4 Ergebnisse

4.1 Erzeugung einer transgenen Foxp3- Reportermaus

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Ziel des Projektes war die Erzeugung einer transgenen Reportermaus, die zusätzlich zur endogenen Foxp3- Expression noch ein Reportergen unter der Kontrolle des Foxp3- Promoters exprimiert. Die Repotermaus bietet den Vorteil, dass Foxp3+ T- Zellen über das Reportermolekül lebend sortiert werden können. Hier für sollte ein BAC in embryonale Stammzellen eingeschleust werden, der große Bereiche des foxp3- Lokus enthält, aber durch die Rekombination mit dem Reportergen die Expression des Foxp3- Gens im ersten Exon abgebrochen wird. Die BAC- Technologie bietet einem die Möglichkeit, in relativ kurzer Zeit die gewünschte Maus fertig zu stellen. Bei dieser Methode muss man im Gegensatz zur klassischen „Knock Out“ oder „Knock In“ Technologie nicht auf embryonale Stammzellklone selektieren, bei denen eine homologe Rekombination stattgefunden hat, sondern nur auf rekombinierte Klone. Dieser Schritt wird dadurch deutlich schneller und einfacher in der Überprüfung der Klone. Ein weiterer entscheidender Grund für die Herstellung einer transgenen BAC- Reportermaus war, dass Foxp3 auf dem X-Chromosom liegt und ein „Knock Out“ bzw. „Knock In“, welcher das endogene Foxp3 zerstört, bei allen männlichen und homozygoten Tieren zu embryonaler Letalität führt (vgl. „scurfy“- Maus, (28); (29); (30)). Mittels des transgenen BACs erhält man die Möglichkeit, Foxp3+ Zellen über das Reporterprotein eYFP (enhanced Yellow Fluorescence Protein) zu identifizieren und zu analysieren und verliert nicht die Expression des endogenen Foxp3- Gens. Die Tregs behalten ihre suppressiven Eigenschaften und es kommt nicht zum von Brunkow und Ramsdell beschriebenen „scurfy“ Phänotyp [131 ].

4.1.1  Strategie zur Erzeugung einer BAC- transgenen Maus mit einem Reportergen im foxp3-Lokus

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Durch die Erzeugung einer BAC- transgenen Maus erhält man die Möglichkeit, wie in der Einleitung erläutert, eine Veränderung in den Mäusen bzw. Zellen vorzunehmen, ohne den endogenen Lokus zu verändern. Im Falle der hier vorgenommenen Veränderung am foxp3- Lokus wurde in dem BAC im ersten Exon des Foxp3- Gens mittels homologer Rekombination das Gen für das Reporterprotein eYFP, ein Polyadenylierungssignal (Poly A) sowie eine duale Resistenzkassette eingeführt. Es wurden für die Rekombination drei BAC- Klone des RZPDs (RPCIB731D08143Q2; RPCIB731H05147Q2; RPCIB731H08362Q2) verwendet. Diese drei Klone wurden gewählt, da auf ihnen der foxp3- Lokus in der Mitte des gesamten BACs liegt und man sich daher relativ sicher sein kann, dass möglichst viele der up- und downstream liegenden regulativen Elemente im BAC enthalten sind. Für die Rekombination wurde der in Abbildung 4-1 dargestellte Zielgenvektor kloniert. Der Vektor besteht aus folgenden Elementen:

1. Die kodierende Region des eYFPs zusammen mit einem PolyA des Virus Simian vacuolating 40 (SV 40) wurde dem Vektor IRES-eYFPpA-IL-2neo (zur Verfügung gestellt von Markus Mohrs, Saranac Lake, USA) entnommen und in ein pBSK (pBluescript) Plasmid über vorhandene Schnittstellen eingefügt.

2. Für die Selektion in den Bakterien und in den embryonalen Stammzellen (ES- Zellen) wurde eine duale Kassette mit einer Kanamycin- und einer Neomycinresistenz ebenfalls in das Plasmid pBSK kloniert. Die Kassette ist von zwei frt- Erkennungssequenzen flankiert, die es einem ermöglichen, nach erfolgreicher Selektion von ES- Zellen die Selektionskassette mit Hilfe der flp- Rekombinase zu entfernen. Dieses ist entweder mit Hilfe eines Flp- Expressionsplasmids direkt in den ES- Zellen oder später durch Kreuzung der BAC- transgenen Maus mit einer Rekombinase exprimierenden transgenen Maus möglich.

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3. Für eine erfolgreiche homologe Rekombination des Zielvektors mit der BAC- DNS wurden mittels PCR die 5` und 3`homologe Region des Foxp3- Gens gewonnen. In dieser Arbeit wurden Regionen mit einer Größe von 300bp für die 5` und von 265bp für die 3`Region erstellt, da bei der hier verwendeten Methode des ET- Klonierens die homologen Regionen im Vergleich zu den Regionen bei der Technologie des „Knock In“ bzw. „Out“ nicht größer sein müssen.

Abbildung 6: Schema für die homologe Rekombination des Repotergens eYFP mit der kodierenden Region des Foxp 3- Gens

Abkürzungen: HR= homologe Region; frt= frt- Erkennungssequenz; neo= Neomycin; kan= Kanamycin; eYFP= enhanced Yellow Fluorescence Protein

4.1.2  Klonierung des Zielgenvektors pBSK5`eYFPSVneo/kan3`

4.1.2.1  Einführung der kodierenden Region des eYFPs und des SV40PolyA

Die kodierende Region von eYFP und das PolyA des Virus SV40 wurden durch Restriktion mit den Endonukleasen KpnI und XhoI aus dem Vektor IRES-eYFPpA-IL2neo geschnitten. Der Vektor pBSK wurden ebenfalls mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und XhoI geöffnet. Das Fragment bestehend aus eYFP und SV40PolyA konnte somit zielgerichtet in den Vektor pBSK kloniert werden (vgl. Abb. 4-2). Es musste somit anschließend nicht die Orientierung des Fragmentes im Vektor überprüft werden. Die Ligation wurde mit Hilfe der KpnI, NcoI und XhoI Restriktionen überprüft.

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Wie in Abbildung 4-2 zu erkennen wurde durch diese Restriktion mit den Endonukleasen KpnI und XhoI ein Teil der IRES (Internal Ribosom Entry Site) mit in den Zielgenvektor kloniert. Dieser Teil wird im nächsten Schritt durch die Einführung der 5`Homologie jedoch wieder entfernt (vgl. 4.1.2.2).

Abbildung 7: Klonierung des Zielgenvektors pBSK5`eYFPSVneo/kan3`

Die Selektionskassette frt-neo/kan-frt wurde mit den Endonukleasen BamHI und EcoRI, die kodierende Region des eYFP Gens zusammen mit dem SV40PolyA mit den Endonukleasen KpnI und XhoI geschnitten und in den Vektor pBSK eingebracht. Die homologen Regionen (HR) des foxp3- Lokus wurden mittels PCR amplifiziert und dann mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen geschnitten und ebenfalls in den Zielgenvektor pBSK kloniert.

4.1.2.2  Erzeugung der homologen Regionen

Die Erzeugung der homologen Regionen erfolgte mittels eines PCR- Mutagenese Ansatzes, bei dem die notwendigen Schnittstellen zur Klonierung in den Zielgenvektor in die homologen Bereiche eingeführt wurden. Mit Hilfe der Primer 5`Fragmenthin bzw. -rück und 3`Fragmenthin bzw. –rück (vgl. Tabelle 2-4) wurden die beiden Regionen mit dem BAC als Template für den PCR- Ansatz amplifiziert. Die entstandenen PCR- Produkte wurden mit den Endonukleasen KpnI und NcoI für die 5` und BamHI und EcoRI für die 3` homologen Bereiche geschnitten. Der Zielgenvektor wurde ebenfalls zuerst mit den Endonukleasen KpnI und NcoI geschnitten und der 5`homologe Bereich eingebaut. Durch diesen Schnitt wurden auch die Teile der IRES entfernt, die durch den in Abschnitt 4.1.2.1 beschriebenen Schritt noch vorhanden waren. Die erfolgreiche Ligation wurde mittels Restriktion mit den Endonukleasen KpnI, NcoI und XhoI überprüft.

