Einige Patienten mit Raynaud-Syndrom, Urtikaria, koronarer Herzkrankheit, Angina pectoris, oder Pulmonaler Hypertonie haben funktionelle Autoantikörper gegen die Thrombin-Rezeptoren PAR1/2 und/oder gegen den Endothelin-Rezeptor ET(A). In dieser Arbeit wurde die Wirkung solcher Patienten-IgG-Präparate auf Funktionen von frisch isolierten, humanen Thrombozyten und Monozyten sowie von Ventrikel-Kardiomyozyten neonataler Ratten und von humanen, glatten Muskelzellen aus Coronararterien (hCASMC) untersucht. Zum Vergleich wurden die PAR-Agonisten Thrombin und das stimulierende Peptid SFLLRN sowie Endothelin-1 verwendet. Die Ergebnisse der Thrombozytenaktivierung durch Patienten-IgG waren unterschiedlich. Versuche mit vorstimulierten Thrombozyten zeigten, dass ein stimulierender Einfluss der Autoantikörper auf präaktivierte Thrombozyten nicht ausgeschlossen werden kann. Ohne Vorstimulation jedoch schien Patienten-IgG eher einen hemmenden Einfluss auf die Thrombozytenfunktion zu haben. Eine Vorinkubation von Monozyten mit Patienten-IgG hatte keinen Einfluss auf die PMA-induzierte Produktion von Superoxidanion im Vergleich zu Kontroll-IgG. Nur bei zwei von fünf Patienten-IgGs konnte eine stimulierende Wirkung anhand der monozytären ERK1/2-Phosphorylierung gefunden werden. Während aufgereinigte ET(A)-Autoantikörper ERK1/2 in Kardiomyozyten nicht aktivierten, bewirkten IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern hier eine ähnliche Aktivierung wie das Peptid SFLLRN. Überraschenderweise bewirkte Kontroll-IgG eine starke Aktivierung von ERK1/2. Die Coinkubation der Kardiomyozyten mit Antikörper-Präparaten und IL-1beta erhöhte die Phosphorylierung von ERK1/2 in allen Fällen. In hCASMCs bewirkten IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern und Kontroll-IgGs eine Aktivierung von ERK1/2, ET(A)-Autoantikörper nicht. Die Schlussfolgerung aus dieser Arbeit liegt darin, dass PAR1/2- und ET(A)-Autoantikörper keine allgemeine Wirkung auf die Funktion von Thrombozyten, Monozyten und glatten Gefäßmuskelzellen zeigten. Die Unterscheidung von Autoantikörper-positiven und -negativen IgG-Präparaten war nur über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten möglich.

Some patients with Raynaud’s syndrome, urticaria, coronary artery disease, Angina or pulmonary hypertension have functional autoantibodies against thrombin receptors PAR1/2 and/or against endothelin receptor ET(A). In this work the effects of such patients’ IgG preparations on functions of ventricular cardiomyocytes of neonatal rats, human smooth muscle cells from coronary arteries (hCASMC); freshly isolated, human platelets as well as monocytes were investigated. For comparison, the PAR agonists thrombin and the stimulating peptide SFLLRN as well as endothelin-1 were used. While purified autoantibodies against ET(A) did not activate ERK1/2 in cardiomyocytes, IgG preparations with autoantibodies against PAR1/2 resulted in a similar activation as the peptide SFLLRN. Surprisingly, control IgG also caused a strong activation of ERK1/2. Coincubation of cardiomyocytes with antibody preparations and IL1beta increased the phosphorylation of ERK1/2 in all cases. In hCASMCs, IgG preparations with PAR-autoantibodies and control IgGs caused activation of ERK1/2, whereas ET(A)-autoantibodies did not. The results of platelet activation with patients’ IgG were varying. Tests with prestimulated platelets showed, that a stimulating effect of the autoantibodies on preactivated platelets can not be excluded. However, without prestimulation patients’ IgG rather seemed to have an inhibiting effect on platelet function. Preincubation of monocytes with patients’ IgG had no influence on PMA-induced production of superoxide anion compared with control IgG. Only two of five patients’ IgGs showed a stimulating effect on monocytic ERK1/2 phosphorylation. In conclusion, PAR1/2- and ET(A)-autoantibodies showed no common effects on the function of vascular smooth muscle cells, platelets and monocytes. The differentiation of autoantibody-positive and negative preparations of IgG only was possible by determining the beating rate of cardiomyocytes.

