Dieser Arbeit liegt eine prospektive Kohortenstudie zugrunde, in deren Rahmen 21 Probanden, nach ihrem Cyp2C9-Genotyp ausgewählt aus einem großen Kollektiv genotypisierter Probanden, die Nichtsteroidalen Antiphlogistika Diclofenac und Ibuprofen mit einem zeitlichen Mindestabstand von einer Woche einnehmen sollten. Die Studie wurde nach Zustimmung der lokalen Ethikkommission gemäß den Richtlinien der Good Clinical Practice am Institut für klinische Pharmakologie der Charité durchgeführt. Die teilnehmenden Probanden wurden durch die studienbetreuenden Ärzte und Doktoranden schriftlich und mündlich aufgeklärt und gaben ihre schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie.

Die Probanden wurden aufgrund ihres jeweiligen Cytochrom P450 2C9-Genotyps aus einem größeren Kollektiv von 516 Probanden, die sich zur Genotypisierung und Teilnahme an klinischen Studien gemeldet hatten, ausgewählt. (siehe Tabelle 5) Dabei wurden jeweils 4 Probanden mit den Cytochrom P-450-Genotypen (*1/*1)(*1/*2), (*1/*3) sowie jeweils 3 mit den seltenen Genotypen (*2/*2), (*2/*3) und (*3/*3) eingeschlossen.

Es handelte sich um freiwillig teilnehmende, gesunde Nichtraucher im Alter zwischen 18 und 65 Jahren mit einem Körpergewicht ± 18% gemäß Broca-Index. Alle 21 Probanden, die Nichtsteroidale Antiphlogistika einnahmen, waren kaukasischer Abstammung. Die Auswahl von Probanden aus einer einheitlichen genetischen Population wurde in der Absicht, das Risiko systematischer Fehler zu verringern, vorgenommen. Es wurde eine Anamnese, eine allgemeinärztliche körperliche Untersuchung sowie ein Routinelaborscreening durchgeführt. Im Rahmen dieser Laboruntersuchung wurden als Parameter die Elektrolyte, Harnstoff, Kreatinin, ASAT, ALAT, γ-GT, AP, Gesamt-Bilirubin, TPZ, PTT, Hämoglobin, Hämatokrit, Erythrozyten-/ Leukozyten-/ Thrombozytenzahl sowie HbsAg und Anti-HCV zum Ausschluss einer Hepatitis B bzw. Hepatitis C bestimmt. Darüber hinaus wurde ein HIV-Test durchgeführt. Die Probanden erhielten schriftliche und mündliche Erläuterungen zu Studieneinschränkungen und Ernährungshinweisen.

Als Ausschlusskriterien galten alle körperlichen oder seelischen Erkrankungen und jegliche Medikamenteneinnahme. Es wurden keine Probanden mit bekanntem Drogen- und Alkoholabusus zur Teilnahme an der Studie zugelassen. Mehrere Autoren fanden in der Vergangenheit eine erhöhte Clearance für Cyp2C9-Substrate bei Alkoholikern. Nicht abschließend geklärt ist, ob Ethanol selbst enzyminduzierend wirkt oder andere Mechanismen (Lebensstilfaktoren, diätetische Gründe etc.) für die erhöhte Clearance verantwortlich sind (Kater et al., 1969; Iber, 1977; Sandor et al., 1981). Neben erhöhten Blutdruckwerten führten auch pathologische Werte im Rahmen der weiter oben dargestellten laborchemischen Routineuntersuchung zum Ausschluss aus der Studie. Die Ausschlusskriterien sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Darüber hinaus konnten keine Probanden in die Studie eingeschlossen werden, die innerhalb der zurückliegenden zwei Monate vor Studienantritt an einer anderen Arzneimittelstudie teilgenommen oder aber Blut gespendet hatten, bei denen anamnestisch eine Arzneimittelallergie bekannt war oder die ganz allgemein klinische Befunde aufwiesen, die eine Teilnahme an der Studie hätten beeinträchtigen können. Auch Raucher wurden wegen der bekannten enzyminduzierenden Wirkung von Nikotin auf Cytochrom P450-Enzyme zur Teilnahme an der Studie nicht zugelassen. Obwohl keine generellen geschlechtsspezifischen Unterschiede hinsichtlich der Aktivität von Cyp2C9 bekannt sind, wurden dennoch keine Frauen in die Studie eingeschlossen, da aufgrund zyklusabhängiger Schwankungen von Östrogen eine Beeinflussung des Leberstoffwechsels nicht auszuschließen ist.

