5 Diskussion

5.1 Erzeugung einer Foxp3- transgenen Reportermaus

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In dieser Arbeit sollte für die in vivo Analyse des murinen Transkriptionsfaktors Foxp3 eine BAC- transgene Maus hergestellt werden, welche eYFP unter der Kontrolle des Foxp3- Promoters exprimiert.

Die Herstellung des Zielgenvektors war erfolgreich. Die Analyse mittels Restriktion zeigte die erwarteten DNS- Fragmentgrößen. Die kodierende Region des eYFPs und die duale frt- Neomycin/Kanamycin- frt- Kassette sind in der richtigen Orientierung integriert worden. Die Sequenzierungen der einzelnen Zwischenprodukte, wie die homologen Regionen oder die kodierende Region des eYFPs, und die abschließende Sequenzierung des Zielgenvektors zeigte keinerlei Abweichungen zu den bekannten Sequenzen der Datenbanken.

Die homologe Rekombination des Zielgenvektors mit dem Foxp3 beinhaltenden BAC ist in dieser Arbeit nicht geglückt. Die ersten Schritte der Methode ET- Klonierung [114 ] waren erfolgreich. Die homologe Rekombination hat, da die Sequenzen des eYFP und der dualen Kassette nicht an der korrekten Stelle im foxp3- Lokus integriert haben, nicht funktioniert.

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Das Ereignis einer homologen Rekombination unter normalen Bedingungen z.B. mit dem Zielgenvektor in embryonalen Stammzellen ist im Vergleich zu einer nicht homologen Rekombination eher selten. Bei Transfektionen und anschließender homologer Rekombination liegen nur in 4-10% der embryonalen Stammzellen eine homologe Rekombinationen vor [115 ]. Bei der Methode des ET- Klonierens wird das Ereignis einer homologen Rekombination durch die Anwesenheit der Rekombinasen E und T in seiner Häufigkeit gesteigert [113 ]. Auffällig war in unseren Fall, dass es immer zu einer Rekombination, aber nie zu einer homologen Rekombination gekommen ist. Dieser Umstand zeugt von einer sehr schlechten Effizienz der homologen Rekombination in den EL250 Bakterien, welches nicht mit den publizierten Daten übereinstimmt [137 ]; [138 ]. Dieses könnte daran liegen, dass zum einem die gewählten homologen Regionen mit 250-300 bp zu klein waren um die homologe Rekombination erfolgreich durchzuführen oder die beiden Rekombinasen E und T nicht aktiv waren und es nur zu einer in Bakterien üblichen nicht homologen Rekombination gekommen ist. Nach den Informationen von Kooperationspartnern des MDCs und vor allem nach Gierl et al. (137) sind die kleinen homologen Bereiche erfolgreich beim ET- Klonieren. Andere publizierte Daten sprechen aber von mindestens 1000bp großen, homologen Regionen für eine erfolgreiche homologe Rekombination [112 ]. Die Aktivierung der beiden Rekombinasen, welche unter einen Hitze- induzierbaren Promoter in den EL250 Bakterien integriert worden sind, erfolgt durch einen 15- minütigen Schritt (vgl.3.10.2). Dieser Schritt könnte in der Herstellung der elektrokompetenten Bakterien nicht funktioniert haben und folglich konnten die beiden Rekombinasen keine homologe Rekombination vermitteln.

Für die Analyse der Rekombination wurde in dieser Arbeit die Methode der Southern Blot- Analyse gewählt. Eine Überprüfung mittels PCR wäre auch möglich gewesen, hat jedoch gegenüber der Southern Blot- Analyse den wesentlichen Nachteil, dass es immer wieder zu falsch positiven bzw. falsch negativen Ergebnissen kommen kann [139 ]. Die Überprüfung des rekombinierten BACs mit den 5` und 3` externen bzw. internen Sonden zeigte die fehlerhafte Rekombination.

Die interne Sonde konnte das Insert des Zielgenvektors detektieren. Die zweite in unseren Experimenten auftretende Bande von ähnlicher Größe könnte auf eine unspezifische Bindung der Sonde zurückzuführen sein. Es besteht aber auch die Möglichkeit, dass es an einer unbekannten Stelle im BAC zu einer Mehrfachintegration gekommen ist, die dieses kleinere Fragment verursacht. Die Mehrfachintegration kann zusätzlich durch einen Vergleich der Intensität der Banden aller positiv getesteten Klonen mit der internen Sonde überprüft werden. In dieser Arbeit spricht die gleich starke Intensität der Banden in allen getesteten Klonen gegen eine Mehrfachintegration des Inserts.

