4 Diskussion

4.1 Funktion von Ventrikel-Kardiomyozyten neonataler Ratten

4.1.1 Nachweis und Charakterisierung von Autoantikörpern anhand der Pulsationsrate von Kardiomyozyten bei Stimulation mit Patienten-Immunglobulin

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In dieser Arbeit konnten Autoantikörper gegen die Protease-aktivierten Rezeptoren 1 und 2 (PAR1/2) und gegen den Endothelin-Rezeptor ET(A) in Seren von Patienten mit Raynaud-Syndrom oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen nachgewiesen werden. In einer Stichprobe von 32 Patienten mit Raynaud-Syndrom enthielten 87,5 % der Patientenseren Antikörper gegen die Rezeptoren PAR1/2 und/oder ET(A). Mit einem Anteil von 46,9 % enthielten die meisten der untersuchten Seren Autoantikörper gegen die Rezeptoren PAR1/2, aber auch die Kombination dieser mit Autoantikörpern gegen den Rezeptor ET(A) war mit 37,5 % relativ häufig. Die PAR1/2-spezifischen Autoantikörper wirkten auf spontan pulsierende Ratten-Kardiomyozyten dosisabhängig positiv chronotrop, ebenso wie die Agonisten Thrombin und das PAR1/2-stimulatorische Peptid SFLLRN. Die funktionellen Effekte der PAR1/2-Autoantikörper sowie der PAR-Agonisten konnten durch das Thrombin-Rezeptor-inhibitorische Peptid YFLLRN geblockt werden [122]. Die Spezifität der Autoantikörper gegen Loop II von PAR1 und PAR2 wurde durch Neutralisierung der Antikörper mit den entsprechenden Peptiden nachgewiesen. Da beide PAR-Autoantikörper-neutralisierenden Peptide einen Abschnitt gleicher Aminosäuresequenz enthalten, kann darin das Epitop der Antikörper vermutet werden. Es kann angenommen werden, dass die PAR-Autoantikörper beide Rezeptorsubtypen, PAR1 und PAR2, erkennen und aktivieren.

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Die Autoantikörper gegen den Endothelin-Rezeptor ET(A) wirkten wie Endothelin-1 dosisabhängig negativ chronotrop. Die Spezifität für den Rezeptor-Subtyp ET(A) konnte durch den antagonistischen Effekt des ET(A)-Blockers BQ610 nachgewiesen werden. Der Inhibitor des ET(B)-Rezeptors BQ788 hatte keinen Einfluss auf den negativ chronotropen Effekt des Endothelins und der ET(A)-Rezeptor-Autoantikörper [124].

Das Raynaud-Syndrom zeichnet sich durch meistens Kälte-induzierte vasospastische Anfälle in den Akren (hauptsächlich Finger) aus (siehe 1.2.1). Die Symptome der Urtikaria sind Histamin-vermittelt, setzen also eine Aktivierung des Immunsystems voraus (siehe 1.2.2). Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie die koronare Herzkrankheit oder Angina pectoris stellen Durchblutungsstörungen der koronaren Gefäße dar (siehe 1.2.3). Veränderungen der Pulmonalarterien können zum schweren Krankheitsbild der pulmonalen Hypertonie führen (siehe 1.2.4). Bei all diesen Erkrankungen spielen Wechselwirkungen zwischen aktivierten Immunzellen, Endothelzellen und glatten Gefäßmuskelzellen eine bedeutende Rolle – Zellen, die auch die Rezeptoren PAR1, PAR2 und ET(A) exprimieren. Eine Autoantikörper-induzierte Aktivierung dieser Rezeptoren könnte das Endothel aktivieren und proinflammatorische Effekte wie die Adhäsion und Penetration von Immunzellen, die Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren und die Aktivierung von Thrombozyten hervorrufen. Durch Endothelin oder Thrombin aktivierte glatte Gefäßmuskelzellen führen zur Vasokonstriktion [111, 87]. Eine pathophysiologische Rolle der funktionellen Autoantikörper gegen PAR1/2 und ET(A) bei Gefäßerkrankungen kann daher nicht ausgeschlossen werden. Untersuchungen zur Funktionalität der Autoantikörper an Zellen des Immun- und Herz-Kreislauf-Systems sind nötig, um eine mögliche Pathogenizität dieser Autoantikörper zu beurteilen.

Bei 80 % der Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie kommen Autoantikörper gegen den β1-adrenergen Rezeptor vor [21]. Erste Studien zur Immunadsorption an solchen Patienten konnten den Erfolg dieser Behandlung aufzeigen (siehe 1.1.3 [15, 16, 17]). Bei der Immunadsorption werden Immunglobuline aus dem Plasma der Patienten entfernt und durch ein therapeutisches Immunglobulin-Präparat ersetzt. Bei der Plasmapherese hingegen wird das Blutplasma des Patienten ausgetauscht. Dragun et al. beschreibt eine solche Behandlung an Patienten mit refraktärer Nierentransplantat-Abstoßung [18]. Von diesen Patienten hatten einige Spender-spezifische HLA-Antikörper und andere Patienten hatten Autoantikörper gegen den G-Protein-gekoppelten Angiotensin II-Rezeptor AT1. Diese Beispiele deuten auf eine mögliche Pathogenizität von Autoantikörpern gegen die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren β1 und AT1.

4.1.2 Einfluss von Serum auf die Aktivierung von ERK1/2 und die Expression von p67phox durch Stimulanzien

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Die Methode der Pulsationsraten-Bestimmung von Kardiomyozyten ist für das serumhaltige System etabliert [127]. Zellkulturmedien ohne Serum werden im Allgemeinen als Mangelmedien bezeichnet, denn es fehlen Nährstoffe und Wachstumsfaktoren. Serum wird aus Blut gewonnen durch Aktivierung der Blutgerinnung und Abtrennung der koagulierten Zellen und des Fibrins. In der Zellkultur wird hitzeinaktiviertes Serum verwendet, d.h. Proteine wie z.B. Komplementfaktoren und Enzyme sind inaktiviert. Solches Serum ist also eine modifizierte Form des physiologischen Blutplasmas und ähnelt außerdem in der Zusammensetzung dem extrazellulären Milieu im Gewebe. Art und Konzentration der Inhaltsstoffe des Serums wie zum Beispiel Hormone, Zytokine oder Wachstumsfaktoren können zum Teil beträchtlich variieren je nach Spezies, Geschlecht, Alter oder sonstigem Zustand des Individuums. Auch exogene Faktoren wie Medikamente oder Bestandteile aus der Nahrung tragen dazu bei, dass unterschiedliche Serum-Chargen unterschiedliche Bedingungen darstellen.

