Die Änderungen der Schlagfrequenz spontan pulsierender Kardiomyozyten in Abhängigkeit der Konzentration von Thrombin, dem PAR1/2-aktivierenden Peptid SFLLRN und Endothelin-1 (ET-1) wurden bestimmt (Abb. 5). Nach Ermittlung der basalen Pulsationsrate wurden die Zellen für 5 min mit den Stimulanzien inkubiert. Thrombin und SFLLRN erhöhten die Pulsationsraten dosisabhängig. Die Maximalantwort auf Thrombin wurde bei einer Konzentration von 1 E/ml und auf das Peptid bei 100 µM ermittelt. ET-1 induzierte einen dosisabhängigen, negativ chronotropen Effekt. Die maximale Antwort wurde bei einer Endothelin-1-Konzentration von 100 nM ermittelt.

Abb. 5: Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten nach Stimulation mit Thrombin, SFLLRN oder ET-1.

Die Effekte von Thrombin (1 E/ml) und dem Peptid SFLLRN (100 µM) wurden durch 15 min Vorinkubation mit dem inhibitorischen Peptid YFLLRN (1 µg/ml) blockiert (Abb. 6). Der ET(A)-Antagonist BQ610 (1 µM), nicht aber der ET(B)-Antagonist BQ788 (1 µM) inhibierte nach 15-minütiger Vorinkubation die folgende Stimulation mit Endothelin-1 (ET-1, 100 nM). Diese Daten zeigen, dass Endothelin-1 die Pulsationsrate der Kardiomyozyten über den ET(A)-Rezeptor erniedrigte.

Abb. 6: Pulsationsraten nach Stimulation mit Thrombin, dem PAR1/2-aktivierenden Peptid SFLLRN oder Endothelin-1 und Antagonismus durch das PAR1-inhibitorische Peptid YFLLRN bzw. den ET(A)-Blocker BQ610 und den ET(B)-Blocker BQ788

Es wurde untersucht, ob und in welcher Zeit das inhibitorische Peptid YFLLRN (1 µg/ml) das Rezeptor-eigene Peptid (nach Spaltung durch Thrombin) oder das synthetisch hergestellte, stimulatorische Peptid SFLLRN verdrängen kann [122]. Dazu wurde zunächst die Pulsationsrate nach 5 min Inkubation mit Thrombin bzw. SFLLRN bestimmt. Dann wurde YFLLRN zugegeben und nach weiteren 5, 15 und 30 min wurde wieder die Pulsationsrate ermittelt. Das Ergebnis ist in Abb. 7 dargestellt. Die zeitliche Abnahme der Pulsationsraten-Erhöhung spricht für eine Verdrängung des stimulatorischen Peptids durch das inhibitorische Peptid YFLLRN.

Abb. 7: Pulsationsrate bei Verdrängung des stimulatorischen Peptids SFLLRN durch das inhibitorische Peptid YFLLRN

Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten durch Autoantikörper gegen die Rezeptoren PAR und ET(A)

Seren von Patienten mit Raynaud-Syndrom oder anderen Herz-Kreislauf-Erkrankungen können sowohl PAR-Autoantikörper als auch ET(A)-Rezeptor-Autoantikörper enthalten. Der Nachweis und die Charakterisierung der Autoantikörper gegen die Rezeptoren PAR und ET(A) erfolgten über die In-vitro-Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten. Nach Ermittlung der basalen Pulsationsrate wurden die Zellen mit Patienten-IgG (1:20) inkubiert (Abb. 8). Die Pulsationsrate wurde erhöht. Wurde nun das PAR1-inhibitorische Peptid YFLLRN [123, 122] (1 µg/ml) eingesetzt, so fiel die Pulsationsrate wieder zurück auf das Basalniveau oder darunter. Wurde im letzteren Fall auch der ET(A)-Blocker BQ610 [124] (1 µM) zugegeben, so wurde die Pulsationsrate wieder auf das Basalniveau angehoben. Die IgG-Präparate, dessen Pulsationsraten-erhöhender Effekt durch das Thrombin-Rezeptor-inhibitorische Peptid YFLLRN aufgehoben wurde, enthielten PAR-aktivierende Autoantikörper. Diese PAR-Autoantikörper erhöhten die Pulsationsrate der Kardiomyozyten um 22,2±1,6 Schläge/min (Mittelwert ± SEM). Die IgG-Präparate, bei denen die Schlagfrequenz der Kardiomyozyten durch YFLLRN unter das Basalniveau fiel und dieser Effekt durch den ET(A)-Antagonisten BQ610 aufgehoben wurde, enthielten PAR- und ET(A)-aktivierende Autoantikörper. Diese Kombination von Autoantikörpern erhöhte die Pulsationsrate nur um 9,3±2,3 Schläge/min.

