Bezeichnung

Firma

Adenosin-5-diphosphat

OEM Produkt H. Diagnostics, U.K.

Albumin bovin Fraktion V

Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland

Ammoniumpersulfat

Serva Feinbiochemica Heidelberg, Deutschland

Aprotinin aus Rinderlunge

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA

Aqua ad iniectabilia

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Bromphenolblau

Feinchemie K.-H. Kallies KG, Sebnitz, Deutschland

BQ610

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

BQ788

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Calcein-AM

Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA

Calciumchlorid Dihydrat

J.T. Baker B.V., Deventer, Niederlande

Collagen

Bio/Data Corporation, Horsham, PA, USA

Developer for medical x-ray film processing

Agfa-Gevaert N.V., Mortsel, Belgien

di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Dithiothreitol

Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland

DMSO

Serva Feinbiochemica Heidelberg, Deutschland

EDTA

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

EGTA

Schuchardt München, München, Deutschland

Endobulin

Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Deutschland

Endothelin 1 human

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Ethanol

Berkel AHK Alkoholhandel GmbH & Co. KG, Berlin, Deutschland

Ficoll-Paque^TM Plus

GE Healthcare UK Limited, Little Calfont, England

Gentamycin

Biochrom AG, Berlin, Deutschland

Glucose, D-(+)~

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA

Glycerol

ICN Biomedicals, Inc., Aurora, Ohio, USA

Glycin

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Heparin-Natrium-25 000-ratiopharm^®

Ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland

HEPES

Serva Feinbiochemica Heidelberg, Deutschland

Interleukin-1β, human, rekombinant

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Interleukin-6, human, rekombinant

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Isotone Kochsalz-Lösung 0,9%

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Kaliumchlorid

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA

Kaliumdihydrogenphosphat

Serva Feinbiochemica Heidelberg, Deutschland

Kaliumthiocyanat

Merck KgaA Darmstadt, Deutschland

Leupeptin

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Lipopolysaccharid von Escherichia coli O55:B5

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Magermilchpulver

TSI GmbH & Co. KG, Zeven, Deutschland

Magnesiumchlorid Hexahydrat

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

MCLA

Molecular Probes, Eugene, OR, USA

Methanol

Merck KgaA Darmstadt, Deutschland

Natrium-beta-glycerophosphat

Merck KgaA Darmstadt, Deutschland

Natriumbicarbonat

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA

Natriumchlorid

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Natriumcitrat Dihydrat

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Natriumfluorid

Nünchritz, DDR

Natriumhydrogenphosphat Dihydrat

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Natriumhydroxid

Chemapol, Prag, Tschechische Republik

Natriumorthovanadat

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA

Natriumpyrophosphat

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Penicillin „Grünenthal“ 1 Mega

Grünenthal GmbH, Aachen, Deutschland

Perchlorsäure

Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz

Phenolrot

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

PMA

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

PMSF

Serva Feinbiochemica Heidelberg, Deutschland

Ponceau S-Lösung

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Precision Plus Protein^TM All Blue Standards

Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA

Rapid Fixer

Agfa-Gevaert N.V., Mortsel, Belgien

Rotiphorese^® Gel 30 (37,5:1)

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

RPMI-1640 Medium

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA

SDS

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Strepto-Hefa

Sanavita AG & Co., Werne, Deutschland

TEMED

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Thrombin, aus humanem Plasma

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Tris

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Triton X-100

Serva Feinbiochemica Heidelberg, Deutschland

Trypsin NB

Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland

Tumor Nekrosis Faktor-α, human, rekombinant

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

Tween^®-20

Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland

Ziegenserum

Serotec Ltd., Oxford, UK

Zitronensäure

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Antikörper

Bezeichnung

Firma

Maus-anti-human-CD14, FITC-konjugiert

BD Biosciences, San Jose, CA, USA

Maus-anti-human-HLA-DR, PE-konjugiert

BD Biosciences, San Jose, CA, USA

Maus-anti-p67^phox, Klon 29

BD Biosciences, San Jose, CA, USA

Maus-anti-Tissue-Factor, monokl., VIC7

zur Verfügung gestellt von Dr. T. Luther, Institut für Pathologie, Dresden, Deutschland

