3 Methoden

3.1 DNS- Präparation

3.1.1  Analytische Plasmidisolierung aus Bakterien (Minipräparation)

↓26

Diese Methode erlaubt eine schnelle Isolierung von Plasmid- DNS aus Bakterien zur Charakterisierung rekombinanter Klone beispielsweise durch eine Testspaltungen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen oder durch eine Sequenzierung nach der Kettenabbruchmethode [125 ].

↓27

Die Lysis der Bakterien beruht hierbei auf einer Kombination aus Lysozym, welches in der Bakterienzellwand das Polysaccharidgerüst des Peptidoglycans spaltet, und dem nicht- ionischen Detergenz Triton-X-100. Hierfür wurde der Reagenziensatz Qiaprep MINIprep 50 (QIAGEN, Hilden) verwendet. Die Präparation erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Je nach Ausbeute (10-20 µg) und in Abhängigkeit von ihrer weiteren Verwendung wurde die DNS in 25-50 µl A. bidest oder TE- Puffer (pH 8,0) aufgenommen und wurde bei 4 °C bzw. -20 °C gelagert.

3.1.2  Präparative Plasmidisolierung aus Bakterien (Midipräparation)

Größere Mengen Plasmid- DNS mit hohem Reinheitsgrad wurden durch Ionenaustausch-Chromatographie gewonnen. Hierfür wurde der Reagenziensatz Qiagen Plasmid Midi Kit 50 (QIAGEN) verwendet. Es handelt sich bei dieser Methode um eine weiterentwickelte Technik der alkalischen Lyse [126 ]. Die Präparation erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Je nach Ausbeute (100-200 µg bei „high copy- Plasmiden“ und einem Kulturvolumen von 50 ml) und in Abhängigkeit von ihrer weiteren Verwendung wurde die Plasmid- DNS in 50-100 µl A. bidest oder TE- Puffer (pH 8,0) aufgenommen und bei 4 °C bzw. –20 °C gelagert.

3.1.3  Präparative, endotoxinfreie Plasmidisolierung aus Bakterien (Maxipräparation)

Die für die Transfektion der Zellen benötigten großen Mengen an Plasmid- DNS wurden mit Hilfe des QIAgen EndoFree MaxiKits der Firma Qiagen gewonnen. Um zu gewährleisten, dass die zu transfizierende DNS frei von bakteriellen Endotoxinen ist, da diese zur Behinderung der Transfektion führen können, wurden bei dieser Präparation ausschließlich Einmal- Plastikpipetten verwendet und entscheidende Schritte unter der Sterilbank durchgeführt.

↓28

3 ml LB- Medium, versetzt mit einem geeigneten Antibiotikum, wurden mit einer Einzelkolonie des gewünschten Bakterienklons inokuliert (Vorkultur) und üN, bei 225 UpM und 37 °C (Schüttler G25, Heraeus) inkubiert. 100 ml bzw. 250 ml mit Antibiotikum versetztem LB- Medium wurden mit 0,2 ml bzw. 0,5 ml der Vorkultur angeimpft und ebenfalls üN, bei 225 UpM und 37 °C (Schüttler G25, Heraeus) inkubiert.

Die Präparation erfolgte über Anionenaustausch- Säulen (QIAgen- Tip 500) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Plasmid- DNS wurde in 100 µl endotoxinfreiem TE- Puffer gelöst. Die Plasmid- DNS- Lösung wurde bei –20 °C gelagert.

3.1.4  BAC- DNS- Isolierung

Eine Einzelkolonie transformierter Bakterien wurde in 2 ml LB- Medium mit geeignetem Antibiotikum bei 37 °C und 225 UpM (Schüttler G25, Heraeus) üN inkubiert. Die 5 ml Kultur wurde in ein Mikroreaktionsgefäß überführt, die Bakterien durch Zentrifugation (1 min, 10x4 g, RT, Heraeus Megafuge1.0R) sedimentiert und der Überstand dekantiert. Das Bakteriensediment wurde in 300 µl Resuspensionslösung resuspendiert. Anschließend wurden 300 µl Lysislösung zu gegeben und die Suspension durch Invertieren gemischt. Nach einer einminütigen Inkubation bei RT wurden 300 µl der Neutralisationslösung zugefügt und die Suspension wiederum durch invertieren gemischt und weitere 15 min auf Eis inkubiert. Es folgte ein Zentrifugationsschritt (15 min, 24x4g, 4 °C, Heraeus Biofuge fresco) bei dem sich ein Sediment aus Zellresten und anhaftender genomischer DNS bildet, welches mit einer sterilen Kanüle entfernt wurde. Durch Zugabe von 670 µl Isopropanol wurde die BAC- DNS im Überstand gefällt und durch anschließende Zentrifugation (15 min, 24x4 g, 4 °C, Heraeus Biofuge fresco) sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen, das Sediment mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert (10 min, 24x4g, 4 °C, Heraeus Biofuge fresco). Wiederum wurde der Überstand abgenommen und das Sediment 10 min bei RT luftgetrocknet. Das Präzipitat wurde in 50 µl TE- Puffer gelöst. Die so aufgereinigte BAC- DNS kann bei 4 °C gelagert werden. Um RNS freie BAC- DNS zu erhalten, kann der TE- Puffer mit RNase A versetzt werden (1% (v/v), pH 8.0).

3.1.5  Isolierung genomischer DNS aus Kulturzellen

↓29

Für die Isolierung großer Mengen genomischer DNS aus murinen Zellen wurden 5x106 Zellen eingesetzt. Die Zellen wurden, um alle Mediumreste zu entfernen, zweimal mit PBS gewaschen. Auf 200 µl PBS wurden dann eine Mischung aus 200 µl Lysispuffer, 20 µl Proteinase K (20 mg/ml) und 4 µl RNase A (100mg/ml) pipettiert. Die Suspension wurde für mindestens 10 min bei 70 °C inkubiert, und anschließend wurden 200 µl absoluter Alkohol zugefügt und die Suspension auf einem Vortexer (Mini Vortexer, VWR) gemischt. Durch die Zugabe von 1,05 ml Isopropanol und mehrmaliges Invertieren wurde die gefällte genomische DNS als weißer Faden sichtbar. Dieser DNS- Faden wurde mit Hilfe einer umgebogenen 1 ml Spitze einer 1 ml Kolbenhubpipette in ein neues Schraubdeckelreaktionsgefäß überführt und zweimal mit 70% (v/v) Alkohol gewaschen. Anschließend wurde die luftgetrocknete DNS- Flocke in 100 µl TE- Puffer aufgenommen. Zum Lösen der Flocke wurde der Ansatz zu erst für 1 h bei 65 °C im Wasserbad inkubiert und anschließend üN bei 55 °C im Schüttelwasserbad. Die genomische DNS- Lösung ist bei 4 °C lagerbar.

3.1.6  Aufreinigung von DNS aus Agarosegelen

DNS- Fragmente verschiedener Länge, z.B. nach einer Spaltung durch Restriktionsendonukleasen (3.8.1), wurden mittels einer präparativen gelelektrophoretische Auftrennung (3.7.1) größenfraktioniert und anschließend unter UV- Licht aus dem Agarosegel mit Hilfe einer Skalpellklinge ausgeschnitten. Es wurde langwellige UV- Strahlung (302 nm) eingesetzt, da DNS im Bereich ihres Absorptionsmaximums (260 nm) geschädigt wird. Die Isolation des gewünschten DNS- Fragmentes aus dem Agarosegel erfolgte mit Hilfe des Reagenziensatzes QIAquick Gel Extraction Kit oder für Fragmente über 10 kb mit dem QIAEXII Agarose Gel Extraction Kit (beide Quiagen, Hilden) und wurde nach den Herstellerangaben durchgeführt. Das Prinzip beruht dabei auf der hohen Affinität von DNS zu der Silikatmatrix einer Zentrifugationssäule oder zu dem Zusatzstoff QIAEXII, welcher DNS- bindende Silikate beinhaltet. Die aufgereinigte DNS ist bei –20 °C lagerbar.

3.1.7  Natriumacetat- Fällung von DNS

Zur Konzentrierung und Umpufferung von DNS wurde die Tatsache genutzt, dass Nukleinsäuren bei der Zugabe von Natrium- oder Ammoniumionen und Ethanol als Kationen- DNS- Salze ausfallen [127 ].

↓30

Zur DNS- Lösung wurden 1/10 Vol. Natriumacetat (3 M; pH 5,2) und 2,5 Vol. eiskalter Ethanol abs. gegeben, der Ansatz durch Invertieren gemischt und die DNS 15 min bei –70 °C gefällt. Durch Zentrifugation (10 min, 24x4 g, 4 °C, Heraeus Biofuge fresco) wurde die DNS sedimentiert, der Überstand wurde dekantiert und das Sediment zur Entfernung der Salze mit 400 µl 70% (v/v) Ethanol gewaschen (10 min, 24x4 g, 4 °C, Heraeus Biofuge fresco), so dass das zur Fällung verwendete Salz aus dem DNS- Präzipitat ausgewaschen wird.

Der Überstand wurde vollständig entfernt, das Sediment an der Luft getrocknet und im gewünschten Volumen TE –Puffer oder A. bidest gelöst. Diese Methode ist für eine Fällung von DNS und RNS in den meisten Fällen anwendbar, eignet sich jedoch nicht bei hohen Phosphatkonzentrationen oder zur Abtrennung von Nukleotiden.