autoantibody thrombin endothelin-1 cardiovascular PAR ET(A) Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung

  • 1.1 Funktionelle Autoantikörper

    • 1.1.1 Funktionelle Antikörper

    • 1.1.2 Natürliche und Erkrankungen-assoziierte Autoantikörper

    • 1.1.3 Autoantikörper gegen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

  • 1.2 Krankheitsbilder mit Vorkommen von Autoantikörpern gegen Protease-aktivierte Rezeptoren PAR1/2 und Endothelin-Rezeptor ET(A)

    • 1.2.1 Raynaud-Syndrom

    • 1.2.2  Urtikaria

    • 1.2.3 Koronare Herzkrankheit und Angina pectoris

    • 1.2.4 Pulmonale Hypertonie

  • 1.3 Protease-aktivierte Rezeptoren

    • 1.3.1 Aufbau und Aktivierung von PARs

    • 1.3.2 Funktionen von PARs im Herz-Kreislauf- und Immunsystem

  • 1.4 Humane Endothelin-Rezeptoren

    • 1.4.1 Aktivierung des ET(A)-Rezeptors

    • 1.4.2 Funktionen von ET(A) im Herz-Kreislauf- und Immunsystem

  • 1.5 Zielsetzung der Arbeit

• 2 Material und Methoden

  • 2.1 Material

    • 2.1.1 Chemikalien

    • 2.1.2 Antikörper

    • 2.1.3 Peptide

    • 2.1.4 Kits

    • 2.1.5 Utensilien

    • 2.1.6 Geräte

    • 2.1.7 Software

    • 2.1.8 Zellen

    • 2.1.9 Antikörper-Präparate von Patienten

    • 2.1.10 Antikörper-Präparate von Kontrollpersonen

  • 2.2 Methoden

    • 2.2.1 Immunglobulin-Präparation aus Serum

    • 2.2.2 Affinitätschromatografische Reinigung von IgG-Präparaten

    • 2.2.3 Kultur von Ventrikel-Kardiomyozyten neonataler Ratten

    • 2.2.4 Kultur von glatten Muskelzellen humaner Coronararterien (hCASMC)

    • 2.2.5 Blutentnahme

    • 2.2.6 Monozytenisolierung aus humanem Vollblut

    • 2.2.7 Bestimmung von Zellzahl und –vitalität

    • 2.2.8 Stimulation von Zellen

    • 2.2.9 Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten

    • 2.2.10 Herstellen eines Zellextrakts

    • 2.2.11 Proteinbestimmung nach Lowry

    • 2.2.12 Western-Blot

      • 2.2.12.1 Prinzip des Western-Blots

      • 2.2.12.2 Herstellung des SDS-Polyacrylamid-Gels

      • 2.2.12.3 Vorbereitung der Proben

      • 2.2.12.4 Gelelektrophorese

      • 2.2.12.5 Wet-Blot-Verfahren

      • 2.2.12.6 Proteindetektion

    • 2.2.13 Messung der Produktion von Sauerstoffradikalen

      • 2.2.13.1 Prinzip der Messung von Sauerstoffradikalen mit MCLA

      • 2.2.13.2 Durchführung der Messung produzierter Sauerstoffradikale

    • 2.2.14 FACS-Messung

      • 2.2.14.1 Prinzip einer FACS-Messung

      • 2.2.14.2 Bestimmung der Reinheit einer Monozytenpräparation

    • 2.2.15 Thrombozyten-Aggregometrie

      • 2.2.15.1 Prinzip der Aggregometrie

      • 2.2.15.2 Aufbereitung gewaschener Thrombozyten

      • 2.2.15.3 Aufbereitung von PRP

      • 2.2.15.4 Durchführung der Aggregometrie

    • 2.2.16 Quantifizierung von Serotonin

      • 2.2.16.1 Prinzip der Serotonin-Quantifizierung mittels HPLC

      • 2.2.16.2 Probenvorbereitung nach Aggregometrie

      • 2.2.16.3 Messung an der HPLC-Anlage

    • 2.2.17 Statistische Auswertung

• 3 Ergebnisse

  • 3.1 Charakterisierung von Autoantikörpern gegen Protease-aktivierte Rezeptoren 1 und 2 und gegen den Endothelin-Rezeptor ET(A)

    • 3.1.1 Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten durch Thrombin, das Peptid SFLLRN und Endothelin-1