Abb. 8: Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten durch Patienten-IgG mit Autoantikörper gegen PAR und/oder ET(A). YFLLRN: Thrombin-Rezeptor-inhibitorisches Peptid, BQ610: ET(A)-Blocker

Die Funktionalität der Autoantikörper an den Rezeptoren PAR und ET(A) konnte durch ein weiteres Experiment mit den Antagonisten gegen PAR und ET(A) gezeigt werden (Abb. 9). Hier wurden die Kardiomyozyten nach Ermittlung der basalen Pulsationsrate entweder mit dem ET(A)-Rezeptorantagonisten BQ610 (1 µM) oder mit dem Thrombin-Rezeptor-inhibitorischen Peptid YFLLRN (1 µg/ml) für 30 min vorbehandelt. Die erneute Bestimmung der Pulsationsrate ergab eine Erhöhung um 20,7±1,5 Schläge/min (Mittelwert ± SEM) bei Vorbehandlung mit BQ610. Da die Kombination von PAR- und ET(A)-Autoantikörpern im oben erläuterten Versuch (siehe Abb. 8) nur eine Erhöhung um 9,3±2,3 Schläge/min ergab, kann von einem hemmenden Effekt der ET(A)-spezifischen Autoantikörper ausgegangen werden. Bei Vorbehandlung mit YFLLRN ergab sich eine Erniedrigung der Pulsationsrate um -14,2±1,0 Schläge/min. Wurde dann im Fall der Vorbehandlung mit BQ610 das inhibitorische Peptid YFLLRN zugegeben und im Fall der Vorbehandlung mit YFLLRN der ET(A)-Rezeptorantagonist BQ610, so lagen die Pulsationsraten wieder auf der Höhe des Basalniveaus. Dieses Experiment bestätigte die Aktivität von Autoantikörpern gegen die Rezeptoren PAR und ET(A) in Patienten-IgG.

Abb. 9: Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten nach Vorbehandlung mit einem Rezeptorblocker und anschließender Zugabe des zweiten Blockers. (vorb. = vorbehandelt mit) YFLLRN: Thrombin-Rezeptor-inhibitorisches Peptid (1 µg/ml), BQ610: ET(A)-Blocker (1 µM)

Eine Stichprobe von 32 Seren von Patienten mit Raynaud-Syndrom bestätigte die unter 1.2.1 auf Seite 13 angeführte Häufung des Frauenanteils bei dieser Erkrankung. Von den 32 Patienten mit Raynaud-Syndrom waren 27 Frauen. Das entspricht einem Verhältnis von Frauen zu Männern wie 5,4:1. Das Vorkommen von Autoantikörpern ist in Tab. 7 wiedergegeben. Fünfzehn der 32 untersuchten Patientenseren enthielten Antikörper gegen PAR1/2. Zwölf Patienten enthielten sowohl Antikörper gegen PAR1/2 als auch gegen den ET(A)-Rezeptor. In einem Patientenserum wurden ausschließlich Antikörper gegen den ET(A)-Rezeptor nachgewiesen. In vier der 32 Patientenseren waren mit der verwendeten Methode keine Autoantikörper nachweisbar.