3.1.8  RNS- Präparation

Um den Abbau der RNS durch endogene und exogene RNasen zu vermeiden, müssen besondere Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. So wurden vor und während der Präparation alle Geräte, Arbeitsflächen und Handschuhe mit 96 % (v/v) Ethanol gereinigt. Die verwendeten Lösungen wurden 1 h autoklaviert, gegebenenfalls mit DEPC- H2O angesetzt und die RNS bei allen Arbeitsschritten auf Eis gelagert.

3.1.9  RNS- Isolierung

↓31

Die RNS wurde mittels RNeasy Mini Kit (Qiagen) wie im Protokoll beschrieben gewonnen. Es wurden 1x106 bis 5x106 Zellen eingesetzt. Die sedimentierte RNS wurde in 30 µl von Qiagen mitgelieferten Rnase- freiem Wasser aufgenommen. Der empfohlene DNS- Verdau für eine höhere Reinheit der RNS wurde immer durchgeführt. Der DNS- Verdau erfolgte ebenfalls nach dem Protokoll des Herstellers (Qiagen).

3.2 Polymerase- Kettenreaktion (engl. Polymerase chain reaction; PCR)

Die Polymerase- Kettenreaktion ist ein Verfahren zur exponentiellen und selektiven Vervielfältigung von DNS- Fragmenten [128 ]. Aus einem bekannten DNS- Bereich werden zwei Oligonukleotid- Primer abgeleitet, die an einer denaturierten, einzelsträngigen Matrizen- DNS in entgegengesetzter Orientierung an die beiden DNS- Stränge binden. Ausgehend von den 3’- Enden dieser beiden Primer synthetisiert die aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus stammende hitzestabile Taq- DNS- Polymerase (Applied Biosystems, Darmstadt), nach Vorgabe der DNS- Matrizen zwei neue komplementäre DNS- Einzelstränge, die nach erneuter Denaturierung und Primeranlagerung selbst als Matrize fungieren. Als Alternative zur Taq- Polymerase wird die Pwo- Polymerase (Peqlab, Erlangen) aus dem Tiefsee- Bakterium Pyrococcus woesei oder die Kombinationspolymerase bestehend aus der Taq- und Tgo- Polymerase (aus Thermococcus gorgonariusrecombinant, Roche, Penzberg) verwendet. Die Pwo- Polymerase, sowie die Kombination der beiden Polymerasen sind aufgrund ihrer erhöhten Temperaturtoleranz in der Lage, G/C- reiche Abschnitte zu amplifizieren. Außerdem weisen sie aufgrund einer 3’- 5’- fehlerkorrigierenden Aktivität eine geringere Fehlerrate auf.

Durch 35-40 fache Wiederholung des Zyklus bestehend aus Denaturierung der DNS- Doppelstränge, Anlagerung der Primer und DNS- Synthese wird eine exponentielle Amplifikation der gewünschten Sequenz bewirkt. Eine anschließende, verlängerte Synthesephase ermöglicht die Verlängerung unvollständig vervielfältigter Stränge. Kontaminierende Fremd- DNS, die ebenfalls als Matrize dienen könnte, wird durch Mitführen einer Kontrollreaktion ohne Matrizen- DNS identifiziert. Eine Agarose- Gelelektrophorese mit einem Aliquot des nativen PCR- Produktes (vgl. 3.7.1) gab Aufschluss über den Erfolg der durchgeführten PCR.

↓32

Bei der Etablierung eines PCR- Programms werden MgCl2- Konzentration, Primeranlagerungstemperatur, Synthesezeit und Anzahl der Reaktionszyklen optimiert. Gegebenfalls kann es besonders bei hohem GC- Gehalt der Matrizen- DNS notwendig sein, PCR- Verstärker wie Glycerin oder DMSO zu verwenden, welche die Stabilität der Polymerase oder die Löslichkeit der DNS erhöhen.

Die Temperaturen der einzelnen Zyklen wurden mittels eines programmierbaren Thermozyklers (Biozym MJ Research PTC-100, MWG AG Biotech) oder eines Gradientencyclers (Mastercycler gradient, Eppendorf) gesteuert. Bei der PCR- Reaktion wurde der Reaktionsansatz wie beschrieben zusammen pipettiert und nicht, wie früher üblich, mit 50 µl Mineralöl (Sigma) überschichtet, da die Deckel der Cycler beheizbar sind.

3.2.1  Ableiten von PCR- Primeren

Primer für eine PCR haben üblicherweise eine Länge von 30 bp und enthalten eine zu den Enden des gewünschten DNS- Fragmentes komplementäre Sequenz. Dabei leitet sich ein Primer vom Sinnstrang („upstream primer“), der andere vom Gegensinnstrang („downstream primer“) ab. Gegebenenfalls bringen die Primer über ihr 5`- Ende eine Restriktionsschnittstelle in das PCR- Produkt mit ein, um eine gerichtete Klonierung zu ermöglichen (vgl. 3.8.5). Diese zusätzlichen Nukleotide hybridisieren nicht mit der DNS- Matrize. Das Verhältnis von G/C- Gehalt zu A/T- Gehalt in einem Primer liegt idealerweise bei 1:1; die Schmelztemperatur eines PCR- Primer- Paares, der Tm- Wert, sollte vergleichbar sein und zwischen 55 bis 65°C liegen. Der Tm- Wert ergibt sich für Primer von mehr als 14 Nukleotiden Länge aus folgender Gleichung:

↓33

Tm in [°C] = 69.3°C + 0.41 x (GC- Gehalt in %) – 650 / Primerlänge

Es ist darauf zu achten, dass sich am 3`- Ende eines PCR- Primers ein Nukleotid mit einer Cytosin- oder Guaninbase befindet. Die drei Wasserstoffbrückenbindungen, die diese Nukleotide zu ihrem komplementären Partner ausbilden, bewirken eine festere Bindung des DNS- Doppelstranges, wodurch die DNS- Polymerase einen geeigneten Synthesestart vorfindet.

3.3 Typischer PCR- Ansatz für die Taq- Polymerase

Tabelle 11: PCR- Ansatz und Programm mit der Taq- Polymerase

PCR- Ansatz (25 µl):

PCR- Programm:

2,5 µl 10x Taq- Puffer

Schritt

Temperatur

Zeit

Zyklen

1,5 µl MgCl2 [25mM]

1

96 °C

5 min

1

0,5 µl Primer hin [10 µM]

2

94 °C

45 sec

0,5 µl Primer rück [10 µM]

3

62 °C

30 sec

35

1 µl dNTPs [je 10 mM]

5

72 °C

je nach Produktgröße 1 kb = 1 min

0,25 µl Taq- DNS- Polymerase

6

72 °C

10 min

1

1 µl DNS

17,25 µl A. bidest

3.3.1  Typischer PCR- Ansatz für die Taq- Polymerase und Tgo- Polymerase

↓34

Tabelle 12: PCR- Ansatz und Programm mit der Taq- und Tgo- Polymerase

PCR- Ansatz (50 µl):

PCR- Programm:

5 µl 10x High- Puffer

Schritt

Temperatur

Zeit

Zyklen

1 µl Primer hin [20 pmol]

1

96 °C

5 min

1

1 µl Primer rück [20 pmol]

2

94 °C

30 sec

1 µl dNTPs [je 10 mM]

3

62 °C

45 sec

35

0,75 µl High- DNS- Polymerase

4

72 °C

vgl. 3.3.2

2 µl DNS

5

72 °C

10 min

1

30,25 µl A. bidest

3.3.2  Typischer PCR- Ansatz für die Pwo- Polymerase

Tabelle 13: PCR- Ansatz und Programm mit der Pwo- Polymerase

PCR- Ansatz (50 µl):

PCR- Programm:

5 µl 10x Reaktionspuffer inkomplett

Schritt

Temperatur

Zeit

Zyklen

0,75 µl Primer hin [10 µM]

1

94 °C

2 min

1

0,75 µl Primer rück [10 µM]

2

94 °C

30 sec

35

1 µl dNTPs [je 10 mM]

3

58 °C

45 sec

2,5 µl Pwo- DNS- Polymerase

4

72 °C

2 min

0,4-1 µl Plasmid- DNS [100-250 ng]

5

72 °C

10 min

1

4-5 µl MgSO4 [2-2,5 mM]

34-35,6 µl A. bidest

3.4 Herstellung von cDNS mit RNS- Matrize für die RTQ- PCR

Für die Gewinnung von cDNS wurden 1 µg RNS in einem PCR (vgl. 3.2) ähnlichen Ansatz umgeschrieben. RNS und Oligo d(T)s werden nachdem sie zusammen pipettiert wurden, für 10 min bei 70 °C in der PCR- Maschine aneinander gelagert. Die Synthese der cDNS erfolgte für 1 h bei 42 °C, anschließend erfolgt ein Inaktivierungsschritt für 5 min bei 94 °C. Der Ansatz für die Synthese der cDNS setzt sich aus den in Tabelle 3-4 dargestellten Komponenten zusammen.