Viele In-vitro-Versuche mit Zellen in Kultur werden in serumfreiem Medium durchgeführt. Dazu wird das serumhaltige Kulturmedium einen Tag oder einige Stunden vor dem Versuch entfernt, die Zellen werden mit PBS gewaschen und erhalten dann serumfreies Medium. Dies soll verhindern, dass die oben genannten variablen Faktoren die Aussagekraft des Versuchsergebnisses beeinträchtigen. Damit wird aber auch von vornherein das Milieu der Zellen drastisch verändert.

Da auch die Pulsationsraten-Bestimmung im serumhaltigen System durchgeführt wurde, wurde diese Versuchsbedingung für die meisten Versuche in dieser Arbeit übernommen. Am Beispiel der Aktivierung von ERK1/2 und der Expression von p67phox in neonatalen Ratten-Kardiomyozyten sollte nun festgestellt werden, ob der Serumgehalt des Mediums einen Einfluss zeigt. Ohne Serum war die Aktivierung von ERK1/2 mit Endothelin-1 stärker als mit Serum. Im serumhaltigen System war die ERK1/2-Phosphorylierung mit Thrombin sogar auf dem gleichen Level wie die Kontrolle. Nur ohne Serum zeigte Thrombin hier einen leichten Effekt. Bei 24-stündiger Stimulation mit IL-1β, IL-6 oder LPS bewirkte serumhaltiges Medium eine etwas stärkere Phosphorylierung von ERK1/2 als serumfreies. Die Expression von p67phox in Medium ohne Serum war bei Stimulation mit SFLLRN niedriger als mit Serum. Alle anderen Ergebnisse erwiesen sich als unabhängig vom Serumgehalt des Kulturmediums.

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Es ist möglich, dass Thrombin durch Faktoren im Serum inaktiviert wird. Antithrombin und Thrombomodulin sind physiologische Thrombin-Inhibitoren, aber auch Protease-Inhibitoren wie α2-Makroglobulin oder Heparin-Cofaktor II können hier eine Rolle spielen [128]. Endothelin-1 ist ein Peptid und kann ebenso wie das Peptid SFLLRN durch Proteasen oder Peptidasen leicht abgebaut werden. Wenn solche Faktoren im Serum durch Erwärmung auf 57°C nicht inaktiviert wurden, könnten sie die Verfügbarkeit der Stimulanzien reduzieren. Die Protease-Wirkung des Thrombins an den Rezeptoren PAR1/2 könnte außerdem im serumhaltigen Milieu herabgesetzt sein, weil Bestandteile des Serums zusätzliche Substrate darstellen können und somit weniger Thrombin für die enzymatische Reaktion an PAR1 und PAR2 zur Verfügung steht.

Andererseits hatte das Serum keinen Einfluss auf die Aktivierung von ERK1/2 durch SFLLRN. Außerdem bewirkte dieses Peptid in PRP eine stärkere Thrombozytenaggregation als bei gewaschenen Thrombozyten. Das legt nahe, dass kein nennenswerter Abbau des Peptids durch Serumbestandteile während der Versuchsdurchführung stattfand und die Aktivität des Peptids erhalten blieb. Eine Inaktivierung von Thrombin erscheint ebenso unplausibel für die fehlende Aktivierung von ERK1/2 im serumhaltigen Medium angesichts der positiv chronotropen Wirkung auf Kardiomyozyten.

Serumkomponenten mit inhibitorischer Wirkung auf die in dieser Arbeit verwendeten Stimulanzien sind nicht auszuschließen. Aber positive funktionelle Effekte in Anwesenheit von Serum bei einigen Methoden schließen eine generelle Inaktivierung der Stimulanzien aus. Abhängig vom jeweiligen Experiment kann der Serumgehalt des Mediums die Testergebnisse beeinflussen.

4.1.3 Agonisten Endothelin-1, Thrombin und Peptid SFLLRN

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Kardiomyozyten exprimieren die Rezeptoren ET(A), PAR1 und PAR2. Die vorliegende Arbeit stützt sich auf die Erkenntnis, dass Autoantikörper gegen diese G-Protein-gekoppelten Rezeptoren die Pulsationsrate von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten verändern. Die Antikörper gegen ET(A) wirken negativ chronotrop, die gegen PAR1/2 positiv chronotrop.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Thrombin und SFLLRN die Pulsationsraten neonataler Ratten-Kardiomyozyten konzentrationsabhängig zunahmen. Der Effekt wurde durch das inhibitorische Peptid YFLLRN blockiert. Endothelin-1 induzierte dosisabhängig einen negativ chronotropen Effekt, der durch den ET(A)-Antagonisten BQ610 geblockt wurde.

Im serumfreien Medium zeigte Endothelin-1 eine deutliche Aktivierung von ERK1/2. Diese Befunde liegen in Übereinstimmung mit den Daten von Sugden und Clerk [106, 128, 106]. In Zellen, die in serumhaltigem Medium kultiviert wurden, war nur ein leichter Effekt nach 10 bis 30 min erkennbar. Thrombin aktivierte ERK1/2 ohne Serum nur geringfügig. Im serumhaltigen System erhöhte Thrombin die Phosphorylierung von ERK1/2 nicht. Demnach scheint Thrombin bei einer Aktivierung von ERK1/2 keine Rolle zu spielen. Das Peptid SFLLRN führte jedoch zu einer verstärkten Phosphorylierung von ERK1/2 nach 2 min. Da Thrombin den Rezeptor PAR1 aktiviert, das Peptid jedoch sowohl über PAR1 als auch über PAR2 seine Wirkung realisiert, könnte die Peptid-induzierte Aktivierung von ERK1/2 hier über PAR2 ausgelöst worden sein.