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Die in Abbildung 4-3 dargestellten Restriktionen zeigten die erwarteten Banden von 3kb, 1kb und 300bp. Die drei isolierten Klone beinhalteten alle das richtige Plasmid mit der kodierenden Region des eYFPs und der 5` homologen Region. Mit diesen Klonen konnten die nächsten Schritte der Erzeugung des Zielgenvektors unternommen werden. Neben der Restriktionsanalyse wurden die Klone zusätzlich sequenziert und zeigten hierbei auch die korrekte Sequenz (vgl. 8.1.1).

Die Klonierung der 3` homologen Region erfolgte durch Restriktion des Vektors mit BamHI und SpeI. Dieser Schritt wurde allerdings erst nach Klonierung der Neo/Kan- Kassette (vgl. 4.1.2.3) durchgeführt, da die 3` homologe Region eine Schnittstelle (EcoRI) enthält, die für diese weitere Klonierung notwendig ist. Die Ligation des 3` homologen Bereiches wurde ebenfalls mittels Restriktionsanalyse und Sequenzierung (vgl. 8.1.1) überprüft.

4.1.2.3  Einführung der Selektionskassette

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Die Einführung der Selektionskassette mit frt- Erkennungssequenzen und den kodierenden Regionen für die Resistenzgene Kanamycin und Neomycin wurde nach dem gleichen Schema durchgeführt, wie die schon in 4.1.2.1 beschriebene Einführung der kodierenden Region des eYFPs. Für diesen Schritt wurden die Endonukleasen BamHI und EcoRI verwendet und der Zielgenvektor mit den gleichen Nukleasen geöffnet. Die Selektionskassette wurde durch diese gerichtete Klonierung in umgekehrter Leserichtung eingebaut (vgl. Abb. 4-2). Die umgekehrte Leserichtung verhindert, dass es in den embryonalen Stammzellen und auch bei der Züchtung der Maus nicht zu Fusionsprodukten bestehend aus eYFP und der noch nicht durch die Flip- Rekombinase entfernten Selektionskassette kommt.

4.1.3  Analyse des Zielgenvektors

Zur Überprüfung des Zielgenvektors wurden unterschiedliche Ansätze von Restriktionen durchgeführt. Sie dienten zur Überprüfung der Vollständigkeit des Vektors und der richtigen Orientierung der einzelnen Fragmente. Der wichtigste Ansatz war die Überprüfung der beiden Schnittstellen für die Endonukleasen KpnI und SpeI, da mit diesen Nukleasen das gesamte Insert aus dem Vektor heraus geschnitten werden kann. Dieser Schritt ist in Abbildung 4-4 in Spur 1 zu sehen, die Bande der Größe 3kb ist das pBSK Plasmid und die der Größe 3,5kb das Insert. Dieses ist für die anschließende Elektroporation mit den Bakterien notwendig, da nur das Insert und nicht der gesamte Vektor elektroporiert wurden. Auch die Überprüfung des Zielgenvektors mit der Restriktionsendonuklease NcoI in Spur 2 und PstI in Spur 3 zeigte das erwartete Bandenmuster.

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Zur weiteren Analyse wurde der Zielgenvektor sequenziert. Wie bereits in Punkt 4.1.2.1 und 4.1.2.2 erwähnt, wurden die einzelnen Fragmente nach Ligation in den Zielgenvektor sequenziert. In dieser abschließenden Sequenzierung wurden vor allem die Übergänge der einzelnen Fragmente zueinander und noch ein weiteres mal die Vollständigkeit der homologen Flanken überprüft.

Zusammenfassend wurde festgestellt, dass im Zielgenvektor pBSK5`sYFPSVneo/kan3` alle Fragmente mit der richtigen Basenfolge vorliegen. Die ermittelten Sequenzen liegen im Anhang (vgl. 8.1.1) vor.

4.1.4  Herstellung und Analyse der transgenen Klone

4.1.4.1  Elektroporation der Bakterien und homologe Rekombination des Inserts mit dem BAC

Die Methode des ET- Klonierens (vgl. 3.10) ermöglicht einem, das Insert bestehend aus der kodierenden Region des eYFPs und der dualen Selektionskassette zielgerichtet in den BAC einzubringen. Beim ET- Klonieren spielen die Rekombinasen E und T eine große Rolle. Sie vermitteln die homologe Rekombination des Inserts in den BAC. Durch diesen Schritt erhält das Insert im BAC die richtige Position. Die drei Foxp3- enthaltenen BACs (362, 147 und 143) wurden in dem Bakterienstamm DH10b vom RZPD geliefert. Da die beiden Rekombinasen E und T sich im Bakterienstamm EL250 befanden, musste als erstes der BAC aus dem Bakterienstamm DH10b isoliert und in den Stamm EL250 elektroporiert werden. Die Größe eines BACs lässt keine Transformation zu. Nach der Elektroporation wurden die Bakterien bei 32°C auf Chloramphenicol und Ampicillin hochgezogen. Nur Bakterien mit dem BAC konnten unter diesem Selektionsdruck wachsen, es waren bei jedem elektroporierten BAC ca. 40-50 Klone gewachsen, so dass die nächsten Schritte problemlos folgen konnten. Die niedrige Temperatur wurde gewählt, da die beiden Rekombinasen in den EL250 Bakterien unter einem hitzeaktiven Hsp- Promoter integriert worden sind und bei einer Temperatur von 37°C aktiv werden. Ihre Aktivität ist aber erst nach erfolgreicher Elektroporation des Inserts gewünscht. Für die Elektroporation des Inserts wurden jeweils zehn Klone der drei unterschiedlichen BACs in die Bakterien EL250 ausgewählt. Die Elektroporation erfolgte nach einer Vermehrung der Bakterien mit den BACs auf eine OD von 0,6. Vor der Elektroporation werden die Bakterien für 15 Minuten bei 37°C gehalten, so dass die Rekombinasen aktiv sind, wenn sich das Insert in den Bakterien befindet. Nach dieser Elektroporation wurden die Bakterien wieder bei 32°C, um weitere unspezifische Rekombinationen zu verhindern, und unter dem Selektionsdruck durch Chloramphenicol und Kanamycin auf einer Agarplatte hochgezogen. Nach diesem Selektionsschritt waren bei dem BAC 147 keine Kolonien gewachsen und für den BAC 362 waren drei, sowie für den Bac143 zwei Kolonien gewachsen. Da Bakterien am Besten bei 37°C wachsen und bei dieser Temperatur auch die Rekombinasen aktiv sind und es so zu unkontrollierten Rekombinationen kommen kann, musste der BAC aus den EL250- Bakterien isoliert, in DH10b zurück elektroporiert und dann unter dem gleichen Selektionsdruck und bei für Bakterien optimalen 37°C kultiviert werden (vgl. auch 3.10.2). Entstandene Kolonien sollten den BAC mit dem integrierten Insert enthalten. Alle gewonnenen Kolonien nach der Elektroporation des Inserts konnten auch nach diesem Schritt wieder gewonnen werden. Für die weitere Analyse standen, somit fünf Klone zur Verfügung. Die Klone mit dem BAC 362 bekamen die Bezeichnung S8-10 und die des BACs 143 8A und 8B. Die Überprüfung der erfolgreichen Rekombination erfolgte mittels Southern- Blot- Analyse und Sequenzierung der gewonnenen Klone.

4.1.4.2  Southern- Blot- Analyse

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Bei der Southern- Blot- Analyse wurde die homologe Rekombination sowie die einfache Integration untersucht. Die Hybridisierung erfolgte mit Hilfe von zwei externen Sonden und einer internen Sonde. Die beiden externen Sonden binden unmittelbar am 5`Ende (5`Sonde) bzw. am 3`Ende (3`Sonde) des Zielgenvektors pBSK5`eYFPSVneo/kan3`. Die interne Sonde bindet im Zielgenvektor im Bereich der dualen Selektionskassette.

