| ↓14 |
Alle verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders vermerkt, in Analysequalität (p.a.) von den Firmen Becton, Dickinson and Company (BD), Miltenyi Biotec, Invitrogen, Merck, Renner, Roth, Falcon und Sigma bezogen. Enzyme und Nukleotide stammen von den Firmen Amersham Biosciences, MWG Biotech, New England BioLabs, Promega und Roche. Nitrozellulosemembranen und Radiochemikalien wurden bei Amersham Biosciences erworben. Die Verwendung der Radiochemikalien erfolgte unter Berücksichtigung von Kalibrierungsdatum und Halbwertszeit.
| ↓15 |
Soweit nicht anders erwähnt, wurden die Lösungen, Puffer und Medien mit sterilem A. bidest angesetzt und die pH- Werte durch Verwendung von 2 N Natronlauge (NaOH) bzw. Salzsäure (HCl) eingestellt. Hitzestabile Lösungen und Puffer für DNS- Arbeiten wurden 20 Minuten, RNS- Lösungen eine Stunde autoklaviert.
Medien werden zur Sterilisation 20 min bei 120 °C autoklaviert, hitzelabile Stoffe steril filtriert und den Medien nach Abkühlen auf 50 – 55 °C zugegeben. Zur Herstellung von LB- Platten wird LB- Medium vor der Sterilisation mit 1,5 % (w/v) Agar versetzt. Nach dem Abkühlen des LB- Agars auf 50 – 55 °C werden gegebenenfalls Selektionsantibiotika zugegeben und die Platten gegossen.
| ↓16 |
| ↓17 |
| ↓18 |
Alle Medien und Lösungen, sowie A. bidest sind zellkulturgetestet. Selbst anzusetzende Lösungen wurden autoklaviert bzw. steril filtriert. Die Kulturmedien werden bei Invitrogen gekauft.
| ↓19 |
Tabelle 1: Klonierungsvektoren, ausführliche Vektorkarten siehe Anhang
|
Name |
Eigenschaft |
Quelle/Referenz |
|
pBluescript II SK (+/-) |
Ampicillin- Resistenz, MCS, Blau- Weiß- Selektion, T7/T3- Promoteren |
Stratagene |
|
pGL3- Basic Vektor |
Ampicillin- Resistenz; MCS, Luciferasegen, SV40 late poly (A) |
Promega |
|
pGL3- Promoter Vector |
Ampicillin- Resistenz, MCS, Luciferasegen, SV 40 late poly (A), SV 40 Promoter |
Promega |
|
pRL- TK Vector |
Ampicillin- Resistenz, HSV TK Promoter, Renilla Reportergen, SV 40 late Poly (A), T7 Promoter |
Promega |
Folgende nicht selbst hergestellte Plasmide wurden im Verlauf der vorliegenden Arbeit genutzt.
| ↓20 |
Tabelle 2: Verwendete rekombinante Plasmide
|
Name |
Vektorgerüst |
Passagier- DNS |
Referenz |
|
pBSK:frt-NEO/KAN-frt |
pBluescript II SK (+/-) |
frt-PGK-NEO/Kan-frt |
M. Gierl; MDC, Berlin |
|
pMCV1.4-GFP |
pMCV1.4 |
eGFP Reportergen |
H. Duong; DRFZ, Berlin |
|
IRES-eYFPpA-l2neo |
pSP73 |
eYFP Reportergen, loxP-PGK-NEO-loxP; IHRES-K11 |
M. Mohrs (SN Lake, USA) |
Alle in dieser Arbeit verwendeten BACs wurden vom RZPD (Deutsches Ressourcenzentrum) bezogen und entstammen der Library Nummer 731.
|
Bezeichnung |
Referenz |
|
RPCIB731D08143Q2 |
RZPD |
|
RPCIB731H05147Q2 |
RZPD |
|
RPCIB731H08362Q2 |
RZPD |
| ↓21 |
Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden bei den Firmen TIB MOLBIOL und Operon bestellt. Sie wurden lyophylisiert geliefert und anschließend in dem vom Hersteller empfohlenen Volumen A. bidest oder TE- Puffer gelöst. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C.