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Im zeitlichen Verlauf bis 24 h schien der p67phox-Level leicht erhöht durch Stimulation mit dem Peptid SFLLRN. Thrombin und Endothelin-1 veränderten bis 24 h den p67phox-Level der Kardiomyozyten nicht. Diese Ergebnisse deuten also auf keine verstärkte Aktivität der NADPH-Oxidase in Kardiomyozyten durch PAR1- oder ET(A)-Agonisten. Eine Induktion über PAR2 kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.

4.1.4 Proinflammatorische Faktoren IL-1β, IL-6 und LPS

Das proinflammatorische Zytokin IL-1β bewirkt Effekte an den meisten Zelltypen über den Rezeptor IL-1RI (IL-1-Rezeptor Typ I) [129]. Kereveur et al. konnten zeigen, dass eine IL-1β-Stimulation die Expression von TFPI (tissue factor pathway inhibitor) in Kardiomyozyten erhöht [130]. In einer Arbeit von Shindo et al. wurde die IL-1β- oder LPS-induzierte Freisetzung von NO aus Kardiomyozyten beschrieben [131].

Die Familie der IL-6-Zytokine ist multifunktionell. Sie werden u.a. von Fibroblasten, Keratinozyten, Monozyten, T- und B-Lymphozyten produziert [132]. Der IL-6-Rezeptor (IL-6R) bildet in der Zellemembran einen Komplex mit gp130, welches das Signal überträgt [133]. IL-6 bewirkt an Kardiomyozyten eine verminderte Expression von SERCA (sarco-/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) [134] und eine erhöhte Expression von ANP (atrial natriuretic peptide) und BNP (B-type natriuretic peptide) [135]. Einerseits wird IL-6 eine Rolle in der Depression der Herzkontraktiliät, der Hypertrophie und Herzdysfunktion nach Ischämie zugewiesen, andererseits wirkt IL-6 in einem Ischämie-Reperfusionsmodell mit neonatalen Ratten-Kardiomyozyten kardioprotektiv [136].

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LPS (Lipopolysaccharid) ist der Hauptbestandteil der äußeren Membran (outer membrane) Gram-negativer Bakterien. Nach Komplexbildung mit dem Akute-Phase-Protein LBP (LPS-binding protein) induziert es proinflammatorische Immunantworten myeloider Zellen durch Aktivierung des LPS-Rezeptors TLR4 (Toll-like-receptor 4) [137]. Auch Kardiomyozyten exprimieren diesen Rezeptor. Der LPS-aktivierte TLR4 bewirkt eine Reduktion der Kontraktilität von Kardiomyozyten, wahrscheinlich indirekt über Mediatoren aus stimulierten Immunzellen im Herzen [138].

In dieser Arbeit wurde die Aktivierung der MAPK ERK1/2 sowie die Expression des p67phox-Proteins in Kardiomyozyten nach Stimulation mit IL-1β, IL-6 und LPS untersucht. IL-1β führte zu einer verstärkten ERK1/2-Phosphorylierung nach 5 und 20 min. LPS zeigte einen deutlichen Effekt nach 20 min. IL-6 aktivierte ERK1/2 im getesteten Konzentrationsbereich nicht. Der p67phox-Level wurde bis 24 h durch keines der Stimulanzien verändert.

Die Phosphorylierung von ERK1/2 durch LPS liegt im Widerspruch mit den Daten von Tavener et al., die keine Aktivierung einer MAPK in diesem Zelltyp nachweisen konnten [138]. Jedoch wird i. A. beschrieben, dass LPS in anderen Zelltypen die MAPK p38, JNK und ERK1/2 aktiviert [138]. Der hier gemessene Effekt könnte auf die Anwesenheit geringer Mengen Nicht-Muskelzellen in der Kultur zurückzuführen sein. Mastzellen zum Beispiel werden ebenfalls durch LPS aktiviert und die folgende Degranulation setzt u.a. Histamin, PAF (platelet activating factor) TNFα und Oxidanzien frei. Die ERK1/2-Aktivierung könnte sekundäre Effekte solcher Mediatoren widerspiegeln.

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Eine ausführliche Darstellung der Signalkaskaden nach Aktivierung von TLR4 veröffentlichten Pålsson-McDermott und O’Neill (2004) [137]: Darin wird nur die Aktivierung der MAPK p38 und JNK aufgezeigt, nicht jedoch ERK1/2. Demnach können positive Ergebnisse zur ERK1/2-Aktivierung durch LPS in der vorliegenden Arbeit auch auf sekundäre Effekte zurückzuführen sein.

4.1.5 Einfluss von Autoantikörpern auf die Aktivierung von ERK1/2

Der Einfluss verschiedener Antikörper-Präparate auf die Aktivierung von ERK1/2 wurde überprüft. IgG-Präparate von Patienten mit Autoantikörper gegen PAR1/2 und der in Kaninchen generierte Autoantikörper gegen PAR2 zeigten den gleichen leicht aktivierenden Effekt wie das Peptid SFLLRN. Obwohl Endothelin-1 die stärkste ERK1/2-Aktivierung hervorrief, blieben die Werte mit Autoantikörpern gegen ET(A) nur wenig über denen der A. dest.-Kontrolle.