Die rekombinierten BACs wurden zur Überprüfung der homologen Rekombination mit den Restriktionsendonukleasen HindIII für die 5` und mit BamHI für die 3`Sonde geschnitten. Eine Darstellung der bei der Hybridisierung eingesetzten externen Sonden und der erwarteten Fragmentgrößen wird in Abbildung 4-5 gegeben.

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Abbildung 10: Darstellung des Southern- Blots mit den externen Sonden

Für die Hybridisierung des mit der Restriktionsendonuklease HindIII verdauten WT BACs mit der 5`externen Sonde liegt das erwartete Signal bei 5,7kb und für den mutierten Lokus bei 1,7kb. Bei der Hybridisierung mit der 3`externen Sonde liegt das erwartete WT Signal bei 2,6kb und für den mutierten Lokus bei 1,6kb; ext. Sonde= externe Sonde, HR= homologe Region, frt= frt- Erkennungssequenz, neo= Neomycin.

Für die Überprüfung der einfachen Integration (interne Sonde) wurde die BAC- DNS ebenfalls mit HindIII geschnitten. Eine Darstellung der bei der Hybridisierung eingesetzten internen Sonde und der erwarteten Fragmentgrößen wird in Abbildung 4-6 gegeben.

Abbildung 11: Darstellung der Southern- Blot- Analyse mit interner Sonde

Für die Hybridisierung mit der internen Sonde des mit HindIII verdauten WT BACs entsteht kein Signal, bei dem mutierten Lokus liegt das erwartete Signal bei 6,9kb; int. Sonde= interne Sonde, HR= homologe Region, frt= frt- Erkennungssequenz, neo= Neomycin.

Nachweis der homologen Rekombination mit den externen und der internen Sonde

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Für die Analyse wurde die DNS mit den in Abbildung 4-5 und 4-6 beschriebenen Restriktionsendonukleasen verdaut und 10µg auf ein Agarosegel aufgetragen. Als Positivkontrolle wurden zum einen Vektoren mit den enthaltenen Hybridisierungsstellen und unverdaute BAC- DNS verwendet, als Negativkontrolle wurde BAC- DNS ohne den foxp3- Lokus verwendet. Für die Vektorkontrollen wurden Plasmid- DNS mit Restriktionsendonukleasen so behandelt, dass die Kontrolle auf der gleichen Höhe wie das erwartete Signal läuft.

Die 5` Sonde zeigte bei allen Klonen nur das WT- Signal von 5,7 kb (vgl. Abbildung 4-7) und die 3` Sonde das WT- Signal von 2,6 kb (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis steht im direkten Widerspruch zu dem erhaltenen, richtigen Signal mit der internen Sonde. Die interne Sonde zeigte bei den drei getesteten Klonen des BACs 362 das erwartete 6,9 kb Signal (vgl. Abbildung 4-7/rechts).

Um diese unterschiedlichen Ergebnisse besser deuten zu können, wurden zwei Klone, jeweils ein Klon je BAC, welche mit der internen Sonde positiv getestet wurden, sequenziert.

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Abbildung 12: Southern Blot Analyse mit der 5´externen und internen Sonde

Links: Hybridisierung des Southern Blot mit der 5`externen Sonde; Vektorkontrolle und Klone S9 und S10 zeigen das 5,7kb WT- Signal, das 1,7kb Signal für den mutierten Lokus fehlt bei den Klonen S9 und S10, die negativ Kontrolle (BAC- DNS ohne Foxp3) zeigt wie erwartet kein Signal und unverdaute BAC- Klone zeigen ein Signal für die Sonde auf falscher Höhe an.
Rechts: Hybridisierung mit der internen Sonde;die unverdaute BAC- DNS zeigt ein Signal für die Sonde auf der falschen Höhe an; die Vektorkontrolle zeigt das 6,9kb Signal des mutierten Lokus; die Klone S8, S9 und S10 zeigen ebenfalls das 6,9kb Signal des mutierten Lokus.

4.1.4.3  Sequenzierungsanalyse der Klone

Für die Sequenzierung wurden zum einen Primer genutzt, um aus dem foxp3- Lokus in den mutierten Bereich zu sequenzieren und weitere Primer, die die Sequenzierung aus dem Insert heraus in den WT foxp3- Lokus ermöglichten (vgl. Tabelle 2-4). So sollte festgestellt werden, ob die Rekombination des Zielgenvektors an der richtigen Stelle stattgefunden hat und ob eine vollständige Rekombination erfolgt ist.

Anhand der ermittelten und in Abbildung 4-8 dargestellten Sequenzierungsdaten eines Klons wurde deutlich, dass es nicht an der richtigen Stelle zu einer Rekombination gekommen ist. Der andere analysierte Klon zeigt das gleiche Ergebnis (Daten nicht gezeigt).

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Abbildung 13: Ergebnisse der Sequenzierungsanalyse

Obere Sequenz: Original- Sequenz aus foxp3- Lokus und dem Zielgenvektor
Untere Sequenz: Daten der Sequenzierung
Kursiv und rot:Foxp3- Sequenz downstream der 3` homologen Region
Fett: 3` homologe Region
Gelb unterlegt: Sequenz des Zielgenvektors
Blau: Missmatch der Sequenzierung zur Originalsequenz

4.1.5  Analyse der DEREG- Maus

Parallel zu unserem negativen Sequenzierungsergebnis erhielten wir von der Arbeitsgruppe von Tim Sparwasser (TU München) ein Kooperationsangebot, um mit einer dort generierten Reportermaus zu arbeiten. Diese Maus ist ebenfalls eine BAC- transgene Maus, die im ersten Exon des foxp3- Lokus die kodierende Region des eGFP sowie den kodierenden Bereich des Diphtheria Toxin Rezeptors (DTR) enthält [37 ]. Der DTR bietet einem die Möglichkeit, Foxp3- exprimierende Zellen gezielt durch die Gabe von Diphtheria- Toxin (DT) zu deletieren. Die Maus wurde DEREG- Maus (depletion of regulatory Tcells) genannt.

4.1.5.1  Analyse der Foxp3 + T- Zellen in der DEREG- Maus

Als erstes wurde überprüft, ob die DEREG- Maus einen normalen Phänotyp einer C57BL/6 Maus zeigt, da der BAC durch seine zufällige Integration in das Genom der Maus ein wichtiges Gen der Maus deletiert haben kann. Es wurden weder im Verhalten noch in der Zucht Auffälligkeiten entdeckt, die DEREG- Maus agiert wie eine WT C57BL/6 Maus. Erste Versuche, dargestellt in Abbildung 4-9, wurden durchgeführt, um zu überprüfen, ob die Foxp3- Expression mit der GFP- Expression korreliert. Dieses war notwendig, da der BAC im Genom der Maus zufällig integriert und somit unter die Kontrolle eines starken Promoters bzw. Silencer geraten sein kann. In diesem Fall würde die GFP- Expression stärker bzw. schwächer als die Foxp3- Expression ausfallen.

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Abbildung 14: Analyse der Foxp3 +   T- Zellen

DEREG Tieren wurden Milz und mLK entnommen und auf die Moleküle CD4 und Foxp3 gefärbt; dargestellt sind alle Lymphozyten in Bezug auf ihre CD4, GFP und Foxp3 Färbung; umkreiste T- Zellen sind die jeweils GFP bzw. Foxp3+ T- Zellen oder GFP/Foxp3 doppel positiven; Prozentangabe entspricht dem Vorkommen der Foxp3+ und GFP+ T- Zellen in den gesamten Lymphozyten des entsprechenden Organs.