↓35

Tabelle 14: Ansatz für die cDNS Synthese

cDNS Ansatz (20µl)

Mengen

RNS [1µg]

10,5 µl

d(T)12-18 [0,1mg/ml]

1 µl

5x RT Puffer

4 µl

NTP [2,5mM]

1 µl

DTT [0,1M]

2 µl

RNasin [40U/µl]

0,5 µl

Superscript [200U/µl]

1 µl

3.5 RTQ- PCR (engl. real time quantitative PCR)

Die RTQ- PCR ist eine schnelle und einfache Möglichkeit, die mRNS- oder DNS- Mengen in Proben quantitativ zu bestimmen. Die mRNS muss für diese Methode zuerst in cDNS umgeschrieben (vgl. 3.4) werden, um in einer RTQ- PCR analysiert zu werden. Die Methode der RTQ- PCR beruht darauf, dass durch die Amplifikation der Template- DNS immer größere Mengen des Farbstoffes SYBR Green (Roche Applied Science, Mannheim) anlagert wird. Große Mengen Template- DNS führen zu einem schneller detektierbaren Signal des SYBR Green als geringe Mengen von Template- DNS. Für den RTQ- PCR Ansatz wurde das LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche Applied Science) genutzt.

Tabelle 15: Ansatz einer RT- PCR Reaktion

RT- PCR Ansatz (20µl)

Mengen

DNS

4 µl

Lightcycler Mix {10 µl 1a in 1b}

2 µl

forward Primer [10 µM]

1 µl

reverse Primer [10 µM]

1 µl

MgCl2 [25 mM]

1,6 µl

DNase/RNase freies Wasser (Gibco)

10,4 µl

↓36

Die Ansätze wurden in LightCycler Kapillare überführt und abzentrifugiert (1 min, 2000 UpM, RT, Heraeus Biofuge fresco). Die Amplifikation erfolgte in Light Cycler Maschinen von Roche Applied Science und die Auswertung der erhaltenen Messwerte mit der Software Rel Quant (Roche Moleculare Biochemicals).

3.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

3.6.1  Photometrische Konzentrationsbestimmung

Anhand der Absorption von UV- Licht lassen sich Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren bestimmen. Das Absorptionsmaximum der heterozyklischen Nukleotidbasen liegt bei 260 nm (A260) und das der aromatischen Aminosäurereste bei 280 nm (A280).

Im Spektralphotometer (Beckman DU®640, Krefeld) wurde die Absorption einer Nukleinsäurelösung in einer Quarzküvette bei 260 nm und 280 nm gegen TE- Puffer als Referenz gemessen. Nach dem Lambert- Beer`schen Gesetz entspricht eine Optische Dichte von 1 (OD1) bei 260 nm und bei einem Strahlengang von 1 cm Länge einer Konzentration von 50 µg/ml für DNS, 40 µg/ml für RNS und 35 µg/ml für Oligonukleotide.

↓37

Konzentration [µg/µl]=A260 x Verdünnung x OD6001/1000

Der Quotient A260/A280 gibt Auskunft über den Reinheitsgrad der Lösung und sollte für DNS zwischen 1,8 und 2,0 und bei RNS zwischen 1,9 und 2,1 liegen. Niedrigere Werte deuten auf eine Verunreinigung durch UV- absorbierende Stoffe wie Proteine oder Phenole hin.

3.6.2  Konzentrationsabschätzung durch Agarose- Gelelektrophorese

Mit dieser Methode lassen sich sehr geringe Nukleinsäurekonzentrationen zwischen 1 ng und 100 ng abschätzen, die für eine photometrische Bestimmung zu niedrig sind. Die Konzentrationsbestimmung im ethidiumbromidhaltigen Agarosegel erfolgte über einen Bandenintensitätsvergleich der Probe unbekannter Konzentration mit einer Probe bekannter Nukleinsäurekonzentration. Da die Leuchtintensität des Ethidiumbromids direkt proportional zur DNS- Menge ist, besitzen Banden von gleicher Intensität die gleiche Menge an DNS- Fragmenten.

3.7 Gelelektrophorese zur Größenfraktionierung von Nukleinsäuren

↓38

Das Prinzip der Gelelektrophorese beruht auf dem Verhalten von Nukleinsäuren im elektrischen Feld. Da sie im gelösten Zustand bei neutralem pH- Wert aufgrund ihrer sauren Phosphatgruppen negativ geladen sind, wandern sie zur Anode. Dabei wirkt die Gelmatrix, die die Nukleinsäuren zu durchwandern haben, als molekulares Sieb, das große Nukleinsäure- Moleküle stärker zurückhält als kleine, sowie die Diffusion minimiert. Die Wanderungsgeschwindigkeit dieser Moleküle ist somit näherungsweise umgekehrt proportional zum dekadischen Logarithmus ihrer molaren Masse, auf diese Weise wird eine Größenfraktionierung erreicht.

Im Agarosegel wurden Nukleinsäuren durch interkalierendes Ethidiumbromid detektiert. Ethidiumbromid ist ein aromatischer Fluoreszenzfarbstoff, der bei Anregung mit UV- Licht fluoresziert. Durch zusätzliches Auftragen eines Größenstandards lässt sich die Größe der aufgetragenen Nukleinsäurefragmente bestimmen.

3.7.1  Native Agarose- Gelelektrophorese

Dieses Verfahren wurde zur analytischen und präparativen Auftrennung doppelsträngiger DNS- Fragmente verwendet. Die Agarosekonzentration der Gelmatrix bestimmt den Größenbereich, in dem die höchste Auflösung erreicht wird. Sie wurde den zu erwartenden Fragmentgrößen angepasst.

↓39

Tabelle 16: Auflösungsvermögen von Agarosegelen bei verschiedenen Agarose konzentra tionen

Fragmentgröße in kb:

0,05-0,6

0,15-2

0,3-10

0,5-20

Agarosekonz. in % (w/v):

2,0 %

1,5 %

0,7 %

0,5 %

Abhängig von Probenanzahl und erwünschter Trennstrecke werden kleine (11 bis 22 Proben, 8 x 11,5 cm, 50 ml) oder mittlere (20 bis 40 Proben, 12 x 14 cm, 100 ml) Gelträger ausgewählt. Die Agarose wird im Erlenmeyerkolben abgewogen, die entsprechende Menge Laufpuffer (1x TAE) zugegeben und die Lösung so lange in der Mikrowelle erhitzt, bis die Agarose komplett gelöst ist. Die auf etwa 50 °C abgekühlte gelartige Agarose wurde mit Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von etwa 0,6 µg/µl versetzt und in einen mit Kämmen bestückten Gelträger gegossen. Nach Aushärtung des Gels wurden die Kämme entfernt und das Gel in eine mit Laufpuffer (1x TAE) gefüllte Kammer platziert. Die mit 1/5 Volumen 6x DNS- Ladepuffer versetzten Proben wurden in die Taschen pipettiert und mit 7– 9 V/cm elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde das im Gel enthaltene fluoreszierende Abbild der DNS- Fragmente mit Hilfe des UV- Transilluminators (Pharmacia Biotech Image Master® VDS) photographiert.

3.8 Enzymatische Modifikation und in vitro- Rekombination von DNS 

3.8.1  Spaltung doppelsträngiger DNS mit Restriktionsendonukleasen

Restriktionsendonukleasen vom Typ II erkennen doppelsträngige, palindromischen Nukleotid- Abfolgen zwischen vier und acht Basenpaaren und schneiden meist innerhalb dieser Erkennungssequenz, wodurch ein ringförmiges DNS- Molekül linearisiert oder in definierte Fragmente zerlegt wird. Bei der Spaltung entstehen je nach verwendeter Restriktionsendonuklease glatte Doppelstrang- oder Einzelstrangenden mit 3´- oder 5´- Überhängen. Bei der Spaltung genomischer DNS muss darauf geachtet werden, dass keine methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen wie ClaI, NotI, SalI oder SmaI verwendet werden.

↓40

Die Zugabe von 0,5 µl RNaseA wirkt Verunreinigungen der DNS- Probe durch RNS entgegen.

3.8.1.1  Vollständige Spaltung von DNS

Zur vollständig Spaltungen von Plasmid- DNS wurden etwa 2 U Restriktionsendonuklease pro µg DNS eingesetzt. Analytische Spaltungen (50– 200 ng DNS) werden in einem Endvolumen von 10 µl durchgeführt, präparative Spaltungen nach Bedarf skaliert, wobei die eingesetzte Enzymmenge 1/10 des Reaktionsvolumens nicht überschreiten darf. Entsprechend den Herstellerangaben werden Restriktionsendonukleasen in den mitgelieferten Puffersystemen bei angegebener Temperatur eingesetzt. Gleichzeitige Spaltung einer DNS- Probe mit mehreren Enzymen ist nur bei kompatiblen Pufferanforderungen möglich, ansonsten muss die Probe vor Behandlung mit jedem neuen Enzym umgepuffert werden (vgl. 3.1.7). Die Spaltung erfolgt für mindestens 1 h, bei großen Mengen an DNS auch üN. Viele Restriktionsendonukleasen können gemäß Herstellerangaben hitzeinaktiviert werden.

3.8.1.2  Vollständige Spaltung von genomischer DNS

Zur Analyse von genomischer DNS mittels Southern- Blot- Hybridisierung wurden für die Spaltung in einem Gesamtvolumen von 40 µl 12 µg DNS und 1,5 µl hochkonzentrierte Restriktionsendonukleasen (40 µg/µl, AvaI bzw. HindIII, Roche) eingesetzt. Die Spaltung erfolgte üN, am Morgen wurden noch einmal 0,5 µl Restriktionsendonuklease nachgeben und weitere 3 h verdaut. Die Vollständigkeit des Verdaus wurde mittels eines 1% Ethidiumbromid- Agarosegels überprüft, es wurde 1/20 Vol. des Restriktionsansatzes aufgetragen.