Tabelle 4: Übersicht über die in dieser Arbeit für die PCR verwendeten Primer
|
Name |
Länge (bp) |
Sequenz 5´ → 3´ |
Bindungs stelle |
Orientie rung |
|
5`Fragment hin |
24 |
GATCGGTACCCAGCAAAGACTATG |
homologe Region FoxP3 |
Sinn |
|
5`Fragment rück |
24 |
GATCCCATGGGGTTCTTGTCAGAG |
homologe Region FoxP3 |
Gegensinn |
|
3`Fragment hin |
24 |
GATCGGATCCAAGCCTATGGCTCC |
homologe Region FoxP3 |
Sinn |
|
3`Fragment rück |
24 |
GATCACTAGTCCACAGTAAAGGTC |
homologe Region FoxP3 |
Gegensinn |
|
Prom Foxp3-5` |
28 |
GATCGGTACCTTGTCCCAGGAGAGCGGG |
Intron 1 Start TSDR |
Sinn |
|
Prom Foxp3-3` |
32 |
GATCCTCGAGGGGATAACAGTGGAATGGAGTC |
Intron 2 ATG Foxp3 |
Gegensinn |
|
FoxP3AS1XmaI |
30 |
GATCCCCGGGCCCATATGGCTGGACCATGG |
Intron 1 Ende TSDR |
Gegensinn |
|
FoxP3S2XmaI |
30 |
GATCCCCGGGTTAAGCCAATATAGTGGAAA |
Intron 1 Ende TSDR |
Sinn |
|
FoxP3AS2XhoI |
31 |
GATCCTCGAGCTTGGATGGAGGAGATGAGAG |
Intron 1 Start Exon -1 |
Gegensinn |
|
CN3neu_fow |
20 |
GGCGTTCCTGTTTGACTGTT |
konservierter Bereich TSDR |
Sinn |
|
CN3neu_rev |
20 |
GGACGTCACCTACCACATCC |
konservierter Bereich TSDR |
Gegensinn |
|
P1fowdel |
28 |
GATCGGTACCAAGTTGTCCCAGGAGAGC |
Start TSDR |
Sinn |
|
P1143revdel |
28 |
GATCCCCGGGCATATGGCTGGACCATGG |
Ende TSDR |
Gegensinn |
|
P285fowdel |
28 |
GATCGGTACCAATGGAGCTCAGGAGGGA |
erste Deletion TSDR |
Sinn |
|
P637fowdel |
28 |
GATCGGTACCTAGCCAGATGGACGTCAC |
zweite Deletion TSDR |
Sinn |
|
P894fowdel |
28 |
GATAGGTACCGTCCCAGAAACAACCTCC |
dritte Deletion TSDR |
Sinn |
Neben den Standardprimern T7 und T3 wurden individuelle Primer für die Auftragssequenzierungen bei der Firma AGOWA verwendet. Diese Startermoleküle wurden direkt von der Firma AGOWA synthetisiert.
| ↓22 |
Tabelle 5: Startermoleküle für Auftragssequenzierungen
|
Name |
Orientierung |
Bindungsstelle |
Sequenz |
|
Int_hin |
Sinn |
Neo/Kan- Kassette |
5`-CCAGATCATCCTGATCGACAAGAC |
|
Int_rück |
Gegensinn |
Neo/Kan- Kassette |
5´-CTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC |
Die Orientierungen beziehen sich auf die kodierende Region von eYFP in den jeweiligen Vektoren.