In Abbildung 4-9 ist zu erkennen, dass die Foxp3- und GFP- Expression in der Milz und im mLK mit annähernd gleicher Prozentzahl auftritt. Der Prozentsatz der GFP+- T- Zellen scheint weniger zu sein, da die Fluoreszenz des Markers GFP schwächer ist, als die der Foxp3- Färbung und die Abgrenzung der GFP+ und GFP- T- Zellen schwerer ist. Die beiden Populationen gehen im Gegensatz zur Foxp3- Färbung in einander über und dadurch ist die genaue Prozentzahl schwer bestimmbar und kann Schwankungen aufzeigen. Bei der Darstellung der Foxp3+ gegen die GFP+ T- Zellen kann man aber erkennen, dass alle GFP+ T- Zellen auch Foxp3+ sind.Weiterhin wurden noch die pLK, Peyers Patches, IELs und der Thymus analysiert. Die gleichen Beobachtungen wie in Milz und mLKs konnten auch in diesen Organen gemacht werden (Daten nicht gezeigt).

4.1.5.2  Depletion der Foxp3 + T- Zellen

Nachdem gezeigt worden war, dass das Expressionsmuster unseren Erwartungen entsprach, wurde die Funktionalität des DTRs analysiert. In diesem Abschnitt wurde die Depletion der Foxp3+ T- Zellen mittels Diphtheria- Toxin (DT) überprüft. Hierfür wurde DEREG- Mäusen an zwei aufeinander folgenden Tagen, Diphtheria Toxin i.p. gespritzt. Am Tag 1 nach DT- Gabe wurden Milz, mLK, pLK, PP, IEL und Thymus der Mäuse auf die Expression von GFP und Foxp3 analysiert.

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Abbildung 15: Depletion der Foxp3 + bzw. GFP +   T- Zellen in DEREG Mäusen

Den Mäusen wurde alle 24 h 1µg Diphtheria Toxin (DT) i.p. gespritzt. Nach zweimaliger DT- Gabe wurden die Milzen der Mäuse entnommen und die Foxp3- und GFP- Expression untersucht; in den umrandeten Bereichen liegen die GFP- bzw. Foxp3- positiven T- Zellen; Prozentangabe entspricht dem Vorkommen der Foxp3+- und GFP+ T- Zellen in den gesamten Lymphozyten des entsprechenden Organs.

Nach der Diphtheria- Toxin Gabe wurden, wie in Abbildung 4-10 für die Milz dargestellt, die GFP- sowie Foxp3- positiven T- Zellen depletiert. Auffällig ist, dass ein Teil der Foxp3+ T- Zellen nicht mit depletiert wurden. Dieser Anteil der Foxp3+ T- Zellen wurde im Gegensatz zu allen GFP+ T- Zellen durch die Gabe von DT nicht depletiert. Bei allen überprüften Organen war die gleiche Entwicklung zu beobachten.

4.1.5.3  Vergleich der Diphtheria- Toxine von Merck und Sigma zur Depletion der Foxp3 +T- Zellen

Im weiteren Verlauf der Arbeit trat eine Diskrepanz zwischen unseren Analysen der DEREG- Maus und den Analysen einer weiteren existierenden BAC- transgenen Maus auf, welche ebenfalls unter der Kontrolle des Foxp3- Promoters den DTR exprimiert. Diese Diskrepanz zeigte sich bei dem Phänotyp der DEREG- Maus nach DT- Gabe [37 ]; [36].

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Bei einer näheren Überprüfung des Depletionsprotokolls mit unserem eigenen Protokoll [37 ] fielen als wichtigste Unterschiede die Herstellerfirma des DTs sowie das Schema der Verabreichung des DTs (jeden zweiten Tag im Gegensatz zu jedem Tag) auf. In dem in Abbildung 4-11 dargestellten Versuch wurden das DT von Merck und Sigma miteinander verglichen. C57BL/6 Kontrolltieren und DEREG- Tieren wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen jeden zweiten Tag genau nach dem Protokoll von Kim et al. [36 ] DT verabreicht. Zunächst wurde der optische Zustand der Mäuse (Fell, körperliche Verfassung) und ihre Gewichtsentwicklung kontrolliert.

Abbildung 16: Gewichtsabnahme der Mäuse bei Diphtheria Toxin- Behandlung

C57BL/6 und DEREG- Tieren wurden jeden zweiten Tag 1µg DT i.p. gespritzt; an diesen Tagen wurde auch das Gewicht der Mäuse überprüft; der Versuch wurde an Tag 14 abgebrochen, da die Kontroll- und DEREG- Tiere, welche mit Sigma DT behandelt worden waren, zu große Gewichtsabnahmen aufwiesen.

Nach 14 Tagen wurde der Versuch abgebrochen, weil die Mäuse, welche das DT von Sigma bekommen hatten, einen Gewichtsverlustes von mehr als 20% aufwiesen (vgl. Abbildung 4-11). Dieser Gewichtsverlust konnte ausschließlich bei den Tieren, welche mit Sigma DT behandelt worden waren, beobachtet werden, interessanterweise auch bei den Kontrolltieren, bei denen keine Depletion der Tregs erfolgte. Die Tiere, welche mit Merck DT behandelt worden waren, zeigten diese massive Gewichtsabnahme nicht. Die Milzen und Lks, der mit Sigma DT behandelten Tiere waren im Vergleich zu den mit Merck DT behandelten Tieren leicht vergrößert (Daten nicht gezeigt). Eine spätere histologische Untersuchung zeigte weiterhin, dass bei allen DEREG- Tieren im Gegensatz zu den Kontrolltieren ein beginnender „scurfy“- Phänotyp feststellbar ist, was den Schluss zulässt, dass beide DTs in Bezug auf die Depletion der Tregs wirksam waren.

4.2 Analyse von Foxp3+ T- Zellen

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In diesem Teilabschnitt wurden erste Schritte zur Analyse der Stabilität des murinen Transkriptionsfaktors Foxp3 unternommen. Es wurde die Stabilität der Expression des Transkriptionsfaktor Foxp3 in T- Zellen in vivo sowie die suppressorische Kapazität von Foxp3+ T- Zellen in vitro überprüft. Im Zuge der Analyse der suppressorischen Kapazität wurde die Induzierbarkeit des Transkriptionsfaktors unter unterschiedlichen Kulturbedingungen in vitro analysiert.

4.2.1  Stabilität von Foxp3 in vivo

Zu Beginn dieser Arbeit gab es nur sehr wenige Informationen über die Regulation und Stabilität der Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3. Es war nicht klar, ob die Expression in vivo stabil ist oder CD4+CD25+ T- Zellen Foxp3+ im Zuge z.B. einer Infektion hochregulieren und nur eine transiente Expression des Transkriptionsfaktors vorliegt. Zunächst wurde die Stabilität der Foxp3- Expression in CD4+CD25+ T- Zellen in vivo überprüft. Hierfür wurden aus BALB/c Mäusen CD4+CD25+ T- Zellen mittels MACS- Aufreinigung isoliert. Es wurden BALB/c- Mäuse für die Isolierung der CD4+CD25+ T- Zellen genutzt, da zu diesem Zeitpunkt die DEREG- Mäuse noch nicht generiert worden waren. Diese CD4+CD25+ T- Zellen, wurden mit CFSE markiert, um sie nach einem adoptiven Transfer in der Reanalyse wiederzufinden. Die markierten Zellen wurden i.v. in syngene BALB/c Mäuse gespritzt, somit kann es zu keinen Kompatibilitätsproblemen und damit zu einer Eliminierung der adoptiv transferierten Zellen kommen. Nach 14 Tagen wurden die Mäuse getötet und in Milz, pLK und mLK die Zellen mit Hilfe eines Antikörpers gegen murines Foxp3 gefärbt und anschließend die CFSE+ transferierten Zellen analysiert. Es konnte im Zuge dieser Färbung der Anteil der Foxp3+ T- Zellen unter den CFSE+ T- Zellen mit dem Anteil der Foxp3+ T- Zellen vor dem adoptiven Transfer verglichen werden.

