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Kapitel 2. Patienten, Material und Methoden

2.1 Patienten

Dieser Studie beschäftigt sich mit einer lokalen Epidemie durch Fasciola hepatica in La Palma, einem Ort in der Provinz Pinar del Rio im Osten Kubas. Nach Angaben der Gesundheitsbehörden kann der Zeitpunkt der Infektion auf eine Salatmahlzeit am Neujahrsabend 1994/95 zurückgeführt werden.

In dieser Region Kubas gehört Salat nicht zu den alltäglichen Nahrungsmitteln, so dass man davon ausgehen kann, dass die meisten Familien diesen Neujahr zu sich genommen haben.

Der Verkäufer fuhr mit einem Handwagen durch das Dorf wobei er seine Ware durch Rufe angeboten hat, noch ein Jahr später lässt sich seine Route anhand der erkrankten Patienten zum Teil nachvollziehen. Zwei Monate nach Verkauf des befallenen Salates waren nahe zu 200 Personen an einem febrilen Eosinophilie-Syndrom erkrankt was den Verdacht auf akute Fasziolose nahe legte. Das örtliche Krankenhaus sah sich genötigt Ärzte und Pflegepersonal zu den Patienten zu schicken da im Krankenhaus nicht genügend Betten zur Verfügung standen, sie wurden in Ihrem Wohnungen medizinisch versorgt (persönliche Kommunikation des Klinikleiters Dr. Míllan). Die von uns behandelte Gruppe von 81 Personen ist nur ein Teil der insgesamt infizierten Population, da durch vorangegangene Therapien, und durch Spontanheilung viele Patienten bereits geheilt wurden Die Patienten berichteten den befallenen Kopfsalat sehr gut gewaschen zu haben. Einige Patienten der Studienpopulation berichten keinerlei Salat oder Gemüse zu sich genommen zu haben. Hier besteht auch die Hypothese, daß das Leitungswasser nicht immer ausreichend geklärt wurde. 51 weibliche und 30 männliche Patienten, im Alter von 15 bis 81 Jahren wurden in die Studie aufgenommen. Bedingung zur Aufnahme der Patienten in die Therapiestudie war, dass mindestens eine Therapie mit Antihelminthika fehlgeschlagen war. Die Patienten hatten teils auf Eigeninitiative versucht sich mit folgenden, fasciolid wirkenden Medikamenten zu therapieren: Metronidazol, Praziquantel, Bithinol, Mebendazol, Thiabendazol, und Levamisol. (siehe auch Kap. 3.2.)

Der Leiter der Inneren Abteilung des Instituto de Medicina Tropical, Dr. Millán und

Dr. Richter vom Institut für Tropenmedizin, Berlin reisten zu einer Erstversammlung nach

La Palma um die Dorfbevölkerung über die Erkrankung, Folgeerscheinungen und Therapiemöglichkeiten aufzuklären.

15Im örtlichen Krankenhaus wurden Stuhlproben vor Beginn der Studie gesammelt und zur Untersuchung nach Havanna gesandt. Patienten die bereits eine antihelminthische Therapie durchgeführt hatten und wiederum Fasciola hepatica Eier in der Stuhluntersuchung zeigten wurde die Möglichkeit eröffnet im Instituto de Medicina Tropical an einer Therapie mit Triclabendazol teilzunehmen. Dort wurde das schriftliche Einverständnis der Patienten nach den Prinzipien der Helsinki- Deklaration eingeholt. Zum Zeitpunkt des Studienbeginns, im September 1995 waren die meisten Patienten bis auf abdominelle Schmerzen (7), Pruritus (3), Schmerzen im rechten Oberbauch (3), Diarrhoe (1), Urticaria (1), asymptomatisch, nach zum Teil langer akuter Fasziolose, mit hohem Gewichtsverlust, Fieber, Koliken, Urticaria, im Frühjahr 1995. Um die Folgen einer chronischen Fasziolose zu vermeiden, (Hyperplasie der Gallengänge, Cholangitis, Cholezystitis, mechanischer Gallengangsobstruktion, Gallengangskonkremente), die zum Teil erst nach Jahren auftreten, wurden auch die Patienten im Latenzstadium der Erkrankung behandelt.