Die zu untersuchenden Substanzen wurden als orale Einmaldosen verabreicht. Die Probanden erhielten zu den jeweiligen Terminen entweder 50mg Diclofenac (Voltaren50 (Fa. Novartis)) oder 600mg Ibuprofen (Ibuprofen600 (Fa. Stada)).

Jeweils drei Tage vor Einnahme eines Medikaments bis nach der letzten Blutentnahme mussten die Teilnehmer auf den Genuss von Alkohol und Grapefrüchten verzichten. Während der Dauer der Studie sollte darüber hinaus der Verzehr Xanthin-haltiger Speisen (Bananen, Schokolade) und Getränke (Kaffee, Tee, Cola) aufgrund der bekannten enzyminduzierenden Wirkung von Xanthinen auf Cytochrom P450 einschränkt werden und zwölf Stunden vor Beginn der Studie bis nach der letzten Blutentnahme vollständig unterbleiben. Der Gebrauch von Nikotin und Drogen war über die gesamte Dauer der Studie untersagt. Die Probanden sollten über einen Zeitraum von zehn Stunden vor bis vier Stunden nach Einnahme der Nichtsteroidalen Antiphlogistika nüchtern bleiben. Sie erhielten in dieser Zeit nach Belieben Mineralwasser.

Unmittelbar vor Einnahme der Testsubstanzen wurden die Probanden im Rahmen einer Kurzanamnese über Medikamentennebenwirkungen, ihren Gesundheitszustand, begleitende Medikamenteneinnahmen sowie Drogen-, Alkohol- und Nikotinkonsum vor bzw. zwischen den Kinetiktagen befragt. Die Studienteilnehmer wurden darauf hingewiesen, dass im Verdachtsfall Blut- und Urinkontrollen zur Überprüfung ihrer Angaben durchgeführt und sie im Falle eines positiven Testergebnisses mit sofortiger Wirkung aus der Studie ausgeschlossen werden würden.

Die Kinetikmessung erstreckte sich jeweils über insgesamt 48 Stunden. In diesem Zeitraum erfolgten insgesamt 16 Blutentnahmen. Sofern sich aus der Kurzanamnese keine Einwände gegen die Teilnahme an der Studie ergaben, erhielten die Probanden eine intravenöse Verweilkanüle, die nach Beendigung des ersten Kinetiktages entfernt wurde. Nach einer Nüchternblutentnahme nahmen die Probanden dann im Beisein des verantwortlichen Studienarztes die jeweilige Testsubstanz ein. Über den intravenösen Zugang wurde den Studienteilnehmern daraufhin 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5; 6; 8 und 10 Stunden nach Einnahme der zu untersuchenden Substanz je 9ml EDTA-Blut zur Medikamentenspiegelbestimmung, eine Heparin-Monovette à 3 ml zur Bestimmung von Pg E2 und eine Serum-Monovette à 3 ml zur Bestimmung von Tx B2 abgenommen. Vier Stunden nach der Medikamenteneinnahme erhielten die Probanden eine Standardmahlzeit. Nach der letzten Blutentnahme zehn Stunden nach Einnahme der Testsubstanz wurde der venöse Zugang entfernt, woraufhin die Probanden das Institut verlassen konnten. 24 Stunden nach Einnahme wurden erneut eine EDTA-, eine Heparin-, und eine Serum-Monovette, nach 28 h, 34 h und 48 h jeweils noch eine EDTA-Monovette durch Punktion einer Armvene entnommen. Das Gesamtvolumen des entnommenen Bluts betrug folglich rund 180 ml pro Medikament.

Die erhobenen Daten (Anamnese, Laborergebnisse, unerwünschte Arzneimittelnebenwirkungen, Blutentnahme- und Laborprotokolle) wurden in case-report-forms (CRFs) eingetragen, die zusammenhängend für 15 Jahre im Institut für Klinische Pharmakologie der Charité aufbewahrt werden.

Die Probandendaten wurden in anonymisierter Form erhoben. Jeder Proband erhielt eine individuelle Code-Nummer. Die Zuordnung von Proband und Code ist nur den an der Studie mitarbeitenden Doktoranden und Ärzten bekannt und wird nicht an Dritte weitergegeben. Die Daten sind computergesteuert verwaltet und gespeichert. Ein Datenzugriff anderer auf die personenbezogenen Daten ist nur nach Genehmigung durch die Probanden selbst möglich.