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Die beiden externen Sonden binden an der Stelle im BAC, an der die homologe Rekombination stattfinden sollte. Daher kann mit den externen Sonden der unveränderte WT- Lokus detektiert werden. Im Gegensatz zur internen Sonde, welche eine Mehrfachintegration oder ein Vorhandensein von Mischklonen (Integration an mehren Stellen im BAC) überprüft, dienen die externen Sonden der Überprüfung der korrekten Position des Inserts in dem BAC. Die korrekte Position wird durch die Bindung der Sonden außerhalb der integrierten Bereiche und die durch die Integration entstehende veränderte Größe der Banden bestimmt (vgl. Abbildung 4-5). Bei den in dieser Arbeit überprüften BACs lag die korrekte Position nicht vor. Die Sequenzierung bestätigte das Ergebnis der Southern Blot- Analyse. Die Primer der Sequenzierung, welche außerhalb des Inserts lagen, konnten keine homologe Rekombination, sondern nur die WT- Sequenz detektieren. Die Primer im Insert zeigten, wie in Abbildung 4-7 dargestellt, eine Rekombination im unbekannten Bereich des BACs. Des weiteren konnte ich feststellen, dass im 5` Bereich des Inserts unbekannte DNS eingebaut worden ist, die nicht im BAC und auch nicht im Zielgenvektor vorhanden ist. Die Vermutung liegt nahe, dass es sich dabei um DNS der Bakterien EL250 handelt, welches nicht überprüft werden konnte, da sie Sequenzabfolge des Genoms dieses E. coli- Stamms nicht bekannt ist. Weitere Analysen der Klone wurden nicht gemacht, da nach den Sequenzierungsergebnissen die Kooperation mit der Münchener Gruppe und die Arbeit mit der DEREG- Maus gestartet wurde.

5.2 Analyse der DEREG- Maus – funktionelle Rolle des Transkriptionsfaktors Foxp3

Die DEREG- Maus ist für die Untersuchung der Regulation und funktionelle Rolle des Transkriptionsfaktors Foxp3 von entscheidender Bedeutung. Im Vorfeld der Arbeit war über die Regulation und die funktionelle Rolle von Foxp3 nicht viel bekannt. Im Laufe dieser Arbeit wurden unterschiedliche Foxp3- Reportemäuse generiert [38 ]; [36 ]; [33 ]; (36); [140 ].

In dieser Arbeit wurden erste initialen Versuche mit der DEREG- Maus gemacht. Bei der Verteilung von Lymphozyten in der DEREG- Maus sieht man keine Unterschiede im Vergleich zu WT- Tieren. Auch die Frequenz von T- Zellen (CD4 und CD8), sowie der Anteil an Foxp3+ T- Zellen sind identisch [37 ]. Die Anzahl der Foxp3+ T- Zellen stimmt mit der Anzahl der GFP+ T- Zellen überein, alle Foxp3+ T- Zellen sind ebenfalls GFP+ T-Zellen. Es konnte festgestellt werden, dass es keine GFP+ T- Zellen gibt, die kein Foxp3 exprimieren. Dieser Umstand spricht für eine identische Regulation des GFPs auf dem BAC und des endogenen Foxp3. Die Expression des GFPs im Vergleich zu dem endogenen Foxp3 spricht ebenfalls dafür, dass keine up- oder downstream liegenden Regulationselemente im Bereich des integrierten BACs einen Einfluss auf die Regulation des GFPs haben. Man kann davon ausgehen, dass das gleiche Expressionsmuster auch für den Diphtheria- Toxin- Rezeptor vorliegt, da es sich um ein DTR- GFP Fusionsprotein handelt. Außerdem wurde scheinbar durch die ungesteuerte Integration kein wichtiger Lokus im murinen Genom zerstört, da die Maus keinerlei augenscheinlichen Phänotyp im Vergleich zu WT- Mäusen aufweist [37 ].

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Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Depletion der Foxp3+ T- Zellen durch DT- Injektion in allen wichtigen Organen überprüft. Es wurden Analysen wie in 4.1.5 beschrieben in mLK, pLK, PP, Thymus, IEL und Milz durchgeführt. In allen Organen zeigte sich das gleiche Bild nach Zugabe von Diphtheria- Toxin. Alle GFP+ T- Zellen wurden durch die Verabreichung von Diphtheria- Toxin eliminiert. Durch den oben schon beschriebenen Umstand, dass alle Foxp3+ T- Zellen GFP+ sind, sollten natürlich auch alle Foxp3+ T- Zellen ebenfalls depletiert werden. Die Depletion der GFP+ T- Zellen war nach zwei Tagen vollständig. Lediglich ein geringer Anteil von Foxp3+ T- Zellen war zu diesem Zeitpunkt noch zu sehen. Der Anteil liegt immer bei ~ 0,2 % der CD4+ T- Zellen (vgl. Abbildung 4-10). Dieser Anteil von Foxp3+ T- Zellen könnte durch einen Färbeartefakt entstanden sein. Die DEREG- Maus zeigte somit den gewünschten Phänotyp und ist für weitere Untersuchungen der Regulation und vor allem für die funktionelle Analyse der Rolle von Foxp3 ein bedeutendes Werkzeug.