Maus-IgG_2a-Isotypkontrolle, FITC-konjugiert

BD Biosciences, San Jose, CA, USA

Maus-IgG_2a-Isotypkontrolle, PE-konjugiert

BD Biosciences, San Jose, CA, USA

Phospho-p44/42 MAPK E10 Monoklonaler Antikörper

Cell Signalling Technology, Inc., Danvers, MA, USA

Ziege-anti-Maus-IgG (H+L), Peroxidase-konjugiert

Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA

Peptide

Peptid

Firma

SFLLRN

Biosyntan, Berlin, Deutschland

YFLLRN

LNITTCHDVL (PAR1/2, extrazellulärer Loop II, human), biotinyliert

MLNATSKFMEFY (ET(A)-Rezeptor, extrazellulärer Loop II, human), biotinyliert

Kits

Bezeichnung

Firma

D_c Protein Assay Kit

Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA

ECL^TM Western Blotting Analysis System

GE Healthcare UK Limited, Little Calfont, England

Monocyte Negative Isolation Kit

Dynal^® Biotech ASA, Oslo, Norwegen

SmGM-2 BulletKit

Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MD, USA

Utensilien

Bezeichnung

Firma

Dialysierschlauch Visking, MWCO 14.000

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Dynal MPC^®-1 Magnetpartikelkonzentrator

Dynal^® Biotech ASA, Oslo, Norwegen

Dynal MPC^®-S Magnetpartikelkonzentrator

Dynal^® Biotech ASA, Oslo, Norwegen

Hybond^TM-ECL^TM Nitrocellulose membrane

GE Healthcare UK Limited, Little Calfont, England

Leucosep^®

Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland

Neubauer improved Zählkammer

Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Deutschland

Parafilm „M“^®

American National Can_TM, Greenwich, CT, USA

Safe-Lock Tubes 0,5 ml, 1,5 ml und 2,0 ml

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Test Tubes 8.75×50 mm

Bio/Data Corporation, Horsham, PA, USA

x-ray Retina Medizinischer Röntgenfilm XBA

Fotochemische Werke GmbH, Berlin, Deutschland

Zellkultur Testplatte 96F

TPP AG, Trasadingen, Schweiz

Zellkulturflaschen 12,5 cm²

Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA

Zellkulturflaschen 25 cm²

TPP AG, Trasadingen, Schweiz

Zellschaber 24 cm

TPP AG, Trasadingen, Schweiz

Geräte

Bezeichnung

Firma

Aggregometer PAP-4

Bio/Data Corporation, Horsham, PA, USA

Biofuge fresco

Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Deutschland

FACS Calibur

Becton Dickinson Heidelberg, Deutschland

Fluoroskan Ascent FL

Labsystems Oy, Helsinki, Finnland

HPLC: DGU-3A Degasser, SIL-10A Auto Injector, FCV-10AL, CTO-10AC Column Oven, RF-10A_XL Fluorescence Detector, CBM-10A Communications Bus Module, LC-10AD Liquid Chromatograph

Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan

HPLC-Säule 218TP104

Grace/Vydac^®, Hesperia, CA, USA

Laborzentrifuge 4K10

Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode, Deutschland

Mikroplatten-Absorptionsfotometer anthos htII

Anthos Mikrosysteme GmbH, Krefeld, Deutschland

Mikroskop IMT-2

Olympus Corporation, Tokyo, Japan

Mini PROTEAN II Cell

Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland

Mini Trans-Blot^® Electrophoretic Transfer Cell

Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland

pH Meter 523

WTW, Weilheim, Deutschland

pH-Elektrode SenTix 21

WTW, Weilheim, Deutschland

Power Pac 200, 300 und 1000

Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland

Rollinkubator Roller SRT1

Stuart Scientific Co. Ltd., Redhill, UK

Scanner 420oe

PDI, Inc., New York, NY, USA

Taumelschüttler Polymax 2040

Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland

Thermomixer comfort

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Vortex Genie 2^TM

Bender & Hobein AG, Zürich, Schweiz

„Mini-Spin“ Tischzentrifuge

Appligene Oncor, Illkirch, Frankreich

Software

Bezeichnung

Firma

Ascent Software Version 2.6 (für Fluoroskan)