    • 3.1.2 Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten durch Autoantikörper gegen die Rezeptoren PAR und ET(A)

    • 3.1.3 Dosis-Wirkungskurven der PAR- und ET(A)-Autoantikörper

    • 3.1.4 Spezifität der Autoantikörper gegen den Protease-aktivierten Rezeptor

    • 3.1.5 Quantifizierung von pERK1/2 und p67^phox mittels Western-Blot

      • 3.1.5.1 Stimulation von Kardiomyozyten mit Endothelin-1, Thrombin und SFLLRN in serumhaltigem oder serumfreiem Medium

      • 3.1.5.2 Stimulation mit IL-1β

      • 3.1.5.3 Stimulation mit IL-6

      • 3.1.5.4 Stimulation mit LPS

      • 3.1.5.5 Stimulation mit Antikörper-Präparaten

  • 3.2 Untersuchungen an Glatten Muskelzellen humaner Coronararterien (hCASMCs)

    • 3.2.1 Quantifizierung von pERK1/2, Tissue Factor und p67^phox mittels Western-Blot

      • 3.2.1.1 Stimulation mit Endothelin-1, Thrombin und SFLLRN

      • 3.2.1.2 Stimulation mit IL-1β

      • 3.2.1.3 Stimulation mit IL-6

      • 3.2.1.4 Stimulation mit LPS

      • 3.2.1.5 Stimulation mit Antikörper-Präparaten

  • 3.3 Untersuchungen an humanen Thrombozyten

    • 3.3.1 Aggregometrie mit plättchenreichem Plasma und gewaschenen Thrombozyten

    • 3.3.2 Aggregation und Freisetzung von Serotonin

    • 3.3.3 Einfluss von Patienten-IgG auf die Thrombozytenfunktion

    • 3.3.4 Einfluss von Patienten-IgG auf vorstimulierte Thrombozyten

  • 3.4 Untersuchungen an humanen Monozyten

    • 3.4.1 Reinheit der Monozytenpräparation

    • 3.4.2 Methodenetablierung zur Messung von Sauerstoffradikalen aus Monozyten

    • 3.4.3 Einfluss von Antikörper-Präparaten auf die Freisetzung von Sauerstoffradikalen

    • 3.4.4 Quantifizierung von Tissue Factor und pERK1/2 in Monozyten mittels Western-Blot nach Stimulation mit Endothelin-1 oder Thrombin

    • 3.4.5 Quantifizierung von Tissue Factor und pERK1/2 in Monozyten mittels Western-Blot nach Stimulation mit Antikörper-Präparaten

• 4 Diskussion

  • 4.1 Funktion von Ventrikel-Kardiomyozyten neonataler Ratten

    • 4.1.1 Nachweis und Charakterisierung von Autoantikörpern anhand der Pulsationsrate von Kardiomyozyten bei Stimulation mit Patienten-Immunglobulin

    • 4.1.2 Einfluss von Serum auf die Aktivierung von ERK1/2 und die Expression von p67^phox durch Stimulanzien

    • 4.1.3 Agonisten Endothelin-1, Thrombin und Peptid SFLLRN

    • 4.1.4 Proinflammatorische Faktoren IL-1β, IL-6 und LPS

    • 4.1.5 Einfluss von Autoantikörpern auf die Aktivierung von ERK1/2

  • 4.2 Funktion von hCASMCs

    • 4.2.1 Agonisten Endothelin-1, Thrombin und Peptid SFLLRN

    • 4.2.2 Proinflammatorische Faktoren IL-1β, IL-6 und LPS

    • 4.2.3 Einfluss von Autoantikörpern auf die Aktivierung von ERK1/2

  • 4.3 Thrombozytenaggregation und Serotonin-Freisetzung

    • 4.3.1 Methodenetablierung Thrombozyten-Aggregometrie

    • 4.3.2 Aggregation, Slope und Serotonin-Freisetzung

    • 4.3.3 Einfluss von Patienten-IgG auf die Thrombozytenfunktion

  • 4.4 Funktion von Monozyten

    • 4.4.1 Methodenetablierung zur Messung des Superoxidanions

    • 4.4.2 Vorinkubation mit Antikörper-Präparaten zur Superoxidanion-Messung

    • 4.4.3 Einfluss von Autoantikörpern auf die Produktion von Sauerstoff-Radikalen

    • 4.4.4 Aktivierung von ERK1/2 und Regulation von Tissue-Factor-Protein durch Endothelin-1 und Thrombin

    • 4.4.5 Aktivierung von ERK1/2 und Regulation von Tissue-Factor-Protein durch Autoantikörper

• 5 Zusammenfassung

• Abkürzungsverzeichnis

• Literaturverzeichnis

• Anhang

• Eidesstattliche Erklärung

• Lebenslauf

• Danksagung

• Tab. 1: Autoantikörper gegen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren [19].