Der geringe Anteil an verbleibenden Foxp3+ T- Zellen könnte, neben der Erscheinung als Färbeartefakt auch auf die unterschiedliche Regulierung von Foxp3 und GFP auf post- transkriptioneller Ebene zurückzuführen sein. Jedoch ist über die post- transkriptionelle Regulation von Foxp3 nicht viel bekannt. Es gibt lediglich einige Hinweise auf die Rolle von microRNS an der Regulation [84 ] und Unterschiede in der Expression von Foxp3- mRNS und dem Protein [32 ]. Man konnte in Zellen große Mengen von Foxp3- mRNS finden, aber kein Foxp3- Protein. Nach Aktivierung wurde die Menge von Foxp3- Protein gesteigert, aber die der mRNS herunterreguliert. Bei der post- transkriptionellen Regulation des GFP- Gens könnte es sein, dass die Menge der GFP- mRNS mit der des Proteins übereinstimmt. Dieser Unterschied könnte dazu führen, dass es einen geringen Anteil von Foxp3+ T- Zellen gibt, welche erst nach der erfolgreichen Depletion der GFP+ T-Zellen sichtbar werden.

Der Untersuchung der beiden Diphtheria- Toxine von unterschiedlichen Herstellern lagen die gegensätzlichen Ergebnisse von Lahl et al. 2007 [37 ] und Kim et al. 2007 [36 ] zu Grunde. In Lahl et al. (36) wurde beschrieben, dass der „scurfy“ Phänotyp mit einem Sterben der Mäuse nur bei Gabe des DTs neonatal ausgelöst werden kann. Kim et al. (35) beschreiben diesen Phänotyp auch für sechs bis acht Wochen alte Tiere. In dieser Arbeit konnte festgestellt werden, dass sich die Toxizität der beiden Toxine erheblich unterscheidet. Das Toxin der Firma Merck, welches von Lahl et al. (36) und auch in dieser Arbeit für vorangegangene Depletionen verwendet worden ist, hat eine deutlich geringere Toxizität als das Produkt von Sigma. Mit dem Toxin von Sigma zeigten die DEREG- Mäuse und die WT- Tiere den gleichen Gewichtsverlust. Dieser Umstand ist nicht auf das Fehlen der Tregs in den DEREG- Tieren durch die Depletion der Foxp3+ T- Zellen zurückzuführen, da DT in den WT- Tieren keinen Einfluss auf die Foxp3+ T- Zellen hat. Das Toxin von Sigma hat demnach eine grundlegende Toxizität auf die Mäuse, die ab einer bestimmten Dosis in den Tieren zu wirken beginnt, da die Tiere alle zwei Tage 1 µg Diphtheria Toxin bekamen und der Gewichtsverlust erst bei der sechsten Injektion auftrat und bei der fünften Injektion noch nicht erkennbar war. Die Tiere, welche mit dem Toxin von Merck behandelt worden waren, zeigten den Gewichtsverlust nicht. Es gibt zwei mögliche Erklärungen für diesen Unterschied, zum einen kann es bei der Produktion des Toxins von Sigma zu einer Verunreinigung gekommen sein und zum anderen kann die Angabe 1 µg zwar für beide Toxine gleich gewesen sein, aber die biologische Aktivität des Toxins, die in einem 1 µg enthalten ist, kann unterschiedlich sein. Die Verunreinigung, wie auch die höhere biologische Aktivität kann zu dem drastischen Verlust des Gewichtes geführt haben.

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Der histologische Phänotyp nach der Behandlung mit den beiden Toxinen zeigte keinen Unterschied zwischen den beiden Toxinen, sondern nur den erwarteten Unterschied zwischen den DEREG- Mäusen und den WT- Tieren. Die DEREG- Mäuse zeigten die erwartete Depletion der GFP/Foxp3+ T- Zellen, während die WT- Tiere noch normale Zahlen an Foxp3+ T- Zellen hatten. Die DEREG- Mäuse zeigten auch in diesem Versuch, dass die Expression von GFP und des Diphtheria Toxin Rezeptors erfolgreich ist und man auf diesem Weg die Foxp3+ T- Zellen zum einen fluoreszent markieren und zum anderen mittels Toxingabe depletieren kann.

5.3 Expression und funktionelle Analyse des Transkriptionsfaktors Foxp3

In der funktionellen Analyse konnte festgestellt werden, dass Foxp3 in den ex vivo- isolierten Tregs eine stabile Expression aufweist, während bei den induzierten T- Zellen ein instabiler Phänotyp zu beobachten war. Über die molekularen Signale, die zur Induktion von Foxp3 führen, ist noch nicht viel bekannt. Es wurde beschrieben, dass ein TZR- Stimulus notwendig ist [55 ]; [141 ]; [142 ]. Weitere Arbeiten beschreiben eine essentielle Rolle von TGF-β [143 ]; [66 ]; [28 ]; [144 ]; [65 ]. Durch die Zugabe von Retinolsäure (RA) zu den Induktionskulturen konnte die Induktionseffizienz noch gesteigert werden [72 ]; [73 ]; [74 ]. Auch dem Hormon Estrogen wird eine Rolle in der Regulation bzw. Induktion von Foxp3 zu geschrieben [145 ]; [57 ]. Bei der Induktion der Foxp3- Expression durch TGF-β ist die Anwesenheit von IL-2 essentiell [59 ]; [146 ].