Abbildung 17: Analyse der Stabilität Foxp3 + T- Zellen in vivo

CD4+CD25+ ex vivo isolierte T- Zellen von Milz und Lk wurden mit CFSE markiert und in syngene Mäuse i.v. gespritzt (2*106 T- Zellen/Maus). Vor dem Transfer wurden die CD4+CD25+ T- Zellen (schwarz) im Vergleich zu CD4+CD25- T- Zellen (weiß) auf Foxp3 gefärbt. Nach 14 Tagen wurden die reisolierten Zellen CD4, CD25 und Foxp3 gefärbt. Im mittleren Blot ist die Unterscheidung zwischen endogenen und adoptiv transferierten Zellen zu erkennen; es wurden nur die CFSE+ Zellen auf ihre Foxp3- Expression analysiert (rechtes Histogramm).

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In Abbildung 4-12 kann man sehr gut erkennen, dass die Foxp3+ T- Zellen stabil in ihrer Foxp3- Expression bleiben. Vor dem Transfer zeigte sich eine Foxp3- Färbung von 94 % der isolierten CD4+CD25+ T- Zellen, welche in der Reanalyse nach 14 Tagen auf 99,3% angestiegen war.

4.2.2  Stabilität korreliert mit demethylierten CpGs in konservierter Region im Intron I

In diesem Abschnitt der Arbeit sollte überprüftwerden, ob eine Korrelation der Foxp3- Expression und der Demethylierung der TSDR im ersten Intron des foxp3- Lokus existiert. Durch die Zugabe von TGF-β in Kulturen mit naiven Foxp3-CD4+ T- Zellen kann die Expression von Foxp3 induzieret werden. Entzieht man den Kulturen in der restimulation das TGF-β, verlieren die Zellen ihre Foxp3- Expression. Diese TGF-β induzierte Foxp3- Expression ist jedoch instabil.

In Abbildung 4-13 ist die Induzierbarkeit der Foxp3- Expression in CD4+CD25-Foxp3- T- Zellen mittels TGF-β dargestellt. Die Zugabe von TGF-β im Laufe einer sechs tägige Kultur mit additiven TZR- Stimulus führt zu einer hohen Foxp3- Expression (82,6%). In den Kulturen ohne die Zugabe von TGF-β, nur in Anwesenheit eines TZR- Stimulus konnte nur eine sehr geringe Foxp3- Expression beobachtet werden (13,2%). Die geringe Foxp3- Expression geht nach Restimulation und weiteren sechs Tagen Kultur unter neutralen Bedingungen wieder zurück. In den Kulturen mit der TGF-β- Stimulation und der hohen Foxp3- Expression geht die Foxp3- Expression nach der Restimulation in Abwesenheit von TGF-β ebenfalls zurück. In diesem Experiment erfolgte die Reduktion von 82,6% auf 36,6% (vgl. Abb. 4-13). Bei der beobachteten Reduktion liegt kein Auswachsen der 17,4% CD25-Foxp3- T- Zellen vor (getestet von Julia Polansky; Daten nicht gezeigt). Die Reduktion der Foxp3- Expression zeigt auf, dass in den durch TGF-β induzierten Kulturen keine stabile Foxp3- Expression vorliegt. In weiteren unter gleichen Bedingungen gelaufenen Kulturen konnte die Foxp3- Expression auch noch weiter reduziert werden. Die Foxp3- Expression bzw. vor allem die Reduktion der Expression in den Induktionskulturen mittels TGF-β unterliegen aber starken Schwankungen. Die Reduktion lag zwischen 6% und 45% (Daten nicht gezeigt).

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Abbildung 18: Foxp3- Expression unter unterschiedlichen Kulturbedingungen

Die T- Zellen wurden unter den in 3.15.7 beschriebenen Kulturbedingungen für sechs Tage und 12 Tage in An- und Abwesenheit von TGF-β kultiviert; dargestellt sind die CD4+ T- Zellen; auf der Y- Achse ist die CD25- und auf der X- Achse die Foxp3- Färbung abgebildet; Prozentangaben beziehen sich auf den Anteil der Foxp3+ T- Zellen in der gesamten CD4- Population.

Ähnlich wie den in der Einleitung dargestellten Ergebnissen der Methylierungsanalyse von ex vivo isolierten CD25- und CD25+ T- Zellen [102 ] wurden in dieser Arbeit die induzierte, unstabile Foxp3- Expression in induzierten Tregs ebenfalls auf das Methylierungsmuster der TSDR hin analysiert. Ex vivo isolierte Tregs zeigten nicht nur einen stabilen Phänotyp in vivo, sondern zeigten auch eine deutliche Demethylierung der in Floess et al. beschriebenen TSDR (Treg specific demethylated Region). Das Methylierungsmuster der TSDR wurde auch bei den TGF-β induzierten Tregs untersucht. Hierdurch sollte geklärt werden, ob eine Demethylierung für eine stabile Foxp3- Expression notwendig ist (vgl. Abbildung 4-14).

Abbildung 19: Methylierungsstatus von sechs Tage bzw. zwölf Tage kultivierten T- Zellen in An- und nach Restimulation in Abwesenheit von TGF- β

Oben: graphisch dargestellter Foxp3 Lokus mit der TSDR (Entspricht Amplikon 1 und 2); -2 bis 11 Exonstruktur des foxp3- Lokus.
Unten: Es wurden mittels MACS- Sortierung CD25- T- Zellen ex vivo isoliert, die T- Zellen wurden in An- (TGF-β) und nach Restimulation in Abwesenheit (TGF-β/Neutral) von TGF-β kultiviert und die Foxp3- Expression analysiert (FACS-Blot); rechts davon Methylierungsanalyse der Amplikone eins und zwei, ein Kästchen enspricht einem analysierten CpG; Index für den Methylierungsstatus; gelb = vollständig demethyliert, blau = vollständig methyliert.

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Die Foxp3- Expression bei den in An- und nach Restimulation in Abwesenheit von TGF-β kultivierten T- Zellen zeigte deutliche Unterschiede zwischen den beiden Kulturen. In Abbildung 4-14 ist zu erkennen, dass die sechs Tage in Anwesenheit von TGF-β kultivierten Zellen im Vergleich zu den Zellen, welche nach der Restimulation in Abwesenheit von TGF-β kultiviert wurden, ein nicht so deutliches, differentielles Methylierungsmuster zeigen wie es bei den Vergleich von CD25+ und CD25- T-Zellen zu sehen war. Es ist zu erkennen, dass die durch TGF-β induzierte Foxp3- Expression mit der leichten Demethylierung korreliert, aber die Demethylierung nicht vollständig erfolgte. Der Verlust der Foxp3- Expression nach Restimulation in Abwesenheit von TGF-β korreliert mit dem Methylierungsstatus, die TSDR ist, wie in Abbildung 4-14 zu erkennen, wieder komplett methyliert. Der Unterschied zwischen dem Methylierungsmuster bei Amplikon eins und zwei bei ex vivo isolierten CD25- und CD25+ T- Zellen und bei in An- und Abwesenheit von TGF-β induzierten Tregs kann für eine Korrelation der Demethylierung mit der Stabilität der Foxp3- Expression sprechen.

Im Gegensatz zu der in der Einleitung dargestellten Methylierungsanalyse ist hier nicht die Analyse von Amplikon drei und vier durchgeführt worden, da diese schon bei den ex vivo T- Zellen keine Unterschiede im Methylierungsmuster zeigten.

4.2.3  Foxp3- Expression korreliert mit suppressiver Kapazität

In weiterem Verlauf dieser Arbeit wurden die suppressorischen Eigenschaften der unterschiedlichen Zellpopulationen, welche Foxp3 exprimieren, überprüft (vgl. Abbildung 4-13). Hierfür wurden ex vivo isolierte CD4+CD25+ T- Zellen mit induzierten Tregs oder neutral kultivierten T- Zellen in einem in vitro Suppressions- Test miteinander verglichen. Bei den induzierten Tregs wurde, wie schon in Abschnitt 4.2.1 und 4.2.2 zwischen Zellpopulationen unterschieden, welche nur in Anwesenheit von TGF-β und welche, die in der Restimulation in Abwesenheit von TGF-β kultiviert wurden. In dem in Abbildung 4-15 dargestelltem Test wurden naive CD4+CD25- T- Zellen zusammen mit den zu untersuchenden T- Zellen in einem Verhältnis von 1:1 (Treg : naiven Zellen) für 72h kultiviert. Die Zellen wurden mit löslichem anti CD3 und APZ stimuliert. Das suppressorische Potential der induzierten und ex vivo isolierten T-Zellen wurde an Hand der Proliferation der naiven CFSE- markierten T- Zellen analysiert.

