1 Einleitung

1.1 Grundzüge des Immunsystems

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Als wirksamen Schutzmechanismus vor Viren, Bakterien, Parasiten und Pilzen haben Vertebraten, insbesondere Säugetiere, das Immunsystem entwickelt. Das Immunsystem kann in eine angeborene und eine adaptive Immunität unterteilt werden. Die angeborene Immunität kann unspezifisch auf eindringende Pathogene reagieren und dient der frühen Abwehr. Diese Art der Immunität hat den Nachteil, dass es viele pathogene Keime nicht erkennt und kein immunologisches Gedächtnis entwickelt. Wesentlich spezifischer reagiert das System der adaptiven Immunität. Dieser hochentwickelte Teil des Immunsystems bildet das immunologische Gedächtnis aus und bietet dem Organismus dadurch einen Schutz vor Reinfektionen, welche durch das immunologische Gedächtnis schneller bekämpft werden können.

Die angeborene Immunität wird über Makrophagen, NK- Zellen und Granulozyten vermittelt. Sie entstehen im Knochenmark aus hämatopoetischen Zellen. Ihre Hauptmechanismen sind Phagozytose von Pathogenen und Antigen- Präsentationen gegenüber den Zellen der adaptiven Immunität des Immunsystems.

Die Zellen der adaptiven Immunität sind die Lymphozyten, es werden B- und T- Lymphozyten unterschieden. Durch die Aktivierung der adaptive Immunität, durch Antigen- präsentierenden Zellen (APC), differenzieren die Lymphozyten in Effektorzellen. Ein Teil dieser differenzierenden Zellen werden keine Effektorzellen, sondern Gedächtniszellen („Memory“ Zellen), welchen bei erneuter Infektion mit dem gleichen Pathogen eine sehr viel schnellerer Immunantwort auslösen. B- Lymphozyten reifen im Knochenmark, und T- Lymphozyten im Thymus. welche durch eine zufällige Rekombination von Gensegmenten eine sehr hohe Diversität der leichten und schweren Ketten erhalten, den T- Zell- Rezeptor (TZR). T- Zellen erkennen und eliminieren infizierte Zellen, außerdem werden andere zelluläre Bestandteile, wie Makrophagen und B- Zellen durch T- Zellen in ihrer Funktion unterstützt. Die beschriebene Rekombination der Gensegmente führt nicht nur zu der hohen Diversität, sondern auch zu der Gefahr, dass Zellen Selbst- Antigene erkennen und gegen den Organismus vorgehen. Um dieser Gefahr der Selbsterkennung zu entgehen gibt es im Thymus eine negativ und positiv Selektion der T- Zellen. Dabei werden T- Zellen deren TZR eine zu starke Autoreaktivität zeigen an dieser Stelle eliminiert [2 ];[3 ]. Diesen Mechanismus der eine gewisse Unreaktivität hervorruft nennt man zentrale Toleranz. Einige autoreaktive T- Zellen entkommen aber im Thymus dem Mechanismus der zentralen Toleranz. Für diesen Fall gibt es in der Peripherie die periphere Toleranz. Dieser Mechanismus beruht auf Ignoration von Selbst- Antigenen, sowie klonale und anerge Eliminierung von autoreaktiven T- Zellen [4 ]; [5 ]; [6 ]. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass an Orten von dominanter Toleranz bestimmte T- Zell Typen auftreten, welche die Autoreaktivität aktiv unterdrücken (vgl. 1.2). Ein Fehler in dem Mechanismus der zentralen und peripheren Toleranz führt zu Autoimmunerkrankungen, wie Diabetes Typ 1, Multipler Sklerose und rheumatischen Arthritis [7 ].

1.2 CD4+CD25+Foxp3+ T- Lymphozyten – regulatorische T- Zellen (Tregs)

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In den frühen 70er Jahren wurden zum ersten Mal „suppressorische/regulatorische Zellen“ [8 ]; [9 ] im Zusammenhang mit Toleranz erwähnt, belegt durch dominante Toleranz in thymektomierten Mäusen. Da aber keine eindeutigen Beweise, wie Marker und Art der Wirkungsweise gezeigt werden konnten, wurde dieser Zelltyp zu diesem Zeitpunkt sehr kontrovers diskutiert [10 ]. Erst durch die Beschreibung des Oberflächenmarkers CD25 durch Sakaguchi und Mitarbeiter im Jahre 1995 [11 ] rückte dieser Zelltyp wieder in den Fokus und wird seit dem als „regulatorische T- Zelle“ (Treg) beschrieben. In der Arbeit von Sakaguchi konnte gezeigt werden, dass 5-10% der CD4+ T- Zellen den Öberflächenmarker CD25 exprimieren. Diese CD4+CD25+ T- Zellen konnten, im Gegensatz zu CD4+CD25- T- Zellen, Dosis- abhängig „graft- versus- Host“ Autoimmunerkrankungen verhindern. Im weiteren Verlauf der Forschung konnte T- Lymphozyten mit suppressorischen Eigenschaften eine entscheidende Funktion in verschiedenen Immunreaktionen zugeschrieben werden. Hierzu gehört vor allem die Vermittlung von Toleranz [12 ]; [13 ] in der Autoimmunität [14 ]; [15 ]; [16 ], wie z.B. in der Tumorentwicklung [17 ]; [18 ] und in Entzündungsreaktionen [19 ]; [20 ]; [21 ]; [22 ]. Neben dem Marker CD25 wurden noch weitere Moleküle beschrieben welche auf der Oberfläche von Tregs exprimiert werden. Hierzu gehören Faktoren, wie CTLA-4 (engl. Cytolytic T lymphocyte- associated antigen 4) [23 ] und GITR (engl. Glucocorticoid- induced TNF receptor) [24 ]. Diese Moleküle werden allerdings nicht nur auf Tregs exprimiert, sondern im Verlaufe der Aktivierung von T- Zellen, auf diesen Zellen ebenfalls exprimiert. Dieser Umstand führt dazu, dass man mit dieser Oberflächenmarker nicht zwischen Tregs und aktivierten Zellen unterscheiden kann. Dieser Umstand führt dazu, dass nach weiteren Marker für Tregs geforscht wurde. In diesem Zusammenhang konnten die Oberflächenmoleküle CD103 [25 ], Neuropilin-1 [26 ] und GPR 83 (engl. G- protein coupled receptor 83) [27 ] als potentielle Kandidaten aufgezeigt werden.

