In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle und Regulation des murinen Transkriptionsfaktor Foxp3 untersucht. Der erste wesentliche Teil zur Analyse der funktionellen Rolle war dabei die Erzeugung einer BAC- transgenen Maus. Hierfür wurde ein Zielgenvektor mit der kodierenden Region des eYFPs und einer dualen Selektionskassette sowie die Methode des ET- Klonierens verwendet. Leider war die homologe Rekombination des Zielgenvektors in den BAC nicht erfolgreich. Es kam zu einer ungeklärten Rekombination mit Fremd- DNS. Die Erzeugung der transgenen Maus wurde nach diesem Ergebnis eingestellt, und es wurde mit einer von unserem Kooperationspartner zur Verfügung gestellten BAC- transgenen Maus weitergearbeitet. Diese Maus, die DEREG- Maus, wurde nach dem gleichen Prinzip erstellt, wie die in dieser Arbeit gestartete transgene Maus, an Stelle des eYFPs trägt die DEREG- Maus die kodierenden Region des GFPs und des Diphtheria- Toxin- Rezeptors. Mit dieser Maus wurden erste Analysen zur Überprüfung der transgenen Maus unternommen. Es wurde die Koexpression von GFP und Foxp3, sowie die Depletion der Foxp3⁺ T- Zellen mittels Diphtheria- Toxin analysiert.

Als nächstes wurde die funktionelle Rolle des Transkriptionsfaktors Foxp3 analysiert. Als einer der ersten Schritte wurde die Stabilität von Foxp3 in vivo überprüft und gezeigt, dass T- Zellen, die das Foxp3- Protein exprimieren, bis zu 14 Tage in vivo stabil sind. Weiterhin wurde die Stabilität der Foxp3- Expression in in vitro Kulturen nach Induktion durch TGF-beta untersucht. Die induzierten Tregs zeigten keine stabile Foxp3- Expression und auch bei der Methylierungsanalyse der TSDR zeigten diese T- Zellen nicht das für ex vivo isolierte Foxp3⁺ T- Zellen beschriebene Methylierungsmuster. Die Stabilität scheint mit der Demethylierung der TSDR zu korrelieren. Die induzierten Tregs zeigten neben dem nicht stabilen Foxp3- Phänotyp auch eine von der Foxp3- Expression abhängige Suppression von naiven Zellen im in vitro Proliferations- Test.

Im dritten Teil der Arbeit wurde die Struktur und Regulation des Transkriptionsfaktors Foxp3 untersucht. Der Lokus wurde auf konservierte Regionen im Vergleich zu den Spezies Maus, Mensch, Ratte, Huhn, Schimpanse, Hund und Frosch untersucht. Die in Floess*, Freyer* et al. [1 ] gefundenen Region TSDR enthält einen hochkonservierten Bereich. Die Region wurde auf mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen hin analysiert, und ebenfalls wurden in diesem Bereich Histon- Modifikationen für die Acetylierung der Histone H3 und H4, sowie Tri- Methylierung des Lysin4 des Histons H3 gefunden. Die TSDR wurde in Luciferase- Tests auf ihre transkriptionelle Aktivität hin getestet und zeigte einem Enhancer ähnliche unterstützende Aktivität. Die Methylierung der TSDR in den Luciferase- Tests führte zu einer Reduktion der transkriptionellen Aktivität. Deletionsmutanten der TSDR konnten den Bereich für die transkriptionelle Aktivität weiter einschränken und zeigten ein 275pb großes Fragment auf, in welchem viele interessante, mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen und auch die größte Anzahl der differentiell methylierten CpG- Motive liegen

The aim of the study was to analyze the function and regulation of the transcription factor Foxp3. In a first step we designed a BAC-transgenic mouse with eYFP under the control of the Foxp3 promoter. For creating these mice we use the ET- cloning method. The step of homologous recombination of the target vector into the BAC failed. Because of that, we decided to work in cooperation with the group of Tim Sparwasser from Munich and their BAC- transgenic mouse called DEREG- mouse. This mouse expresses the coding region of eGFP fused to the diphtheria- toxin- receptor under the control of the Foxp3 promoter. Therefore Foxp3⁺ T cells can be easily detected by eGFP expression and can even be depleted by diphtheria- toxin- application. We confirmed the co- expression of Foxp3 and eGFP and furthermore tested the functionality of the depletion- process of Foxp3⁺ T cells by treatment with diphtheria- toxin.