Bemerkenswert ist, dass das IgG von Kontrollpersonen stärkere Effekte zeigte als die IgG-Präparate mit Autoantikörper gegen die Rezeptoren PAR1/2 und ET(A). Das therapeutisch verwendete Endobulin hatte keinen Einfluss auf die Aktivierung dieser MAPK. Es bedarf deshalb einer Erklärung für die Wirkung des Kontroll-IgGs. In den Untersuchungen zur Pulsationsrate von Kardiomyozyten zeigten die Kontroll-IgGs keinen Effekt. Dieses wurde auf die gleiche Art präpariert wie das IgG der Patienten mit PAR1/2-Autoantikörpern. Eine Aktivierung von Zellen über Fcγ-Rezeptoren ist mit hoher Wahrscheinlichkeit auch auszuschließen, da das Endobulin keinen Einfluss auf die Phosphorylierung der MAPK ausübte.

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Eine Coinkubation mit IL-1β erhöhte in allen Fällen die Phosphorylierung von ERK1/2. Dieser Effekt blieb mit IL-6 oder LPS aus. Wie unter 4.1.4 erwähnt, erhöhte IL-1β auch allein pERK1/2, aber auf einem niedrigeren Niveau. Es kann hier also von einem additiven, costimulatorischen Effekt ausgegangen werden. Dieses Ergebnis liefert einen Hinweis dafür, dass Autoantikörper gegen PAR1/2 oder ET(A) im inflammatorischen Gewebe mit erhöhtem Vorkommen von IL-1β verstärkt wirksam werden können.

4.2 Funktion von hCASMCs

4.2.1 Agonisten Endothelin-1, Thrombin und Peptid SFLLRN

Endothelin-1 ließ nur eine leichte Aktivierung von ERK1/2 in kultivierten hCASMCs nach 20 min erkennen (1,8-faches der Kontrolle). Untersuchungen von Trevisi et al. an Rattenschwanzarterien zeigten eine ähnlich schwache Aktivierung dieser MAPK durch ET-1 [108]: In diesen Untersuchungen wurden Arteriensegmente mit 50 nM Endothelin-1 für 10 min behandelt und die Phosphorylierung von ERK1/2 war gegenüber der Negativkontrolle 1,8-fach (pERK1) bzw. 2,5-fach (pERK2) erhöht.

Weder die Protease Thrombin noch das aktivierende Peptid SFLLRN erhöhten die Phosphorylierung von ERK1/2 in hCASMCs. Jerius et al. untersuchten die Tyrosin-Phosphorylierung in frisch präparierten Abschnitten bovinen glatten Muskelzellgewebes aus Carotisarterien [87]. Sie stimulierten die Zellen mit einer Thrombin-Konzentration, die das 100-fache der hier verwendeten Konzentration beträgt. Aus einer Bande bei 46 kDa im Western-Blot schließen sie auf die Phosphorylierung einer MAPK mit einem Maximum nach 1 min Stimulation. Diese Methodik zeigt wesentliche Unterschiede zu der hier verwendeten Methodik auf und kann daher nicht zu einem Vergleich der Ergebnisse herangezogen werden.

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Ein veränderter TF- oder p67phox-Level in den hCASMCs konnte nach 24 h Stimulation mit keinem der drei Agonisten festgestellt werden. Proinflammatorische Zellfunktionen wie erhöhte TF-Expression oder verstärkte NADPH-Oxidase-Aktivität scheinen durch ET-1, Thrombin und SFLLRN an hCASMCs nicht induziert zu werden.

4.2.2 Proinflammatorische Faktoren IL-1β, IL-6 und LPS

Die Phosphorylierung von ERK1/2 sowie der Proteinlevel von TF und p67phox in hCASMCs wurden nach Stimulation mit IL-1β, IL-6 oder LPS untersucht. Auf die Phosphorylierung von ERK1/2 hatte IL-1β keinen stimulierenden Einfluss. Der TF-Proteinlevel war nach 5 min Stimulation mit diesem Zytokin leicht erhöht und nach 2 h leicht erniedrigt. Nach 24 h schien der p67phox-Level ebenfalls leicht erniedrigt. Diese Ergebnisse sind nicht signifikant und deshalb nicht gesichert. Falls höhere Stichprobenzahlen oder andere Untersuchungen diese Beobachtungen bestätigen, könnte der schnelle und kurzfristige Anstieg von TF-Protein auf eine größere Verfügbarkeit bereits vorhandenen Proteins hinweisen. Vielleicht liegt ein Teil des TF-Proteins in komplexierter/gebundener Form vor und ist im Western-Blot erst nach induzierter Freisetzung aus diesem Komplex nachweisbar. Der Abfall des Proteins nach 2 h ließe sich durch eine Freisetzung ins Medium erklären. Die Phosphorylierung und von p67phox und dessen Transport in die Zellmembran zur Bildung des aktiven NADPH-Komplexes wäre eine Erklärung für den Abfall von p67phox.

Die proinflammatorische Wirkung von IL-1β, IL-6 und LPS wurde u.a. von Calabró et al. anhand der Induktion von CRP (C-reaktives Protein) nachgewiesen [139]. Nach 48 h Stimulation von hCASMCs mit diesen Faktoren war CRP im Überstand signifikant erhöht. Humane glatte Gefäßmuskelzellen exprimieren den IL-6-Rezeptor nur geringfügig, aber durch Inkubation der Zellen mit dem IL-6/sIL-6R-Komplex konnten Klouche et al. die Expression von gp130 und auch die Sekretion von IL-6 erhöhen [140]. Kaur et al. wiesen an den gleichen Zellen eine IL-1β-induzierte Aktivierung der NADPH-Oxidase nach 24 h mit dem Cytochrom-c-Assay nach [141]. Allerdings wurden vorher die Zellen für 24 h in serumfreiem Medium kultiviert und während der 24-stündigen Inkubation mit IL-1β enthielt das Medium nur 0,1 % Serum. Das normale Kulturmedium für diese Zellen enthält 5 % Serum. Die Versuchsbedingungen entsprechen also nicht denen in der vorliegenden Arbeit.