Thermo Labsystems Oy, Helsinki, Finnland

CLASS-LC 10 (für HPLC), Version 1.64A, 3.81 CBM-10A

Shimadzu Chemical Laboratory Analysis System & Software, Kyoto, Japan

Imagoquant Fourieranalyse 100

Mediquant GmbH, Lützen, Deutschland

Prism^® 4 for Windows, Version 4.00

GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA

Quantity One^® Version 3.0 (für Scanner)

PDI, Inc., New York, NY, USA

Zellen

Bezeichnung

Firma

hCASMC

Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MD, USA

Nummer

Autoantikörper gegen …

Art der Präparation

Diagnose

Geschlecht

Patient 1

PAR, ET(A)

Ammoniumsulfatfällung

KHK, Bypass

♂

Patient 2

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Angina pectoris, Raynaud-Syndrom

♂

Patient 3

PAR, ET(A)

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♀

Patient 4

PAR, ET(A)

Ammoniumsulfatfällung

Angina pectoris

♂

Patient 5

PAR, ET(A)

Ammoniumsulfatfällung

Angina pectoris, Raynaud-Syndrom

♂

Patient 6

Patient 6a

PAR, ET(A), β₂

ET(A)

Ammoniumsulfatfällung

Affinitätschromatografie

Raynaud-Syndrom

♀

Patient 10

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Angina pectoris, Bypass

♂

Patient 11

PAR, ET(A)

Ammoniumsulfatfällung

Angina pectoris, Bypass

♀

Patient 12

PAR, ET(A)

Ammoniumsulfatfällung

KHK, Bypass

♀

Patient 13

PAR

Ammoniumsulfatfällung

KHK, Bypass

♂

Patient 14

PAR, ET(A), β₂

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♂

Patient 15

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Urtikaria

♀

Patient 16

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♀

Patient 17

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♀

Patient 18

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♀

Patient 19

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♀

Patient 20

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♀

Patient 21a

ET(A)

Affinitätschromatografie

PHT

♀

Patient 22a

ET(A)

Affinitätschromatografie

PHT

♂

Patient 23a

ET(A)

Affinitätschromatografie

Prostataadenom

♂

Patient 24

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♀

Patient 25

PAR

Ammoniumsulfatfällung

Raynaud-Syndrom

♂

Tab. 4: Antikörper-Präparate von Patienten. Über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten (siehe 2.2.9) ist die Aktivität vorhandener Autoantikörper ermittelt. Zur Präparation durch Ammoniumsulfatfällung siehe 2.2.1, Affinitätschromatografie siehe 2.2.2. (KHK: koronare Herzkrankheit, PHT: Pulmonale Hypertonie)

Nummer

Art der Präparation

Geschlecht

Kontrolle 1

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 2

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 3

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 4

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 5

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 6

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 7

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 8

Ammoniumsulfatfällung

♂

Kontrolle 9

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 10

Ammoniumsulfatfällung

♀

Kontrolle 11

Ammoniumsulfatfällung

♂

Tab. 5: Antikörper-Präparate von Kontrollpersonen. Tests auf verschiedene Antikörperspezifitäten über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten (siehe 2.2.9) sind negativ. Zur Präparation durch Ammoniumsulfatfällung siehe 2.2.