Abbildung 1: Übersicht zur Entstehung von CD25 + CD4 + T- Zellen in Thymus und Peripherie

Regulatorische CD4+ T- Zellen können im Thymus und der Peripherie entstehen. Die genauen Bedingungen der Entwicklung und das Zusammenspiel der einzelnen entstandenen T- Zellen sind noch nicht weiter beschrieben worden. Thymus generierte Tregs, auch bekannt als natürliche Tregs oder CD4+CD25+ Tregs entstehen im Thymus. Durch eine Kombination aus TZR Stimulus und kostimulatorischen Signalen. In der Peripherie entstandene Tregs, z.B. Tr1- oder Th3- Zellen, werden durch eine Vielzahl von Bedingungen erzeugt. CD4+Foxp3- T- Zellen können in vitro durch die Gabe von TGF-β in Foxp3+ Tregs konvertiert werden. Abbildung aus Fehervari et al. 2005 [28 ].

Der bedeutendste Faktor zur Diskriminierung von Tregs wurde im Jahre 2001 charakterisiert, dabei handelt es sich um den Transkriptionsfaktor Foxp3 (engl. Forkhead- box- factor P3). Foxp3 ist zuerst in der „scurfy“ Maus [29 ]; [30 ]; [31 ] beschrieben worden. Diese Maus trägt eine deletierende Mutation im Gen für Foxp3, was zur Folge hat, dass kein vollständiges Foxp3 Protein translatiert wird. Auf Grund dieser Mutation werden in der Maus zahlreiche Autoimmunerkrankungen ausgebildet. Der Phänotyp der „scurfy“- Maus kann durch die Überexpression von Foxp3 oder den adaptiven Transfer von CD4+CD25+ T- Zellen gerettet werden [32 ]; [23 ]. Diese Experimente zeigten, dass es sich bei den Transkriptionsfaktor Foxp3 um den „Mastertranskriptionsfaktor“ für Tregs handelt. Weiterhin wurde gezeigt, dass T- Zellen, welche durch ein Knock- In von dem Reportergen eGFP bzw. eYFP kein Foxp3 exprimieren können, sogenannte „wannabe- Tregs“, eine normale T- Zellreifung im Thymus durchlaufen, aber auf Grund fehlender Foxp3- Expression keine suppressorischen Eigenschaften zeigen [33 ]; [34 ]. Im humanen System ist die Autoimmunerkrankung IPEX (immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X- linked), die ebenfalls auf Mutationen im Foxp3- Gen zurückzuführen ist, beschrieben [35 ]. IPEX- Patienten zeigen die gleichen Autoimmunerkrankungen, wie die „scurfy“- Maus. Die phänotypische Analyse und funktionelle Studie von Foxp3+ T-Zellen gestaltet sich allerdings sehr schwierig, da Foxp3 als Transkriptionsfaktor im Kern lokalisiert ist und nur durch interzellulare Färbungen nachgewiesen werden kann. Durch die Entwicklung von Reportermäusen [36 ]; [37 ]; [38 ]; (140); (32); (60) sind auch diese Studien möglich.

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Wie in Abbildung 1-1 dargestellt können Tregs im Thymus und in der Peripherie entstehen. Die CD4+CD25+ Tregs, welche im Thymus entstehen, werden als natürlichen Tregs bezeichnet. Analysen zeigen, dass Tregs während der positiv und negativ Selektion entstehen. Es handelt sich dabei um T- Zellen, welche eine gewisse Autoreaktivität besitzen, aber der Eliminierung entkommen [39 ]; [40 ]. In der Peripherie entstehen die sogenannten induzierten Tregs, welche durch die Anwesenheit von TGF-β und/oder Antigen induziert werden [41 ]; [42 ]; [43 ], (66). Eine charakteristische Eigenschaft von Tregs ist die oben erwähnte Unterdrückung der Aktivität von Effektor- T- Zellen zur Vermittlung von Toleranz. Tregs supprimieren in vitro die Proliferation von CD4+CD25- T- Zellen. Diese Suppression erfolgt Zell- Zell- Kontakt abhängig und benötigt die Zugabe von exogenen IL-2 [44 ]. CD4+CD25+ Tregs können, obwohl sie ihre suppressorische Aktivität nur durch antigen- spezifisch oder CD3- vermittelte Aktivierung erlangen, antigen- unspezifisch die Proliferation von CD4+ und CD8+ T- Zellen unterdrücken [45 ]; [46 ].