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IL-6 erhöhte die Menge an nachweisbarem TF nach 5 min Stimulation, nach 2 h zeichnete sich hingegen eine Erniedrigung ab. Dies entspricht einem ähnlichen Ablauf wie bei der Stimulation mit IL-1β und kann auf dieselben Mechanismen beruhen. Nach 6-stündiger Inkubation von hCASMCs mit IL-6 war der pERK1/2-Level erhöht, ebenso nach 24 h. Diese Erhöhungen waren sehr gering, aber gut reproduzierbar. Eine Aktivierung der MAPK nach mehreren Stunden kann auf sekundäre Effekte zurückzuführen sein. Der p67phox-Level blieb nach 24 h unverändert. Dies spricht gegen eine Induktion des NADPH-Oxidase-Signalwegs durch IL-6.

Nach 5 min Stimulation mit LPS war der TF-Level leicht erhöht. Eine Aktivierung von ERK1/2 konnte nicht nachgewiesen werden (siehe 4.1.4/[137]). Der p67phox-Level schwankte zwischen einer leichten Erhöhung nach 5 min, einem Abfall nach 2 h und wiederum einer leichten Erhöhung nach 24 h. Während eine erhöhte Verfügbarkeit des Proteins die schnelle Erhöhung erklären könnte, könnte bei einer Aktivierung des Proteins durch Phosphorylierung und Komplexbildung den Abfall des nachweisbaren p67phox-Levels nach 2 h erklären. Nach 24 h können sich eine induzierte Transkription des Gens und Translation der mRNA für p67phox in einem erhöhten Proteinlevel äußern.

4.2.3 Einfluss von Autoantikörpern auf die Aktivierung von ERK1/2

Humane CASMCs zeigten bei Stimulation sowohl mit PAR-Autoantikörper-positivem IgG als auch mit Kontroll-IgG eine leichte Aktivierung von ERK1/2. Die zwei getesteten ET(A)-Antikörper-Präparate und das Endobulin bewirkten keine Aktivierung dieser MAPK. Die Costimulation mit IL-1β, IL-6 oder LPS hatte keinen Einfluss. Diese Ergebnisse hinsichtlich der Wirkung der Antikörper-Präparate sind vergleichbar mit den Daten, die mit Kardiomyozyten erhoben wurden (siehe 4.1.5). Die Costimulanzien bewirkten auch in den Vorversuchen an hCASMCs nach 20 min keine Aktivierung von ERK1/2 (siehe 4.2.2).

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Auffällig ist jedoch, dass der PAR1/2-Agonist SFLLRN keinen Effekt hatte und ET-1 einen pERK1/2-Anstieg bewirkte. Da SFLLRN zu keinem Zeitpunkt im zuvor getesteten Bereich von 1 min bis 24 h eine ERK1/2-Aktivierung hervorrief, kann von einer PAR1/2-unabhängigen Aktivierung dieses Signalproteins durch das IgG der Patienten ausgegangen werden. Da außerdem das Kontroll-IgG den gleichen Effekt wie das Patienten-IgG zeigte, könnte eine unspezifische Aktivierung von ERK1/2 durch das IgG oder andere Faktoren in den IgG-Präparaten vorliegen. Im Gegensatz zu den hCASMCs allerdings waren bei den Kardiomyozyten die Effekte von IgG mit PAR-Autoantikörpern und Kontroll-IgG unterschiedlich stark. Dort scheint zusätzlich zur unspezifischen Aktivierung ein PAR1/2-abhängiger Mechanismus eine Rolle zu spielen.

4.3 Thrombozytenaggregation und Serotonin-Freisetzung

4.3.1 Methodenetablierung Thrombozyten-Aggregometrie

Die Thrombozyten-Aggregometrie ist eine Methode zur Beurteilung der Funktionalität von Thrombozyten. In der klinischen Diagnostik wird hierfür PRP (platelet rich plasma) aus Citrat-antikoaguliertem Blut verwendet. In dieser Arbeit wurden die Thrombozyten für funktionelle Untersuchungen jedoch gewaschen. Individuelle Unterschiede im Plasma der Thrombozytenspender entfallen somit, ebenso jedoch die natürliche Regulation der Thrombozytenaktivität durch pro- und antikoagulatorische Plasmafaktoren. Die Reaktionsfähigkeiten von PRP und gewaschenen Thrombozyten auf die Aktivatoren Collagen und ADP wurden verglichen. Die Aggregation gewaschener Thrombozyten durch Collagen war deutlich niedriger als bei Thrombozyten in PRP. Im Gegensatz zu PRP reagierten gewaschene Thrombozyten nicht auf ADP.

Das Waschen der Thrombozyten erfolgt unter Zugabe von Apyrase und Prostaglandin E1 (PGE1). Apyrase baut aus Thrombozyten und Erythrozyten freigesetztes ADP und ATP ab - Nukleotide, die Thrombozyten aktivieren können. PGE1 ist ein potenter Thrombozyteninhibitor. Diese beiden Zusätze verhindern eine vorzeitige Aktivierung der Thrombozyten während der Zentrifugations- und Resuspendierungsschritte. Da im oben beschriebenen Vergleich von PRP und gewaschenen Thrombozyten diese nicht auf ADP reagierten, wurde die Rolle der Apyrase untersucht. Es wurde festgestellt, dass sowohl mit als auch ohne Apyrase gewaschene Thrombozyten nicht durch Zugabe von ADP aggregierten. Im Vergleich zur Kontrolle (0,9 % NaCl) war die Lichtdurchlässigkeit beider Thrombozytensuspensionen jedoch vermindert, was auf einen induzierten Formenwandel der Thrombozyten schließen lässt. Dieser thrombozytäre Wandel von der diskoiden zur sphärischen Form, auch als shape change bezeichnet, ist eine Reaktion auf nur geringe Stimulation und geht einer Aggregation voraus [142]. Mit Collagen zeigten ohne Apyrase gewaschene Thrombozyten eine geringere Aggregation als mit Apyrase, was für den protektiven Effekt der Apyrase bei der Waschprozedur spricht. Aus diesem Versuch lässt sich schließen, dass PGE1 für die fehlende Thrombozytenaggregation durch ADP verantwortlich sein konnte.