In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass für eine stabile Expression von Foxp3 in suppressorischen Zellen der Methylierungsstatus eine Rolle spielt. In Floess*, Freyer* et al. [1 ] konnten wir zeigen, dass die als TSDR (Treg specific demethylated Region) bezeichnete Region im Intron1 des Foxp3- Gens bei stabilen ex vivo isolierten CD25+Foxp3+ T- Zellen demethyliert vorliegt, während sie bei CD25-Foxp3- T- Zellen methyliert ist. Dieser gefundene Methylierungsstatus bedeutet, dass die auf ihre Stabilität in vivo getesteten T- Zellen, bei denen es sich ebenfalls um ex vivo isolierte T- Zellen handelte, auch eine demethylierte TSDR haben (vgl. Abschnitt 4.2.1). Die CD25- T- Zellen, welche nach TGF-β- Gabe Foxp3 zu einem hohen Prozentsatz exprimierten, zeigten diese vollständige Demethylierung nicht (vgl. Abbildung 4-14). Es war sogar so, dass die induzierten Tregs in Abwesenheit von TGF-β nach Restimulation die Foxp3- Expression wieder herunter regulieren und gleichzeitig der Methylierungsgrad wieder auf 100% anstieg. Die induzierten Zellen zeigten keinen stabilen Phänotyp und keine vollständige Demethylierung. Die ex vivo isolierten Tregs zeigten dagegen stabile Foxp3- Expression und eine komplette Demethylierung der TSDR (vgl. Abschnitt 1.4.1). Dieser Umstand lässt die Schlussfolgerung zu, dass es eine Korrelation zwischen Methylierung und stabiler Foxp3- Expression gibt.

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Es wurde weiterhin die Bedeutung der Foxp3- Expression für die suppressorische Aktivität der Tregs in einem in vitro Proliferations- Test untersucht. Eine Rolle von Foxp3 für die Funktion von Tregs wurde schon oft veröffentlicht [147 ]; [32 ]; [23 ], aber hier konnte gezeigt werden, dass es eine Korrelation zwischen der suppressorischen Eigenschaft, der Stabilität und der Demethylierung der TSDR gibt. Die Zellen mit dem höchsten Anteil von demethylierten CpGs in der TSDR haben auch die stabilste Foxp3- Expression und zeigen die effektivste suppressive Kapazität. Der exakte Suppressions- Mechanismus konnte bisher jedoch nicht geklärt werden [44 ]; [148 ]. Foxp3 ist das entscheidende Molekül in Zellen, wenn sie regulatorische Eigenschaften zeigen sollen. Dieses ist vor allem bei den „wannabe“- Tregs beschrieben worden (32); (33). Diese Tregs werden im Thymus generiert und unterlaufen erst einmal die normale Treg- Entwicklung, aber durch die fehlende Foxp3- Expression (vgl. 1.2) besitzen sie keine suppressorischen Eigenschaften, sondern gleichen in der Peripherie eher Th1 oder Th2 Zellen [33 ]; [34 ]. Weiterhin konnte in der Arbeit von Williams und Rudensky (32) gezeigt werden, dass eine permanente Expression des Foxp3- Moleküls von großer Bedeutung für die Funktion von Tregs ist. Dieser Umstand konnte auch bei dem Vergleich der ex vivo Tregs mit den induzierten Tregs beobachtet werden. Durch die Restimulation in Abwesenheit von TGF-β nach erfolgreicher Induktion der Foxp3- Expression verloren die induzierten Tregs nicht nur ihre Foxp3- Expression, sondern auch ihre suppressorische Kapazität. Die permanente, stabile Foxp3- Expression scheint über den Methylierungsstatus der TSDR gesteurt. Liegt die TSDR demethyliert vor, kommt es zu einer stabilen, permanenten Expression (ex vivo Tregs), liegt sie methyliert oder nur schwach demethyliert vor ist die Expression nicht stbil (induzierte Tregs).

5.4 Regulation der Transkription des Foxp3- Gens

Über die Regulation von Foxp3 auf molekularer Ebene ist ein bisher wenig bekannt. Nur einige, wenige Arbeiten brachten in den letzten Jahren erste Hinweise in die Regulation von Foxp3, wie in der Einleitung beschrieben worden ist. Im humanen Foxp3- Lokus wurden im letzten Jahr der „core“- Promoter gefunden [52 ] und ein weiterer konservierter Bereich mit STAT 5 Bindestellen [58 ] im Intron1.