2.2 Methoden

2.2.1 Klinische Untersuchung

Die Patienten wurden an den Tagen 0, 3, 7, 30, 60 einer klinischen Untersuchung unterzogen,

die folgende Parameter einschloss: Körpergewicht, Temperatur, Puls, Blutdruck, Atemfrequenz, Hepato- und Splenomegalie, Ikterus. Es wurde gezielt nach folgenden Krankheitssymptomen gefragt: Appetitlosigkeit, Übelkeit, Durchfall, Verstopfung, Oberbauchbeschwerden im rechten Quadranten, Bauchschmerzen, Intercostalschmerzen, Urticaria. Es sollten hierbei neben den klassischen Symptomen der Fasciola hepatica Infektion; rechtsseitige oder epigastrische Oberbauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Urtikaria das Augenmerk auch auf eventuelle unerwünschte Nebenwirkungen von Triclabendazol sowie auf Symptome ektoper Fasciola hepatica gerichtet werden.

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2.2.2 Laborchemische Untersuchung

An den Tagen 0, 3, 7, 15, 30, und 60 nach Medikamenteneinnahme wurden folgende

Laborparameter erhoben: Blutsenkungsgeschwindigkeit nach einer Stunde, rotes Blutbild, weißes Blutbild, Differentialblutbild, Leukozytenzählung, Eosinophilenzählung, Differantialblutbild, Serumharnstoff, Serumkreatinin, Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Alkalische Phosphatase (AP), Bilirubin.

2.2.3 Parasitologische Methoden

2.2.3.1 Stuhluntersuchung nach Kato modifiziert nach Katz

Die Methode von Kato modifiziert nach Katz bestimmt die Eimenge bezogen auf ein definiertes Volumen. Es lassen sich Aussagen über die Parasitenzahl und über die Wirksamkeit einer eingeleiteten Therapie machen. Bei sehr flüssigem Material ist diese Methode nicht anwendbar.

1. Die Stuhlprobe wurde durch ein Metal oder Nylonnetz mit 105 Perforationen pro Millimeter gegeben, um gröberes nicht verdautes Material (Pflanzenfasern) zu entfernen.
2. Eine vorgefertigte Schablone mit einem Loch in der Mitte von ca. 9mm Durchmesser wurde mit der Stuhlprobe gefüllt. Da so definierte Volumen entspricht ca. 42 mg Stuhl.
3. Die Probe wurde auf einen Objektträger aufgebracht, mit Zellophanfolie abgedeckt und leicht komprimiert.
4. Nach 2 Stunden wurden die Eier unter dem Mikroskop ausgezählt.
   Die so bestimmte Menge Eier mit 23 multipliziert, entspricht der Eimenge pro Gramm Stuhl (67).

2.2.3.2 Stuhluntersuchung nach Ritchie

Es handelt sich um ein Anreicherungsverfahren zum Nachweis von Parasiteneiern.

War die Stuhlprobe sehr fest, wurde sie mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt.

1. Die Stuhlprobe wurde durch ein doppelt geschlagenes feuchtes Gaze (Verbandmull) gepresst. 10 ml der abgepressten Flüssigkeit wurden in ein 15ml Zentrifugierröhrchen gegeben.
2. Die Probe wurde für 2 Minuten bei 1500 rpm zentrifugiert und dann dekantiert.