Autoantikörper gegen

Anzahl der Patienten mit Raynaud-Syndrom

das entspricht

PAR1/2

15

46,9 %

PAR1/2 und ET(A)

12

37,5 %

ET(A)

1

3,1 %

(keine)

4

12,5 %

Summe

32

100,0 %

Tab. 7: Vorkommen von Autoantikörpern bei einer Stichprobe von 32 Patienten mit Raynaud-Syndrom

Dosis-Wirkungskurven der PAR- und ET(A)-Autoantikörper

Am Beispiel dreier Patienten-IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern wurde eine Dosis-Wirkungskurve im System der spontan pulsierenden Ratten-Kardiomyozyten erstellt (Abb. 10). Um allein die Effekte der PAR-Autoantikörper zu messen, wurden die Kardiomyozyten für 10 min mit dem ET(A)-Rezeptor-Antagonisten BQ610 (1 µM) vorbehandelt. Die Autoantikörper erhöhten dosisabhängig die Pulsationsrate der Kardiomyozyten. Die maximale Antwort wurde bei einer IgG-Verdünnung von 1:40 ermittelt. Zur Ermittlung des maximalen Effektes, der über den ET(A)-Rezeptor vermittelt wurde, wurden die Kardiomyozyten mit dem inhibitorischen Peptid YFLLRN (100 ng/ml) vorbehandelt. Die Autoantikörper gegen den ET(A)-Rezeptor induzierten einen dosisabhängigen, negativ chronotropen Effekt. Zur Analyse der Autoantikörper-Effekte wurden die Immunglobuline in einer Verdünnung von 1:40 eingesetzt.

Abb. 10: Dosis-Wirkungskurven von IgG-Präparaten mit Autoantikörpern gegen die Rezeptoren PAR oder ET(A)

Spezifität der Autoantikörper gegen den Protease-aktivierten Rezeptor

Bisher konnte gezeigt werden, dass der Effekt der Autoantikörper gegen den Protease-aktivierten Rezeptor (PAR) auf die Pulsationsrate der Kardiomyozyten durch das Thrombin-Rezeptor-inhibitorische Peptid YFLLRN geblockt wurde. Die Spezifität dieser Autoantikörper sollte näher untersucht werden. Dazu wurde das IgG mit Autoantikörpern gegen PAR mit unterschiedlichen Peptiden 10 min vorinkubiert (Abb. 11). Diese Peptide entsprachen Sequenzen aus dem Loop II von PAR1 oder PAR2, dem Loop I von PAR2, dem N-Terminus von PAR2 und dem Loop II des β₁-adrenergen Rezeptors (Tab. 8). Die Peptide aus dem Loop II von PAR1 und von PAR2 neutralisierten den positiv chronotropen Effekt der PAR-Autoantikörper aus drei getesteten Patienten-IgGs. Diese zwei Peptide enthalten einen Abschnitt mit der gleichen Aminosäuresequenz (siehe Tab. 8). Die anderen verwendeten Peptide hatten keinen Neutralisierungseffekt. Dieses Experiment zeigte, dass die PAR-Autoantikörper an Epitope aus Loop II von PAR1 und von PAR2 binden.

Lokalisation

Aminosäurenposition

Aminosäurensequenz

PAR1 Loop II

242-263

QTIQVPGLNITTCHDVLWETLL

PAR2 Loop I

131-149

KIAYHIHGNNWIYGEALCN

PAR2 Loop II

214-235

QTIFIPALNITTCHDVLPEQLL

PAR2 N-terminal

29-47

FSVDEFSASVLTGKLTTVF

β₁-adren. Rez. Loop II

196-221

HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTN

Tab. 8: Verwendete Peptide zum Testen der Neutralisierungsfähigkeit von PAR-Autoantikörpern. Die Angaben entsprechen den Humansequenzen. Gleiche Sequenzen sind hervorgehoben. Die Peptide aus Loop II von PAR1 und PAR2 neutralisierten die PAR-Autoantikörper.