In dieser Arbeit wurde auf die Regulation der Transkription des Foxp3- Gens im murinen Lokus fokussiert. Ein besonderes Augenmerk lag auf dem Aufbau des murinen Lokus, damit durch die vorgefundenen Strukturen Rückschlüsse auf die möglichen Regulationsmechanismen gezogen werden konnten.

5.4.1  Aufbau des foxp3 - Lokus

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Durch den Vergleich der Sequenzen des Foxp3- Gens unterschiedlicher Spezies konnten erste Strukturen neben der schon bekannten Exon und Intron Struktur gefunden werden [131 ]. Auffällig waren drei homologen Bereiche im Promoter und im Intron 1, die es in Maus, Mensch, Ratte, Hund und Schimpanse gibt (71). Hier wurde erkennbar, dass nicht nur die Exon Struktur, und vor allem die Namensgebende und Familienzugehörigkeit bestimmende „Forkhead“ Domäne [131 ]; [149 ] stark zwischen den Spezies konserviert ist, sondern dies auch auf andere Bereiche zutrifft, die demnach eine wichtige Rolle bei der Genregulation spielen können. Die ersten Analysen der gefundenen konservierten Region zeigten auf, dass man die Daten von Mantel et al. [52 ], und Zorn et al. [58 ], für den humanen Lokus mit den nun gefundenen, murinen, konservierten Regionen verknüpfen kann. Der von Mantel et al. beschrieben „core“- Promoter für das humane Foxp3 liegt im ersten konservierten Bereich und lässt den Schluss zu, dass der „core“- Promoter des murinen Foxp3 ebenfalls an dieser Stelle zu finden ist. Diese Tatsache wird noch deutlicher, da in diesem homologen Bereich der Erste der zwei postulierten Transkriptionsstarts im murinen Lokus zu finden ist (nicht gezeigte Datenbank- Analyse; ensembl und genomatix). Der zweite postulierte Transkriptionsstart liegt downstream der dritten Homologie in der die in dieser Arbeit behandelte TSDR liegt und unmittelbar vor dem Translationsstart des murinen Foxp3- Proteins (ebenfalls Datenbankanalyse und Brunkow et al. 2001 [131 ]). In der homologen Region der TSDR liegt auch der von Zorn et al. [58 ], beschriebene Bereich im humanen Lokus mit den postulierten STAT 5 Bindestellen. Die beiden konservierten Bereiche könnten somit entscheidende Rollen in der Regulation der Transkription des Foxp3- Gens spielen. Die zweite homologe Region enthielt nur repetitive Elemente, genauer gesagt SINES (short interspersed sequences), die im gesamten Vertebraten Genom vorkommen und selten eine Bedeutung für die Regulation von Genen spielen [150 ]. Trotzdem wurde kürzlich für den murinen foxp3- Lokus in diesem Bereich ein TGF-β responsives- Enhancer- Element gefunden werden (71). Die Bindung von SMAD und TZR- vermittelten Transkriptionsfaktoren an dieses Element führt zur Offnung des Foxp3- „core“- Promotors. Er wird demethyliert und es kommt zu Histon- Modifikationen in diesem Bereich. An der TSDR wurden keine Analysen durchgeführt, trotzdem unterlegen diese Daten unsere gefundene Ergebnisse bei der Induzierung von Tregs mittels TGF-β (vgl. Abschnitt 4.2). Es kommt in den induzierten Tregs zu einer initialen Foxp3- Expression, aber nicht zu einer vollständigen Demethylierung der TSDR, wie es bei den ex vivo Tregs der Fall ist (63), und die Foxp3- Expression ist nicht stabil.

Die in einer in siliko Analyse der TSDR gefundenen möglichen Transkriptionsfaktor- Bindestellen können einen ersten Eindruck über die funktionelle Rolle der TSDR bei der Transkription von Foxp3 geben. Einige von den möglichen Bindestellen sind von besonderem Interesse. Darunter fallen vor allem die schon in T- Zellen und Tregs beschriebenen Faktoren NF-κB [132 ]; [133 ], NFAT [134 ]; [135 ]; [136 ], STAT [63 ]; [58 ], SMAD [70 ]; [151 ] und auch CREB/ATF. Weiterhin könnten Faktoren besonders interessant sein, deren Bindung schon als methylierungabhängig beschrieben worden ist, wie z.B. CREB/ATF [152 ] oder im Zusammenhang mit TGF-β und den SMAD- Faktoren, wie z.B. Evi-1 eine Rolle spielen [153 ]; [154 ]. Im Falle des CREB/ATF wurde im Laufe dieser Arbeit eine methylierungsabhängige Bindung an der TSDR von Kim und Leonard, 2007 [155 ] beschrieben. Weitere Analysen der möglichen Bindungen von Transkriptionsfaktoren müssen überprüft werden, z.B. durch ChIP- Analysen um in dieser Frage Klarheit zu gewinnen. Interessant ist auch die vorgeschlagene Bindestelle für Foxp3 selbst. Diese würde, wenn die Bindung bestätigt werden kann, für einen autokrinen „Feedback Loop“ sprechen, der entweder die Transkription fördern bzw. stabilisieren oder aber auch unterdrücken könnte (32).