Neben den CD4+CD25+ regulatorischen T- Zellen wurden noch weitere Zelltypen mit regulatorischem Potential beschrieben. Dazu gehören die TGF-β produzierenden Th3- Zellen [47 ], die IL-10 sekretierenden Tr1 Zellen [48 ] sowie CD8+ T- Zellen [49 ]. Diese Zellarten werden in dieser Arbeit nicht weiter berücksichtigt.

1.3 Regulation und Funktion des Transkriptionsfaktors Foxp3

1.3.1  Regulation der Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3

Die Regulation des Transkriptionsfaktors Foxp3 ist für die Funktion von Tregs von entscheidender Bedeutung. Wie schon am Ende des Abschnittes 1.2 beschrieben, entwickeln sich T- Zellen im Thymus bis zu einem gewissen Punkt in die Richtung möglicher Tregs, fehlt allerdings in der weiteren Differenzierung der Transkriptionsfaktor Foxp3 entstehen keine Tregs [33 ]; [34 ].

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Ein wesentlicher Bestandteil der Regulation der Foxp3- Expression ist das T- Zell Rezeptor- Signal (kurz TZR- Signal). Durch die Stimulation des TZR wird die Signalkaskade über die bekannten beteiligten Faktoren, wie die Kinasen Lck oder MAPKs oder den Faktor Ras aktiviert [50 ]. Im Zusammenhang mit der Aktivierung der Foxp3- Expression sind vor allem die Faktoren Phospholipase C-γ [51 ] und der Linker für Aktivierung von T- Zellen (LAT) [51 ], welche wichtige Bestandteile des TZR- Signalweges sind, beschrieben worden. Am Ende der resultierenden Signalkaskade ist die genaue Aktivierung der Expression von Foxp3- Gens noch nicht beschrieben worden. Im humanen Lokus konnte von Mantel et al [52 ] der „core“- Promoter identifiziert worden. In diesem Bereich wurden auch Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren NFAT und Ap-1 aufgezeigt. Die Bindung der beiden Faktoren an den Promoter ist für die Expression des humanen Foxp3- Gens [52 ] von entscheidender Bedeutung. Im murinen System konnte diese Aussage bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht gezeigt werden. Hier scheint die Bindung von NFAT an den Foxp3 Lokus eher keine Rolle zu spielen. Der Doppel Knock- Out von NFATc2/c3 zeigte keinen Einfluss auf die murine Foxp3- Expression [53 ]. Kostimulatorische Signale spielen bei der Expression von Foxp3 eine entscheidende Rolle wie der TZR- Stimulus. Sie unterstützen das TZR- Signal noch in seiner Aktivierung der Transkription von Foxp3. Hierbei sind die Rezeptoren und Liganden CD28, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), „programmed cell death 1“ Rezeptor (PD-1) und CD152 (CTLA-4) von bedeutender Rolle. CD80 und CD86 sind die Liganden für CTLA-4 und CD28 und ihr Zusammenspiel führt zur Induktion der Foxp3- Expression in der Peripherie und dem Thymus [54 ]; [55 ]. PD-1 wurde ebenfalls auf CD4+CD25+ Tregs gefunden [56 ] und scheint für die Expression von Foxp3 in der Peripherie wichtig zu sein und wirkt auch im Zusammenhang mit Estrogen. Estrogen kann PD-1 -abhängig und -unabhängig die Foxp3- Expression regulieren [57 ]. Auch bei den Signalwegen der kostimulatorischen Moleküle ist der Faktor, der direkt an den Foxp3- Gen- Lokus bindet, ähnlich zu dem TZR- Signal, noch nicht nähr beschrieben worden.

Als die beiden wichtigsten Faktoren für die Foxp3- Expression wurden in vielen Arbeiten IL-2 und TGF-β postuliert. Für IL-2 ist vor allem im humanen System beschrieben worden, die Foxp3- Expression über den STAT- abhängigen Signaltransduktionsweg zu induzieren [58 ]. Genauer gesagt induziert die Bindung des IL-2 an den IL-2- Rezeptor die Bindung von STAT3 und STAT5 im Bereich des ersten Introns des humanen foxp3- Lokus. Im murinen System ist die Rolle von IL-2 für die Induktion der Foxp3- Expression umstritten. Es werden indirekte und direkte, sowie IL-2 abhängige und unabhängige Systeme vorgestellt [59 ]; [60 ]; [61 ]; [62 ]. Burchill et al. [63 ] beschrieb für das murine System einen ähnlicher Mechanismus, wie für das humane System beschrieben worden ist (38). In dieser Arbeit wurde beschrieben, dass der IL-2 Rezeptor β STAT5 vermittelt, die Foxp3- Expression induziert. An diesen Rezeptor kann neben IL-2 auch IL-15 binden. IL-15 kann in den IL-2 -/- Tieren die die IL-2 Defizienz kompensieren. Durch diesen Umstand kann der Eindruck entstehen, dass die Induktion der Expression IL-2 abhängig und unabhängig ist (43).