3.8.2  Glätten überhängender einzelsträngiger 5‘- DNS- Enden

↓41

Neben Restriktionsendonukleasen, die die Zielsequenzen glatt schneiden, also keine DNS- Einzelstrangüberhänge entstehen lassen, erzeugen andere Enzyme bei der Spaltung 3´- oder 5´- überhängende Enden. Bei Klonierungen unter Einsatz verschiedener Restriktionsendonukleasen sind diese entstehenden Enden oft nicht kompatibel. Für ein späteres Zusammenfügen solcher Fragmente ist es nötig, diese Überhänge zu glätten. Sollte ein 5´- überhängendes Ende aufgefüllt werden, geschah dies mit Hilfe des Klenow- Fragments der DNS- Polymerase I aus E. coli. 3´-überhängende Enden wurden mittels der Mung Bean- Polymerase abgebaut. Im Verlauf dieser Arbeit wurden 5`- und 3`- überhängende Enden geglättet.

Dem hitzeinaktiviertem Restriktionsansatz (0,1-4 µg DNS) wurden 3 µl Restriktionspuffer (10x Puffer B oder H bzw. Mung Bean- Puffer, Roche) und 1 µl Klenow- bzw. Mung Bean- Polymerase (2 U/µl) zugesetzt. Bei dem Ansatz mit der Klenow- Polymerase wurden zusätzlich noch 1 µl dNTPs (2 mM/µl) zugefügt. Das Gesamtvolumen wurde bei beiden Ansätzen mit A. bidest auf 30 µl aufgefüllt. Die Inkubation der Ansätze erfolgte bei 37 °C für 20 Minuten. Anschließend wurden die Enzyme bei 75 °C für 10 min inaktiviert.

3.8.3  Dephosphorylierung von Vektorenden

Weist der Vektor bei einer in vitro- Rekombination mit Passagier- DNS komplementäre überhängende Enden auf, muss verhindert werden, dass es zu einer Religation des linearisierten Vektorrückgrats kommt, da sonst bei einer Transformation nicht- rekombinante Klone auftreten. Dies wird durch Dephosphorylierung der Vektorenden mit der alkalischen Kälber- Phosphatase (engl. „Calf Alkaline Phosphatase“ (CIP), NewEngland Biolabs, Freiburg) oder der antarktischen Phosphatase (New England Biolabs) erreicht. Damit ist eine Verknüpfung des Vektors durch die T4- Ligase nur über die phosphorylierten 5’- Enden der Passagier- DNS möglich.

↓42

Die nach Spaltung mittels Restriktionsendonukleasen über ein Gel aufgereinigte Vektor- DNS (vgl. 3.1.6) wurde mit 10 units, maximal jedoch 1/10 des Reaktionsvolumens, CIP versetzt; die optimalen Reaktionsbedingungen wurden durch die Zugabe 1/10 Vol. von 10 x CIP- Puffer hergestellt. Nach 30 min Inkubation des Ansatzes im Brutschrank bei 37°C wurde, da die CIP sehr hitzelabil ist, erneut 10 units Enzym hinzugegeben und für weitere 30 min inkubiert. Anschließend wurde die CIP 20 min bei 75 °C im Wasserbad inaktiviert, um zusätzliche Dephosphorylierungen der Passagier- DNS im Ligationsansatz zu verhindern.

3.8.4  Ligation von DNS- Fragmenten

Mit Hilfe der T4- Ligase (Roche Applied Science) lassen sich intra- bzw. intermolekulare Verknüpfungen freier DNS- Enden durchführen. Die Ligation kann zwischen kohäsiven oder glatten DNS- Enden erfolgen. Die T4- Ligase verknüpft ATP- abhängig freie 5’- Phosphatgruppen mit freien 3’- Hydroxylgruppen von DNS- Molekülen durch die Bildung von Phosphodiesterbindungen. Die jeweiligen Stellen, an denen Vektor- und Passagier- DNS noch nicht verknüpft sind, werden nach der Transformation durch Reparaturenzyme des Bakteriums geschlossen.

Vektor- und Passagier- DNS wurden zur Ligation in einem molaren Verhältnis von 1:3 oder 1:6 eingesetzt, je nach Konzentration von Vektor- und Passagier- DNS, wobei das Reaktionsvolumen zwecks häufiger Interaktionsereignisse zwischen den Reaktionspartnern mit 10 bis 15 µl möglichst gering gehalten wurde. Die DNS- Gesamtmenge sollte 100 ng nicht unterschreiten.

↓43

Der Ansatz aus Vektor- und Passagier- DNS, 10x Ligasepuffer (Roche Applied Science) und 1 bis 1,5 µl T4- Ligase (1 U/µl) wurde für 15 min bei RT bei kohäsiven, für 60 min bei RT bei glatten Enden und üN bei 16°C im Thermoschüttler inkubiert. Es ist darauf zu achten, dass der 10x Ligasepuffer nur kurz aufgetaut wird, um einen Abbau des ATP zu vermeiden. Zur Kontrolle der Ligation wurde eine Reaktion mit Vektor- DNS und H2O anstelle von Passagier- DNS durchgeführt.

Soweit nicht anders erwähnt, wurden in dieser Arbeit sowohl Vektor, als auch Passagier- DNS über das Gel aufgereinigt eingesetzt. War eine Religation erwünscht, beispielsweise nach der Deletion einer Schnittstelle, wurde auf Dephosphorylierung verzichtet und das Reaktionsvolumen zur Vermeidung der Entstehung von Konkatemeren erhöht.

3.8.5  Klonierung von PCR- Fragmenten

Zur Klonierung einer bestimmten DNS- Sequenz in einen Vektor und für die in dieser Arbeit vorgenommene Einführung von Punktmutationen bzw. Restriktionsendonukleasen- Schnittstellen eignet sich folgendes Verfahren am besten: Der gewünschte DNS- Abschnitt wird zunächst mittels PCR (vgl. 3.2) amplifiziert. Dabei wurden die Primer jeweils so gewählt, dass sie zum einem zur Einführung der gewünschten Veränderung führen, und zum anderem noch ausreichend komplementäre Sequenz besitzen, um zur sequenzspezifischen Hybridisierung mit der Matrizen- DNS zu führen. Das amplifizierte und dabei an seinen Enden modifizierte DNS- Fragment wurde mit entsprechenden Restriktionsendonukleasen geschnitten (vgl. 3.8.1) und in den Zielvektor einligiert (vgl. 3.8.4). Eine weitere Methode ist die Ligation von PCR- Produkten mit Hilfe der Topoisomerase (Invitrogen, Carlsbad, Californien). Hierfür wurden die bei einer PCR entstehenden Adenin- Überhänge genutzt. Das PCR- Produkt wurde in einen speziellen Plasmid, welcher dem Ligationskit (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen) beiliegt, einkloniert und kann über eine Vielzahl von Restriktionsendonukleasen wieder ausgeschnitten werden.

3.8.6  Methylierung von DNS- Fragmenten

↓44

Mit der CpG Methylase M. SssI (New England Biolabs) können in der DNS auftretende CpG- Motive in vitro methyliert werden. Hierfür wurden die vom Hersteller mitgelieferten Komponenten nach den vorgegebenen Angaben zusammen gemischt und die DNS zugefügt. Die Reaktion erfolgte bei 37 °C im Heizblock (Eppendorf). Anschließend wurde die Methylase bei 65 °C für 20 min nach Herstellerangabe hitzeinaktiviert.

3.9 Transformation

E. coli Bakterien sind in seltenen Fällen in der Lage, DNS aus dem Kulturmedium durch Zellwand und –membran hindurch aufzunehmen (Transformation). Durch besondere Behandlung von E. coli Bakterien des Stamms TOP10 kann die Effizienz dieses Prozesses um ein Vielfaches gesteigert werden. Die Bakterien werden dann als (transformations-) kompetent bezeichnet. Experimentell wird dieser Vorgang dazu genutzt, Plasmid- DNS in größeren Mengen zu gewinnen oder bakterielle Proteinexpressionssysteme zu etablieren. Eine Retransformation liegt vor, wenn durch eine Midi- Präparation (vgl. 3.1.2) bereits aufgereinigte Plasmid- DNS zur Transformation weiterer Bakterien- Kulturen dient.