Die Immunglobuline wurden aus den Seren wie folgt präpariert: In einem 2 ml-Reaktionsgefäß werden zu 1 ml Serum tropfenweise 660 µl einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (Endkonzentration 40 %) unter Rühren zugegeben. Nach einer Inkubation bei 4°C für 18 h folgt eine Zentrifugation bei 6.000 × g bei 4°C für 15 min. Der Überstand wird entfernt. Das Pellet wird in 750 µl PBS-Dialysepuffer aufgenommen und mit Hilfe des Vortex-Gerätes vermischt. Anschließend wird tropfenweise 750 µl einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (Endkonzentration 50 %) zugegeben und mit dem Vortex-Gerät vermischt. Nach erneuter Zentrifugation (6.000 × g bei 4°C für 15 min) wird dieser Resuspendierungsschritt noch einmal wiederholt. Anschließend wird das Pellet in 700 µl PBS-Dialysepuffer gelöst und gegen einen PBS-Dialysepuffer drei Tage lang dialysiert. Das Volumenverhältnis von Probe zu Puffer ist 1:100. Die Dialyse erfolgt bei 4°C und der Puffer wird täglich zweimal gewechselt. Die erhaltene IgG-Fraktion wird bei –20°C gelagert.

Affinitätschromatografische Reinigung von IgG-Präparaten

Biotinylierte Peptide, deren Aminosäuresequenzen dem Epitop des zu reinigenden Antikörpers entsprechen (Tab. 6), werden in PBS gelöst (100 µg/ml). 1 ml IgG-Präparat wird mit 100 µl Peptidlösung gemischt und für eine Stunde bei 4°C inkubiert. In einem 2 ml-Reaktionsgefäß werden 150 µl Streptavidin-konjugierte Magnetobeads mit 1 ml PBS versetzt und gut vermischt. Mit Hilfe einer speziellen Halterung für die Reaktionsgefäße mit verschiebbarer Magnetrückwand (Dynal MPC^®-S) werden die Beads fixiert und der Überstand wird abpipettiert. Dieser Waschvorgang wird 2-mal wiederholt. Zu den Beads wird nun das mit dem Peptid vorinkubierte IgG-Präparat gegeben, die Suspension wird gut vermischt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Streptavidin-konjugierten Magnetobeads binden an das biotinylierte Peptid. Mit der Magnetrückwand werden die Beads mit den daran gekoppelten Antikörpern fixiert. Der Überstand wird abgenommen. Die Beads werden 6-mal mit PBS gewaschen. Die Elution der Antikörper erfolgt mit 400 µl einer 3 M KSCN-Lösung unter mehrmaligem Schwenken für 5 min. Dann werden 400 µl 6 M KSCN zugefügt und ebenfalls für 5 min inkubiert. Nach Zugabe von 400 µl PBS erfolgt eine weitere Inkubation für 5 min. Dieses Gemisch wird in BSA-blockierte (1 mg BSA/3 ml PBS) Dialyse-Gefäße gefüllt und für 2-3 Tage bei 4°C ohne Rühren dialysiert. Dabei wird der PBS-Dialysepuffer täglich 2-mal gewechselt. Zur Konzentrationsbestimmung wird die Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen.

affinitätschromatografische Reinigung von

Peptidsequenz

PAR-Autoantikörper

LNITTCHDVL (aus Loop II von PAR1 und PAR2)

ET(A)-Autoantikörper

MLNATSKFMEFY [aus Loop II von ET(A)]

Tab. 6: Peptidsequenzen für die affinitätschromatografische Reinigung von Autoantikörpern

Kultur von Ventrikel-Kardiomyozyten neonataler Ratten

Neugeborene Ratten (1-3 Tage alt) werden in Gruppen von 5 bis 10 Tieren dekapitiert. Alle weiteren Schritte erfolgen unter sterilen Bedingungen. Mit Zellstoff und 70 % Ethanol wird der Brustkorb desinfiziert und anschließend mit einer Schere geöffnet. Das Herz wird mit zwei Skalpellen entnommen und in eine Petrischale mit PBS und Antibiotikum überführt. Nach der Entfernung der Atrien werden die Ventrikel mit dem Skalpell in 4-6 Stücke zerkleinert. Die Lösung mit den Ventrikelstücken wird in einen Erlenmeyerkolben pipettiert. Nach Absetzen der Stücke wird die PBS-Antibiotikum-Lösung abpipettiert und durch 10 ml frische Lösung ersetzt. Nach Schwenken und Absetzenlassen der Ventrikelstücken wird der Überstand wiederum entfernt. Nun erfolgt dieser Waschvorgang mit 10 ml PBS ohne Antibiotikum.