• Tab. 2: PARs und ihr Vorkommen im humanen Herz-Kreislauf- und Immunsystem

• Tab. 3: Mechanismen der Signaltransduktion von PARs

• Tab. 4: Antikörper-Präparate von Patienten. Über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten (siehe 2.2.9) ist die Aktivität vorhandener Autoantikörper ermittelt. Zur Präparation durch Ammoniumsulfatfällung siehe 2.2.1, Affinitätschromatografie siehe 2.2.2. (KHK: koronare Herzkrankheit, PHT: Pulmonale Hypertonie)

• Tab. 5: Antikörper-Präparate von Kontrollpersonen. Tests auf verschiedene Antikörperspezifitäten über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten (siehe 2.2.9) sind negativ. Zur Präparation durch Ammoniumsulfatfällung siehe 2.2.

• Tab. 6: Peptidsequenzen für die affinitätschromatografische Reinigung von Autoantikörpern

• Tab. 7: Vorkommen von Autoantikörpern bei einer Stichprobe von 32 Patienten mit Raynaud-Syndrom

• Tab. 8: Verwendete Peptide zum Testen der Neutralisierungsfähigkeit von PAR-Autoantikörpern. Die Angaben entsprechen den Humansequenzen. Gleiche Sequenzen sind hervorgehoben. Die Peptide aus Loop II von PAR1 und PAR2 neutralisierten die PAR-Autoantikörper.

• Abb. 1: Nekrotische Fingerspitze eines Patienten mit Raynaud-Syndrom, mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Thomas Harrer, Universität Erlangen

• Abb. 2: Schematische Darstellung von PAR1 [61]. Aufgeführt sind mögliche Spaltungsstellen von Proteasen [65]. Blau: Domäne mit Einfluss auf Bindung und Katalyse von Thrombin. Grün: rezeptoreigener Ligand. Pink: Thrombin-Bindungsstelle. Rot: Cluster saurer Aminosäuren. Lila: mutmaßliche Liganden-Bindungsstelle. Grün gefüllt: Aminosäuren in der mutmaßlichen Liganden-Bindungsstelle, bei denen eine Alanin-Substitution zu einer defekten PAR1-Aktivierung durch SFLLRN führt aber nicht durch Thrombin [66]. Rot gefüllt: Serin- oder Threoninreste als mögliche Phosphorylierungsstellen der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase. Rot umkreiste Aminosäuren C-terminal: Motiv für Verschiebung und Internalisierung von PAR1.

• Abb. 3: Berechnete Vorhersage der Interaktion von Endothelin-1 (blau) mit dem Rezeptor ET(A) [104].

• Abb. 4: Ponceau-S-Färbung der Proteine auf einer Western-Blot-Membran zum Nachweis gleicher Proteinmengen

• Abb. 5: Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten nach Stimulation mit Thrombin, SFLLRN oder ET-1.

• Abb. 6: Pulsationsraten nach Stimulation mit Thrombin, dem PAR1/2-aktivierenden Peptid SFLLRN oder Endothelin-1 und Antagonismus durch das PAR1-inhibitorische Peptid YFLLRN bzw. den ET(A)-Blocker BQ610 und den ET(B)-Blocker BQ788

• Abb. 7: Pulsationsrate bei Verdrängung des stimulatorischen Peptids SFLLRN durch das inhibitorische Peptid YFLLRN

• Abb. 8: Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten durch Patienten-IgG mit Autoantikörper gegen PAR und/oder ET(A). YFLLRN: Thrombin-Rezeptor-inhibitorisches Peptid, BQ610: ET(A)-Blocker

• Abb. 9: Änderung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten nach Vorbehandlung mit einem Rezeptorblocker und anschließender Zugabe des zweiten Blockers. (vorb. = vorbehandelt mit) YFLLRN: Thrombin-Rezeptor-inhibitorisches Peptid (1 µg/ml), BQ610: ET(A)-Blocker (1 µM)

• Abb. 10: Dosis-Wirkungskurven von IgG-Präparaten mit Autoantikörpern gegen die Rezeptoren PAR oder ET(A)