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3. Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung auf 10 ml, erneutes Zentrifugieren und Dekantieren.
4. Das Röhrchen wurde mit 10ml 10%iger Formollösung aufgefüllt und 5 min stehen gelassen.
5. Es wurden 5 ml Äther hinzugegeben, und 30 sec kräftig geschüttelt.
6. Das Röhrchen wurde bei 1500rpm für 2 min zentrifugiert und es schieden sich 4 Schichten ab: Oben eine Schicht Äther, dann eine Schicht Fäkalreste, dann Formalinlösung, und zuletzt ein Sediment mit Fäkalresten.
7. Die oberen Schichten wurden dekantiert, das Sediment mit der Restflüssigkeit vermischt.
8. Mit Lugolscher Lösung versetzt, wurde das Sediment unter dem Mikroskop betrachtet (63).

2.2.3.3 Sedimentationsmethode:

Auch Drei-Becher Methode genannt, bietet den Vorteil, dass größere Mengen Stuhl untersucht werden können. Im Fall der Fasziolose, mit geringer und unregelmäßiger Eiproduktion kann dies von Vorteil sein.

1. Die Stuhlprobe (ca. 15 Gramm) wurde unter fließendem Wasser durch ein doppelt gelegtes, angefeuchtetes Gaze (Verbandmull) in ein Sedimentationstrichter (500ml) filtriert.
2. Das Gefäß wurde für mehrere Stunden stehengelassen, anschließend dekantiert und erneut mit Wasser aufgefüllt.
3. Nach wiederum einigen Stunden wurde erneut dekantiert, das Sediment mit der Restflüssigkeit in ein Zentrifugierröhrchen gegeben, und anschließend 2 Minuten bei 1500 rpm zentrifugiert
4. Der Überstand wurde verworfen und das Zentrifugat unter dem Mikroskop auf Parasiteneier untersucht (56).

2.2.4 Immunparasitologische Methoden

2.2.4.1 Spezifische Antikörperbestimmung mittels ELISA

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay wurde mit Polyvinyl Platten ausgeführt.

1. Das Antigen wurde in 0,06 M Karbonatpuffer verdünnt (ph 9,6 bei einer Konzentration von 4 µg/ml) und 0,1 ml wurden in jede Vertiefung eingebracht.

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2. Die Platte wurde versiegelt, bei 37°C 4 Stunden inkubiert und über Nacht bei 4°C gelagert.
3. Das nicht adsorbierte Antigen wurde durch Schütteln und Drehen der Platten entfernt. Jede Vertiefung wurde dann 3 mal für 3 min mit 0,01 PBS (pH 7,1) gewaschen.
4. Das Serum wurde 1:16 in PBS/Tween verdünnt. 0,1 ml wurden in jede Vertiefung gegeben und bei 37°C für eine Stunde in einem Wasserbad inkubiert.
5. Der unadsorbierte Antikörper wurde, wie unter 3.) beschrieben ausgewaschen.
6. Ein Meerrettich-Peroxidase Konjugat gegen IgG wurde 1:10.000 verdünnt und jeweils 1 ml in jede Vertiefung gegeben und für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
7. Die Platten wurden wie unter 3.) beschrieben gewaschen.
8. Das Substrat (ODP) wurde durch Lösung von 10 mg ODP in 10ml Methanol vorbereitet um eine Vorratslösung herzustellen. Einem Milliliter dieser Vorratslösung wurde 99ml Wasser mit 3% H²O² zugesetzt.
9. Jeder Vertiefung wurden 0,1 ml dieser Arbeitslösung zugesetzt und bei Dunkelheit und Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert.
10. Die Farbreaktion wurde durch 0,025 ml 8 N Schwefelsäure beendet.
11. Die Platten werden bei 490 nm in einem ELISA Autoreader abgelesen (101).

2.2.4.2 Bestimmung exkretorisch-sekretorischer Antigene im Stuhl

Es handelt sich hierbei um einen enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), der einen

monoklonalen Antikörper zum Aufsuchen exkretorisch-sekretorischer Antigene von Fasciola hepatica im Stuhl benutzt. Die Methode wurde von A.M.Espino und C.M.Finlay am Instituto Pedro Kouri entwickelt. Zur Untersuchung wurde die Stuhlprobe mit 3 Teilen phosphatgepufferter Salzlösung versetzt, anschießend homogenisiert und bei 900g 3 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und bei -20 °C gelagert.