In a second study, we analyzed the stability of Foxp3 expressing cells in vivo. Therefore we transferred Foxp3⁺ T cells in syngenic mice and analyzed these cells after 14 days for their Foxp3- expression. Furthermore, we tested the induction of Foxp3 expression through TGF-beta and the suppressive activity of these cells. We also analyzed those cells for their methylation pattern, comparing cells, which showed an induction of Foxp3- expression after one week of culture with TGF-beta to cells, which received TGF-beta for one week and were then restimulated in the absence of TGF-beta. The stability of Foxp3 expression seems to correlate with the demethylated state of the TSDR (Treg Specific Demethylated Region).

To get a closer look on the region called TSDR in the murine foxp3 locus, we decided to analyze this region under different aspects. First, we checked for putative binding sites of transcription factors by database analysis of the TSDR. We also analysed histon modifications, such as acetylation of histon H3 and H4 and tri- methylation of lysine 4 at histon3, in this region. Presence of these modifications hinted an epigenetic regulation of Foxp3 involving the TSDR. In a last step, the transcriptional activity of TSDR was tested to delineate whether the TSDR serves as an alternative promoter or acts as a regulative element like an enhancer. Luciferase assays showed that TSDR is a regulative enhancer element, which loses transcriptional activity when methylated. Deletion mutants determined the most important fragment of the TSDR.

Transkriptionsfactor Foxp3 regulatory T- cells TSDR = Treg specific demethylated region epigentic control Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung

  • 1.1 Grundzüge des Immunsystems

  • 1.2 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T- Lymphozyten – regulatorische T- Zellen (Tregs)

  • 1.3 Regulation und Funktion des Transkriptionsfaktors Foxp3

    • 1.3.1  Regulation der Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3

    • 1.3.2  Funktion des Transkriptionsfaktors Foxp3

  • 1.4 Gen- Regulation und Chromatin- Struktur

    • 1.4.1  DNS- Methylierung zur Inaktivierung genetischer Aktivität

    • 1.4.2  Histon- Modifikation und Chromatin- Struktur

  • 1.5 Erzeugung transgener Mäuse

    • 1.5.1  Einfacher Genersatz in bakterielle, artifizielle Chromosomen (engl. Bacterial atrificial chromosoms; BACs)  

    • 1.5.2  Weitere Rekombinationssysteme

  • 1.6 Ziel der Arbeit

• 2 Material

  • 2.1 Stammlösungen, Puffer und Medien 

    • 2.1.1  Allgemeine Lösungen

  • 2.2 Lösungen und Medien für die Bakterienkultur

    • 2.2.1  Kultivierung von Bakterien

  • 2.3 Lösungen zur Analyse von Nukleinsäuren

    • 2.3.1  Präparation von DNS

    • 2.3.2  Gelelektrophorese

    • 2.3.3  Transfer von Nukleinsäuren

  • 2.4 Lösungen und Medien für die Zellkultur

    • 2.4.1  Kultivierung

  • 2.5 Nukleinsäuren

    • 2.5.1  Klonierungsvektoren

    • 2.5.2  Rekombinante Plasmide

    • 2.5.3  Bakterielle, artifizielle Chromosomen (engl. Bacterial artificial chromosoms; BAC)

    • 2.5.4  Oligonukleotide

      • 2.5.4.1  Primer für PCR

      • 2.5.4.2  Primer für Auftragssequenzierungen

  • 2.6 Größenstandard für Agarose- Gelelektrophorese

  • 2.7 Bakterienstämme

  • 2.8 Zelllinien

  • 2.9 Antikörper und Fluorochrome

  • 2.10 Reagenzien- Sätze (Kits)

  • 2.11 Allgemeine Labormaterialien

  • 2.12 Fertige Lösungen

  • 2.13 Geräte

  • 2.14 Versuchstiere

• 3 Methoden

  • 3.1 DNS- Präparation

    • 3.1.1  Analytische Plasmidisolierung aus Bakterien (Minipräparation)

    • 3.1.2  Präparative Plasmidisolierung aus Bakterien (Midipräparation)