Zu Beginn der Trypsinierung werden die Ventrikelstücken in 15 ml 0,2 % Trypsinlösung im 37°C-Wasserbad für ca. 3 min unter Rühren inkubiert. Der Überstand wird abgesaugt und verworfen. Danach erfolgt die Isolierung der Kardiomyozyten. Für die erste Hauptfraktion werden die Ventrikelstücken in 30 ml Trypsinlösung im Wasserbad für 20 min inkubiert. Die Trypsinierung wird mit 10 ml eisgekühltem NKS abgestoppt. Die Zellsuspension wird in ein 50 ml-Röhrchen überführt und bei 130×g für 6 min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 10 ml SM20-I/50 % NKS aufgenommen. Dieser Vorgang wird für die zweite und gegebenenfalls für die dritte Hauptfraktion wiederholt. Die Fraktionen werden in einem 50 ml-Röhrchen vereint und erneut zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wird das Zellpellet in 20 ml SM20-I-Medium aufgenommen. Nach Vermischen von 100 µl Zellsuspension mit 100 µl Trypanblaulösung werden Zellzahl und –vitalität mit einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt. Pro Herz werden 1-2 Millionen Kardiomyozyten gewonnen. Zur Zellsuspension werden NKS (10 %), Glutamin (2 mM), FUDR (2 µM) und SM20-I zugesetzt, so dass 2 Millionen Zellen in 3 ml Medium vorliegen. In 12,5 cm²-Kulturflaschen werden 3 ml Zellsuspension eingesät und die Flaschen werden mit einem Gummistopfen verschlossen. In einem 37°C-Brutschrank werden die Zellen kultiviert. Das Medium wird am Tag nach der Isolierung und dann jeden dritten Tag gewechselt.

Kultur von glatten Muskelzellen humaner Coronararterien (hCASMC)

Zur Lagerung werden 500.000 Zellen pro Milliliter in SmGM-2-Medium mit 10 % FCS und 10 % DMSO aufgenommen und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Für die Kultur werden pro 25 cm²-Kulturflasche 90.000 Zellen in 5 ml SmGM-2-Medium (5 % FCS) eingesät. Die Zellen werden im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO₂ kultiviert. Der erste Mediumwechsel erfolgt am nächsten Tag, weitere Wechsel alle zwei bis drei Tage. Bei 70-90 % Konfluenz werden die Zellen unter Verwendung von TV-Lösung passagiert oder in Passagen 7 bis 10 für eine Stimulation verwendet.

Blutentnahme

Für die Versuche mit Thrombozyten und Monozyten wird Blut gesunder Spender aus den Blutspendezentren der Charité und von HAEMA (Marzahn) in Berlin verwendet. Mit mündlicher Einwilligung der diensthabenden Ärzte und schriftlicher Einwilligung der Spender wird zu Beginn der Spende im Zuge der Abfüllung von Röhrchen für die routinemäßigen Laboruntersuchungen zusätzliches Blut entnommen. Dieses wird gut verpackt umgehend zum Labor transportiert und sofort entsprechend den Versuchen aufbereitet.

Monozytenisolierung aus humanem Vollblut

Es wird unter sterilen Bedingungen gearbeitet.

Für die Blutentnahme von einem Plasmaspender werden zwei 60 ml-Spritzen mit je 20 ml Heparin (10.000 IE) in physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Die Spritzen werden mit Blut auf 50 ml aufgefüllt, geschwenkt und in Styropor verpackt zum Labor transportiert.

In vier Leucosep-Röhrchen werden je 15 ml Ficoll-Paque^TM Plus gegeben. Die Röhrchen werden 1 min bei 800×g zentrifugiert. Nun wird das Blut auf die Röhrchen verteilt und 10 min bei 1.000×g ohne Bremse zentrifugiert. Das Plasma wird mit einer Pipette abgesaugt. Die Buffy Coats (Lymphozyten und PBMCs) aus zwei Leucosep-Röhrchen werden in ein 50 ml-Röhrchen abgegossen.