Vor allem bei der Induktion von Foxp3 in vitro spielt TGF-β eine entscheidende Rolle. Neben unseren eigenen Arbeiten [1 ] konnten mehrere Arbeitsgruppen die Rolle von TGF-β bei der Induktion der Foxp3- Expression zeigen [64 ]; [65 ]; [66 ]; [67 ]; [68 ]. TGF-β induziert die Phosphorylierung der SMAD- Faktoren, welche dann an den Lokus des murinen Foxp3 binden können [69 ]; [70 ]; [71 ]. In der Arbeit von Tone et al. [71 ] konnte gezeigt werden, dass TGF-β im Zusammenspiel mit dem TZR- Signal einen Enhancer im ersten Intron des murinen foxp3- Lokus aktiviert, welche die Expression des Foxp3- Gen induziert. Weiterhin wurde beschrieben, dass durch TGF-β induzierte Foxp3- Proteine die Expression von SMAD7 unterdrücken [28 ] und somit den Einfluss von TGF-β verstärkt wird (positiver autoregulatorischer Loop). Retinolsäure („Retonic Acid“; RA) kann die Induktion von Foxp3 in Tregs verstärken ([72 ]; [73 ]; [74 ]; [75 ]. Gandhi et al. [76 ] konnten zeigen, dass unreife dendritische Zellen TGF-β und LAP (latency- associated peptide) auf ihrer Oberfläche exprimieren, was dazu führt, dass die Proliferation von Th1- Zellen inhibiert wird und Tregs induziert werden. Weiterhin konnte in Kang et al. [77 ] eine Verbindung von RA vermittelter Foxp3- Induktion im Zusammenhang mit Histon- Acetylierung im „core“- Promoter des foxp3- Lokus aufgezeigt werden. Dieser Umstand zeigt eine Beteiligung von Histon- Modifikationen an der Expression von Foxp3, welches im Zuge dieser Arbeit weiter analysiert wird.

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Weiteren Einfluss auf die Foxp3- Expression haben Toll- like Rezeptoren (TLR), vermittelt vor allem über das Adaptermolekül MyD88 [78 ]; [79 ] und IFN-γ [80 ]. Den TLR- Liganden wird auch eine Bedeutung in der Regulation der Foxp3- Expression zu geschrieben [81 ]. Ebenfalls für die Induktion von Foxp3, allerdings nur in Hemaglutinin– spezifischen Tregs, wird STAT 6 eine wichtige Rolle zu geschrieben [82 ]. Die antigen- spezifischen Tregs entstehen nur durch die simultane Stimulation über den TZR und den IL-4- Rezeptor und die daraus resultierende STAT6 Aktivierung. IL-6 ist bis zum jetzigen Zeitpunkt, als einer der wenigen Faktoren bekannt, der die Foxp3- Expression unterdrücken kann. Gezeigt wurde dieses an Hand der simultanen Stimulation von naiven Zellen mit TGF-β und IL-6, welches nicht in Induktion von Tregs resultierte, sondern die Differenzierung zu IL-17 produzierenden Th17- Zellen bewirkte [83 ].

Auf posttranskriptioneller Ebene gibt es höchstwahrscheinlich weitere Regulationsmechanismen der Expression des Foxp3- Proteins. Fontenot et al. [32 ] beschreiben eine unterschiedliche Expression von Foxp3 mRNS und Foxp3- Protein. Vor Stimulation liegen große Menge der Foxp3 mRNS und wenig Protein vor, nach Stimulation hatte sich das Bild umgedreht. In der Arbeit von Cobb et al. [84 ] wird deutlich, dass microRNS eine Rolle in der posttranskriptionellen Regulation des Foxp3- Proteins spielen, welche die Translation steuern können.

1.3.2  Funktion des Transkriptionsfaktors Foxp3

In Arbeiten von Marsonet et al. [85 ] und Zheng et al. [86 ] werden Zielgene des Foxp3- Proteins beschrieben, welche durch den Vergleich von Foxp3+ und Foxp3- T- Zellen identifiziert werden konnten. In diesen Arbeiten wurde ebenfalls die Foxp3- Bindung an die Zielgene analysiert, welche entweder hoch oder runter regulierte wurden. Die meisten, der analysierten Gene werden durch Foxp3 herunter reguliert, somit wirkt Foxp3 als Repressor. Es gibt aber auch einige Gene, welche durch die Anwesenheit von Foxp3 aktiviert werden, hier wirkt Foxp3 als Aktivator. Am besten beschrieben ist die Wirkung von Foxp3 auf die Expression von IL-2 und IFNγ in Tregs. In den Jahren 2001 und 2005 wurden erste Hinweise dafür gefunden, dass Foxp3 mit den Transkriptionsfaktoren NF-κB und NFAT interagieren kann und dadurch die Expression von IFN-γ und IL-2 unterdrückt wird [87 ]; [88 ]. Im Vergleich hierzu wurden auch Foxp1 und Foxp2, zwei weitere Mitglieder der „forkhead box“ Transkriptionsfaktor- Familie untersucht und es zeigte sich, dass nur Foxp3 diese Interaktionen eingehen kann und die daraus resultierende Abschaltung der Zytokinexpression allein auf Foxp3 zurückzuführen ist. In einer späteren Arbeit konnte gezeigt werden, dass Foxp3 mit dem Transkriptionsfaktor AP-1 um die Interaktion mit NFAT konkurriert. Bilden NFAT und AP-1 einen Komplex, wird das IL-2 Gen abgelesen. Bindet im Gegensatz dazu Foxp3 an NFAT, wird die Expression von IL-2 unterdrückt [89 ]. Weitere Arbeiten zeigten, dass noch zusätzliche Faktoren im Zusammenspiel mit Foxp3 an der Regulation der Expression von IL-2 und IFN-γ beteiligt sind, wie z.B. die Bindung des AML1/Runx1 Komplexes an NFAT, wodurch eine reduzierte Promoteraktivität im IL-2- und IFN-γ- Lokus induziert wird. In Tregs bindet Foxp3 mit AML-1/Runx1 zusammen an NFAT und übt somit seine Suppressor- Funktion aus [90 ]. Es gibt die Annahme, dass die Bindungskapazität von Foxp3 an NFAT und der dadurch resultierenden Verdrängung von AP-1 an NFAT, durch TGF-β, den TZR- Stimulus und RA beeinflusst werden kann (mündliche Mitteilung V. Heissmeyer, München). Am IFN-γ- und IL-2- Lokus konnte nicht nur die Interaktion von NFAT und AML-1/Runx1 mit Foxp3, sondern auch eine Interaktion von Foxp3 mit Histon Deacetylasen (HDAC7 und HDAC9) gezeigt werden[91 ]; [92 ]. Am CD25-, CTLA-4- und GITR- Lokus konnte ein Zusammenspiel von Foxp3 mit Acetylasen (z.B. TIP60) nachgewiesen werden [91 ]; [92 ]. Foxp3 ist somit aktiv an der Remodelierung von Chromatin für die Stilllegung (Histon- Deacetylierung) bzw. Aktivierung (Histon- Acetylierung) der Expression von Genen beteiligt. Auf den Prozess der Chromatin- Modifikationen für die aktive Transkription von Genen wird im folgenden Abschnitt näher eingegangen.