    • 3.1.3  Präparative, endotoxinfreie Plasmidisolierung aus Bakterien (Maxipräparation)

    • 3.1.4  BAC- DNS- Isolierung

    • 3.1.5  Isolierung genomischer DNS aus Kulturzellen

    • 3.1.6  Aufreinigung von DNS aus Agarosegelen

    • 3.1.7  Natriumacetat- Fällung von DNS

    • 3.1.8  RNS- Präparation

    • 3.1.9  RNS- Isolierung

  • 3.2 Polymerase- Kettenreaktion (engl. Polymerase chain reaction; PCR)

    • 3.2.1  Ableiten von PCR- Primeren

  • 3.3 Typischer PCR- Ansatz für die Taq- Polymerase

    • 3.3.1  Typischer PCR- Ansatz für die Taq- Polymerase und Tgo- Polymerase

    • 3.3.2  Typischer PCR- Ansatz für die Pwo- Polymerase

  • 3.4 Herstellung von cDNS mit RNS- Matrize für die RTQ- PCR

  • 3.5 RTQ- PCR (engl. real time quantitative PCR)

  • 3.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

    • 3.6.1  Photometrische Konzentrationsbestimmung

    • 3.6.2  Konzentrationsabschätzung durch Agarose- Gelelektrophorese

  • 3.7 Gelelektrophorese zur Größenfraktionierung von Nukleinsäuren

    • 3.7.1  Native Agarose- Gelelektrophorese

  • 3.8 Enzymatische Modifikation und in vitro- Rekombination von DNS 

    • 3.8.1  Spaltung doppelsträngiger DNS mit Restriktionsendonukleasen

      • 3.8.1.1  Vollständige Spaltung von DNS

      • 3.8.1.2  Vollständige Spaltung von genomischer DNS

    • 3.8.2  Glätten überhängender einzelsträngiger 5‘- DNS- Enden

    • 3.8.3  Dephosphorylierung von Vektorenden

    • 3.8.4  Ligation von DNS- Fragmenten

    • 3.8.5  Klonierung von PCR- Fragmenten

    • 3.8.6  Methylierung von DNS- Fragmenten

  • 3.9 Transformation

    • 3.9.1  Herstellung transformationskompetenter, einfrierbarer Bakterien

    • 3.9.2  Durchführung der Transformation

    • 3.9.3  Identifizierung rekombinanter Klone

  • 3.10 Elektroporation von Bakterien zur homologen Rekombination

    • 3.10.1  Vorbereitung der zu transfizierenden DNS

    • 3.10.2  Methode des ET- Klonierens

  • 3.11 Auftragsarbeiten

    • 3.11.1  Sequenzierungen

    • 3.11.2  Methylierungsanalyse

  • 3.12 Transfer von Nukleinsäuren

    • 3.12.1  Transfer von DNS (Southern- Blot)

  • 3.13 Chemilumineszenter Nachweis von Nukleinsäuren und Hybridisierung mit einer markierten Sonde

    • 3.13.1  Herstellung Biotin- markierter Sonden

    • 3.13.2  Vorhybridisierung

    • 3.13.3  Hybridisierung

    • 3.13.4  Waschen

    • 3.13.5  Chemilumineszente Detektion

  • 3.14 Chromatin Immun- Präzipitations- Test (ChIP)

  • 3.15 Methoden der Zellkultur von isolierten Mauszellen und Zelllinien der Maus

    • 3.15.1  Auftauen von Zellen

    • 3.15.2  Einfrieren von Zellen

    • 3.15.3  Zellzahlbestimmung

    • 3.15.4  Passagieren von adhärenten Zellen

    • 3.15.5  Ex vivo Isolierung von murinen Lymphozyten

    • 3.15.6  Färbung von Zellen

      • 3.15.6.1  Foxp3- Färbung

    • 3.15.7  Kulturbedingungen

  • 3.16 Durchflusszytometrische Analyse 

  • 3.17  In vitro Proliferations- Test

  • 3.18 Amaxa Transfektionen

  • 3.19 Adaptiver Transfer von CD4⁺CD25⁺ T- Zellen

  • 3.20 Diphtheria Toxin Gabe zur Depletion von Tregs in den DEREG- Mäusen

  • 3.21 Dualer Luciferase- Test

• 4 Ergebnisse

  • 4.1 Erzeugung einer transgenen Foxp3- Reportermaus

    • 4.1.1  Strategie zur Erzeugung einer BAC- transgenen Maus mit einem Reportergen im foxp3-Lokus