Ab jetzt wird mit eisgekühltem PBS-HSA 0,1 % gearbeitet und Zentrifugations- und Inkubationsschritte erfolgen bei 4°C.

Mit PBS-HSA 0,1 % werden die zwei Röhrchen mit Buffy Coat auf jeweils 40 ml aufgefüllt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 250×g wird der Überstand abpipettiert. Das Zellpellet wird in 1 ml PBS-HSA 0,1 % resuspendiert und auf 30 ml aufgefüllt. Die Zellzahl wird bestimmt und die Zellsuspension erneut für 10 min bei 250×g zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert und das Zellpellet in 200 µl PBS-HSA 0,1 % pro 1×10⁷ Zellen aufgenommen. Es folgt eine Inkubation mit 20 µl Blocking- und 20 µl Antikörper-Lösung (monoklonale Mausantikörper spezifisch für T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Erythrozyten und Granulozyten) pro 1×10⁷ Zellen für 10 min auf dem Rollinkubator.

Während dieser Zeit werden 100 µl Magnetobeads (besetzt mit Anti-Maus-Antikörpern) pro 1×10⁷ Zellen in einem Glasröhrchen gewaschen. Dazu wird dieses für 1 min in den Magnetpartikelkonzentrator gestellt. Der Überstand wird abpipettiert und die Beads werden in 2 ml PBS-HSA 0,1 % aufgenommen. Mit dem Magnetpartikelkonzentrator werden die Beads erneut von der Flüssigkeit getrennt. Danach werden die Beads im Ausgangsvolumen PBS-HSA 0,1 % aufgenommen und auf Eis gelagert.

Nach der Inkubation mit den Antikörpern werden die Zellen gewaschen. Dazu wird zu der Zellsuspension pro 1-5×10⁷ Zellen 1 ml PBS-HSA 0,1 % hinzugegeben. Es folgt eine Zentrifugation für 10 min bei 250×g. Der Überstand wird abpipettiert und die Zellen werden in 0,9 ml PBS-HSA 0,1 % pro 1×10⁷ Zellen resuspendiert.

Danach erfolgen die Zugabe der Magnetobeads und eine Inkubation für 15 min auf dem Rollinkubator. Danach wird pro 1×10⁷ Zellen 1 ml PBS-HSA 0,1 % hinzupipettiert. Die Suspension wird auf Glasröhrchen verteilt und diese werden jeweils für 2 min in den Magnetpartikelkonzentrator gestellt. Dabei werden die an die Magnetobeads gebundenen Zellen abgetrennt. Die Monozyten-Suspension wird dann in ein 50 ml-Röhrchen überführt. Die Zellzahl und Vitalität werden bestimmt.

Nach einer Zentrifugation für 10 min bei 250×g und Entfernen des Überstandes werden die Monozyten in auf 37°C erwärmtem RPMI-Medium aufgenommen (1×10⁶ Monozyten/ml). Die Zellsuspension wird auf 25 cm²-KF verteilt und bis zur Stimulation 30 min im Brutschrank (37°C, 5 % CO₂) inkubiert.

Bestimmung von Zellzahl und –vitalität

Zum Zählen von Thrombozyten wird die Suspension zunächst 1:100 mit 0,9 % NaCl-Lösung in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß verdünnt. Die Zählung der Zellen erfolgt mit einer Neubauer-Zählkammer. Am Mikroskop werden fünf diagonale Kleinquadrate zu je 16 Kleinstquadraten ausgezählt. Die Summe multipliziert mit 5.000 ergibt die Thrombozytenzahl in der Suspension pro Mikroliter.