3.9.1  Herstellung transformationskompetenter, einfrierbarer Bakterien

Bei diesem Verfahren wird die Bakterienzellwand durch Behandlung mit CaCl2 durchlässig gemacht [129 ]. Der entsprechende Bakterienstamm wurde auf einer ggf. antibiotikumhaltigen Agarplatte üN bei 37 °C kultiviert. Mit einer Einzelkolonie wurden 2,5 ml YT++- Medium inokuliert und üN in einem Thermoschüttler (225 UpM, G25, Heraeus) bei 37 °C inkubiert. Mit 200 µl dieser üN- Kultur wurden 5 ml YT++- Medium inokuliert und 1,5 h bei 37 °C geschüttelt (225 UpM, G25 Heraeus). Diese gesamte Vorkultur wurde zu 100 ml vorgewärmtem YT++- Medium gegeben und bis zu einer OD600 von 0,45 bis 0,55 bei 37°C im Thermoschüttler (225 UpM, G25 Heraeus) erneut inkubiert. Anschließend wurde die Kultur auf zwei 50 ml Röhrchen (Falcon, USA) verteilt, 5 min auf Eis abgekühlt und zentrifugiert (5.850 g, 4°C, 5 min, Heraeus Multifuge 3 S-R). Nach vollständiger Entfernung des Kulturmediums wurden die sedimentierten Bakterien im Kühllabor (4 °C) in jeweils 10 ml TFB I resuspendiert, 10 min auf Eis inkubiert und erneut sedimentiert (5,850 g, 4 °C, 5 min, Beckman Ultrazentrifuge). Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Bakteriensedimente im Kühllabor in je 2 ml TFB II aufgenommen, die beiden Ansätze zusammengegeben und nach Aliquotierung von jeweils 200 µl Bakteriensuspension in einem 1,5 ml Schraubdeckelgefäß sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Auf diese Weise sind die kompetenten Bakterien mehrere Monate bei –70 °C lagerbar.

3.9.2  Durchführung der Transformation

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Ein Aliquot eingefrorener Bakterien wird auf Eis aufgetaut, die frischen kompetenten Bakterien auf Eis gelagert. Nach der Zugabe der Plasmid- DNS (1 bis 100 ng) bzw. des Ligationsansatzes und vorsichtigem Durchmischen erfolgte eine 30 minütige Inkubation der Transformationsansätze auf Eis. In dieser Zeit adsorbiert die DNS an die bakterielle Zellwand. Ein anschließender Hitzeschock der Bakterien für 30 bis 90 sec bei 42 °C bewirkt die Aufnahme der DNS. Danach wurden die Bakterien sofort 5 min auf Eis abgekühlt. Die Kultivierung der Bakterien beginnt zunächst in jeweils 250 µl SOC- Medium ohne Antibiotikum für 45 bis 60 min bei 37 °C im Thermoschüttler (225 UpM, G25 Heraeus). In dieser Zeit sollen sich die plasmidkodierten Resistenzeigenschaften der Bakterien ausbilden, welche eine Selektion transformierter Bakterien ermöglichen. Anschließend wurden 10 µl einer Bakterienkultur auf einem Selektionsnährboden mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert. Der Rest der Bakterienkultur wurde abzentrifugiert (30 sec, RT, 13.000 UpM, Heraeus Biofuge fresco) und der Überstand wird bis auf ca. 50 µl dekantiert. Darin wurde das Bakteriensediment resuspendiert und auf einem weiteren Selektionsnährboden ausplattiert. Mit dem Deckel nach unten wurden die angeimpften und getrockneten Agarplatten üN bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.

3.9.3  Identifizierung rekombinanter Klone

Nur transformierte Bakterien, die das Plasmid mit kodiertem Resistenzgen aufgenommen haben, sind in der Lage, in Anwesenheit eines Selektionsantibiotikums, wie z.B. Ampicillin, zu wachsen. Dabei können Bakterien, welche rezirkularisierte Vektoren ohne die gewünschte einligierte Passagier- DNS aufgenommen haben, neben korrekten rekombinierten Klonen existieren. Zu einer Rezirkularisierung von Vektoren kommt es, wenn sie durch die CIP oder antarktische Phosphatase unzureichend dephosphoryliert wurden (vgl. 3.8.3). Der Anteil nicht- rekombinanter Klone wird mit Hilfe eines Selektionsnährbodens abgeschätzt, auf welchem mit dem Kontrolligationsansatz (vgl. 3.8.4) transformierte Bakterien ausplattiert wurden. Korrekt rekombinierte, nicht- und falsch rekombinierte (z.B. mehrfache Insertion der Passagier- DNS) Bakterienklone wurden durch analytische Plasmid- Präparation (vgl. 3.1.1) und anschließende Restriktionsanalyse der gewonnenen DNS (vgl. 3.8.1) mit Hilfe einer Agarose- Gelelektrophorese (vgl. 3.7.1) identifiziert.

3.10 Elektroporation von Bakterien zur homologen Rekombination

Die Elektroporation ist eine weitere Methode, um Bakterien mit DNS zu transfizieren. Die Bakterien werden einem elektrischen Puls ausgesetzt, wodurch kurzzeitig Poren in der Membran entstehen, durch die exogene DNS in das Zytosol gelangen kann. Durch geeignete Selektionsbedingungen können Bakterien, welche die exogene DNS aufgenommen haben, angereichert werden.

3.10.1  Vorbereitung der zu transfizierenden DNS

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Für die Elektroportion der Bakterien mit dem BAC (vgl. 3.10.2) war es erforderlich, saubere DNS zu gewinnen. Es wurde die in 3.1.4 beschriebene Methode angewendet. Die gewonnene BAC- DNS wurde für die Analyse der Reinheit mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut. Der Verdau wurde auf ein Agaroesgel aufgetragen. An Hand des Bandenmusters war die Reinheit der BAC- DNS bestimmbar. Die Banden, die in der Tasche hängen bleiben, weisen auf eine Verunreinigung mit Proteinen hin. In diesem Fall musste die DNS entweder nochmals neu gewonnen oder sie konnte mittels der Natriumacetat- Fällung (vgl. 3.1.7) aufgereinigt werden.

Bei einem zweiten Elektroporationsschritt wurde nur ein kurzes DNS- Fragment elektroporiert, im Falle dieser Arbeit das Insert des Zielgenvektors. Das DNS- Fragment wurde durch Restriktionsendonukleasen aus dem Plasmid geschnitten und über ein Agarosegel aufgereinigt (vgl. 3.1.6).

3.10.2  Methode des ET- Klonierens

Die Methode des ET- Klonierens wurde von Muyers et al. im Jahre 1999 zum ersten Mal als eine Möglichkeit der schnellen, homologen Rekombination beschrieben [113 ]. Wesentlicher Bestandteil der Methode sind die aus einem Phagen stammenden Rekombinasen E und T, welche der Methode auch ihren Namen gaben. Diese beiden Rekombinasen wurden in dem E.coli Stamm EL250 unter einem hitzeinduzierten Promoter exprimiert. Dieses bedeutet, dass die Rekombinasen nur aktiv sind, wenn die Bakterien bei 37 °C gehalten werden. Die Rekombination kann somit sehr gezielt gesteuert werden. Die BACs wurden in dem Bakterienstamm DH10B gehalten, deswegen erfolgte zunächst eine Elektroporation der BAC- DNS in den Bakterienstamm EL250. Die Bakterien mussten vor der Elektroporation noch elektrokompetent gemacht werden. Hierfür wurden sie bis zu einer OD600 von 0,6 wachsen gelassen, in 50 ml Gefäße überführt, danach 15 min bei 42 °C erhitz (Aktivierung der Rekombinasen, bei der ersten Elektroporation nicht notwendig) und 10 min in Eiswasser abgekühlt und anschließend abzentrifugiert (10 min, 10x2,5g, 4 °C, Hereaus Megafuge 1.0R). Die Bakterien wurden in 10 %igem kaltem Glycerin aufgenommen und ein zweites Mal abzentrifugiert (10 min, 10x4g, 4 °C, Hereaus Megafuge 1.0R). Nach diesem Schritt wurde wieder mit 10% igem Glycerin resuspendiert und bei 10x6g abzentrifugiert (10 min, 4 °C, Hereaus Megafuge 1.0R). Ein letzter Zentrifugationsschritt erfolgte bei 10x8g (10 min, 4 °C, Hereaus Megafuge 1.0R) ebenfalls in 10% igem Glycerin. Die Bakterien waren nach diesen Schritten elektrokompetent und konnten mit der DNS vermischt werden. Die DNS wurde wie in 3.10.1 beschrieben aufgereinigt und mit den EL250 vermischt. Es wurden von den Bakterien 26 µl und von der BAC- DNS 0,5-1 µl eingesetzt. Die Suspension wurde in eine Küvette gegeben (1mm, Electroporation cuvette black, Thermo) und elektroporiert. Die Elektroporation wurde für 3,5 sec bei 25 µF, 200 µOhm und 1,8 kV durchgeführt. Die Zellen wurden im Anschluss unter der Sterilbank für 10 min bei RT inkubiert und anschließend auf 10 cm Kulturschalen mit Normalmedium verteilt. Die Suspension wurde anschließend auf LB- Agarplatten ausgestrichen und bei 32 °C unter Ampicillin- (Amp) und Chloramphenicol- (Cam) Selektionsdruck hochgezogen. Der Selektionsdruck garantierte, dass nur Bakterien, die den BAC enthalten hochgezogen wurden. Für die anschließende Elektroporation des Inserts wurden BAC- enthaltende EL250- Bakterien, wie für die erste Elektroporation beschrieben, elektrokompetent gemacht. 100 ng des aufgereinigten Inserts (vgl. 3.10.1) wurden mit den Bakterien vermischt und wie beschrieben elektroporiert. Der Selektionsdruck erfolgte in diesem Schritt mit den Antibiotika Kanamycin (Kan) und Chloramphenicol. Anschließend wurden die BACs mit dem Insert für bessere Wachstumsbedingungen wieder in DH10B Bakterien eingeführt. Auch in diesem Fall erfolgte die Elektroporation wie beschrieben und der Selektionsdruck wieder mit den Antibiotika Cam und Kan.