Antigengewinnung:

Fasciola hepatica Antigene wurden von adulten Egeln gewonnen. Nach vierfacher Waschung in physiologischer Salzlösung wurden die Egel in einem sterilen Kulturmedium (RPMI 1640) dem Penicillin und Streptomycin zugesetzt sind, 24 Stunden bei 37°C inkubiert und dann zentrifugiert (1500g für 10 min bei 4°C). Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Lowry bestimmt (83).

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Ein Milligramm des ES Antigens wurde im gleichen Volumen Freundsches Adjuvant emulgiert und einem Kaninchen subcutan injiziert. Nach 15, 21, und 28 Tagen wurde die halbe Dosierung subcutan nachinjiziert. Eine Woche nach der letzten Injektion wurde Blut abgenommen und mittels Prezipitation IgG gewonnen.

Elisa:

Der Elisa wurde in Einmal-Polystyrenplatten durchgeführt. ES Antigene wurden in 0,05 M Karbonatpufferlösung bei pH 9,6 verdünnt. 100µl des Antigens pro Feld wurden zugegeben und für 16h bei 4°C belassen. Nach dreimaligem Waschen wurden 150µl von 1,5 % Serum- Albumin zugegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Platten geleert, mit Tween 20 befüllt und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach sechsmaligem Waschen wurden 100µl Enzymkonjugat hinzugegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach weiterem sechsmaligem Waschen wurde Substrat (H²O², 0,1M Zitratpuffer, Phenylendiamin-HCL) zugegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubiert und die Reaktion wurde mit 50µl 12,5% Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption wurde in einem 492 nm Titertek-multiscan-reader gemessen

2.2.5 Ultraschalluntersuchung

Technische Ausstattung:

Die Ultraschalluntersuchung wurde mit einem tragbaren Fukuda FF-Sonic UF-4500 Gerät mit einem 3,5 MHZ curved array und einem 5 MHZ linear Schallkopf durchgeführt.

Zur Dokumentation standen ein Thermopapierdrucker Sony, Japan und ein Videogerät Toshiba, Japan zur Verfügung. Das Videogerät wurde eingesetzt um aktive Bewegungen der Fasciola hepatica zu dokumentieren. Um die Untersucher zu trainieren wurden durch Dr. Richter adulte, tote Fasciola hepatica Würmer in einem Wassercontainer mit 3,5; 5; und 7,5 MHZ Schallköpfen untersucht.

Untersuchungvorgang:

Das Gallengangssystem der Patienten wurde zunächst nüchtern und zusätzlich nach einer fettreichen Mahlzeit untersucht, um die Gallenblasenfunktion zu überprüfen.

Alle Patienten wurden mindestens einmal in Rücken-, Links- und Rechtsseitenlage, sowie in sitzender Position untersucht, um mögliche Auffälligkeiten im Gallenblasenlumen

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1.) Gallengänge:

Die intra- und extrahepatischen Gallengänge wurden soweit darstellbar bis in die Peripherie untersucht. Ein extrahepatischer Ductus hepato-choledochus (DHC) größer als 6mm und ein intrahepatischer DHC größer als 5mm wurde für pathologisch erachtet. Bei choleszyst-ektomierten Patienten entsprechend 9 mm extrahepatisch und 8 mm intrahepatisch (97).

2.) Gallenblase:

Länge, Breite und Wanddicke der Gallenblase, Bestandteile, Größe der Bestandteile, Konkremente, Fasciola hepatica-ähnliche Bestandteile, Gallenblasengries, aktive oder passive Bewegung der Bestandteile, ferner wie lange der Patient nüchtern war, oder welche Art von Nahrung er aufgenommen hatte, wurden dokumentiert. Der 5 MHZ Schallkopf erwies sich für die Gallenblasensonographie als sehr hilfreich. Bei den in der Mehrzahl schlanken Patienten wurde durch die höhere Auflösung vielfach eine Diagnosestellung erst möglich.