Bei allen anderen Zelltypen werden in einem 500 µl-Reaktionsgefäß 10 µl Zellsuspension mit 10 µl Trypanblaulösung gemischt. Die Zählung erfolgt ebenfalls mit einer Neubauer-Zählkammer. Nach Auszählung der lebenden und blau angefärbten toten Zellen in den vier Eckquadraten zu je 16 Kleinquadraten können Zellzahl und –vitalität berechnet werden. Die Summe wird dazu verdoppelt und mit dem Faktor 0,4 multipliziert. Das Ergebnis ist die Zellzahl in der Ausgangssuspension pro Mikroliter.

Stimulation von Zellen

Alle Untersuchungen erfolgen unter sterilen Bedingungen.

Frisch isolierte Monozyten werden nach einer 30-minütigen Ruhephase im Brutschrank stimuliert.

Bei adhärenten Zellen in Kultur wird einen Tag vor der Stimulation das Medium gewechselt. Dazu werden Medien und ggf. PBS auf 37°C erwärmt. Nach dem Abpipettieren des Mediums werden die Zellen mit 2 ml (12,5 cm² KF) bzw. 4 ml (25 cm² KF) frischem Medium versetzt.

Bei Stimulationen unter serumfreien Bedingungen werden die Zellen nach Entfernen des serumhaltigen Mediums zwei Mal mit 2 ml (12,5 cm² KF) bzw. 4 ml (25 cm² KF) PBS gespült. Danach werden 2 ml (12,5 cm² KF) bzw. 4 ml (25 cm² KF) serumfreies Medium in die Flaschen pipettiert. Bis zur Stimulation werden die Zellen weiter im Brutschrank kultiviert.

Stimulanzien und gegebenenfalls Blocker werden mit A. dest. (Aqua ad iniectabilia) so verdünnt, dass sie im Volumenverhältnis 1:100 ins Zellmedium pipettiert werden können. Als Negativkontrolle wird A. dest. verwendet. Die Inkubation erfolgt unter normalen Kultivierungsbedingungen (im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO₂, bei Kardiomyozyten ohne CO₂-Einstellung).

Antagonisten werden 30 min vor Beginn der Stimulation zu den Zellen gegeben.

Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten

Neonatale Ratten-Kardiomyozyten werden am 3. oder 4. Tag der Kultivierung verwendet. Das Medium SM20-I mit 10 % NKS sowie der Objekttisch des Mikroskops werden auf 37°C erwärmt. Für eine Stunde werden die spontan pulsierenden Kardiomyozyten mit 2 ml frischem Medium im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Mit Hilfe einer gelöcherten Metallschablone auf dem Objekttisch werden zehn Messfelder mit synchron kontrahierenden Zellaggregaten ausgewählt. Die computergestützte Messung erfolgt über das Programm Imagoquant Fourieranalyse 100. Zunächst wird die basale Pulsationsrate der Zellen in den festgelegten Messfeldern ermittelt. Nach einer Inkubation mit dem Antikörper-Präparat (1:40, bei affinitätschromatografisch gereinigten Antikörpern 1:100) für eine Stunde bei 37°C folgt eine erneute Bestimmung der Pulsationsrate. Die Differenz aus beiden Bestimmungen wird in Schläge/min angegeben. Der ermittelte „cut off“-Wert liegt bei 7,2. Alle Antikörper-Präparate, bei denen die Differenz der Pulsationsraten größer als der „cut off“-Wert ist, werden als Autoantikörper-positiv bewertet.

Herstellen eines Zellextrakts

Die Zellkulturflaschen, die Reaktionsgefäße, die D-PBS-Lösung und der Lysispuffer werden stets in Eis gekühlt. Das Medium wird aus der KF abgegossen. Die Flasche wird zwei Mal mit 2 ml (12,5 cm² KF) bzw. 4 ml (25 cm² KF) D-PBS gespült. Nach dem Abgießen wird das verbliebene D-PBS sorgfältig abpipettiert. Die Zellen werden in 50 µl Lysispuffer lysiert und mit einem Zellschaber vom Flaschenboden gelöst. Das Lysat wird in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert und 10 min inkubiert. Nach einer kurzen Durchmischung (Vortex) erfolgt eine Zentrifugation bei 16.000×g bei 4°C für 10 min. Ungelöste Zellbestandteile bilden ein Pellet. Der Überstand wird abpipettiert und in ein 0,5 µl-Reaktionsgefäß überführt. Der Zellextrakt wird bei –80°C gelagert.

