Identifizierung.

Bei der Flüssigkeitschromatografie ist die Probe in einem Lösemittel gelöst. Diese mobile Phase wird durch eine Säule geleitet, die die stationäre Phase enthält. Für die Elution kann ein geeignetes Lösemittel oder eine Reihe von Lösemitteln gewählt werden.

Die hohe Leistungsfähigkeit der HPLC beruht auf die Nutzung hocheffizienter Materialien für die stationäre Phase und deren geringe Teilchengröße sowie auf der Verbesserung der Geräte.

Für die Serotonin-Bestimmung in Proben der Thrombozyten-Aggregometrie wird eine C-18-Umkehrphase-Säule verwendet. C-18-Alkylgruppen sind an der Oberfläche von Kieselgelteilchen gebunden. Umkehrphase (RP, engl. reverse phase) bedeutet, dass die Polarität der stationären Phase geringer ist als die der mobilen Phase. Ein Fluoreszenzdetektor misst die Emission von Licht der Wellenlänge 345 nm bei einer Exzitation der Wellenlänge 295 nm.

Sofort nach der Aggregometrie werden die Küvetten in Eis gepackt und gegebenenfalls mit Aluminiumfolie vor Licht geschützt. Der Rührmagnet wird aus der Küvette entfernt und die Thrombozyten-Suspension in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Es erfolgt eine Zentrifugation bei 16.000 × g bei 4°C für 10 min. Der Überstand sowie die restliche, für die Aggregometrie nicht verwendete Thrombozyten-Suspension werden unter Dokumentation des Volumens jeweils in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Pro 100 µl Probe werden 4 µl 70 % Perchlorsäure zugesetzt. Die Reaktionsgefäße mit der Thrombozyten-Suspension werden 3× 20 s bei 4°C mit Ultraschall lysiert. Im Intervall werden die Proben kurz anzentrifugiert. Nach der Ultraschallbehandlung werden diese Proben bei 16.000 × g bei 4°C für 20 min zentrifugiert und anschließend für 15 s mit dem Vortex-Gerät durchmischt. In Eis gestellt setzt sich das Zellpellet ab und der Überstand kann in ein neues Reaktionsgefäß überführt und gegebenenfalls bei –80°C aufbewahrt werden. Für die Messung an der HPLC-Anlage werden 75 µl Probe in ein HPLC-Messgefäß pipettiert.

Die Proben werden auf 2-4°C gekühlt. Für den Probenfluss im System wird HPLC-Puffer (10 mM KH₂PO₄, 5 % Methanol) verwendet. 70 µl der Probe werden in die Messsäule injiziert. Die Auswertung erfolgt mit dem Programm CLASS-LC10. Das AUC des entsprechenden Peaks gilt als Maß für die Serotonin-Menge.

Soweit nicht anders erwähnt sind in Text und Grafen Mittelwerte ± SEM angegeben. Die Zahl der Stichproben n ist den Abbildungsbeschriftungen zu entnehmen. Bei genügend hoher Stichprobenanzahl und positiver Testung auf Normalverteilung wird der T-Test für ungepaarte Stichproben verwendet. Sind die Voraussetzungen für die Verwendung des T-Tests nicht gegeben, erfolgt die Ermittlung signifikanter Unterschiede mit dem nichtparametrischen Test nach Mann-Whitney. Beim Vergleich von Stichprobenwerten mit einem bestimmten Wert, z.B. mit dem Kontrollwert=1, wird der Wilcoxon-Rang-Test verwendet. Die Irrtumswahrscheinlichkeit α ist 0,05. Alle Grafen und statistischen Berechnungen sind mit dem Programm Prism^® 4 erstellt.