An den Tagen 0, 7, 15, 30 und 60 wurden zusätzlich zu 1. und 2. folgende Organe untersucht:

3.) Leber:

Das Leberparenchym wurde auf Echogenitätsveränderungen und erweiterte intrahepatische

Gallengänge untersucht. Eine Größenbestimmung wurde in der Parasternallinie, sowie in der Hemiclavearlinie durch Messung der kraniokaudalen Länge und Tiefe ermittelt.

Der Durchmesser der Pfortader wurde am Leberhilus unter Vermeidung eines Valsalva Manövers gemessen.

4.) Milz:

Die Milz wurde im subkostalen Flankenschnitt in der Hilusschnittebene auf größte Ausdehnung in 3 Ebenen vermessen.

5.) Pankreas:

Der Pankreas wurde auf Obstruktion oder Parenchymveränderungen untersucht.

Pankreaskopfdurchmesser und ein erweiterter Ductus Pancreaticus wurden dokumentiert.

6.) Sonstiges:

Ein Perikard- oder Pleuraerguss oder sonographisch sichtbare Veränderungen der Nieren

wurden erfasst.

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Score 0: Normalbefund: 0 Punkte

Score 1: unspezifische Sonographiebefunde: 1-2 Punkte

Milz:Länge >11cm und Tiefe >4cm, und /oder Leber: im kranio-kaudalen Durchmesser in PSL > 11cm,oder in der rechten Hemiclavearlinie >14cm.

Score 2: unspezifische Gallengangsveränderungen: >2 Punkte

Bei Diagnose einer der unten aufgeführten Veränderungen 3 Punkte.Wenn mehr als eine Veränderung diagnostiziert werden konnte wurde jeweils ein halber oder ein Punkt addiert.

+1 sonographisch gesteuerter Murphy positiv

+1 Erweiterter Ductus hepato-choledochus (DHC),intrahepatisch > 5mm, extrahepatisch >6mm, periphere Gallengänge > 2mm.

+1/2 geringe Gallengangserweiterung nach Therapie, Normwerte nicht übersteigend.

+1 Gallenblase länger als 10cm und breiter als 4 cm.

+1 behinderte Gallenblasenkontraktilität (Verkleinerung des Gallenblasenvolumens nüchtern* und nach einer fettreichen Mahlzeit kleiner als 50%.

+1 Gallenblasenwand nüchtern* dicker als 3 mm.

+1 Gallensteine.

+1 Gallenblasengries bei Lagewechsel der Gravitation folgend.

Score 3: verdächtige Sonographiebefunde: 15 Punkte

Bei Diagnose einer der unten aufgeführten Veränderungen 15 Punkte. Wenn mehr als eine Veränderung diagnostiziert werden konnte wurde jeweils ein Punkt addiert.

+1 geformter Gallenblasengries.

+1 schwebender Gallenblasengries (nicht der Gravitation folgend).

+1 Fasciola hepatica ähnliche Bestandteile (halbmondförmig)

+1 andere Bestandteile in den Gallengängen.

+1 netzartige Leberfibrose.

Score 4: pathogonomisch für Fasciola hepica: 25 Punkte

Bei Diagnose einer der unten aufgeführten Veränderungen 25 Punkte. Wenn mehr als eine Veränderung diagnostiziert werden konnte wurde jeweils ein Punkt addiert.

+1 spontan sich bewegende Fasciola hepatica.

+1 wandständige Fasciola hepatica.

* nüchtern länger als 8 Stunden (Kaffee und Zigarette eingeschlossen).

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2.2.6 Statistische Methoden

Alle erhobenen Werte wurden mittels deskriptiver Statistik analysiert. Eine vergleichende Studie (Doppelblindstudie) war aus ethischen Gründen nicht geplant.