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Abbildung 20: Analyse der suppressorischen Eigenschaften der unterschiedlich Foxp3 exprimierenden T- Zellen

CD4+CD25- T- Zellen wurden wie in Kapitel 3.15.7 beschrieben für eine bzw. zwei Wochen kultiviert. Naive CD25-CD62LhighCD4+ CFSE markierte T- Zellen wurden mit löslichem anti CD3 und CD90 depletierten APZ kultiviert. Zur Auswertung der suppressorischen Eigenschaften wurde die Teilungsrate der naiven Zellen herangezogen, die durch die Ausdünnung der CFSE- Markierung (X- Achse) in den naiven Zellen bestimmt werden kann, Prozentangebe bezeichnet den Anteil der nicht proliferierten naiven T- Zellen. Positive Kontrolle sind naive Zellen ohne regulatorische Zellen.

In diesem in vitro Test konnte festgestellt werden, dass die suppressorische Eigenschaft von T- Zellen mit der Foxp3- Expression korreliert. Die ex vivo isolierten Tregs lassen keinerlei Teilung der naiven Zellen zu. Die neutral kultivierten T- Zellen zeigen keine Foxp3- Expression (vgl. Abbildung 4-13) und auch keine Suppression der naiven Zellen (vgl. Abbildung 4-15). In Anwesenheit von TGF-β wird die Foxp3- Expression induziert, die T- Zellen zeigen eine Foxp3- Expression von ~ 96% (vgl. Abbildung 4-13) und eine erfolgreiche, aber weniger effektive Suppression der Proliferation der naiven Zellen als ex vivo Tregs. Im Gegensatz dazu haben die T- Zellen, welche nach der Restimulation in Abwesenheit von TGF-β kultiviert wurden und kaum eine Foxp3- Expression zeigten, kein suppressorisches Potential. Es besteht somit eine Korrelation zwischen der Foxp3- Expression und der suppressorischen Eigenschaften der T- Zellen.

4.3 Analyse der Regulation des murinen foxp3- Lokus

Ziel dieses Projektes war die Analyse des foxp3- Lokus in Bezug auf die Regulation von der Foxp3- Expression. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf der Regulation der Transkription und die damit im Zusammenhang stehenden Veränderungen der chromosomalen Strukturen.

4.3.1  Histon- Modifikationen korrelieren mit Foxp3- Expression

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Ein wichtiger Schritt in der Analyse der Regulation der Transkription eines Gens ist die Untersuchung von möglichen Modifikationen der Histonstruktur.

Im Zuge dieser Arbeit wurde die Acetylierung der Histone H3 und H4 und die Tri- Methylierung des Lysin4 des Histon H3 untersucht. Diese Modifikationen kann man mit Hilfe eines ChIP- Tests (Chromatin- Immuno- Präzipitations- Test/vgl. Kapitel 3.14) überprüfen. Die eingesetzten Antikörper binden spezifisch an Histone mit den entsprechenden Modifikationen, danach erfolgt eine spezifische Präzipitation der Zielproteine mit der an sie gebundenen DNS. In einem nächsten Schritt wurden die Proteine von der DNS getrennt und diese mittels RTQ- PCR quantifiziert. Bei diesem Schritt wurde mit Primern für den hochkonservierten Bereich der TSDR gearbeitet (vgl. auch Kapitel 3.14 und Tabelle 2-4).

Abbildung 21: ChIP- Analyse der CD25 + versus CD25 - T- Zellen

Ex vivo isolierte CD25+ und CD25- T- Zellen wurden per Chromatin- Immuno- Präzipitation- Test analysiert. Zur Präzipitation wurden ein Kontrollantikörper (Isotyp), sowie Antikörper gegen acetyliertes Histon 3 und Histon 4 und gegen tri- methyliertes Lysin 4 im Histon H3 verwendet. Anschließend wurden die Proben mittels RTQ- PCR analysiert, es wurden Primer für den hochkonservierten Bereich der TSDR genutzt. Die Quantifizierung erfolgte relativ zu der mitgeführten Input- Kontrolle.

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Nach der Quantifizierung der Proben zur mitgeführten Input- Kontrolle wurde deutlich sichtbar, dass in CD25+ T- Zellen im Vergleich zu CD25- T- Zellen die untersuchten Histon- Modifikationen im Bereich der TSDR vorliegen. Der stärkste Unterschied konnte bei der Methylierung des Lysins 4 des Histons 3 beobachtet werden, diese Histon- Modifikationen treten im Bereich der TSDR in ex vivo isolierten Tregs verstärkt auf (vgl. Abbildung 4-16).

Zusammenfassend kann man sagen, dass die Untersuchung der Histon- Modifikationen für einen offnen foxp3- Lokus im Bereich der TSDR bei CD25+ T- Zellen spricht. Dieser Befund unterstützt das gefundene Methylierungsmuster bei ex vivo isolierten CD4+CD25+ T- Zellen und spricht stark für einen offenen Lokus, welcher die Foxp3- Expression unterstützt.

4.3.2  Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen in der TSDR

Abbildung 22: Darstellung gefundener, möglicher Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen in der TSDR

Obere Sequenz ist die der Maus im Vergleich zur unteren humanen Sequenz, rot = gefundene CpGs in Mensch und Maus, eingerahmt mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen mit ihrer Bezeichnung; dargestellte Sequenz beginnt 358bp downstream des TSDR- Starts und endet 133bp upstream des TSDR- Endes.

4.3.3  Analyse der transkriptionalen Aktivität der TSDR

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Für die Analyse der transkriptionalen Aktivität wurde die Methode des dualen Luciferase- Test gewählt. Es wurden unterschiedliche Konstrukte und Plasmide verwendet, um einen genauen Einblick in die transkriptionale Aktivität des foxp3- Lokus zu bekommen.

4.3.3.1  Analyse der unterschiedlichen Luciferasekonstrukte

Die in Abbildung 4-20 dargestellten Luciferasekonstrukte wurden in zwei unterschiedliche Plasmide mit der Bezeichnung pGL3- Basic und pGL3- Promoter eingebracht. Die beiden Plasmide sind von ihrem Aufbau fast identisch. Der einzige Unterschied zwischen den Plasmiden ist, dass der pGL3- Promoter im 5`Bereich des Luciferasegens einen schwachen, minimalen Promoter des Viruses Simian vacuolting 40 (SV 40) enthält. Der Vektor pGL3 Basic beinhaltet diesen minimalen Promoter nicht.

Abbildung 23: Darstellung der Luciferasekonstrukte

Dargestellt ist der foxp3- Lokus mit der TSDR (rot) und die Lage der unterschiedlichen klonierten Bereiche.
Blau: unterschiedliche Konstrukte zur Analyse der Region mit der TSDR
Grün: angedeutetes Luciferasegen
Links neben den blauen Konstrukten: verwendete Bezeichnungen im weiteren Verlauf der Arbeit

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Dieser Unterschied zwischen den beiden Plasmiden ermöglicht, dass man eingebrachte Elemente auf unterschiedliche transkriptionale Aktivität testen kann. In dem pGL3- Basic ist nur eine Luciferase- Aktivität messbar, wenn das eingebrachte Konstrukt ein eigenständiger Promoter ist. Im pGL3- Promoter kann überprüft werden, ob es sich bei dem eingebrachten Element um einen Enhancer oder einen Silencer handelt. Bei dem Luciferase- Test werden die Zellen transfiziert und anschließend stimuliert (vgl. 3.21). Man kann dann nach 24 bzw. 48 Stunden die Luciferase- Aktivität messen. Für die Festlegung des besten Zeitpunktes wurden ein erster Luciferase- Test mit dem Vektor pGL3- Promoter in der EL-4 T- Zelllinie (vgl. 2.8) durchgeführt und getestet, wann die Aktivität der Luciferase am höchsten ist.