1.4 Gen- Regulation und Chromatin- Struktur

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An der Regulation genetischer Aktivität ist das Chromatin beteiligt. Genaktivität findet man im locker gepackten Euchromatin. Im Bereich des dicht gepackten Heterochromatins ist keine genetische Aktivität messbar. Eines der meist untersuchten Beispiele für diesen Zusammenhang ist das weibliche X- Chromosom. Das heterochromatische X- Chromosom ist weitgehend inaktiv, während auf dem euchromatischen X- Chromosom die Gene aktiv sind [93 ]. Die De- bzw. Methylierung von DNS ist ein weiterer Regulationsmechanismus, um die Aktivität von Genen zu steigern oder zu inhibieren.

1.4.1  DNS- Methylierung zur Inaktivierung genetischer Aktivität

Das Methylierungsmuster von Genen ist für die Gen- Expression vor allem im Rahmen der Epigenetik von entscheidender Bedeutung. Viele Erbkrankheiten, wie z.B. das Prader- Willi- Syndrom, das Angelman- Syndrom oder das Beckwith- Wiedemann- Syndrom sind durch ein fehlerhaftes „Imprinting“, d.h. eine fehlerhafte Methylierung bzw. Demethylierung der DNS gekennzeichnet [93 ]. Die Methylierung erfolgt, wie in Abbildung 1-2 dargestellt, am Cytosin- Baustein durch Anhängen einer Methylgruppe. Die Methylierung von Cytosin im Zusammenhang mit dem Motiv CpG findet man im Genom von fast allen höheren Lebewesen.

Abbildung 2: Darstellung der Methylierung des Cytosins

Molekülstruktur des 5-Methyl-Cytosins und des Cytosin.

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Durch Deaminierung wird 5-Methyl-Cytosin, welches immer in der Basenabfolge CpG zu finden ist, zu Thymidin umgewandelt. Auf Grund dieser Umwandlung spricht man deswegen bei den CpG- Inseln, d.h. bei DNS- Bereichen mit einem statistisch erhöhten Anteil an CpG- Motiven, auch von „Hot Spots“ für Mutationen. Da der Einbau von Thymidin in Cytosin nicht revertierbar ist, kommt es im weiteren Verlauf der Replikation somit zum Einbau eines Adenins anstatt eines Guanins. Wegen dieser Mutation treten CpG- Abfolgen seltener auf, als man es erwarten würde. Auffällig an den CpG- Inseln ist eine weitere strukturelle Besonderheit im Genom von Säugetieren. Sie treten meistens im Bereich von Promoteren vor Genen auf. Bei aktiven Genen sind die CpG- Inseln demethyliert, während sie bei inaktiven Genen methyliert vorliegen. Die DNS- Methylierung scheint mit der Inaktivierung von Genen zu korrelieren. Die Inaktivierung der Genexpression wird durch das Enzym, Methyl- CpG- Bindeprotein 2 (MeCP2) vermittelt. MeCP2 bindet an die Methylgruppe von 5-Methyl-Cystosin. Dieses Bindeprotein gehört zu einem Proteinkomplex, zu dem auch Histon- Deacetylasen gehören, welche an der Umwandlung der Chromatinstruktur von einer offenen Struktur (Heterochromatin) zu dem dicht gepackten Euchromatin beteiligt sind [93 ].

Das Methylierungsmuster, welches jedes Säugetier trägt, entsteht in seiner embryonalen Entwicklung. Nach der Befruchtung liegen alle CpG- Folgen in einem demethylierten Zustand vor. Mit der Implantation des Embryos im Uterus erfolgt eine unspezifische Methylierung aller CpG- Inseln. Die „Feinregulierung“ des Methylierungsmuster erfolgt in der weiteren embryonalen Entwicklung. In einem ersten Schritt werden zuerst die CpG- Inseln von sogenannten Haushaltsgenen demethyliert, danach die jeweils Zelltyp- und entwicklungsspezifischen Gene, die von den Zellen gebraucht werden. Für die Erhaltung des Methylierungsmusters sind, die sogenannten DNS- Methyltransferasen (Dnmt) verantwortlich. Es sind bis jetzt drei Dnmt bekannt, Dnmt-1, Dnmt-3a und Dnmt-3b. Dnmt-1 überträgt bei der Replikation der DNS das Methylierungsmuster des alten DNS- Stranges auf den neu replizierten DNS- Strang (Abbildung 1-3). Für diese Aufgabe folgt die Methyltransferase Dnmt-1 dem Replikationskomplex, wobei sie auf dem parentalen Strang eine schon vorhandene Methylierung der Cytosine als Matrize benötigt [93 ]. Bei diesem Ablauf kann es zu einer passiven Demethylierung der DNS kommen, da z.B. Enzyme an 5-Methyl-Cytosine im parentalen Strang gebunden sein können und somit die Dnmt-1 das Methylierungsmuster nicht erkennen kann [94 ].