Abb. 11: Neutralisierung von Autoantikörpern gegen den Protease-aktivierten Rezeptor (PAR) durch Vorinkubation mit den Peptiden des Loops II von PAR1 und PAR2. (Achtfachbestimmung)

Um den Einfluss von Faktoren im Blutplasma der Thrombozytenspender auszuschließen, wurden die Thrombozyten für die Untersuchungen in dieser Arbeit gewaschen. In der klinischen Diagnostik wird für die Aggregometrie jedoch PRP (platelet rich plasma) verwendet. Es sollte untersucht werden, inwiefern sich die Messwerte gewaschener Thrombozyten von denen mit PRP unterschieden. Als Stimulanzien wurden Collagen (190 µg/ml) und ADP (20 µM) eingesetzt (Abb. 22). Die Reaktion gewaschener Thrombozyten auf Collagen war signifikant vermindert. Die gewaschenen Thrombozyten aggregierten nicht, wenn sie mit ADP stimuliert wurden.

Abb. 22: Aggregometrie mit PRP und gewaschenen Thrombozyten. Stimulanzien waren Collagen bzw. ADP. Statistische Auswertung mit dem Mann-Whitney-Test. (Kontrolle: n=45 für PRP, n=10 für gew. Tbz.; Collagen: n=27 für PRP, n=10 für gew. Tbz.; ADP: n=44 für PRP, n=3 für gew. Tbz.)

Die bei der Thrombozytenpräparation verwendete Apyrase verhindert eine frühzeitige Aktivierung der Thrombozyten durch Spaltung von freiem ADP und ATP in der Suspension. Der letzte Waschschritt der Thrombozytenpräparation erfolgte ohne Zugabe von Apyrase. Dennoch sollte nun geprüft werden, ob ein vorhandener Rest der Apyrase in der Thrombozytensuspension die verminderten Reaktionen der Thrombozyten auf Collagen und ADP verursachte. Dazu wurden die Reaktionen mit und ohne Apyrase gewaschener Thrombozyten verglichen (Abb. 23). Bei Collagen war die Aggregation ohne Apyrase signifikant vermindert, was auf die protektive Wirkung der Apyrase hinweist. Nach Stimulation mit ADP zeigten gewaschene Thrombozyten weder mit noch ohne Apyrase eine Aggregation. Die verminderte Lichtdurchlässigkeit gegenüber der Kontrolle (0,9 % NaCl) deutete auf eine Formumwandlung (shape change) der Thrombozyten, unabhängig von der Apyrase. Dieses Enzym ist nicht verantwortlich für die verminderte Aggregationsfähigkeit der Thrombozyten.

Abb. 23: Aggregation gewaschener Thrombozyten mit und ohne Verwendung von Apyrase. Statistische Auswertung mit dem Mann-Whitney-Test.

Danach wurde die Aggregation durch das PAR-aktivierende Peptid SFLLRN getestet. Abb. 24 zeigt die Abhängigkeit der Aggregation von der Peptidkonzentration. In diesem Versuch wurden PRP mit gewaschenen Thrombozyten verglichen. Die Aggregation gewaschener Thrombozyten war geringer als die von PRP. Bei einer Peptidkonzentration von 1 µM erfolgte keine Aggregation. Bei einer Konzentration von 3 µM SFLLRN war die Aggregation geringer als mit 10 µM SFLLRN.

Abb. 24: Aggregometrie mit PRP und gewaschenen Thrombozyten. Stimulanz war das Peptid SFLLRN in den angegebenen Konzentrationen. Statistische Auswertung mit dem T-Test für ungepaarte Stichproben (0,9 % NaCl: p=0,006; 3 µM SFLLRN: p=0,002; 10 µM SFLLRN: p<0,0001).

Aggregation und Freisetzung von Serotonin

Die Aggregation in Prozent, der Slope (Anstieg des Aggregationsverlaufs) und die Serotoninfreisetzung wurden verglichen in Antwort auf verschiedene Konzentrationen von Thrombin, dem stimulatorischen Peptid SFLLRN und dem PAR1-spezifischen partiell-agonistischen Peptid YFLLRN (Abb. 25). Während der Slope bei mittleren Konzentrationen von Thrombin und dem Peptid SFLLRN ein Maximum zeigte und bei steigenden Konzentrationen wieder leicht abfiel, korrelierten die Kurvenverläufe der Serotonin-Freisetzungen mit denen der Aggregationen. Das Peptid YFLLRN bewirkte in niedriger Konzentration einen Formenwandel, jedoch keine Aggregation oder Serotonin-Freisetzung.