Abbildung 24: Analyse der Luciferase Aktivität nach 24 und 48 Stunden

Die Zelllinie EL-4 wurde mit dem Plasmid pGL3- Promoter transfiziert und für 24 Stunden stimuliert; der Assay wurde 24 Stunden und 48 Stunden nach Transfektion gemessen; RLUs auf interne pTKRenilla Kontrolle standardisiert; n=3; einExperiment von drei unabhängigen dargestellt.

In Abbildung 4-19 wurde deutlich, dass nach 24 Stunden die Luciferase- Aktivität im Vergleich zu 48 Stunden am höchsten ist. Alle weiteren Analysen wurden in dem Zeitraum von 24 Stunden nach Stimulierung gemessen. Die RLUs sind in diesem Vesuch nicht sehr hoch, weswegen noch weitere Zelllinien getestet werden sollten.

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Für die Auswahl einer geeigneten Zelllinie wurde zuerst ihre Transfizierbarkeit getestet. In Abbildung 4-20 sieht man den Vergleich von EL-4- und humane Jurkat- Zelllinien nach erfolgreicher Nucleofektion mit den Plasmiden pGL3- Promoter und pGL3- Promoter- TSDR.

Abbildung 25: Vergleich der Transfektion von Jurkat und EL-4 Zellen

Transfektion von EL-4- und Jurkat- Zelllinien mit den pGL3- Promoter (pGL3Pro) und dem pGL3- Promoter- TSDR (TSDR), Zelllinien wurden nach Transfektion für 24 Stunden mit PMA stimuliert und dann mittels des dualen Luciferase- Tests analysiert; „Light units“ wurden auf die interne Kontrolle des pTKRenilla standardisiert; n=3.

Die humane Jurkat- Zelllinie zeigte eine gute Transfektionseffizienz und sehr hohe RLUs und eignet sich für die Durchführung des dualen Luciferase- Tests deutlich besser als die EL-4- Zelllinie. Zur gleichen Zeit wurden in unserem Labor mit weiteren Zelllinie die Amaxatechnik ausprobiert, dabei stellt sich heraus, dass die murine T- Zelllinie RLM-11 die gleiche gute Transfektionseffiziens und ebenso hohe RLUs aufzeigte wie die humane Jurkat- Zelllinie (getestet von Nils Grabole). Alle getesteten Zelllinien zeigten keine endogene Foxp3- Expression (Daten in unserem Labor erhoben). Somit wurde die Zelllinie mit der besten Transfektionsrate ausgewählt, welches bedeutet, dass die beiden Zelllinie RLM-11 und Jurkat genutzt werden konnten. Die Jurkat- Zelllinie ist eine human Zelllinie und die RLM-11 eine murine T- Zelllinie. Bei den Konstrukten der TSDR in den Luciferasevektoren handelt es sich um murine Konstrukte. Auf Grund dessen wurden alle weiteren Analysen in den RLM-11- Zellen durchgeführt und somit murine Konstrukte in eine murine Zelllinie transfiziert.

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In der Abbildung 4-21 sind die Versuche mit den Plasmiden pGL3- Basic, pGL3- Promoter und den Konstrukten der TSDR dargestellt. Die Luciferase Aktivität wurde 24 Stunden nach Stimulierung, welche vier Stunden nach Transfektion mit den Plasmiden erfolgte, analysiert.

Abbildung 26: Vergleich der unterschiedlichen Konstrukte in verschiedenen Luciferaseplasmiden

Für den Luciferaseassay wurden RLM-11 Zellen mit 4µg des Plasmides und 0,2µg der internen pTKRenilla- Kontrolle nucleofektiert und 24h mit PMA (10ng/ml) stimuliert. Nach 24h wurden die Zellen lysiert und mittels des Dual Luciferaseassays analysiert; Light units wurden auf interne pTKRenilla- Kontrolle standardisiert.
A) Analyse der Konstrukte in dem Plasmid pGL3- Basic; n=3
B) Analyse der Konstrukte in dem Plasmid pGL3- Promoter; n=3
Ein Versuch von drei unabhängigen ist dargestellt.

An Hand der Versuche in Abbildung 4-21 wurde deutlich, dass die Region TSDR keinen eigenständigen Promoter beinhaltet, da in dem Vektor pGL3- Basic keine Luciferase- Aktivität gemessen werden konnte. Die gemessene Aktivität liegt unter der Hintergrundaktivität des pGL3- Basic (Abbildung 4-21 A). In dem Plasmid pGL3- Promoter sieht man mit dem Konstrukt TSDR eine zehnfache Steigerung der Luciferase- Aktivität im Vergleich zu der Kontrolle mit dem pGL3- Promoter. Dieser Umstand zeigt, dass die TSDR die Promoterleistung des minimalen SV40 Promoter steigern kann.

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Auf Grund dieses Ergebnisses wurden alle weiteren Analysen der TSDR- Konstrukte nur im pGL3- Promoter- Plasmid durchgeführt. Der Vergleich aller drei Konstrukte der Region um die TSDR ergab, dass das Element downstream der TSDR bis zum Exon –1 (5`Exon-1) keine transkriptionale Aktivität zeigt. Das große Element (3kb incl. TSDR) führt zu einer Reduzierung der Luciferase- Aktivität im Vergleich zu dem Plasmid pGL3- Promoter- TSDR. Die Verbindung der Konstrukte TSDR und 5`Exon-1 führt zu einer Steigerung der Luciferase Aktivität um das 1,5 fache im Vergleich zu der Aktivität der TSDR alleine.

4.3.3.2  Methylierung der TSDR im dualen Luciferase- Test

Die Methylierung von DNS kann, wie in der Einleitung beschrieben, eine wichtige Rolle in der Regulation der Transkription spielen. Zwischen CD25+ und CD25- T- Zellen und bei den induzierten Tregs wurde im Bereich der TSDR ein differentielles Methylierungsmuster gefunden. In diesem Abschnitt wurde überprüft, ob eine Methylierung der TSDR in den Luciferasekonstrukten in dem Plasmid pGL3- Promoter zu einer Reduzierung der transkriptionalen Aktivität führt.

Für die Analyse der methylierten TSDR wurde ein Vorversuch gemacht. Es wurde die DNS- Menge titriert, die man für einen Luciferase- Test benötigt, da die DNS- Menge durch die Methode der in vitro Methylierung sehr eingeschränkt werden kann. Es war zu erkennen, dass 2µg die ideale DNS- Menge für einen Luciferase- Test ist, aber auch mit geringeren Mengen von 1µg und 0,5µg DNS eine deutliche Luciferase Aktivität messbar ist (vgl. Abbildung 4-22 A).

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Abbildung 27: Methylierung der TSDR im Luciferase- Test

A) Es wurden DNS- Mengen von 4, 2, 1 und 0.5µg DNS getestet; n=3; einer von drei unabhängigen Versuchen ist dargestellt.
B) Analyse der Methylierung der TSDR nach der SssI Behandlung vor der Ligation mit den Plasmid pGL3- Promoter; beide Restriktionsendonukleasen schneiden CpG- Motive, MspI methylierungsunabhängig und HpaII methylierungsabhängig.
C) Methylierung des Plasmids erfolgte mit Hilfe des Enzyms SssI, Vergleich der Luciferase Aktivität von unmethylierten und mit SssI behandelten Plasmiden; n=3; einer von drei unabhängigen Versuchen ist dargestellt.
D) Luciferase- Test mit methylierter und unmethylierter TSDR; Religations- Kontrolle bedeutet geöffneter pGL3Promoter und wieder religiert; n=3; ein Versuch von drei unabhängigen ist dargestellt.
Light units wurden auf die interne pTKRenilla- Kontrolle standardisiert.