↓81

Versuche mit dem aktivierenden Peptid SFLLRN zeigten eine konzentrationsabhängige Aggregation und ähnlich wie bei Collagen (und ADP) eine verminderte Aggregation gewaschener Thrombozyten im Vergleich zu PRP-Präparaten.

4.3.2 Aggregation, Slope und Serotonin-Freisetzung

Der Slope beschreibt den Anstieg der Kurve des Aggregationsverlaufs. Dabei können verminderte Werte <0 entstehen, wenn es zu einem Formenwandel der Thrombozyten kommt und somit die gemessene Lichtdurchlässigkeit der Suspension sinkt. Die Serotonin-Freisetzung ist neben der Aggregation ein weiteres Maß für die Thrombozytenreaktion. Das in den elektronendichten Granula gespeicherte Serotonin wird von aktivierten Thrombozyten freigesetzt. Es gilt wiederum als schwacher Aktivator von Thrombozyten. Serotonin führt aber auch zur Aktivierung von Endothelzellen und glatten Gefäßmuskelzellen. Die gefäßverengende Wirkung und Effekte auf das periphere und zentrale Nervensystem von Serotonin werden mit diversen kardiovaskulären Erkrankungen in Zusammenhang gebracht [143]. Frishman et al. stellten dar, dass Ketanserin als hoch selektiver Serotonin-Rezeptor-2-Antagonist (mit zusätzlichem Antagonismus gegen α-adrenerge Rezeptoren) eine ähnlich antihypertensive Wirkung besitzt wie vergleichbare Medikamente [143]. Außerdem kann Ketanserin möglicherweise der Behandlung peripherer Gefäßerkrankungen dienen [143].

In weiteren Versuchen wurden Konzentrationsabhängigkeiten von Thrombin, dem stimulatorischen Peptid SFLLRN und dem partiell-agonistischen Peptid YFLLRN erstellt. Entsprechend den Erwartungen korrelierten die Aggregationskurven mit denen der Serotonin-Freisetzung. Der Slope, also die Aggregationsgeschwindigkeit, war bei mittleren Konzentrationen von Thrombin und dem Peptid SFLLRN sogar größer als bei höheren. Wie von Rasmussen et al. gezeigt induzierte auch in dieser Arbeit das Peptid YFLLRN nur einen Formenwandel der Thrombozyten [123, 144, 123].

4.3.3 Einfluss von Patienten-IgG auf die Thrombozytenfunktion

↓82

Durch die Vorinkubation der Thrombozyten mit IgG von Patienten oder Kontrollpersonen sollte festgestellt werden, ob Autoantikörper gegen PAR und ET(A) die Thrombozytenfunktion beeinflussen. Bei Aggregation und Serotonin-Freisetzung konnte kein genereller Unterschied zwischen Patienten-IgG und Kontroll-IgG festgestellt werden. Es fiel jedoch auf, dass die Thrombozyten durch Vorinkubation mit dem Immunglobulin des Patienten 1 nach Stimulation mit 3 µM SFLLRN eher höhere Werte für Aggregation und Serotonin-Freisetzung zeigten als durch Vorinkubation mit Kontroll-IgG, während die Werte bei IgG von Patient 5 sowohl mit 3 µM als auch mit 10 µM SFLLRN niedriger ausfielen. Die Aktivität der Thrombozyten war mit IgG von Patient 1 erhöht und von Patient 5 erniedrigt. Das IgG der anderen drei Patienten zeigte gar keine oder keine einheitlichen Effekte. Eine Wirkung von PAR- oder ET(A)-Autoantikörper auf die Thrombozytenfunktion konnte mit diesem Ergebnis nicht nachgewiesen werden.

In einem weiteren Experiment wurden Thrombozyten mit 1 µM SFLLRN vorbehandelt. Dieser Ansatz sollte klären, ob eine Vorstimulation der Thrombozyten durch SFLLRN eine Sensibilisierung gegenüber nachfolgende Stimulanzien hervorrufen kann. Nach Zugabe von IgG von Patienten und Kontrollpersonen wurden Aggregation und Slope der Aggregationskurve sowohl mit 3 µM SFLLRN als auch mit 0,9 % NaCl überprüft.

Aggregation und Slope mit 0,9 % NaCl waren bei vorstimulierten Thrombozyten unabhängig vom IgG-Präparat in 9 von 12 Fällen erhöht. Mit 3 µM SFLLRN zeigten vorstimulierte Thrombozyten in 7 der 12 Fälle eine Erniedrigung von Aggregation oder Slope. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine teilweise Aktivierung durch 1 µM SFLLRN die nachfolgende Reaktion auf Stimulanzien verminderte. Die unvollständige Aktivierung der Thrombozyten war anhand einer erhöhten Spontanaggregation erkennbar, konnte aber die Reaktionsintensität bei erneuter, stärkerer Stimulation verringern.

↓83

Wurden die Messwerte vorstimulierter Thrombozyten nach Inkubation mit Kontroll-IgG oder Patienten-IgG verglichen, so zeigten sich mit Patienten-IgG Erhöhungen von Aggregation und Slope in 2 der 3 Vergleichsgruppen. Ein fördernder Einfluss von Patienten-IgG auf die erneute Aktivierung präaktivierter Thrombozyten kann demnach nicht ausgeschlossen werden. Ohne Vorstimulation jedoch schien Patienten-IgG eher einen hemmenden Einfluss auf die Thrombozytenfunktion zu haben.

Es ist anzunehmen, dass sich die Seren von Kontrollpersonen und Patienten in Art und Konzentration vieler Faktoren unterscheiden. Zu diesen Faktoren zählen physiologische wie auch medikamentöse. Herz-Kreislauf-Patienten können zum Beispiel Medikamente einnehmen, die die Thrombozytenfunktion hemmen, den Blutdruck verändern oder den Lipidstoffwechsel positiv beeinflussen. Zwar erfolgte eine ausgiebige Dialyse gegen PBS bei der Herstellung der IgG-Präparate, aber nachhaltige Effekte auf die Thrombozytenfunktion waren nicht auszuschließen. Kenntnisse über solche medikamentöse und physiologische Faktoren in den hier verwendeten IgG-Präparaten sind nötig, um Einflüsse auf die Messergebnisse abzuschätzen.