Abb. 25: Aggregation, Serotonin-Freisetzung und Slope in Abhängigkeit der Konzentration von Thrombin, SFLLRN bzw. YFLLRN bei gewaschenen Thrombozyten. (Thrombin: n=7, SFLLRN: n=7, YFLLRN: n=2)

Es wurde untersucht, ob eine 30-minütige Vorinkubation der Thrombozyten mit Patienten-IgG die Aggregation oder die Serotonin-Freisetzung beeinflusste. Die IgG-Präparate von Patienten 1 bis 5 wurden getestet. Thrombozyten desselben Spenders wurden mit Patienten-IgG und zum Vergleich mit Kontroll-IgG vorinkubiert. Die Aggregation und damit die Serotonin-Freisetzung wurden durch 3 µM und 10 µM SFLLRN-Peptid initiiert. Entsprechend der verschiedenen Verfügbarkeit sowohl von IgG-Volumen als auch von Spenderthrombozyten wurden unterschiedlich viele Parameterkombinationen getestet. Zur Verdeutlichung des Unterschieds wurden die Differenzen, Messwert Patient minus Messwert Kontrolle, berechnet. Die Ergebnisse sind in Abb. 26 bis Abb. 30 dargestellt. Bei Vorinkubation der Thrombozyten mit IgG von Patient 1 waren die Aggregation und die Serotonin-Freisetzung bei 3 µM SFLLRN-Peptid überwiegend stärker als bei Vorinkubation mit IgG von Kontrollen 1, 2, 3 oder 4. Dies deutete auf einen stimulierenden Effekt des IgGs von Patient 1 hin. Umgekehrt zeigte sich bei Patient 5 ein hemmender Einfluss auf die Aggregation und die Serotonin-Freisetzung bei Stimulation sowohl mit 3 µM als auch mit 10 µM SFLLRN. Bei Patienten 2, 3 und 4 konnten keine homogenen Effekte festgestellt werden.

Abb. 26: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 1 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

Abb. 27: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 2 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

Abb. 28: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 3 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

Abb. 29: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 4 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

Abb. 30: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 5 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

Es sollte geprüft werden, ob mit nur 1 µM SFLLRN-Peptid für 15 min vorstimulierte Thrombozyten (Kontrolle erhielt 0,9 % NaCl) sensibler auf Autoantikörper-enthaltendes IgG reagierten. Nach der Vorstimulation der Thrombozyten erfolgte die 30-minütige Vorinkubation mit den Antikörper-Präparaten. Dazu wurde die Thrombozytensuspension aufgeteilt: Ein Teil wurde mit Patienten-IgG und ein Teil mit Kontroll-IgG vorinkubiert. Anschließend wurde jeweils die Aggregation nach Stimulation mit der mittleren Peptidkonzentration von 3 µM gemessen (Abb. 31).

Verglichen mit den Mittelwerten aus 3.3.2 (bei 3 µM SFLLRN Aggregation 51,0 % ± 4,7 %; Slope 23,4 ± 0,8; siehe Abb. 25) lagen die hier ermittelten Werte deutlich tiefer (Aggregation 9,3 % ± 3,2 %; Slope 5,8 ± 1,9). Die Berechnungen der Signifikanz nach Mann-Whitney ergaben für die Aggregation p=0,0008 und für den Slope p=0,0005. Diese Diskrepanz konnte sich aus der zusätzlichen Zeit für die Vorstimulation ergeben. Unter den gegebenen artifiziellen Bedingungen sinkt die Funktionalität der Thrombozyten mit fortschreitender Zeit.

Unabhängig vom IgG-Präparat bewirkte die Vorstimulation in 9 von 12 Fällen eine Erhöhung der Aggregation (+1 bis +7 %) bzw. Slope-Werte (+3 bis +9) im Vergleich zu den Proben ohne Vorstimulation nach Zugabe von 0,9 % NaCl.