3.11 Auftragsarbeiten

3.11.1  Sequenzierungen

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Alle Sequenzierungen wurden als Auftragssequenzierungen bei der Firma AGOWA durchgeführt. Die DNS wurde hierzu in A. bidest gelöst versandt. Für die Sequenzierung von GC- reichen Abschnitten mussten spezielle Reagenziensätze, wie z. B. das „GTP-Kit“, verwendet werden.

3.11.2  Methylierungsanalyse

Für die Methylierungsanalyse wurden aus den ex vivo isolierten und kultivierten Zellen die genomische DNS mit Hilfe des DNeasy Tissue Kit (50) (Qiagen) gewonnen. Die Methylierungsanalyse der DNS wurde bei der Firma Epiontis (Berlin) durchgeführt. Für dies Analyse waren eine Bi- Sulfitrektion und eine Sequenzanalyse der gewünschten Bereiche von Nöten. Bei der Bi- Sulfitierung der DNS werden alle unmethylierten Cytosin durch eine hydrolytische Deaminierung in Uracil umgewandelt. Durch die anschließende Sequenzierung der gewünschten Region können nach einer erfolgreichen Bi- Sulfitierung methylierte Cytosine von unmethylierten Cytosinen unterschieden werden, da nur unmethyliertes Cytosin in Uracil umgewandelt wird.

3.12 Transfer von Nukleinsäuren

Der Transfer von Nukleinsäuren auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran und ihre damit verbundene Immobilisierung ermöglicht die Detektion spezifischer Nukleinsäuremoleküle nach Anlagerung einer z.B. radioaktiv oder Biotin- markierten DNS- Sonde. Nylonmembranen haben gegenüber Nitrozellulosemembranen den Vorteil höherer Bindungskpazität und Haltbarkeit. Dies ermöglicht mehrmaliges Hybridisieren einer Membran, beispielsweise mit verschiedenen DNS- Sonden.

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Mittels Kapillarkräften wurden einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle auf Nylonmembranen übertragen. Anschließen wurden sie mit Hilfe von Hitze (15 min, 120 °C) und/oder UV- Kreuzvernetzung auf der Membran immobilisiert.

3.12.1  Transfer von DNS (Southern- Blot)

Gespaltene genomische DNS (~20 µg) wurde über Agarose- Gelektrophorese (vgl. 3.7.1; mittlerer Größe, 100 ml, 0,5% TAE,1% Agarose) aufgetrennt (33V, 20-22 h) und durch Anlegen eins Fluoreszenzlineals als Größenmaßstab unter dem UV- Transilluminator (Pharmacia Biotech Image Master® VDS) dokumentiert. Beim sogenannten Southern- Blot wird DNS aus einem Agarosegel durch Kapillarsog auf eine Nylonmembran (Hybond N+, Amersham) übertragen [130 ]. Zur Depurinierung der DNS wurde das Gel 10 min in 0,25 M HCl auf einer Wippe (10 UpM, GFL 3013) bei RT inkubiert. Das Gel wurde mit A. bidest gespült, 30 min bei RT auf der Wippe (10 UpM, GFL 3013) denaturiert (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl). Beim Aufbau des Blots wurde eine Glasplatte quer auf eine mit 1 l Transferpuffer (0,25 M NaOH,1,5 M NaCL) gefüllte Melaminschale gelegt. Auf dieser Glasplatte liegen zwei mit Transferpuffer angefeuchtete 3MM- Papiere, das mit den Taschenöffnungen nach unten liegende Gel, welches bündig mit Parafilmstreifen umlegt wurde. Hierdurch wirken später die Kapillarkräfte nur im Bereich des Gels. Auf das Gel wurde eine von A. bidest angefeuchtete und in Transferpuffer äquilibrierte Nylonmembran gelegt, so dass das Gel vollständig bedeckt wurde. Auf die Membran wurden zwei in Puffer getränkte 3MM- Papiere in Gelgröße gelegt. Luftblasen mussten beim Blot- Aufbau vermieden bzw. entfernt werden. Der Blot- Aufbau wurde mit zwei 15 cm hohen Stapeln Handtuchpapier (Tork) abgeschlossen sowie mit einer Glasplatte und einem Gewicht (etwa 500g) stabilisiert und beschwert. Der Transfer fand üN oder übers Wochenende statt. Mit Bleistift wurde beim Abbau die Position der Geltaschen auf der Nylonmembran markiert. Die Nylonmembran wurde nach dem Abbau in 2x SSC gewaschen, um Gelreste zu entfernen und Salzkristallbildung zu vermeiden. Nachdem die Membran 1 h bei RT getrocknet wurde, wurde die DNS UV- vernetzt (UV Stratalinker® 2400, Stratagene). Die Vollständigkeit des DNS- Transfers wurde durch Betrachten des Gels auf dem UV- Transilluminator (Pharmacia Biotech Image Master® VDS) und der Membran unter der UV- Handlampe (Bachofer HL 6M, 302 nm) überprüft.

3.13 Chemilumineszenter Nachweis von Nukleinsäuren und Hybridisierung mit einer markierten Sonde

Komplementäre Sequenzen können auf Nylonmembranen durch Hybridisierung mit einzelsträngigen Biotin- markierten DNS- Molekülen nachgewiesen werden. Die Stabilität der durch Basenpaarung entstehenden Hybridmoleküle ist vom Komplementaritätsgrad der beiden Moleküle abhängig. Da die Stringenz, d.h. die Selektivität der Hybridisierung, durch die Temperatur beeinflusst wird, kommen unspezifische Paarungen kaum vor, wenn die Temperatur nahe am Schmelzpunkt ideal gepaarter Hybridmoleküle liegt. Die Temperatur kann ohne Verlust der Stringenz durch Zugabe von Formamid, welches Wasserstoffbrücken- Bindungen destabilisiert, auf 42 °C gesenkt werden. Hierdurch werden die Arbeitsschritte erleichtert und die DNS- Moleküle weniger beschädigt als bei Temperaturen um 65 °C.

3.13.1  Herstellung Biotin- markierter Sonden

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Für die Herstellung der Sonden wurden die gewünschten DNS- Fragmente mittels PCR (vgl. 3.2) amplifiziert. Die DNS- Fragmente (5 ng – 1 µg) wurden nach dem Herstellerprotokoll mit Biotin markiert (NEBlot Phototope Kit, New England BioLab). Die markierten Sonden werden in 20 µl TE- Puffer aufgenommen und bei –20 °C eingelagert.

3.13.2  Vorhybridisierung

Zur Hybridisierung wurde die Nylonmembran mit gebundenen Nukleinsäuren mit der DNS/RNS- Seite nach innen aufgerollt und in eine Hybridisierungsröhre überführt. In die auf 42 °C erwärmte Hybridisierungslösung wurden 50 µl gescherte Heringssperma- DNS ( 5 min denaturiert, 5 min auf Eis, 10 mg/ml, Invitrogen) gegeben, die Hybridisierunslösung gut durchmischt und die Membran für 3 h bei 42 °C im Rollinkubator (GFO 7601) vorhybrisidiert. Dieser Schritt diente der Blockierung aller unspezifischen Bindungsstellen durch die Heringssperma- DNS.

3.13.3  Hybridisierung

Zur Hybridisierung wurde in die Hybridisierungslösung 5 min hitzedenaturierte, biotinylierten Sonde gegeben, die Hybridisierunslösung gut durchmischt und die Membran üN bei 68 °C im Rollinkubator (GFO 7601) hybridisiert. Die Menge der eingesetzten Sonde wurde nach Herstellerangaben (Amersham, Freiburg) errechnet und eingesetzt. Während der Hybridisierung band die Sonde spezifisch unter Verdrängung der unspezifisch gebundenen Heringssperma- DNS an die Zielsequenzen.

3.13.4  Waschen

↓50

Nach der Hybridisierung wurde unspezifisch gebundene Sonde durch Waschen der Membran entfernt. Das Waschen erfolgte im Schüttelwasserbad (60 UpM) bei RT mit unterschiedlichen Waschlösungen in folgender Reihenfolge:

2x 5 min 2,0x SSC/ 0,1% SDS

2x 5 min 0,1x SSC/ 0,1% SDS bei 68 °C

↓51

Danach konnte die Detektionsreaktion erfolgen.

3.13.5  Chemilumineszente Detektion

Die Detektionsreaktion wurde genau nach Herstellerangaben durchgeführt. Es wurde das Phototope Star Detection Kit (New England Biolabs) verwendet. Der letzte Schritt erfolgte lichtgeschützt und die Membran wird luftblasenfrei in Folie eingeschweißt und in eine BioMax Kassette (Kodak) eingelegt. Die Exposition erfolgt sehr schnell und die Entwicklung der Filme (x-ray, Amersham) erfolgt 30 sec bis 10 min nach Auflage der Filme. Zur leichteren Orientierung nach der Entwicklung des Films wurde nach dem Einschweißen Markierungen auf der Folie gemacht, welche auf den Film übertragen wurden. Über die Markierung der Taschen ließen sich die Größen der Fragmente bestimmen. Die Entwicklung des Films wurde in einer Entwicklermaschine durchgeführt (Agfa Curix 60).