Tabelle 6: verwendete Nukleinsäure- Größenstandards
|
Verwendete DNS- Größenstandards |
Fragmentgrößen (kb) |
|
1 kb DNS- Leiter (Invitrogen) |
12,216; 11,198; 10,180; 9,162; 8,144; 7,126; 6,108; 5,090; 4,072; 3,054; 2,036; 1,636; 1,018; 0,517; 0,506; 0,396; 0,344; 0,298; 0,220; 0,201; 0,154; 0,134 |
| ↓23 |
Tabelle 7: In dieser Arbeit verwendeter Bakterienstämme
|
E. coli Stamm |
Genotyp |
Eigenschaft |
Referenz |
|
XL I blue |
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, Δ(mcr)A183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173, supE44, relA1, lac[F’proAB lacIqZΔM15, Tn10 (Tetr 12,5 µg/ml)]. |
Plasmidvermehrung |
Stratagene |
|
DH10B |
F- mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZΔM15, ΔlacX74 recA1, endA1 araD139; Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG |
elektrokompetent; Plasmidvermehrung |
Invirtogen |
|
EL250 |
DH10B [λcI857(cro-bioA)<> araC-PBADflpe] |
Hitzeinduzierte Rekombination |
[121 ] |
Tabelle 8: Verwendete Zelllinien
|
Bezeichnung |
Genetischer Hintergrund |
Referenz |
|
RLM-11 |
murine T- Zelllinie (CD3+ CD4+ CD8- J11d ) heterogeneous |
DennisY. Loh, Washington University School of Medicine, St. Louis. |
|
EL4 |
murine T- Zelllinie, C57BL/6 Hintergrund |
[122 ] |
|
3DO |
murine T- Zell Hybridoma, Ovalbumin- spezifisch, BALB/C Hintergrund |
[123 ] |
|
DO11-10 |
murines T- Zell Hybridoma, Ovalbumin spezifisch, Antigen I-Ad, IgG, BALB/C Hintergrund |
[124 ] |
Die in der Tabelle aufgeführten Antikörper gegen murine Antigenewurden für die Sortierung von Zellen und für die Durchflusszytometrie verwendet. Eingesetzte Fluorochrome sind in Tabelle 2-9 dargestellt.
| ↓24 |
Tabelle 9: Verwendete Antikörper
|
Spezifität |
Klon |
Spezies |
Isotyp |
Herkunft |
|
CD4 |
GK1.5 |
Ratte |
IgG2b |
Deutsches Rheuma- Forschungszentrum (DRFZ), Berlin |
|
CD4 |
L3T4 |
Ratte |
IgG2b |
Becton Dickinson, Heidelberg |
|
CD25 |
PC61.5 |
Ratte |
IgG1 |
Becton Dickinson, Heidelberg |
|
CD62L |
MEL-14 |
Ratte |
IgG2a |
Becton Dickinson, Heidelberg |
|
Foxp3 |
FJK-16s |
Ratte |
IgG2a |
eBioscience, San Diego, USA |
Tabelle 10: Eingesetzte Fluorochrome und Farbstoffe
|
Fluoreszenzkonjugat bzw. Farbstoff |
Extinktionsmaximum |
Emissionmaximum |
|
APC (Allophycocyanin) |
650 |
660 |
|
Cy5 (Indodicarbocyanin) |
650 |
670 |
|
FITC (Fluoreszein- Isothiozyanat) |
495 |
519 |
|
PE (R- Phycoerythrin) |
480; 565 |
613 |
|
PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) |
490 |
675 |
|
PI (Propidium Iodid) |
550 |
650 |
|
ECL+Plus |
Amersham |
|
NEBlot® Phototope® Kit |
New England Biolabs |
|
Phototope®- Star Detection Kit |
New England Biolabs |
|
QIAGEN® Plasmid Midi Kit (50) |
Qiagen |
|
Endofree® Plasmid Maxi Kit 10 |
Qiagen |
|
QIAquick®Gel Extraction Kit 50 |
Qiagen |
|
Qiaprep® Spin Miniprep Kit 50 |
Qiagen |
|
DNeasy® Tissue Kit (50) |
Qiagen |
|
RNeasy® Mini Kit (50) |
Qiagen |
|
LightCycler® FastStart DNA Master YBR Green I |
Roche |
|
Chromatin Immunprecipitation (ChIP) Assay Kit |
Upstate |
|
Foxp3 Staining Kit |
eBioscience |
|
NucleofectionTM Protocol |
Amaxa |
| ↓25 |
| ↓26 |
Es wurden ausschließlich Mäuse als Versuchstiere bzw. zur Organentnahme verwendet. Alle Mäuse wurden unter spezifisch Pathogen- freien (specific pathogen free, SPF) Bedingungen gezüchtet. Für die Experimente wurden weibliche und männliche Mäuse im Alter von sechs bis acht Wochen verwendet. Die Wildtyp- (WT) Stämme BALB/c und C57BL/6 wurden vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR, Berlin) bezogen. Die transgenen DEREG- Mäuse wurden an der Forschungsanstalt für experimentelle Medizin (FEM, Berlin) gezüchtet.
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| DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 09.04.2009 |