Die mit 3 µM SFLLRN stimulierte Aggregation und einhergehend auch der Slope bei Kontrolle 2 waren ohne Vorstimulation deutlich höher als mit Vorstimulation. Dies könnte auf eine sensiblere Reaktion der hier verwendeten Spenderthrombozyten auf das Peptid zurückzuführen sein. Dabei war anzunehmen, dass die Thrombozyten nach Vorstimulation mit 1 µM SFLLRN bereits zu stark aktiviert waren, um eine erneute Reaktion auf 3 µM SFLLRN zu zeigen.

Die verwendeten Thrombozyten in diesem Versuch stammten von drei Spendern. Jeweils dieselben Thrombozytenpräparate wurden benutzt für die Gruppe „Kontrolle 1 und Patient 4“, für die Gruppe „Kontrolle 2 und Patient 4“ und für die Gruppe „Kontrolle 5 und Patient 5“. Werden die vorstimulierten Thrombozyten innerhalb jeder dieser drei Gruppen verglichen, so wurden in den ersten beiden nach Zugabe von sowohl 0,9 % NaCl als auch 3 µM SFLLRN höhere Werte gemessen mit Patienten-IgG als mit Kontroll-IgG (Differenzen bei Aggregation +3 % bzw. +7 %, beim Slope +5 bzw. +3). In der dritten Gruppe trifft das nicht zu (Differenz Aggregation -7 %, Slope -2).

Ein Vergleich der nicht vorstimulierten Thrombozyten innerhalb jeder Gruppe zeigte, dass die Thrombozytenfunktion mit Patienten-IgG eher abnahm. Bei Zugabe von 0,9 % NaCl betrugen die Unterschiede zum Kontroll-IgG bei der Aggregation ±0 %, ±0 % bzw. -2 %, beim Slope -4, ±0 und -9. Bei Stimulation mit 3 µM SFLLRN betrugen die Unterschiede bei der Aggregation ±0 %, -35 % (siehe oben) bzw. -2 %, beim Slope -5, -2, bzw. -8.

Abb. 31: Wirkung von Antikörperpräparaten auf vorstimulierte Thrombozyten. Es wurden drei verschiedene Thrombozytensuspensionen verwendet, jeweils dieselbe für Ko. 1 und Pat. 4, für Ko. 2 und Pat. 4 bzw. für Ko. 5 und Pat. 5. Fehlende Säulen entsprechen dem Wert 0.

Mittels FACS-Analyse sollte stichprobenartig überprüft werden, wie rein die Monozytenpräparation war. Dazu wurden die zellulären Oberflächenrezeptoren HLA-DR und CD14 mittels Fluoreszenz-Farbstoff-konjugierter Antikörper markiert. Das kombinierte Auftreten dieser beiden Rezeptoren ist charakteristisch für Monozyten. Der Anteil von HLA-DR- und CD14-positiven Zellen in der Monozytensuspension lag bei 72,3 % ± 1,2 (Abb. 32). Innerhalb des Gates, das über die vermutete Monozytenpopulation gesetzt wurde, lag der Anteil bei 89,4 % ± 0,6.

Abb. 32: Anteil von HLA-DR+/CD14+ Zellen in Monozytenpräparationen, ermittelt durch Messungen am FACS.

Methodenetablierung zur Messung von Sauerstoffradikalen aus Monozyten

Frisch isolierte Monozyten wurden mit 800 nM PMA zur Freisetzung von Sauerstoff-Radikalen angeregt. Die Farbstoffe Lucigenin und das Luciferinderivat MCLA wurden in ihrer Lumineszenz-Intensität verglichen. Dazu wurden die Konzentrationen von 5 µM und 25 µM für Lucigenin und 10 µM für MCLA verwendet. In Abb. 33 sind die Lumineszenz-Signale ohne Zellen, von 50.000 und von 500.000 Zellen pro Well in Abhängigkeit von der Zeit wiedergegeben. Unter den gegebenen Bedingungen konnte mit Lucigenin kein Lumineszenzsignal gemessen werden. Mit 10 µM MCLA und 500.000 Zellen erreichte die Kurve nach 10 min ein Maximum von 3,2 RLU.