    • 4.1.2  Klonierung des Zielgenvektors pBSK5`eYFPSVneo/kan3`

      • 4.1.2.1  Einführung der kodierenden Region des eYFPs und des SV40PolyA

      • 4.1.2.2  Erzeugung der homologen Regionen

      • 4.1.2.3  Einführung der Selektionskassette

    • 4.1.3  Analyse des Zielgenvektors

    • 4.1.4  Herstellung und Analyse der transgenen Klone

      • 4.1.4.1  Elektroporation der Bakterien und homologe Rekombination des Inserts mit dem BAC

      • 4.1.4.2  Southern- Blot- Analyse

        • Nachweis der homologen Rekombination mit den externen und der internen Sonde

      • 4.1.4.3  Sequenzierungsanalyse der Klone

    • 4.1.5  Analyse der DEREG- Maus

      • 4.1.5.1  Analyse der Foxp3 ⁺ T- Zellen in der DEREG- Maus

      • 4.1.5.2  Depletion der Foxp3 ⁺ T- Zellen

      • 4.1.5.3  Vergleich der Diphtheria- Toxine von Merck und Sigma zur Depletion der Foxp3 ⁺T- Zellen

  • 4.2 Analyse von Foxp3⁺ T- Zellen

    • 4.2.1  Stabilität von Foxp3 in vivo

    • 4.2.2  Stabilität korreliert mit demethylierten CpGs in konservierter Region im Intron I

    • 4.2.3  Foxp3- Expression korreliert mit suppressiver Kapazität

  • 4.3 Analyse der Regulation des murinen foxp3- Lokus

    • 4.3.1  Histon- Modifikationen korrelieren mit Foxp3- Expression

    • 4.3.2  Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen in der TSDR

    • 4.3.3  Analyse der transkriptionalen Aktivität der TSDR

      • 4.3.3.1  Analyse der unterschiedlichen Luciferasekonstrukte

      • 4.3.3.2  Methylierung der TSDR im dualen Luciferase- Test

      • 4.3.3.3  Deletion der TSDR- Region

      • 4.3.3.4  Amaxa- Transfektion von naiven Zellen

• 5 Diskussion

  • 5.1 Erzeugung einer Foxp3- transgenen Reportermaus

  • 5.2 Analyse der DEREG- Maus – funktionelle Rolle des Transkriptionsfaktors Foxp3

  • 5.3 Expression und funktionelle Analyse des Transkriptionsfaktors Foxp3

  • 5.4 Regulation der Transkription des Foxp3- Gens

    • 5.4.1  Aufbau des foxp3 - Lokus

    • 5.4.2  Transkriptionale Aktivität der TSDR

    • 5.4.3  Gen- Regulation und Chromatin- Struktur im foxp3- Lokus

  • 5.5 Ausblick

• Abkürzungsverzeichnis

• 6. Literaturverzeichnis

• 7. Anhang

• Eidesstattliche Erklärung

• Publikationsliste und Kongressteilnahme

• Danksagung

• Tabelle 1: Klonierungsvektoren, ausführliche Vektorkarten siehe Anhang

• Tabelle 2: Verwendete rekombinante Plasmide

• Tabelle 3: Verwendete BACs

• Tabelle 4: Übersicht über die in dieser Arbeit für die PCR verwendeten Primer

• Tabelle 5: Startermoleküle für Auftragssequenzierungen

• Tabelle 6: verwendete Nukleinsäure- Größenstandards

• Tabelle 7: In dieser Arbeit verwendeter Bakterienstämme

• Tabelle 8: Verwendete Zelllinien

• Tabelle 9: Verwendete Antikörper

• Tabelle 10: Eingesetzte Fluorochrome und Farbstoffe

• Tabelle 11: PCR- Ansatz und Programm mit der Taq- Polymerase

• Tabelle 12: PCR- Ansatz und Programm mit der Taq- und Tgo- Polymerase

• Tabelle 13: PCR- Ansatz und Programm mit der Pwo- Polymerase

• Tabelle 14: Ansatz für die cDNS Synthese

• Tabelle 15: Ansatz einer RT- PCR Reaktion

• Tabelle 16: Auflösungsvermögen von Agarosegelen bei verschiedenen Agarose konzentra tionen