Abbildung 3: Methylierung und Demethylierung von DNS

Links: Die Dnmt-3a und 3b übertragen Methyl- Gruppen auf Cytosine in CpG- Inseln.
Rechts: Das Enzym Dnmt-1 folgt dem Replikationskomplex und überträgt das Methylierungsmuster des parentalen Stranges auf den neu- synthetisierten Strang. Molekulare Genetik, Knippers, 8. Auflage

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Während Dnmt-1 für die Erhaltung des Methylierungsmusters verantwortlich ist, sind Dnmt-3a und Dnmt-3b sind für die Neu- Methylierung der DNS zuständig. Sie können an demethylierten CpG- Inseln vor aktiven Genen die CpG- Folge wieder methylieren und somit eine Reduktion der Genaktivität verursachen. Auf diesem Weg werden nicht mehr benötigte Gene wieder abgeschaltet.

Die in der frühen embryonalen Entwicklung komplette Demethylierung wird durch DNS- Demethylasen vermittelt. Diese sind allerdings in der späteren Entwicklung, wenn bestimmte Gene eingeschaltet werden, nicht aktiv. Hierfür muss es andere DNS- Methylasen geben. Die aktive Demethylierung wurde bis vor kurzer Zeit nur theoretisch vermutet, da es bis zu diesem Zeitpunkt niemandem gelungen war, eine aktive Demethylierung durch eine DNS- Methylase nachzuweisen. Auf Grund dieser Tatsache spricht man korrekt von einer nicht erfolgten „de novo Methylierung“ und nicht Demethylierung, da diese experimentell noch nicht nachgewiesen werden konnte. Für ein besseres Verständnis wurde in dieser Arbeit immer von Demethylierung und nicht von der Inhibition der „de novo Methylierung“ gesprochen.

In Pflanzen wurde zum ersten Mal eine DNS- Demethylase „Demeter“ beschrieben, welche eine aktive Demethylierung der DNS durchführt [95 ]. Weiterhin konnte von Barreto et al. [96 ] zum ersten Mal auch eine aktive Demethylierung durch das Enzym mit dem Namen Gadd45a in Xenopus laevis Oozyten postuliert werden. Damit scheint der Beweis für die schon lange bestehende Vermutung der Existenz von Demethylasen in Zellen nach der frühen embryonalen Entwicklung erbracht zu sein.

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In T- Zellen ist vor allem für Zytokin- Gene ein Zusammenhang zwischen genetischer Aktivität und der Demethylierung des Promoters beschrieben worden [97 ]; [98 ]. In der Arbeit von Tykocinski et al. [99 ] konnte gezeigt werden, dass die Transkription des IL-4 Gens nur erfolgt, wenn die CpG- Insel des IL-4 Promoters demethyliert und die Histone acetyliert vorliegen. Auch für die Expression von STAT4 in humanen T- Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Demethylierung der im STAT4- Lokus befindlichen CpG- Insel für eine erfolgreiche Transkription des STAT4 Gens notwendig ist [100 ]. Für den Lokus des IL-2 Zytokins konnte neben einer Demethylierung einer Enhancer- Region gezeigt werden, dass nach der Demethylierung das Protein Oct-1 an diese Region bindet und es zu einer Chromatinveränderung kommt. Die Bindung von Oct-1 an diesen Enhancer hat außerdem die Folge, dass die IL-2 Expression stabilisiert wird und somit eine Art des IL-2 Gedächtnisses in der T- Zelle festlegt [101 ]. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass auch im Foxp3- Genlokus eine Region existiert, die differentiell methyliert vorliegt (74). Die Arbeit zeigt, dass die als TSDR (Treg specific demethylated region) benannte Region in natürlichen Tregs demethyliert vorliegt (vgl. auch Abbildung 1-4). Diese Region liegt im ersten Intron des foxp3- Lokus (vgl. Abb. 1-4 Amp. 1+2), eine weitere analysierte CpG- Motiv reiche Region im Intron sieben (vgl. Abb. 1-4 Amp. 3+4) zeigte diese differentielle Demethylierung nicht. In T- Zellen, in denen keine Foxp3- Expression

nachweisbar ist, ist die TSDR dagegen vollständig methyliert.

Abbildung 4: Methylierungsstatus von ex vivo isolierten CD25 + / - T- Zellen

Dargestellt ist der murine foxp3- Lokus mit den vier analysierten Amplikons (Amp.). Die auf CD25+ und CD25- sortierten T- Zellen zeigten, dass die CD25 mit Foxp3 korreliert. In der Methylierungsanalyse sind die Amplikons eins und zwei, sowie drei und vier dargestellt; links die der CD25- und rechts die der CD25+ T- Zellen; ein Kästchen entspricht einem analysiertem CpG; der Index für den Methylierungsstatus ist als Farbskala dargestellt (gelb = vollständig demethyliert, blau = vollständig methyliert).
TSDR = Treg specific demethylated region. Abbildung nach Floess*, Freyer* et al. 2007 [102 ].
Ähnlich dem IL-4 Gen scheint auch bei Foxp3 die Expression vom Methylierungsstatus der im Genlokus liegenden CpG- Abfolge abhängig zu sein.