• Abb. 11: Neutralisierung von Autoantikörpern gegen den Protease-aktivierten Rezeptor (PAR) durch Vorinkubation mit den Peptiden des Loops II von PAR1 und PAR2. (Achtfachbestimmung)

• Abb. 12: Aktivierung von ERK1/2 in neonatalen Ratten-Kardiomyozyten nach Stimulation mit Endothelin-1, Thrombin und SFLLRN. Die Stimulation erfolgte in serumhaltigem oder serumfreiem Medium für 1 min bis 24 h. Das Foto zeigt ein Beispiel für die Stimulation mit ET-1 in serumhaltigem Medium (M: Molekulargewichtsmarker, Ko: A. dest.-Kontrolle 10 min). (Kontrolle: n=11, Endothelin-1: n=3, Thrombin: n=4, SFLLRN: n=4, n jeweils gleich für serumhaltiges und serumfreies Medium)

• Abb. 13: Quantifizierung von p67^phox in neonatalen Ratten-Kardiomyozyten nach Stimulation mit Endothelin-1, Thrombin und SFLLRN. Die Stimulation erfolgte in serumhaltigem oder serumfreiem Medium. Das Foto zeigt ein Beispiel für die Stimulation mit ET-1 in serumhaltigem Medium (M: Molekulargewichtsmarker, Ko: A. dest.-Kontrolle 10 min). Dargestellt sind die Werte nach 10 min, 2 h, 6 h und 24 h. (Kontrolle mit Serum: n=11, Kontrolle ohne Serum: n=10, Endothelin-1: jeweils n=3, Thrombin mit Serum: n=4, Thrombin ohne Serum: n=3, SFLLRN: jeweils n=4)

• Abb. 14: Phosphorylierung von ERK1/2 in neonatalen Ratten-Kardiomyozyten nach Stimulation mit IL-1β, IL-6 oder LPS. Die Stimulation erfolgte in serumhaltigem oder serumfreiem Medium für 5 min bis 24 h. (IL-1β: jeweils n=4; IL-6: mit Serum n=5, ohne Serum n=4; LPS: jeweils n=4)

• Abb. 15: Quantifizierung von p67^phox in neonatalen Ratten-Kardiomyozyten nach Stimulation mit IL-1β, IL-6 oder LPS. Die Stimulation erfolgte in serumhaltigem oder serumfreiem Medium für 5 min bis 24 h. (IL-1β: jeweils n=4; IL-6: mit Serum n=5, ohne Serum n=4; LPS: jeweils n=4)

• Abb. 16: Quantifizierung von pERK1/2 in neonatalen Ratten-Kardiomyozyten nach Stimulation mit Antikörper-Präparaten für 20 min in serumhaltigem Medium. Mit dem Wilcoxon-Rang-Test wurden signifikante Unterschiede zur Kontrolle=1 errechnet (ET-1: p=0,0156; Patienten-IgG mit PAR-Autoantikörper: jeweils p=0,0156; Kontroll-IgG: jeweils p=0,0039).

• Abb. 17: Quantifizierung von pERK1/2, TF und p67^phox in hCASMCs nach Stimulation mit Thrombin, Peptid SFLLRN oder Endothelin-1 in serumhaltigem Medium für 1 min bis 24 h. Die Fotos zeigen als Beispiel eine Stimulation mit SFLLRN (M: Molekulargewichtsmarker, Ko: A. dest.-Kontrolle 10 min).

• Abb. 18: Quantifizierung von TF, pERK1/2 und p67^phox in hCASMCs nach Stimulation mit IL-1β. Die Stimulation erfolgte in serumhaltigem Medium für 5 min bis 24 h mit IL-1β-Konzentrationen von 1-50 ng/ml. (n=4)

• Abb. 19: Quantifizierung von TF, pERK1/2 und p67^phox in hCASMCs nach Stimulation mit IL-6. Die Stimulation erfolgte in serumhaltigem Medium für 5 min bis 24 h mit IL-6-Konzentrationen von 1-50 ng/ml. (TF: n=2; pERK1/2: n=4; p67^phox: n=4)

• Abb. 20: Quantifizierung von TF, pERK1/2 und p67^phox in hCASMCs nach Stimulation mit LPS. Die Stimulation erfolgte in serumhaltigem Medium für 5 min bis 24 h mit LPS-Konzentrationen von 0,1-50 µg/ml. (n=4)

• Abb. 21: Quantifizierung von pERK1/2 in hCASMCs nach Stimulation mit Antikörper-Präparaten für 20 min in serumhaltigem Medium

• Abb. 22: Aggregometrie mit PRP und gewaschenen Thrombozyten. Stimulanzien waren Collagen bzw. ADP. Statistische Auswertung mit dem Mann-Whitney-Test. (Kontrolle: n=45 für PRP, n=10 für gew. Tbz.; Collagen: n=27 für PRP, n=10 für gew. Tbz.; ADP: n=44 für PRP, n=3 für gew. Tbz.)