Proteinbestimmung nach Lowry

In einem 0,5 ml-Reaktionsgefäß werden 4 µl Zellextrakt mit 16 µl Lysispuffer verdünnt (1:5). Dann werden 140 µl A. dest. zugegeben. Nach dem Vermischen werden davon dreifach 40 µl in eine 96-Well-Platte pipettiert.

Für die Eichreihe werden BSA-Standard (0,2 mg/ml), Lysispuffer und A. dest. dreifach nach folgendem Schema in die Platte pipettiert: BSA-Standard 2,5 µl bis 20,0 µl (entspricht 0,5 µg bis 4,0 µg), 5 µl Lysispuffer und mit A. dest. jeweils auf 40 µl auffüllen.

Pro 1 ml Lösung A werden 20 µl Lösung S des Bio-Rad-Proteinbestimmungskits in einem Reaktionsgefäß vermischt. Von diesem Gemisch werden 25 µl pro Well hinzupipettiert. Anschließend werden 200 µl Lösung B des Kits zugegeben. Es folgt eine Inkubation auf dem Mikrotiterplatten-Schüttler für 15 min. Die Platte wird im Mikroplatten-Absorptionsfotometer bei einer Wellenlänge von 650 nm gemessen.

Western-Blot Prinzip des Western-Blots

Mit „blotten“ (engl.: to blot = klecksen) wird die Übertragung bestimmter Substanzen auf eine Membran bezeichnet. Im Western-Blot sind diese Substanzen Proteine. Fixiert auf der Membran können die Proteine detektiert und quantifiziert werden.

Zuvor wird ein Proteingemisch, z.B. ein Zellextrakt, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Dabei bewegen sich in einem elektrischen Feld kleine Proteine schnell und große Proteine langsam durch ein polymeres Netzwerk. Bei der diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) werden Acrylamid- und Bisacrylamidmonomere durch die Katalyse von TEMED (N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin) und Ammoniumpersulfat vernetzt. SDS (Natriumdodecylsulfat) ist negativ geladen und überdeckt bei der Anlagerung an die Proteine deren Eigenladung. Somit beeinflusst diese nicht den Lauf der Proteine im elektrischen Feld und alle Proteine bewegen sich entsprechend ihrer Molekularmasse in Richtung Anode. Bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese werden die Proteine zunächst in einem Sammelgel zu einer scharfen Bande fokussiert. Danach werden die Proteine im Trenngel der Größe nach aufgetrennt.

Beim Wet-Blot-Verfahren wird der gesamte Komplex aus Gel, anliegender Membran und fixierendem Filterpapier und Schwämmen eingeklemmt in einer Kunststoffkassette vollständig in Transferpuffer getaucht. Wieder bewegen sich die Proteine im elektrischen Feld in Richtung Anode, und zwar aus dem Gel auf die Membran.

Beim sogenannten Immunoblot wird für die Proteindetektion ein Antikörper verwendet, der spezifisch gegen ein Epitop eines Proteins gerichtet ist. Dieser Primärantikörper wird wiederum mit einem Sekundärantikörper detektiert, welcher mit einem Enzym markiert ist. Durch die Reaktion mit dem passenden Substrat entsteht ein direkt nachweisbares Produkt.

Bei der ECL (engl. enhanced chemiluminescence, verstärkte Lumineszenz)-Reaktion wird ein Meerrettich-Peroxidase-gekoppelter Sekundärantikörper verwendet. Das Enzym katalysiert die Oxidation des Substrats Luminol in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H₂O₂). Luminol wird dadurch in einen angeregten Zustand versetzt. Bei der Umkehr in den Grundzustand wird Licht emittiert. Diese Lichtemission wird verstärkt und kann mit einem radiografischen Film detektiert werden.