Dass präaktivierte Thrombozyten in vitro eine erhöhte Aktivität zeigen können bewiesen Furman et al. anhand von Untersuchungen bei Patienten mit stabiler koronarer Herzkrankheit [35]. Barradas et al. legen dar, welche Rolle Thrombozytenstruktur und –funktion in der Pathogenese auch peripherer Gefäßkrankheiten spielen [145]. Das Raynaud-Syndrom kann ebenfalls zu den peripheren Gefäßkrankheiten gezählt werden und so könnten Thrombozyten-aktivierende Effekte der PAR- oder ET(A)-Autoantikörper einen Zusammenhang zu diesem Syndrom herstellen. Allgemein kommt es bei endothelialer Dysfunktion zu einer erhöhten Thrombozyten-Gefäßwand-Interaktion, wobei Serotonin und Thromboxan aus Thrombozyten u.a. Gefäßmuskelzellen aktivieren und damit eine Vasokonstriktion bewirken [146].

4.4 Funktion von Monozyten

4.4.1 Methodenetablierung zur Messung des Superoxidanions

↓84

Monozyten wurden aus humanem Blut mit dem Monocyte Negative Isolation Kit (Dynal® Biotech ASA) isoliert (siehe 2.2.6). Dabei binden Zellmarker-spezifische Antikörper an T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Erythrozyten und Granulozyten, nicht aber an Monozyten (Produktbeschreibung). Andere kommerziell erhältliche Monozyten-Isolierungskits funktionieren mit Monozytenmarker-spezifischen Antikörpern, über welche diese Zellen aus der Zellsuspension separiert werden. Monozytenmarker sind oft Rezeptoren für Liganden, die wichtige Zellfunktionen steuern, zum Beispiel CD14, CD11b oder CD16. Der Vorteil der hier verwendeten negativen Selektionsmethode liegt darin, dass die Monozyten frei sind von spezifisch gebundenen Antikörpern. Dadurch wird die Monozytenfunktion nicht durch bereits gebundene Antikörper beeinflusst.

72,3 % der Zellen in der Monozytenpräparation nach dem oben beschriebenen Verfahren waren HLA-DR- und CD14-positiv, also positiv für charakteristische Monozytenmarker. Die restlichen Zellen repräsentierten hauptsächlich Thrombozyten, Erythrozyten und tote Zellen.

In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Messung der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies von Monozyten in einer 96-Well-Mikrotiterplatte etabliert. Zunächst wurden die Lumineszenzfarbstoffe Lucigenin und MCLA, ein Luciferinderivat, verglichen. Lucigenin produziert selbst das Superoxidanion [147, 148, 149]. Bei einer Lucigenin-Konzentration von 5 µM ist dieser Umstand vernachlässigbar für eine korrekte Messung des von den Zellen produzierten Superoxidanions [150]. Es stellte sich heraus, dass Lucigenin bei Konzentrationen von 5 µM und 25 µM keine Messung der Radikale erlaubte. Im Gegensatz hierzu produzierte MCLA einen signifikanten Anstieg der Lumineszenz durch das Superoxidanion. Die Messung von Lumineszenz in einem Mikrotiterplatten-Reader ist weniger sensitiv als in einem Küvettenmessgerät. Für die Mikrotiterplatte reicht die Lumineszenzintensität von den getesteten Lucigenin-Konzentrationen deshalb nicht aus. Ein Vorteil der 96-Well-Platte gegenüber der Messung in Küvetten ist das benötigte geringe Probenvolumen. So lassen sich sowohl Zellen als auch Reagenzien einsparen.

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Des Weiteren wurden MCLA-Konzentration und Monozytenzahl optimiert. Entscheidend waren hierbei eine möglichst hohe Sensitivität bei geringem Verbrauch von Zellen sowie die Einhaltung eines optimalen Zeitfensters für den Prozess der Messung. Der Signal-Peak sollte nicht zu früh erscheinen um eine bequeme Handhabung von der Plattenbestückung bis zum Start der Messung zu ermöglichen. Die Zeitspanne bis zum Abfall des Signals auf das Nullniveau sollte nicht zu lang sein, um die benötigte Messzeit zu verkürzen. In dieser Arbeit wurden deshalb 300.000 Monozyten pro Well und eine MCLA-Konzentration von 5 µM als optimale Bedingungen ermittelt.

4.4.2 Vorinkubation mit Antikörper-Präparaten zur Superoxidanion-Messung

Nach einstündiger Vorinkubation der Monozyten mit einem IgG-Präparat wurde eine stärkere Bildung der Sauerstoff-Radikale ermittelt als ohne diese zeitliche Verzögerung. Dieser Effekt war PMA-Konzentration-unabhängig. Auch ohne PMA-Stimulation wurden nach 1 h Vorinkubation mehr Superoxidradikale gemessen als ohne Vorinkubation. Abgesehen von rein physiko-chemischen Prozessen von Mediumbestandteilen können die Monozyten selbst für die vermehrte Produktion der Radikale verantwortlich sein. Dies würde auf eine PMA-unabhängige Aktivierung der monozytären NADPH-Oxidase deuten oder auf Stoffwechselvorgänge, die während der Vorinkubation oxidativen Stress hervorrufen.

Dennoch sprechen einige Gründe für eine Vorinkubation mit den IgG-Präparaten zur Beurteilung des Einflusses von Autoantikörpern auf die Monozytenfunktion:

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4.4.3 Einfluss von Autoantikörpern auf die Produktion von Sauerstoff-Radikalen

Vor der Initiation der Produktion von Sauerstoff-Radikalen mit 8 nM, 80 nM oder 800 nM PMA wurden die Monozyten eine Stunde lang mit verschiedenen IgG-Präparaten vorinkubiert. Die Messung von Superoxidanion zeigte keinen Unterschied zwischen der Vorinkubation mit Patienten-IgG oder Kontroll-IgG.