3.14 Chromatin Immun- Präzipitations- Test (ChIP)

Bei einem ChIP- Test werden die Zellen permeabilisiert und die Proteine an die DNS fixiert. In dieser Arbeit wurde der gesamte ChIP- Test mittels des Chromatin immunoprecipitation (ChIP) Assay Kits (upstate, Schwalbach) durchgeführt. Hierfür wurden zuerst die Zellen durch Formaldehyd fixiert und anschließend mit Proteinase- Inhibitoren gewaschen und durch SDS-Lysis- Puffer lysiert. Nach diesem Schritt wurde die DNS mit den fixierten Proteinen sonifiziert, so dass etwa 1 kb große DNS- Fragmente entstehen. Anschließend wurden die an DNS Fragmente fixierten Proteine nach Herstellerangaben weiter behandelt. Das Prinzip beruht auf den spezifischen Bindungen von Antikörpern gegen die von der DNS gebundenen Proteinen bzw. deren Proteinmodifikationen. In dieser Arbeit wurden die Antiköper gegen acetyliertes H3 und H4, sowie trimetyhliertes Lysin 4 des Histon 4 verwendet. Mit Protein Agarose Beads (upstate) gegen den primären Antikörper werden die Antikörper- Protein- DNS Komplexe präzipitiert. Bei diesem Schritt wird zur Verhinderung unspezifischer Bindungen an die Agarose denaturiertes Heringssperma zugegeben. Um die Agarose wieder von den DNS- Protein Komplexen zu trennen, wurde die gesamte Suspension mit Puffern mit steigender Salzkonzentration (Menge und Konzentration nach Herstellerangaben) gewaschen. Hierbei war wichtig, dass die Waschschritte bei RT stattfinden, aber die Zentrifugationsschritte zwischen den einzelnen Puffern bei 4 °C durchgeführt wurden. Die DNS wurde über mehrere Elutionsschritte mit einer gepufferten Lösung und einem abschließenden Schritt durch die Zugabe von 5 M NaCl bei 65 °C von den fixierten Proteinen befreit. Für die Quantifizierung der präzipitierten DNS- Fragmente wurde die Methode der RTQ- PCR mit Primern für die Region von Interesse durchgeführt. Hierfür musste die DNS in einem sehr sauberen Zustand vorliegen. Um dieses zu erreichen, wurde die DNS mit dem NucleoSpin ExtractionII Kit (Macherey- Nagel, Düren) aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte strikt nach Herstellerangaben.

↓52

3.15 Methoden der Zellkultur von isolierten Mauszellen und Zelllinien der Maus

Ex vivo isolierte murine Zellen aus Milz und Lymphknoten wurden in Heraeus- Inkubatoren in einer wassergesättigten Atmosphäre bei 37 °C inkubiert. Sie lassen sich bei einem CO2- Gehalt von 5 % in Zellkulturplastikgefäßen kultivieren. Beim Arbeiten mit den Zellen wurden mit der Ausnahme der verwendeten Glas- Pasteur- Pipetten sterile Einmal- Plastik- Materalien verwendet (Castor). Alle Zentrifugationsschritte wurden bei 1200 UpM für 8 min in einer Heraeus Megafuge 1.0R bei 4 °C oder RT durchgeführt. Murine Zellen, die Zelllinien 293Heck und RLM-11 wurden in RPMI und alle anderen Zelllinien in DMEM Vollmedium kultiviert (vgl. 2.8).

3.15.1  Auftauen von Zellen

Die in Einfrierröhrchen (NUNC) in flüssigem Stickstoff gelagerten Zellen wurden schnell in einem 37 °C- Wasserbad aufgetaut. Anschließend wurde die Zellsuspension in 50 ml Kulturmedium gefüllt, durchmischt und zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstands wurde das Zellsediment in einem gewünschten Volumen Medium resuspendiert und auf ein Kulturgefäß gewählter Größe ausgesät.

3.15.2  Einfrieren von Zellen

↓53

Zum Einfrieren wurden die Zellen sedimentiert und in Einfriermedium mit 20 % (v/v) DMSO resuspendiert und auf Einfrierröhrchen verteilt. Die Menge des Einfriermedium wird durch die Zellzahl bestimmt, ein ml Medium für 1x107 bis 1x108 Zellen. Die Röhrchen wurden für mindesten 4 h bei -70 °C eingefroren und anschließend in flüssigem Stickstoff gelagert.

3.15.3  Zellzahlbestimmung

Für die Zellzahlbestimmung wurden die Zellen in einem Verhältnis von 1:10 mit Trypanblau vermischt. Tote Zellen nehmen diesen Farbstoff an und wurden somit blau gefärbt. Die Zellsuspension wurde auf eine Neubauerzählkammer gegeben und alle lebenden Zellen wurden in den vier Quadranten ausgezählt. Die Gesamt- Zellzahl wurde nach folgender Formel berechnet:

n/4*Verdünnungsfaktor*Kulturvolumen*104

3.15.4  Passagieren von adhärenten Zellen

↓54

Nach vollständiger Abnahme des Kulturmediums wurde der Zellrasen zur Entfernung aller Mediumreste und toter Zellen zweimal mit PBS (37 °C) gewaschen. Durch Zugabe von 1/15 Kulturvolumen Trypsin bei den kleinen Schalengrößen und 1/7 Kulturvolumen Trypsin ab der 6- Loch- Schale wurden die adhärent wachsenden Zellen in einer fünfminütigen Inkubation bei 37 °C vom Kulturgefäßboden abgelöst und durch Klopfen und/oder Schwenken des Kulturgefäßes vereinzelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Kulturmedium (vierfaches Volumen des eingesetzten Trypsin) abgestoppt und die Zellen anschließend sedimentiert. Das Sediment wurde in einem geeigneten Volumen frischen Mediums resuspendiert und entweder in gewünschter Dichte ausgesät, eingefroren (vgl. 3.15.2) oder zur Transfektion verwendet (vgl. 3.18).

3.15.5  Ex vivo Isolierung von murinen Lymphozyten

Für die Isolierung von murinen Lymphozyten wurden 6-8 Wochen alten Mäusen die peripheren und mesenterialen Lymphknoten und die Milz entnommen. Die Organe wurden zerkleinert und durch ein feinmaschiges Sieb (Rotilabo- Rundsiebe, Roth) zur Gewinnung einer Einzelzellsuspension gedrückt. Die Zellen wurden abzentrifugiert (zur Vermeidung von großen Fettanhäufungen bei RT) und durch ein weiteres Sieb gegeben (Cell Strainer, 70 µm, BD). Die Zellen konnten nun für die weitere Isolation mit entsprechenden Antikörperen gefärbt und mit magnetischen Beads markiert werden (vgl. 3.15.6). Nach diesem Schritt mussten die gefärbten und mit Beads markierten Zellen für die Sortierung am Automacs gefiltert werden (Preseperationfilter, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach). Bei diesem Schritt war es wichtig, PBS und nicht Medium zu verwenden, da die Sortierung am Automacs durch die einzelnen Mediumkomponenten gestört wird. Je nach gewünschten Phänotyp der zu isolierenden Zellen mussten die Färbeschritte und Sortierungen wiederholt werden. Der Automacs (Miltenyi Biotch) wurde nach Herstellerangaben verwendet.

3.15.6  Färbung von Zellen

Die Färbung von Zellen beruht auf der Bindung von Antikörpern an ihr Antigen. Bei allen Färbungen wurde Antigen- spezifische mit Fluoreszenz- Molekülen markierte Antikörper (vgl. 2.9) eingesetzt. Die Färbung mit Antikörpern erfolgte in PBS/BSA für 15 min auf Eis im Dunkeln. Die Antikörper wurden entsprechend der austitrierten Vorgaben in einem 100 µl Färbeansatz eingesetzt. Bei allen Färbungen wurde zur Blockade von unspezifischen Bindungen 20 µg/ml anti Fcγ Rezeptor zum Färbeansatz hinzugefügt. Die Markierung mit Beads (Miltenyi) wurde ebenfalls für 15 min, aber bei 4 °C durchgeführt. Zwischen den einzelnen Färbeschritten wurden die Zellen mit PBS/BSA gewaschen.

3.15.6.1  Foxp3- Färbung

↓55

Die Foxp3- Färbung der Zellen erfolgte nach dem Protokoll der Firma eBioscience. Es wurde die eingesetzte Menge Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer, sowie der Permeabilisierungspuffer um die Hälfte reduziert. Der Foxp3- Antikörper wurde wie vorgeschlagen 1µg auf 1x106 Zellen eingesetzt.

3.15.7  Kulturbedingungen

Die CD4+CD25+ oder CD4+CD25- T- Zellen wurden mit an den Boden des Kulturgefäßes gebundenen 6 µg αCD3 und 4 µg αCD28 für 48 h stimuliert. Nach sechs Tagen erfolgte eine weitere Stimulation der T- Zellen mit 2 µg αCD3 und 1 µg αCD28 für 48 h. Über den gesamten Verlauf der Kultur wurde den T- Zellen 10 ng/ml IL-2 (rmIL-2, R&D, Minneapolis) und bei den CD4+CD25- T- Zellen 5 ng/ml TGF-β (porcine TGF-β1, R&D, Minneapolis) zugegeben. Die Kulturen der CD4+CD25+ und der Kontrollpopulation der CD4+CD25- T- Zellen erfolgte unter den gleichen Bedingungen ohne TGF-β.