Die Analyse der Bindung von Transkriptionsfaktoren kann einen weiteren Einblick in die Funktion der TSDR geben und auch weitere Hinweise für die Klärung der unterschiedlichen Methylierungsmuster in ex vivo isolierten CD25+ zu CD25- T- Zellen und induzierten Tregs liefern. Die Bindung von Transkriptionsfaktoren kann die Transkription eines Gens stabilisieren [93 ] und die Methylierung könnte die Bindung von stabilisierenden Faktoren verhindern und somit die stabile Expression in den induzierten Tregs verhindern. Dies würde dafür sprechen, dass die initiale Transkription vom Promoter in der gefundenen ersten homologen Region (Methylierungsstatus in induzierten Tregs und [155 ]) ohne eine funktionelle bzw. demethylierte TSDR gestartet werden kann und die Stabilität der Expression durch den gleichen Mechanismus wie bei dem IL-2- Lokus [101 ] über die TSDR gesteuert wird. Natürlich kann es noch andere Regulationsmechanismen der Foxp3- Expression geben. In dieser Arbeit wurde z.B. die post- transkriptionale Regulation nicht untersucht, aber auch für diese Art der Regulation gibt es erste Hinweise bei dem murinen foxp3- Lokus [32 ]; [84 ]. Die vollständige Entschlüsselung der molekularen Regulation der Transkription des murinen Foxp3- Proteins wird noch einiges an interessanten Ansätzen erfordern.

5.4.2  Transkriptionale Aktivität der TSDR

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Die in dieser Arbeit durchgeführten Luciferase- Tests geben erste konkrete Hinweise auf die transkriptionelle Rolle der TSDR im murinen foxp3- Lokus. In den ersten Versuchen konnte geklärt werden, ob es sich bei der TSDR um einen zusätzlichen Promoter im murinen foxp3- Lokus handelt oder ob die TSDR ein additives Element zur Unterstützung der Aktivität des Promoters ist (z.B. ein Enhancer). Die Theorie eines zweiten eigenständigen Promoter wurde durch den Umstand unterstützt, dass für das murine Foxp3 drei ESTs (Expressed Sequence tags) gefunden worden sind (Datenbank des NCBI und ensemble). Das erste beginnt am beschriebenen Promoter [52 ]; [155 ], das zweite EST beginnt unmittelbar hinter der TSDR am Exon-1 und das dritte am eigentlichen Transkriptionsstart im Exon1. Das zweite EST lässt die Vermutung zu, dass es sich bei der TSDR um einen zusätzlichen Promoter handeln könnte. Zur Überprüfung beider Möglichkeiten wurden im Luciferase- Test zwei unterschiedliche Vektoren eingesetzt, die eine Unterscheidung zwischen Promoter und additiven Element ermöglichten (vgl. Abschnitt 4.3.4.2). Im pGL3- Basic, der keinen eigenen Promoter enthält konnte keine Aktivität der Luciferase gemessen werden, was bedeutet, dass es sich bei der TSDR nicht um einen eigenständigen Promoter handelt. In einem zweiten Ansatz wurde der pGL3- Promoter, welcher einen minimalen SV40- Promoter beinhaltet, eingesetzt. Die mit dem pGL3- Promoter und der integrierten TSDR gezeigte stärkere Luciferaseaktivität deutet darauf hin, dass es sich bei der TSDR um ein additives Element, wie z.B. ein Enhancer zur Unterstützung des Foxp3- Promoters handelt. Die gleichen Ergebnisse konnten auch unsere Kooperationspartnern Edgar Schmitt (Institut für Immunologie, Universität Mainz) mit dem TSDR- Konstrukt in ex vivo- isolierten Tregs gezeigt werden. Weitere Analysen zeigten auch, dass die TSDR alleine einen zehnfach- verstärkten Effekt auf die Luciferaseaktivität hat, während die anderen untersuchten Konstrukte die Aktivität im Zusammenspiel mit der TSDR nur 1,5fach steigern konnten oder gar kein Einfluss auf die Expression der Luciferase zeigten.