Eine gesamte Methylierung des pGL3- Promoter mittels der Methylase SssI führt zu einem kompletten Verlust der Luciferase Aktivität unabhängig von einklonierten Fragmenten (vgl. Abbildung 4-22 C). Die Methylierung blockiert die gesamte Transkription in dem Vektor, da auch der SV 40- Promoter und das Luciferase- Gen methyliert werden. Auf Grund dieser Ergebnisse in Abbildung 4-22 C musste das Konstrukt TSDR ohne den Vektor pGL3- Promoter methyliert werden. Dieses erreicht man durch die in Kapitel 3.8.6 beschriebene in vitro Methylierung der TSDR, welche aus dem pGL3- Promotor heraus geschnitten wurde und nach erfolgreicher Methylierung wieder mit dem pGL3- Promotor ligiert wurde. Die Methylierung der TSDR wurde durch einen Verdau mit den methylierungsab- bzw. unabhängigen Restriktionsendonukleasen HpaII und MspI überprüft. Mit der Endonuklease MspI war die Restriktion erfolgreich und wie erwünscht wurde mit der Endonuklease HpaII keine Restriktion der methylierten TSDR sichtbar (vgl. Abbildung 4-22 B). Im Luciferase- Test mit der un- und methylierten TSDR und dem religierten pGL3- Promoter- Plasmid als Kontrolle zeigte sich eine deutliche Reduzierung der Luciferase- Aktivität mit der methylierten TSDR im Vergleich zu der unmethylierten TSDR (vgl. Abbildung 4-22 D; ~75%). An Hand dieses Ergebnis kann man erkennen, dass die TSDR nur im unmethylierten Zustand ihre Enhancer- Aktivität entfalten kann.

4.3.3.3  Deletion der TSDR- Region

Für weitere Einblicke in die transkriptionelle Aktivität der TSDR wurden Deletionsmutanten dieser Region hergestellt und in den Plasmid pGL3- Promoter eingebaut. Die Deletionen wurden am 5` Bereich der TSDR begonnen und die 1215bp große TSDR um jeweils ein 303pb, 370bp und ein 275bp Fragment deletiert. Die letzte Deletion führte dazu, dass nur noch ein 267bp großes Fragment des 3`Bereiches der TSDR übrig geblieben ist (vgl. Abbildung 4-23 oben).

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Abbildung 28: Deletion der TSDR im Luciferase- Test

Oben: Darstellung der erzeugten Deletionsmutanten der TSDR
Unten: Luciferase- Test mit den Deletionsmutanten der TSDR in RLM-11; „light untis“ wurden auf die interne pTKRenilla- Kontrolle standardisiert; n=3; ein Versuch von drei unabhängigen.

Die einzelnen Deletionsschritte führten zu einer graduellen Reduzierung der transkriptionalen Aktivität der TSDR (vgl. Abbildung 4-23). Jedes Deletionsfragment enthält anscheinend Elemente die für die transkriptionelle Aktivität benötigt werden. Das Fragment der Deletion von 500bp zu 250bp ist für die transkriptionale Aktivität der TSDR von größter Bedeutung. Bei dieser Deletion fällt die Luciferase Aktivität auf das Niveau des pGL3- Promoter herab, die anderen Deletionen zeigen nicht diese starke Reduzierung der Luciferase- Aktivität. Man kann davon ausgehen, dass das verbliebene 267bp große Fragment der TSDR keine eigene Aktivität mehr hat. Interessant ist in diesem Zusammenhang auch ein genauerer Blick auf die in diesem Bereich der TSDR liegenden Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen, die in dem letzten Deletionsschritt wegfallen. Sie könnten eine große Rolle in der transkriptionalen Aktivität der TSDR und der gesamten Transkription des Foxp3- Gens spielen. In dieser Region liegen als markante mögliche Bindungsstellen, die von STAT1, CREB/ATF, NF-κB, c-Ets-1, Foxp3 selbst, NFAT und Evi1 (vgl. Abbildung 4-17).

4.3.3.4  Amaxa- Transfektion von naiven Zellen

Die Verwendung von naiven Zellen bietet die Möglichkeit den Einfluss der Foxp3- Expression bzw. die Regulation der Luciferase- Aktivität in naiven T- Zellen zu analysieren. Für die Versuche mit naiven T- Zellen fiel die Wahl auf die Nucleofektion mit dem Gerät von Amaxa, genau wie bei den Zelllinien. Zur Untersuchung der Transfektionseffizienz der naiven T- Zellen wurden die ersten Transfektionen mit einem GFP Reporterplasmid durchgeführt, da die Expression dieses Markers sehr schnell nach Transfektion messbar und die Messung der GFP- Expression mittels durchflusszytometrischer Analyse sehr einfach ist. Dargestellt ist in Abbildung 4- 24 die Transfektionsrate des GFP- Reporterplasmides über einen Zeitraum von 22 Stunden und die Analyse der Überlebensrate der naiven Zellen nach erfolgreicher Transfektion.

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Abbildung 29: Expression des GFP- Reporterplasmids in naiven CD4 + T- Zellen und Analyse der Zellzahl nach Amaxa Transfektion

Links: CD4+CD25-CD62Lhigh T- Zellen wurden isoliert und mittels des Nucleofektors von Amaxa transfiziert;
eingesetzter Reporterplasmid: pMCVGFP; die Expression des Reporters wurde 4, 8, 12 und 22 Stunden nach Transfektion gemessen; dargestellt wurde der Anteil der GFP positiven T- Zellen in Bezug auf die absolute Anzahl lebender Zellen.
Rechts: Bestimmung der Anzahl lebender Zellen nach Transfektion mit pMCVGFP und pMCVhCD4; die Zellen wurden mit Trypanblau zu dem Zeitpunkt der Transfektion und 4, 8, 12 und 22 Stunden nach Transfektion gefärbt und die absolute Anzahl lebender Zellen mikroskopisch mittels einer Neubauer Zählkammer bestimmt.

Die Effizienz der Transfektion mittels der Amaxatechnik ist bei dem GFP- Repoterplasmid mit 50% positiver Zellen nach acht Stunden sehr gut. Bei den in Abbildung 4-25 dargestellten Transfektion wurde neben der Transfektionseffizienz ebenfalls die Überlebensrate der Zellen untersucht, da es durch die Nucleofektion bzw. Elektroporation zu einem Absterben der Zellen kommen kann. Hierfür wurde zum Zeitpunkt der Transfektion und allen weiteren Zeitpunkten der durchflusszytometrischen Analyse, die absolute Anzahl lebender Zellen bestimmt. Im rechten Teil der Abbildung 4-25 wird deutlich, dass durch die Elektroporation die meisten Zellen absterben (Reduzierung der Zellzahl um 70-80%). Die Anzahl der überlebenden Zellen ist nach der Elektroporation zu gering um diese Transfektionstechnik bei naiven Zellen vorzunehmen. Das Plasmid pMCVhCD4 wurde transfiziert, um auszuschließen, dass das GFP- Protein einen Einfluss auf die Überlebensrate der naiven T- Zellen hat. Die Transfektion von pMCVhCD4 zeigt den gleichen Einfluss auf die Überlebensrate wie die Transfektion des pMCVGFP- Plasmids. Die Überlebensrate scheint nicht abhängig vom Reportermolekül, sondern der Methode zu sein.

Die Untersuchung der Luciferasekonstrukte mit der TSDR (vgl. Abbildung 4-18) wurde auf Grund der erhaltenen Ergebnisse mit den naiven Zellen (vgl. Abbildung 4-24) nur in Zelllinien durchgeführt. Auf Grund dieser Tatsache war es nicht möglich, die Analyse der Luciferasekonstrukte unter den Bedingungen durchzuführen, unter denen auch die Induktion der Foxp3- Expression in An- und Abwesenheit von TGF-β gesehen worden war (vgl. Abbildung 4-13).


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09.04.2009