3.16 Durchflusszytometrische Analyse 

Die Analyse mittels Durchflusszytometrie erlaubt die Untersuchung der Expression verschiedener Oberflächenproteine und intrazellulärer Proteine auf Einzelzellebene. Alle in dieser Arbeit dargestellten Messungen wurden am FACS Calibur (BD Bioscience) vorgenommen. Die markierten Zellen passieren nacheinander zwei Laserstrahlen, einen 488 nm Argonlaser und einen 635 nm Diodenlaser. Hierdurch werden die Fluorochrome zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, gleichzeitig streuen die Zellen das Licht. Man unterscheidet zwischen Vorwärtsstreulicht (FSC), welches in einem geringen Winkel von 3-10° gestreut wird und dem Seitwärtsstreulicht (SSC), welchem dem um 90° reflektierte Licht entspricht. FSC korreliert mit der Zellgröße und SSC mit der Granularität und Membranfaltung der Zelle. Diese beiden Signale werden im Gegensatz zum Fluoreszenzlicht (logarithmisch) in einer linearen Verstärkung aufgenommen. Zur Messung des Fluoreszenzlichtes unterschiedlicher Wellenlängen gibt es unterschiedliche Systeme aus Bandpassfiltern und Photoröhren. Über die Anregung mit dem Argonlaser wurden die Fluoreszenzen der Wellenlängen 530 nm (FL1), 585 nm (FL2) und 650 nm (FL3) und über den Diodenlaser die Fluoreszenz der Wellenlänge 661 nm (FL4) gemessen. Tote Zellen und Bruchstücke wurden durch ihre Lage im FSC bzw. SSC ausgeschlossen, bei der Messung von unfixierten Zellen zusätzlich über die Anfärbung mit Propidiumiodid (PI). Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Software „CellQuest- Pro“ (BD Bioscience). Durch Setzen von elektronischen Analysefenstern wurden die gewünschten Zellpopulationen analysiert.

3.17  In vitro Proliferations- Test

↓56

Dieser Test wurde in 96- Well- Platten mit rundem Boden in einem Kulturvolumen von 200 µl RPMI- Medium für 72 h durchgeführt. Es wurden 1x105 ex vivo isolierten T- Zellen (vgl. 3.15.5) kultiviert. Die T- Zellen wurden durch die Zugabe von 1 µg/ml löslichem CD3 und 2x105 Antigen präsentierenden Zellen (APZ) stimuliert. Die APZ sind CD90 depletierte Zellen. Die T- Zellen setzen sich aus CFSE- markierten naiven T- Zellen (CD4+CD62Lhigh) und den möglichen Tregs zusammen. Für die CFSE- Färbung müssen die naiven T- Zellen zweimal mit PBS gewaschen und auf 1x107 Zellen pro ml eingestellt werden. Das CFSE wurde entsprechend einer Endkonzentration von 2,5 µM eingestellt und die Zellen in der Färbelösung resuspendiert. Die Inkubationszeit betrug 2 min und 40 sec bei RT, danach wurden die Zellen in kaltem RPMI- Medium zweimal gewaschen. An Hand der CFSE-Markierung konnte man die Proliferationsrate der naiven Zellen bestimmen. Bei jeder Teilung wird der Farbstoff CFSE gleichmäßig auf beide entstandenen Zellen verteilt, so dass ein schwache CFSE-Markierung der Zellen für eine hohe Proliferationsrate steht. In dem in vitro Proliferations- Test bedeutet wenig CFSE und viele Teilungspopulationen, dass die naiven Zellen proliferiet sind und nicht durch die anwesenden Tregs supprimiert wurden. Wenige Teilungspopulationen und geringe CFSE- Verdünnung bedeutet, dass die naiven T- Zellen von den Tregs supprimiert wurden und nicht proliferiert sind.

Die Zellzahl der einzelnen Populationen wurde durch das Verhältnis der naiven Zellen zu den Tregs bestimmt und überschreitet die vorgegebene Menge von 1x105 Zellen nicht. Die drei Zellpopulationen, APZ, naive und regulatorischen Zellen wurden zusammenpipetiert und nach 72 Stunden wird die Verdünnung der CFSE- Markierung der naiven T- Zellen per Durchflusszytometrie (vgl. 3.16) analysiert. Als Kontrollen diente die Proliferation von naiven Zellen in Abwesenheit von Tregs (positiv Kontrolle) und unstimuliert naive T- Zellen (negativ Kontrolle).

3.18 Amaxa Transfektionen

Für die Transfektion bzw. Nucleofektion wurde der Nucleofector der Firma Amaxa genutzt. Ebenfalls wurden die benötigten Komponenten, Medium, Nucleofectorsolution etc. von Amaxa verwendet. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann auf die gewünschte Zellzahl eingestellt. Pro Transfektion bzw. Küvette wurden 1x106 Zellen eingesetzt. Zu diesen Zellen wurden 95 µl Nucleofectorsolution zugegeben. Hierbei ist zu bedenken, dass diese Lösung toxisch für die Zellen ist und nach spätestens 15 min mit Medium verdünnt werden muss. Es wurden von den Luciferase- Plasmiden 1-4 µg DNS und von dem pTKRenilla Kontrollplasmid 200 ng DNS transfiziert. Die Zellen in der Nucleofectorsolution wurden in Küvetten überführt und mit dem Programm W-01 für naive und A-23 für die Zelllinien nucleofektiert. Nach der erfolgreichen Nucleofektion wurde die Zellen in 1,5 ml IMDM Medium überführt und auf 12-Well Platten gegeben. In diesen 1,5 ml Medium mussten die Zellen für 3 bis 4 h ruhen und wurden dann gewaschen und in zwei ml frischem IMDM- Medium weiterkultiviert und je nach Ansatz stimuliert. Die Zelllinien wurden nach der Transfektion mit 10ng/ml PMA für 24 Stunden und die naiven T- Zellen wurden mit an den Boden des Kulturgefäßes gebundenen 6 µg αCD3 und 4 µg αCD28 für 48 h stimuliert.

3.19 Adaptiver Transfer von CD4+CD25+ T- Zellen

↓57

Für die Analyse des Verhaltens von Zellpopulationen in vivo wurde die Methode des adaptiven Transfers genutzt. Hierfür werden 2x106 CD4+CD25+T- Zellen mit CFSE markiert (vgl. 3.17) und anschließend in syngene Mäuse i.v. gespritzt. Nach 14 Tagen wurden die Zellen der Milz, dem peripheren und mesenterialen Lymphknoten entnommen und auf CD4, CD25 und Foxp3 (3.15.6) gefärbt und mit der durchflusszytometrische Analyse untersucht (vgl. 3.16).

3.20 Diphtheria Toxin Gabe zur Depletion von Tregs in den DEREG- Mäusen

Die Toxine von Merck und Sigma wurden nach Herstellerangabe gelöst und als Aliquots bei -80 °C eingefroren. Jedes Aliquot wurde nur dreimal aufgetaut, da das Toxin bei RT instabil wird. Um ein frühzeitiges Auftauen zu verhindern, wurden die Aliquots auf Trockeneis transportiert. Bei den ersten Depletionsversuchen wurden den WT- und DEREG- Tieren jeden Tag 1 µg DT s.c. (subkutan) verabreicht. Bei dem Vergleich der beiden Toxine von Merck und von Sigma wurde den Tieren 1 µg Toxin nur jeden zweiten Tag s.c. gespritzt. Zur Überprüfung der Depletion wurden die Zellen nach zweimaliger DT- Gabe am Tag 3 ex vivo isoliert (vgl. 3.15.5) und auf CD4, CD25 (vgl. 3.15.6) und Foxp3 (vgl. 3.15.6.1) gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Die Histologie erfolgte im Labor von Christoph Loddenkemper am Charité Campus Benjamin Franklin in Berlin Steglitz.

3.21 Dualer Luciferase- Test

Die mittels Nucleofektion transfizierten und anschließende stimulierten Zellen (vgl. 3.18) wurden in 2 ml Eppendorftubes überführt und abzentrifugiert (2500 UpM, 4 °C, Eppendorf Centrifuge 547R, Eppendorf, Wesseling). Den einzelnen Proben wurden durch die Zugabe von 100 µl 1x Lysispuffer (PLB, Promega, Mannheim) und Inkubation für 15 min bei RT im Thermomixer comfort (Eppendorf) lysiert. Die Lysate bzw. Membranbestandteile und weitere Proteinreste wurden bei 13.000 UpM (4 °C, Eppendorf Centrifuge 547R, Eppendorf) sedimentiert. Für den Test wurden 40 µl des Überstandes eingesetzt. Die Zugabe der beiden Substrate, zum einem das Firefly Substrat (Promega) und zum anderen das Renilla Substrat (Promega) zu den einzelnen Proben erfolgte durch eine automatische Einspritzanlage. Die Aktivität der Renilla- Luciferase dient der Normalisierung der einzelnen Proben auf deren Aktivität die Firefly- Aktivität bezogen wird (vgl. Formel). Das Renilla Substrat beinhaltet zusätzlich noch eine inaktivierende Substanz, welche die Aktivität der Firefly- Luciferase stoppt. Die Lumineszenz der beiden Luciferasen wurde durch ein Luminometer (BD, Heidelberg) gemessen. Nach der erfolgreichen Messung erfolgte die Berechnung der relativen Licht units (RLU) nach folgender Formel:

↓58

(Renilla Aktivität)/(höchste Renilla Aktivität im Experiment)*(Firefly Aktivität)

Mittelwert der Triplikate ergibt RLU


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09.04.2009