1.4.2  Histon- Modifikation und Chromatin- Struktur

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Die Umwandlung der Chromatinstruktur, dass sogenannte „Remodeling“ wird durch Histon- Modifikationen eingeleitet bzw. begünstigt [93 ]. Die bekannteste Histon Modifikation ist die Acetylierung der Histone. Eine Acetylierung führt zu einer Auflockerung der Chromatinstruktur und ermöglicht weiteren Enzymen den Zugang zur DNS (vgl. Abbildung 1-5). Die Acetylierung der Histone wird durch die sogenannten Histon- Acetyl- Transferasen (HAT) und Histon- Deacetylasen vermittelt. Die HATs acetylieren die Histone und die HADCs Deacetylierung die Histone und ermöglichen die Öffnung der Chromatinstruktur (93).

Abbildung 5: Histon- Acetylierung führt zu offenen Chromatin- Strukturen

Die Acetylierung führt zur offenen Heterochromatin- Struktur, Deacetylierung der Histone führt zu dichtgepacktem Euchromatin; Ac=Acetyl-Gruppe.

Weiterhin können die Histone neben der Acetylierung auch methyliert werden. Im Gegensatz zur Methylierung der DNS ist die Wirkung der Methylierung der Histone in den meisten Fällen genau gegensätzlich. Bei der Methylierung von Histonen wird die Chromatinstruktur gelockert und es kommt zur genetischen Aktivität, nicht zur Inaktivierung der Genexpression wie bei der Methylierung der DNS. Es gibt auch einige wenigen Histon- Modifikation, die zur Bildung von Euchromatin führen, bei denen die Histone demethyliert werden [103 ]; [104 ]. Im Falle dieser Arbeit wurden aber nur methylierte Histon- Modifikationen analysiert.

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In T- Zellen wurden schon im Zusammenhang mit der Expression von einigen Genen Histon- Modifikationen beschrieben. Beispiele hierfür sind die Genregion des Gens für das Zytokin IFN-γ in natürlichen Killerzellen [105 ] oder des IL-10- Lokus in Makrophagen [106 ]. In Tregs konnte gezeigt werden, dass am IL-2 Lokus nicht nur Foxp3 mit AP-1 um die Bindung von NFAT konkurrieren (vgl. Abschnitt 1.3.2), sondern auch im Gegensatz zu naiven T- Zellen keine Histon- Modifikationen stattfinden [107 ]. Im IL-4- Lokus wurde neben den in Abschnitt 1.4.1 beschriebenen Methylierungsmustern auch für die Expression notwendige Histon- Modifikationen aufgezeigt [99 ]. Dieses weist darauf hin, dass Histon Modifikationen und DNS- Methylierung in einer engen Kooperation die genetische Aktivität regulieren können.

Bis zum heutigen Zeitpunkt ist nicht geklärt in welcher Reihenfolge die Histon- Modifikationen und DNS- Methylierung stattfinden, d.h. welcher Mechanismus zuerst greift. Es ist dennoch klar, dass beide Modifikationen zusammen die Genexpression regulieren [108 ]. Ein interessanter Aspekt ist somit, das Zusammenspiel dieser beiden Regulationsmechanismen auch am foxp3- Lokus im Bereich der TSDR zu überprüfen.

1.5 Erzeugung transgener Mäuse

Im Verlauf dieser Arbeit sollte für die bessere Analyse der Funktion und Regulation des Transkriptionsfaktors Foxp3 eine bakterielle, artifizielle Chromosomen (engl. Bacterial Artifical Chromosom; BAC) transgene Maus erzeugt werden. Diese BAC- transgene Maus exprimiert unter der Kontrolle des Foxp3- Promoters das Reporterprotein verstärktes Gelb- fluoreszierendes Protein (engl. enhanced yellow fluorescenc protein; eYFP).

1.5.1  Einfacher Genersatz in bakterielle, artifizielle Chromosomen (engl. Bacterial atrificial chromosoms; BACs)  

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BACs entstanden in großer Anzahl bei den Sequenzierungsanalysen diverser Genome [109 ]; [110 ]; [111 ]. Die BACs enthalten große Fragmente der Genome und können für die schnelle Erzeugung transgener Mäuse genutzt werden [112 ]. Der einfache Genersatz, welcher normalerweise in den embryonalen Stammzellen (ES- Zellen) der Maus stattfindet, kann nun in den leichter zu handhabenden Bakterien erfolgen. Über die Methode des ET- Klonierens (vgl. 3.10.2) [113 ] erfolgt der Austausch einer Gensequenz mittels homologer Rekombination mit einem Zielgenvektor, welcher die Sequenz der erwünschten einzubringenden Region und homologe Bereich für die zielgerichtete Rekombination enthält. Die homologe Rekombination wird in den Bakterien durch die Rekombinasen E und T vermittelt [113 ]; [114 ]. Man kann mit einem Ersetzungs- oder Insertionsvektor als Zielgenvektor arbeiten. Ein Ersetzungsvektor mit zwei kleinen homologen Bereichen und dem Selektionsgen, rekombiniert dabei mit der Zielsequenz über ein „Crossing Over“ und ersetzt das endogene Fragment mit dem des Selektionsgens. Bei diesem werden keine speziellen Rekombinasen benötigt, sondern es wird der Ablauf des „Crossing Overs“ von homologen DNS- Sequenzen, welcher auch in der Meiose auftritt, genutzt. Der Insertionsvektor integriert als Ganzes durch Rekombination der Homologieflanken mit der Zielsequenz ([115 ]; [116, ]). Dieser Prozess wird von Rekombinasen wie den E- und T- Rekombinasen vermittelt. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Zielgenvektor handelte es sich um einen Insertionsvektor.