Die Vitalparameter, hämatologische- und biochemische Parameter wurden zum Teil als Tabelle und zum Teil als Box-Whisker Plots dargestellt. Die obere bzw. untere Grenze der Box sind durch das obere bzw. untere Quartil gegeben. Die Linie innerhalb der Box gibt den Median wieder. Ausreißer (zwischen 1-3 Box Längen vom Median entfernt) werden durch ein ° wiedergegeben. Extremwerte (mehr als 3 Box Längen vom Median entfernt) werden durch ein * wiedergegeben. Die äußeren Striche geben den kleinsten bzw. größten Wert an, der nicht als Ausreißer eingestuft wurde. Folgende Daten wurden nach Geschlechtern getrennt betrachtet: Hämoglobin (Serum) Hämatokrit, Erythrozytensedimentation, Gewicht. Gewicht und Körpertemperatur der Aufnahmeuntersuchung wurden als Tabelle mit Median, Minima, Maxima, sowie Perzentilen (25,75) dargestellt. Parasitologische Parameter wurden als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt. Bei nicht-normalverteilten Stichproben kam zur Signifikanzberechnung der Laborparameter vor und nach Therapie der Wicoxon-signed-rank Test zur Anwendung. Als Irrtumswahrscheinlichkeit wurde das 5% Niveau veranschlagt, d.h. ein p-Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Statistische Berechnungen und Box Whisker Plots wurden mit SPSS 7.5 for Windows, Spss Inc. erzeugt, alle anderen Diagramme mit Microsoft Excel 5.0.

Zur Verarbeitung der sonographischen Daten wurde ein Score entwickelt.

Score 0: keine pathologischen Befunde.

Score 1: unspezifische Veränderungen an Leber oder Milz.

Score 2: unspezifische Veränderungen der Gallenwege.

Score 3: Fasciola hepatica-verdächtige Veränderungen.

Score 4: Pathognomonische Veränderungen.

Der Score wurde für Tag 0 (vor Therapie),Tag 7 (nach Therapie), und Tag 60 ermittelt, und als Perzentile graphisch dargestellt.

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2.2.7 Studiendesign

Dies ist eine offene Phase II Therapiestudie um die Sicherheit und Effektivität von Triclabendazol bei therapieresistenten Infektionen mit Fasciola hepatica zu untersuchen.

Die Studie wurde an einem Zentrum (Instituto de medicina tropical Pedro Couri, Havanna, Kuba) durchgeführt. Ein 7-tägiger stationärer Aufenthalt zur Überwachung medikamenten- bedingter Nebenwirkungen sowie Folgewirkungen der Wurmexpulsion, wurde durch ambulante Nachuntersuchungen an den Tagen 15, 30, und 60 komplettiert

Bedingungen zur Aufnahme der Patienten in die Therapiestudie

Einschlusskriterien:

Männliche oder weibliche Patienten mit einem Körpergewicht von minimal 20 Kg die wenigstens eine antihelminthische Therapie gegen Fasciola hepatica erfolglos eingenommen hatten. Die antihelminthische Therapie musste wenigstens 30 Tage vor Beginn der Triclabendazoltherapie beendet worden sein, um eventuelle Wechselwirkungen auszuschließen. Die Sicherung der Diagnose erfolgte durch mikroskopische Stuhluntersuchungen auf Fasciola hepatica Eier mittels Kato-Katz, Ritchie-, oder Sedimentationstechnik.

Ausschlusskriterien:

Andere Studienmedikamente oder Fasziolide innerhalb der letzten 30 Tage vor Studienbeginn, eine schwere Anämie mit einem Hämoglobinwert < 5 mg%, Patienten mit Symptomen oder Zeichen einer schweren Lebererkrankung anderer Genese wie zum Beispiel bei Alkoholabusus, Hepatitis oder Tumorleiden, Überempfindlichkeit oder Allergie auf Triclabendazolderivate, Patienten mit schwerer renaler, kardialer oder anderer Organdysfunktion (Ausschlusskriterium ein um den Faktor 2,5 über dem Grenzwert liegender Laborwert), schwangere Frauen oder stillende Mütter.

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