• Abb. 23: Aggregation gewaschener Thrombozyten mit und ohne Verwendung von Apyrase. Statistische Auswertung mit dem Mann-Whitney-Test.

• Abb. 24: Aggregometrie mit PRP und gewaschenen Thrombozyten. Stimulanz war das Peptid SFLLRN in den angegebenen Konzentrationen. Statistische Auswertung mit dem T-Test für ungepaarte Stichproben (0,9 % NaCl: p=0,006; 3 µM SFLLRN: p=0,002; 10 µM SFLLRN: p<0,0001).

• Abb. 25: Aggregation, Serotonin-Freisetzung und Slope in Abhängigkeit der Konzentration von Thrombin, SFLLRN bzw. YFLLRN bei gewaschenen Thrombozyten. (Thrombin: n=7, SFLLRN: n=7, YFLLRN: n=2)

• Abb. 26: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 1 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

• Abb. 27: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 2 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

• Abb. 28: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 3 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

• Abb. 29: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 4 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

• Abb. 30: Vergleich des Antikörperpräparats von Patient 5 mit Präparaten von Kontrollpersonen im Einfluss auf Thrombozyten-Aggregation und –Serotonin-Freisetzung unter Verwendung unterschiedlicher Thrombozytenspender

• Abb. 31: Wirkung von Antikörperpräparaten auf vorstimulierte Thrombozyten. Es wurden drei verschiedene Thrombozytensuspensionen verwendet, jeweils dieselbe für Ko. 1 und Pat. 4, für Ko. 2 und Pat. 4 bzw. für Ko. 5 und Pat. 5. Fehlende Säulen entsprechen dem Wert 0.

• Abb. 32: Anteil von HLA-DR+/CD14+ Zellen in Monozytenpräparationen, ermittelt durch Messungen am FACS.

• Abb. 33: Vergleich der Lumineszenz-Intensität von Lucigenin und MCLA. Monozyten wurden mit 800 nM PMA zur Bildung von Sauerstoffradikalen angeregt. Von jedem Messwert wurde der Wert ohne PMA subtrahiert. (n=1, Doppelbestimmung)

• Abb. 34: Abhängigkeit des Lumineszenz-Signals von MCLA-Konzentration und Zellzahl. Monozyten wurden mit 800 nM PMA zur Bildung von Sauerstoffradikalen angeregt. Von jedem Messwert wurde der Wert ohne PMA subtrahiert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus drei Versuchen (maximaler SEM-Wert 0,16).

• Abb. 35: Superoxidanion-Messung von PMA-stimulierten Monozyten mit und ohne Vorinkubation für 1 h mit IgG von Patient 11 bzw. Kontrolle 6

• Abb. 36: Sauerstoffradikal-Bildung von PMA-stimulierten Monozyten nach einstündiger Vorinkubation mit IgG von Patienten bzw. Kontrollen

• Abb. 37: Quantifizierung TF und pERK1/2 in Monozyten nach Stimulation mit Endothelin-1 oder Thrombin

• Abb. 38: Quantifizierung von TF und pERK1/2 in Monozyten nach Stimulation mit IgG von Kontrolle 3. Die Werte wurden normiert, so dass die Negativkontrolle (A. dest.)=1 ist.

• Abb. 39: Quantifizierung von TF und pERK1/2 in Monozyten nach Stimulation mit IgG von fünf Kontrollen und sechs Patienten. Die Werte wurden normiert, so dass die Negativkontrolle (A. dest.)=1 ist.

• Abb. 40: Quantifizierung von TF und pERK1/2 in Monozyten nach Stimulation mit Eluat bzw. Durchfluss affinitätschromatografisch aufgereinigter Antikörper-Präparationen von zwei Patienten. Die Werte wurden normiert, so dass die Negativkontrolle (A. dest.)=1 ist.