Die Rekombination mittels der beiden Rekombinasen E und T erhöht die Rekombinationsfrequenz ([114 ]; [117 ]) im Gegensatz zu der Frequenz der Rekombination in embryonalen Stammzellen [118 ] erheblich, da die in den embryonalen Stammzellen auftretenden Rekombinasen nicht so effektiv arbeiten. Neben der Effizienz wird auch die Geschwindigkeit der Erzeugung einer transgenen Maus erhöht, da die aufwendige homologe Rekombination nicht in ES- Zellen durchgeführt werden muss. Der modifizierte BAC integriert in den ES- Zellen an einer beliebigen Stelle im Genom. Die daraus resultierende höhere Anzahl von Klonen, im Gegensatz zu bei einer homologen Rekombination entstehenden Anzahl von Klonen, führt zu einem schnelleren Ablauf der ES- Zellkultur und der anschließenden Blastozysten Injektion.

1.5.2  Weitere Rekombinationssysteme

Zur Entfernung von zusätzlichen Sequenzen im bestehenden Mausmodel, welche man durch den modifizierten BAC eingebracht hat, eignet sich das Cre/loxP- und Flp/frt- System [119 ]. Die Systeme beruhen darauf, dass zwei gleich orientierte Erkennungssequenzen von einer Rekombinase erkannt werden und der dazwischenliegende DNS- Bereich herausgeschnitten wird. Hierbei werden keinerlei Hilfsproteine benötigt. In der Arbeit wurde das Flp/frt- System zum entfernen der Selektionskassette, welche in den Bakterien und in den ES- Zellen nötig ist (vgl. 4.1), verwendet

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Die Flp- Rekombinase aus Saccharomyces cereviseae [120 ] erkennt die 34 bp frt- Erkennungssequenz ( F lp r ecombination t arget). Ein zwischen zwei gleich gerichteten Erkennungssequenzen liegendes Zielgen wird durch die Flp- Rekombinase ausgeschnitten und ein zwischen zwei unterschiedlich orientierten Erkennungssequenzen liegendes Zielgen invertiert.

1.6 Ziel der Arbeit

Ziel der Arbeit war es, die Funktion und Regulation des murinen Transkriptionsfaktors Foxp3 zu analysieren. Hierfür wurde im ersten Teil der Arbeit eine BAC- transgene Maus erzeugt, die unter der Kontrolle des Foxp3- Promoters ein Reportergen (eYFP) exprimiert. Mittels dieser transgenen Maus erhält man die einzige Möglichkeit lebende Tregs ex vivo zu identifizieren und adaptiv zu transfrieren ohne über den Marker CD25 sortieren zu müssen. Man erlang somit zum ersten Mal eine hochreine Foxp3+ T- Zell Population, nämlich auch die Foxp3+ CD25- T- Zellen. So sollte in ersten Schritten das Expressionsmuster des Transkriptionsfaktor Foxp3 über die Identifizierung des eYFP analysiert werden. Der Einsatz der BAC- transgenen DEREG- Maus, welche unter dem Foxp3- Promoter eGFP fusioniert mit dem Diphtheria Toxin Rezeptor exprimiert, ermöglicht zusätzlich zur Identifizierung, die Depletion Foxp3- exprimierender Zellen. Durch die Depletion der Tregs kann ihr Einfluss auf den Ablauf der Immunantwort weiter untersucht und weiter mögliche Eigenschaften der Tregs analysiert werden.

Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Stabilität der Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3 analysiert werden, wodurch erste Einblicke in die Regulation erlangt werden sollten. In einem ersten Schritt wurde die Stabilität der Foxp3- Expression in vivo ermittelt. Für eine nähere Analyse des Zusammenhangs der initialen bzw. der stabilen Expression und die Korrelation mit dem Methylierungsmuster der TSDR, sollten unterschiedlich kultivierte T- Zellen analysiert werden. In diesem Zusammenhang sollte auch die Korrelation des Methylierungszustandes der TSDR und der suppressorischen Eigenschaft der T- Zellen untersucht werden.

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Weiterhin war ein Ziel der Arbeit, den Lokus des Foxp3- Gens und vor allem den Bereich der TSDR auf Besonderheiten, wie z.B. konservierte Regionen und Histon Modifikationen, sowie mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen, hin zu analysieren.

In einem dritten Teil der Arbeit stand die funktionelle Analyse der TSDR im Vordergrund. Es sollte ihre Bedeutung in Bezug auf die Expressionskontrolle des Foxp3- Gens untersucht werden. Bei dieser Analyse war die Frage, ob es sich bei dieser Region um einen eigenständigen Promoter oder um ein regulatives Element, z.B. ein Enhancer- Element handelt, entscheidend. Weitere Einblicke auf die Funktion der TSDR konnten durch Deletionsmutanten oder Methylierungsanalysen gewonnen werden.


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09.04.2009