• Tabelle 17: Orginalwerte zur Methylierungsanalyse

• Abbildung 1: Übersicht zur Entstehung von CD25 ⁺ CD4 ⁺ T- Zellen in Thymus und Peripherie

• Abbildung 2: Darstellung der Methylierung des Cytosins

• Abbildung 3: Methylierung und Demethylierung von DNS

• Abbildung 4: Methylierungsstatus von ex vivo isolierten CD25 ⁺ / ^- T- Zellen

• Abbildung 5: Histon- Acetylierung führt zu offenen Chromatin- Strukturen

• Abbildung 6: Schema für die homologe Rekombination des Repotergens eYFP mit der kodierenden Region des Foxp 3- Gens

• Abbildung 7: Klonierung des Zielgenvektors pBSK5`eYFPSVneo/kan3`

• Abbildung 10: Darstellung des Southern- Blots mit den externen Sonden

• Abbildung 11: Darstellung der Southern- Blot- Analyse mit interner Sonde

• Abbildung 12: Southern Blot Analyse mit der 5´externen und internen Sonde

• Abbildung 13: Ergebnisse der Sequenzierungsanalyse

• Abbildung 14: Analyse der Foxp3 ⁺   T- Zellen

• Abbildung 15: Depletion der Foxp3 ⁺ bzw. GFP ⁺   T- Zellen in DEREG Mäusen

• Abbildung 16: Gewichtsabnahme der Mäuse bei Diphtheria Toxin- Behandlung

• Abbildung 17: Analyse der Stabilität Foxp3 ⁺ T- Zellen in vivo

• Abbildung 18: Foxp3- Expression unter unterschiedlichen Kulturbedingungen

• Abbildung 19: Methylierungsstatus von sechs Tage bzw. zwölf Tage kultivierten T- Zellen in An- und nach Restimulation in Abwesenheit von TGF- β

• Abbildung 20: Analyse der suppressorischen Eigenschaften der unterschiedlich Foxp3 exprimierenden T- Zellen

• Abbildung 21: ChIP- Analyse der CD25 ⁺ versus CD25 ^- T- Zellen

• Abbildung 22: Darstellung gefundener, möglicher Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen in der TSDR

• Abbildung 23: Darstellung der Luciferasekonstrukte

• Abbildung 24: Analyse der Luciferase Aktivität nach 24 und 48 Stunden

• Abbildung 25: Vergleich der Transfektion von Jurkat und EL-4 Zellen

• Abbildung 26: Vergleich der unterschiedlichen Konstrukte in verschiedenen Luciferaseplasmiden

• Abbildung 27: Methylierung der TSDR im Luciferase- Test

• Abbildung 28: Deletion der TSDR im Luciferase- Test

• Abbildung 29: Expression des GFP- Reporterplasmids in naiven CD4 ⁺ T- Zellen und Analyse der Zellzahl nach Amaxa Transfektion

• Abbildung 30: Graphische Darstellung der Sequenzierung des Zielgenvektors pBSK5`eYFPpAdual3`mit dem Primer T3

• Abbildung 31: Graphische Darstellung der Sequenzierung des Zielgenvektors pBSK5`eYFPpAdual3` mit dem Primer T7

• Abbildung 32: Übersicht des Klonierungsvektors pBluescript II SK (2+)

• Abbildung 33: Übersicht des Klonierungsvektor pBSK mit dualer Resistenzkassette

• Abbildung 34: Übersicht des Klonierungsvektor von Markus Mohrs

• Abbildung 35: Übersicht über Transfektionsvektor pMCV 1.4 eGFP

• Abbildung 36: Übersicht des Zielgenvektors 5`eYFPpAdual3`

• Abbildung 37: Übersicht des Reportevektors pRL-TK

• Abbildung 38: Übersicht über Klonierungsvektor pGL3Basic

• Abbildung 39: Übersicht des Reportervektors pGL3BasicTSDR

• Abbildung 40: Übersicht des Klonierungsvektors pGL3Promoter

• Abbildung 41: Übersicht des Repotervektors pGL3Promoter TSDR