Dörffel et al. konnten eine Präaktivierung von Monozyten von Bluthochdruck-Patienten anhand einer verstärkten Sekretion proinflammatorischer Zytokine nachweisen [151]. Außerdem stellten sie eine erhöhte PMA (800 nM)-induzierte Freisetzung reaktiver Sauerstoff-Spezies aus solchen Monozyten fest [152]. Eine Präaktivierung von Monozyten durch PAR- oder ET(A)-Autoantikörper konnte in dieser Arbeit anhand der PMA-stimulierten Superoxidanion-Bildung nicht festgestellt werden.

4.4.4 Aktivierung von ERK1/2 und Regulation von Tissue-Factor-Protein durch Endothelin-1 und Thrombin

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Monozyten exprimieren die Thrombin-Rezeptoren PAR1 und PAR3 sowie die Endothelin-Rezeptoren ET(A) und ET(B) [153, 154]. Eine Phosphorylierung der MAPK ERK1/2 innerhalb weniger Minuten weist auf eine direkte Aktivierung dieses Signalweges hin, wohingegen ein Anstieg der Phosphorylierung nach Stunden für sekundäre Effekte der Aktivierung spricht. Die Veränderung des intrazellulären TF-Proteinlevels stellt keinen akuten Effekt dar, denn für eine TF-Erhöhung müssen zunächst die Transkription des TF-Gens und die Translation der mRNA erhöht werden.

Eine Stimulation von Monozyten mit Thrombin oder Endothelin-1 für 2 h bewirkte keine reproduzierbaren Quantifizierungen von TF und pERK1/2 im Western Blot. Die Funktion der frisch isolierten Monozyten von drei unterschiedlichen Blutspendern scheint zu variabel, um eine Aussage zur Aktivierung von TF und pERK1/2 treffen zu können.

In der Literatur lassen sich Hinweise zur proinflammatorischen Wirkung von ET-1 an Monozyten finden. Diese sind über den ET(A)-Rezeptor vermittelt [154]. Über den ET(B)-Rezeptor werden antiinflammatorische Effekte realisiert [153]. Browatzki et al. beschrieben die ET(A)-abhängige Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB und die Expression des proinflammatorischen Moleküls CD40 [154]. Nach King et al. wird über ET(B) die monozytäre Produktion von NO stimuliert und die Adhäsion an die Gefäßwand vermindert [153].

4.4.5 Aktivierung von ERK1/2 und Regulation von Tissue-Factor-Protein durch Autoantikörper

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Um die Aussagekraft der Ergebnisse bei Stimulation mit IgG-Präparaten zu beurteilen, wurde in vier unabhängigen Versuchen dasselbe IgG-Präparat eingesetzt und in Hinblick auf TF-Expression und ERK1/2-Phosphorylierung beurteilt. Dabei wurden jeweils Monozyten eines anderen Spenders benutzt. Die Schwierigkeit, reproduzierbare Testergebnisse mit unterschiedlichen, frisch isolierten Monozyten-Präparaten zu erzielen, wurde auch hier deutlich. Demnach können in dieser Arbeit nur eingeschränkt Aussagen zum Einfluss der Autoantikörper auf die Monozytenfunktion getroffen werden.

Bei der Bestimmung des TF-Proteins erbrachte die Vorinkubation mit Kontroll-IgG durchschnittlich höhere Messwerte als mit Patienten-IgG. Die relative Quantifizierung von pERK1/2 zeigte starke Aktivierungen dieser MAPK bei zwei (PAR-Autoantikörper bzw. PAR- und ET(A)-Autoantikörper) von fünf Patienten-IgGs. Ein Unterschied zwischen der Anwesenheit von PAR-Autoantikörpern allein und der Kombination PAR- und ET(A)-Autoantikörper wurde nicht festgestellt. Diese Daten zeigen eine unspezifische, von den PAR- und ET(A)-Rezeptoren unabhängige Stimulierung durch Immunglobulin.

Um die Wirkung der Autoantikörper auf Monozyten wie auch auf Thrombozyten zu untersuchen sollten interindividuelle Unterschiede aufgrund verschiedener Zellpräparate möglichst vermieden werden. Für solche Untersuchungen ist es nötig, größere Mengen an Thrombozyten oder Monozyten der Spender zu erhalten.

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Bei der Affinitätschromatografie mit biotinylierten Peptiden werden die Autoantikörper zunächst an die stationäre Phase gebunden. Der Durchfluss sollte dann frei von aktivierenden Autoantikörpern sein. Durch die Elution wird der aufgereinigte Autoantikörper aufgefangen. Dies konnte in den Untersuchungen der Pulsationsrate von Kardiomyozyten bestätigt werden. Dabei zeigten die Durchfluss-Präparate im Gegensatz zu den Autoantikörper-angereicherten Eluaten keine funktionellen Effekte.

Zwei affinitätschromatografisch aufgereinigte PAR-Autoantikörper ließen nach 2 h keine Aktivierung von ERK1/2 erkennen, gleichzeitig jedoch induzierte eines der beiden Präparate eine 3-fach erhöhte Expression des TF-Proteins. Das Durchfluss-Präparat mit ET(A)-Autoantikörpern erhöhte sowohl TF als auch pERK1/2. Das Durchfluss-Präparat ohne Autoantikörper zeigte einen ähnlichen Effekt, allerdings eine nicht ganz so starke Aktivierung der MAPK. Weil dieser Versuch mit einem Monozyten-Präparat durchgeführt wurde, sind die Ergebnisse untereinander vergleichbar.

Es wurde gezeigt, dass auch der Durchfluss aus der Affinitätschromatografie entgegen der Vermutung Monozytenfunktionen aktivierte. Diese Ergebnisse bestätigen die oben formulierte Annahme, dass unspezifische Reaktionen der Immunglobuline sowohl die Phosphorylierung von ERK1/2 als auch die Expression des TF beeinflussen können.


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16.01.2009