Abb. 33: Vergleich der Lumineszenz-Intensität von Lucigenin und MCLA. Monozyten wurden mit 800 nM PMA zur Bildung von Sauerstoffradikalen angeregt. Von jedem Messwert wurde der Wert ohne PMA subtrahiert. (n=1, Doppelbestimmung)

Zur Optimierung der MCLA-Konzentration wurde der Bereich von 1 µM bis 50 µM näher untersucht. Außerdem wurden unterschiedliche Zellzahlen getestet (100.000 bis 500.000 Monozyten pro Well). Die Ergebnisse sind in Abb. 34 dargestellt. Mit steigender MCLA-Konzentration sank das maximale Lumineszenz-Signal, welches jedoch von 1 µM bis 10 µM immer später erreicht wurde. Dafür hielt das Signal mit steigender MCLA-Konzentration länger an. Je mehr Zellen verwendet wurden, desto stärker wurde das Lumineszenz-Signal und desto kürzer war das Kurvenplateau. In den folgenden Versuchen wurden 300.000 Zellen und 5 µM MCLA eingesetzt.

Abb. 34: Abhängigkeit des Lumineszenz-Signals von MCLA-Konzentration und Zellzahl. Monozyten wurden mit 800 nM PMA zur Bildung von Sauerstoffradikalen angeregt. Von jedem Messwert wurde der Wert ohne PMA subtrahiert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus drei Versuchen (maximaler SEM-Wert 0,16).

Des Weiteren wurde untersucht, ob die Zeit der Vorinkubation der Monozyten mit präparierten Antikörpern die Bildung von Sauerstoffradikalen beeinflusst. Die Funktion der isolierten Monozyten konnte mit der Zeit beeinträchtigt sein, ebenso konnte sie aber auch durch Rehabilitation während der Ruhephase verbessert sein. Außerdem konnten Faktoren der Antikörpersuspension akute Effekte zeigen, die nach einer einstündigen Vorinkubation nicht mehr messbar wären. Die Monozyten wurden nicht oder für eine Stunde mit den Anitkörperpräparationen eines Patienten oder einer Kontrollperson vorinkubiert. PMA wurde in den Konzentrationen 80 nM oder 800 nM zugegeben. Es wurden mehr Sauerstoffradikale nachgewiesen nach einstündiger Vorinkubation als ohne, auch ohne Zusatz von PMA (Abb. 35). Das Lumineszenz-Signal war bei 800 nM PMA am höchsten und erreichte das Plateau am frühesten. Ein qualitativer Unterschied zwischen Patient und Kontrollperson war dabei nicht erkennbar. Quantitativ lagen die Kurvenmaxima beim Patienten ein wenig über denen der Kontrollperson (Differenzen zwischen 0,01 und 0,05 RLU).

Abb. 35: Superoxidanion-Messung von PMA-stimulierten Monozyten mit und ohne Vorinkubation für 1 h mit IgG von Patient 11 bzw. Kontrolle 6

Einfluss von Antikörper-Präparaten auf die Freisetzung von Sauerstoffradikalen

In drei Versuchen wurde der Einfluss von Antikörper-Präparaten auf die Freisetzung von Sauerstoffradikalen aus Monozyten untersucht. Es wurden unterschiedliche PMA-Konzentrationen (0,8 nM - 800 nM) verwendet. Die Monozyten wurden vor der Zugabe von PMA mit den Antikörper-Präparaten 1 h lang vorinkubiert. Abb. 36 fasst die Ergebnisse zusammen. Die Kurvenverläufe spiegeln lediglich die jeweilige PMA-Konzentration wider. Ein genereller Unterschied zwischen Kontrollen und Patienten konnte nicht festgestellt werden.

Abb. 36: Sauerstoffradikal-Bildung von PMA-stimulierten Monozyten nach einstündiger Vorinkubation mit IgG von Patienten bzw. Kontrollen

Quantifizierung von Tissue Factor und pERK1/2 in Monozyten mittels Western-Blot nach Stimulation mit Endothelin-1 oder Thrombin

Der Einfluss von Endothelin-1 (10 nM) und Thrombin (1 E/ml) auf die Produktion von TF (tissue factor) und die Aktivierung der MAPK ERK1/2 in serumhaltigem Medium wurde in drei Versuchen analysiert (Abb. 37). Die Monozyten wurden mit den Stimulanzien bzw. A. dest. als Kontrolle 2 h inkubiert. Die Werte wurden auf die Kontrolle=1 umgerechnet. Die Streuung der Messergebnisse war zu groß, um eine eindeutige Aussage zum Einfluss der beiden Stimulanzien treffen zu können.