In weiteren Analysen der TSDR in Luciferase- Tests konnte gezeigt werden, dass es für die transkriptionale Aktivität der TSDR von entscheidender Bedeutung ist, dass die TSDR in einem demethylierten Zustand vorliegt. Eine Methylierung der TSDR verhindert die Aktivität der Luciferase. Dieses Ergebnis zeigt, dass das gefundene Methylierungsmuster in den ex vivo isolierten CD25+ T- Zellen und in den induzierten Tregs eine Bedeutung für die Foxp3- Expression hat. Eine genauere Überprüfung des Zusammenhanges ist notwendig, da die Luciferase- Tests unter nicht physiologischen Bedingungen durchgeführt worden sind. Die Zelllinie zeigt keine endogene Foxp3- Expression und somit ist unklar, ob alle Faktoren, die durch die Aktivierung der Zellen produziert werden, auch bei der Transkription des Foxp3- Gens in Tregs vorhanden sind. Weiterhin ist zu überprüfen, ob die transkriptionelle Aktivität der TSDR nicht nur im Zusammenhang mit dem minimalen Promoters des SV40, sondern auch mit dem endogenen Foxp3 Promoter beobachtbar ist, wie es von Kim und Leonard [155 ] für ein kleines Fragment der TSDR (299 bp) gezeigt werden konnte. In diesem Zusammenhang könnte, ähnlich zu der Arbeit von Kim und Leonard, überprüft werden, ob die Methylierung bei dem Zusammenspiel der TSDR mit dem endogenen Promoter eine unterstützende oder inhibierende Funktion hat. Diese weiteren Analysen der TSDR erscheinen immer noch als wichtig, obwohl die Arbeit von Kim und Leonard dieses für das 299 bp große Fragment schon gezeigt haben, da unser analysierter Bereich deutlich größer ist (1235 bp) und es so, da weitere regulative Elemente enthalten sein können, zu anderen Ergebnissen kommen kann.

Die Deletionen der TSDR konnten den wichtigsten Bereich in der TSDR näher eingrenzen, welcher 673 bp downstream von dem Start der TSDR beginnt und 267 bp upstream des 3`Endes aufhört. Der in dieser Arbeit gefundene Bereich beinhaltet auch die von Kim und Leonard [155 ] beschriebene Region und unterstreicht die Bedeutung dieser Region deutlich. Die Ergebnisse beider Arbeiten zeigen, dass dieser Bereich für die transkriptionelle Aktivität von entscheidender Bedeutung ist. Die transkriptionelle Aktivität nimmt mit jedem Deletionsschritt ab. Das letzte verbleibende Stück des 3`Endes der TSDR zeigt nur noch basale Aktivität der Luciferase, die auch der pGL3- Promoter ohne weitere Inserts erreicht wird. Der letzte Deletionsschritt war mit dem größten Verlust an Luciferaseaktivität verbunden Schritt.

5.4.3  Gen- Regulation und Chromatin- Struktur im foxp3- Lokus

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In der Einleitung wurde der Zusammenhang der Regulation der Transkription eines Genes mit Histon- Modifikationen erläutert. Histon- Modifikationen wurden auch im Bereich der TSDR gefunden. Die Histone H3 und H4 weisen im Bereich der TSDR bei CD25+ T- Zellen im Gegensatz zu CD25- T- Zellen eine Acetylierung auf. Ebenfalls konnte eine tri- Methylierung des Lysins4 des Histon3 nachgewiesen werden. Diese Modifikationen sprechen dafür, dass im Bereich der TSDR Euchromatin vorliegt. Dies bedeutet, wie schon in der Einleitung beschrieben, dass an dieser Stelle offene Strukturen vorliegen. Diese offenen Strukturen erleichtern die Expression von den in diesem Bereich liegenden Genen.

Die Modifikationen von Histonen können auch im Zusammenspiel mit der Methylierung von DNS auftreten und sich gegenseitig unterstützen und ergänzen [108 ]; (101). Mit den in dieser Arbeit enthaltenen Ergebnissen, kann man dieses Zusammenspiel auch für den murinen Foxp3 Lokus vermuten. In den ex vivo isolierten CD25+ T- Zellen wurde nicht nur die Demethylierung der TSDR, sondern auch Histon- Modifikationen gefunden. Bei den induzierten Tregs konnte nur eine teilweise Demethylierung der TSDR gefunden werden und das Histon- Modifizierungsmuster sieht auch anders aus als bei ex vivo isolierten CD25+. Die ersten, vorläufigen Daten zu den Histon- Modifikationen in den induzierten Tregs wurden in unserer Arbeitsgruppe von Julia Polansky erstellt und zeigten für die Acetylierung der Histone H3 und H4 die gleichen Ergebnisse wie die Modifikationen bei den ex vivo isolierten CD25+ T- Zellen. Die tri- Methylierung des Lysins 4 des Histon3 fiel bei den induzierten Tregs signifikant geringer aus als bei den ex vivo isolierten CD25+ T- Zellen. Dieser Umstand könnte bedeuten, dass die tri- Methylierung des Lysins 4 erst erfolgt, wenn die TSDR komplett demethyliert ist oder die Demethylierung erst erfolgen kann, wenn die tri- Methylierung erfolgt ist. Die Histon- Modifikationen zeigen einen weiteren Umstand im Zusammenhang mit der Stabilität der Foxp3- Expression und der regulativen Rolle der Transkription durch die TSDR. In Kang et al. konnte ebenfalls bei der Induktion der Foxp3- Expression durch Retinolsäure (engl. Retonic Acid, RA) auch eine Acetylierung der Histone im „core“- Promotor nachgewiesen werden.