Abb. 37: Quantifizierung TF und pERK1/2 in Monozyten nach Stimulation mit Endothelin-1 oder Thrombin

Mit IgG von Kontrolle 3 wurde die intraindividuelle Streuung der Messergebnisse untersucht (Abb. 38). In vier unabhängigen Versuchen zeigten sich nach 2 h einmal eine TF-Erhöhung (2,86-faches der Negativkontrolle) und einmal eine ERK1/2-Aktivierung (8,30-faches der Negativkontrolle). Die restlichen Ergebnisse unterschieden sich nicht deutlich von der Negativkontrolle. Die monozytäre Expression von TF und die Aktivierung von ERK1/2 sind demnach je nach Herkunft der Monozyten unterschiedlich.

Abb. 38: Quantifizierung von TF und pERK1/2 in Monozyten nach Stimulation mit IgG von Kontrolle 3. Die Werte wurden normiert, so dass die Negativkontrolle (A. dest.)=1 ist.

Es wurden Antikörper-Präparate von fünf Kontroll- und von fünf Patientenseren im Hinblick auf eine veränderte Produktion von TF und pERK1/2 getestet. Die Monozyten wurden 2 h mit den IgG-Präparaten inkubiert. In Abb. 39 sind die Ergebnisse zusammengefasst. Im Falle von TF ergaben die Kontrollen Werte zwischen dem 1,5- und 6,0-fachem der Negativkontrolle, die Patienten zwischen dem 1,1- und 2,8-fachem. Für pERK1/2 ergab sich eine Spanne vom 1,1- bis 2,6-fachem der Negativkontrolle bei den Kontroll-IgGs und Werte vom 0,8- bis 12,2-fachem bei den Patienten-IgGs. Die Messwerte von Patient 10 (12,2) und Patient 11 (9,4) unterschieden sich hierbei deutlich von den anderen Patienten und Kontrollen. Eine zusammenfassende Aussage über den Einfluss von Patienten-IgG auf die Produktion von TF und pERK1/2 bei Monozyten im Vergleich zu Kontroll-IgG ließ sich damit nicht treffen.

Abb. 39: Quantifizierung von TF und pERK1/2 in Monozyten nach Stimulation mit IgG von fünf Kontrollen und sechs Patienten. Die Werte wurden normiert, so dass die Negativkontrolle (A. dest.)=1 ist.

Des Weiteren wurde untersucht, ob Eluat und Durchfluss affinitätschromatografisch aufgereinigter PAR-Autoantikörper eine unterschiedliche monozytäre Aktivierung von TF-Produktion bzw. ERK1/2 bewirken. Der Durchfluss sollte eine direkte Negativkontrolle zum Eluat darstellen. Der Versuch wurde unter Verwendung eines einzigen Monozyten-Präparats durchgeführt. Wie in Abb. 40 gezeigt, bewirkten die Durchfluss-Präparate von Patient 14a [ET(A)] und Patient 15a (keine Autoantikörper) wie auch das Eluat von Patient 15a eine Erhöhung des TF-Proteins, nicht jedoch das Eluat von Patient 14a (PAR). ERK1/2 wurde bei Stimulation mit beiden Durchfluss-Präparaten verstärkt phosphoryliert. Die Eluate (PAR) lieferten hier Ergebnisse vergleichbar mit der Negativkontrolle.

Abb. 40: Quantifizierung von TF und pERK1/2 in Monozyten nach Stimulation mit Eluat bzw. Durchfluss affinitätschromatografisch aufgereinigter Antikörper-Präparationen von zwei Patienten. Die Werte wurden normiert, so dass die Negativkontrolle (A. dest.)=1 ist.