5.5 Ausblick

Ein erster Einblick in die funktionelle Rolle und die Regulation des murinen Transkriptionsfaktors Foxp3 konnte in dieser Arbeit gewonnen werden.

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Die weitere Analyse der DEREG- Maus wird noch mehr Informationen über die funktionelle Rolle des Transkriptionsfaktors Foxp3 bringen oder besser gesagt über die Zellen, welche Foxp3 exprimieren. Erste Schritte in diese Richtung könnte eine Untersuchung der Depletion im Entzündungsmodel DTH (delayed- type- hypersensitivity) und die Erforschung von Tumorentwicklung in An- und Abwesenheit von funktionellen Tregs sein. Interessant ist auch der Aspekt, wann und ob die Tregs nach erfolgter Depletion wieder entstehen, also wie lange es dauert, bis neue Foxp3+ T- Zellen in dem Thymus generiert werden, in dem man z.B. thymektomierten Mäusen Diphtheria- Toxin verabreicht und kontrolliert, ob Foxp3+ T- Zellen aus dem Pool der peripheren Zellen entstehen. Weitere Analysen können auch über den Ursprung der Tregs (Thymus oder Peripherie) gemacht werden. Mit der DEREG- Maus werden eine Vielzahl von Versuchen möglich, um die funktionelle Rolle des Transkriptionsfaktor Foxp3 weiter zu analysieren.

Weiterhin wurde im Zuge dieser Arbeit eine Region im Lokus des Foxp3- Gens identifiziert, die TSDR, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Foxp3- Expression spielt. Für weitere Analysen der Struktur des foxp3- Lokus sollte auch ein DNAse- Hypersensitivity- Test mehr Information liefern. Dieser Test gibt noch mehr Klarheit, ob der foxp3- Lokus in CD25+ versus CD25- T- Zellen eine offene bzw. geschlossene Struktur aufweist. Diese Daten würden die Ergebnisse der Methylierungsanalyse und der ChIP- Test ergänzen. In unserer Arbeitsgruppe wird daran gearbeitet, in in vitro Kulturen die Stabilität der Foxp3- Expression durch repetitive Stimulation in der Anwesenheit von TGF-β zu verbessern und mehr über das Methylierungsmuster bei einer stabilen, induzierten Foxp3- Expression herauszufinden. Fragestellungen könnten dabei sein: Welchen Einfluss hat die mehrfache Stimulation in Anwesenheit von TGF-β auf das Methylierungsmuster? Wird die TSDR immer stärker demethyliert? Welchen Einfluss hat die Verwendung von Aza- Cytidin- Behandlung auf die induzierten Tregs oder auf die Induktion selbst?

Wie in Abschnitt 5.4.3 schon angedeutet, sind die Ergebnisse zur transkriptionellen Aktivität der TSDR eine erste erfolgreiche Analyse, die aber noch weiter vertieft werden muss. Die Analyse zusammen mit dem endogenen Foxp3- Promoter wird dabei noch einmal genauer zeigen, in welchem Maße die Aktivität durch das gefundene Element TSDR gesteigert werden kann. Auch kann in diesem Zusammenhang die Bedeutung der Methylierung der TSDR weiter untersucht werden. Von entscheidender Bedeutung wird die Analyse der Bindung der postulierten Transkriptionsfaktoren an die TSDR sein. Sie könnten einen weiteren Einblick in den gesamten Ablauf der Regulation des Transkriptionsfaktor Foxp3 im Zusammenhang mit der Methylierung bzw. Demethylierung und den gefundenen Histon Modifikationen geben. Hierbei wird entscheidend sein, welche Faktoren an der Regulation der Expression des Foxp3- Gens beteiligt sind und ob die Bindung methylierungsabhängig oder -unabhängig erfolgt. In folgenden Versuchen sollte dieser Umstand in den durch die Deletion gefundene Region der TSDR genauer analysiert werden. Hier könnten auch mit hoher Wahrscheinlichkeit die wichtigsten Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen gefunden werden. Nächste Schritte könnten z.B. die Deletion einzelner Bindungsstellen sein, um den Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität zu beobachten. Mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen in diesem Bereich sind, wie in Abschnitt 4.3.3.3 bereits beschrieben, STAT-1, CREB/ATF (vgl. auch [155 ], NF-κB, c-Ets-1, Foxp3, NFAT und Evi-1. In diesem Bereich liegen ebenfalls acht der 14 auf ihren Methylierungszustand analysierten CpG- Motive [1 ]. Dieses ist ein weiterer Umstand der für eine entscheidende Bedeutung des Methylierungsstatus der TSDR bei der Expression des murinen Foxp3- Gens spricht. Nach einer Überprüfung, welche der postulierten Transkriptionsfaktoren an die TSDR binden, ist ein weiterer Schritt die Analyse einer möglichen methylierungsabhängige Bindung der Transkriptionsfaktoren an die TSDR. Bis jetzt ist diese Art der Bindung nur für CREB/ATF beschrieben worden [155 ].


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09.04.2009