Während der Kinetikmessungen aufgetretene Nebenwirkungen wurden erfasst und gesondert sechs und 34 Stunden nach Einnahme der Testsubstanz per Kurzanamnese erfragt. Alle Nebenwirkungen wurden in offenen Fragebögen, die keine Rückschlüsse auf das verabreichte Medikament zuließen, schriftlich dokumentiert.

Die im Rahmen der Studie verwendeten Medikamente wurden in unterschiedlicher Reihenfolge, d.h. randomisiert zugeteilt, wodurch systematische Fehler durch Gewöhnung oder Ermüdung der Probanden vermieden werden sollten. Allerdings sind die Hauptzielparameter der Studie, d.h. Arzneimittelkonzentration und Enzymaktivitäten, von der subjektiven Wahrnehmung der Probanden oder Studienärzte unabhängig.

Gemäß den Vorschriften des Arzneimittelgesetzes waren die Probanden über 1000000 DM gegen die bei Blutabnahmen potentiell auftretenden Schäden sowie gegen die nicht therapeutisch indizierte Einnahme der Nichtsteroidalen Antiphlogistika versichert. Die Versicherung wurde bei der Gerling Industrie Service GmbH West, Prinzenallee 21, 40549 abgeschlossen.

Die für die Medikamentenspiegelbestimmung (EDTA-Monovette) vorgesehenen Blutproben wurden unmittelbar nach der Abnahme zehn Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert. Das so gewonnene Blutplasma wurde bis zur Weiterverarbeitung bei -20° C gelagert. Für die Tx B2-Konzentrationsbestimmung (Serum-Monovette) wurden 3 ml Vollblut für eine Stunde bei 37° C inkubiert und daraufhin bei 5000 U/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein Eppendorf-Cup überführt und bei -80° C eingefroren. Für die Pg E2-Konzentrationsbestimmung (Heparin-Monovette) wurde das entnommene Blut mit 10μg/ml Vollblut Lipopolysaccharid (LPS, Typ E.Coli Serotyp 026: B6 (Fa.Sigma)) (Methode nach Patrignani et al., 1994) versetzt, für insgesamt 24 h in einem Brutschrank bei 37° C inkubiert, dann bei 5000 U/min für 10 min zentrifugiert und schließlich der Überstand in ein Eppendorf-Cup überführt und bei -80° C eingefroren.

Zunächst wurden mindestens 3ml des aufgetauten EDTA-Vollbluts mit 35 ml 1 x Erythrozyten-Lyse-Puffer versetzt, so dass die kern- und DNA-losen Erythrozyten zerstört wurden. Auf der anderen Seite blieben kernhaltige Blutkörperchen aufgrund ihrer höheren Membranstabilität intakt. Daraufhin wurden die Proben 30 min bei 2000 U/min und 4°C (Beckmann-Zentrifuge GS-6R) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, das Zellsediment nach Zugabe von 1,5 ml TEN-Puffer bei -20° C bis zur DNA-Extraktion eingefroren. Chemikalien und Lösungen siehe Tab.7.

In einem zweiten Schritt konnte die in den Leukozyten enthaltene DNA mithilfe des Phenol-Chloroform-Verfahrens extrahiert werden. Zunächst wurden die Zellsedimente aus der Erythrozytenlyse in sterilen Plastikgefäßen (PP-Röhrchen, Fa. Greiner) in 1,5 ml Lysis-Puffer und 100 μl Proteinase K-Lösung verdaut, danach verblieben sie bei 37° C für mindestens 12h im Überkopfschüttler. Daraufhin wurden sie mit 1,5 ml Phenol/ Chloroform-Lösung versetzt und für zwei Stunden im Überkopfschüttler gemischt. Dabei diente Phenol der Ausfällung von Proteinen, die in Komplexen mit Nukleinsäuren vorliegen. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 2500 U/min (Beckmann-Zentrifuge GS-8R) wurde die obere, wässrige Phase abpipettiert und im Rahmen der Chloroform-Nachextraktion mit 1,5 ml Chloroform zwecks Eliminierung verbliebener Lipidbestandteile versetzt. Die Proben wurden für 30 min im Überkopfschüttler gemischt und erneut für 10 min bei 2500 U/min zentrifugiert. Im folgenden Arbeitsschritt wurde die DNA präzipitiert. 2 ml des Überstands wurden auf Gefäße mit 6 ml 96%igem Ethanol und 100 μl 3M Natriumacetat (pH 5,5) überpipettiert und schließlich für 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, woraufhin die ausgefällte DNA am Boden der Gefäße haftete. Der Überstand wurde abgegossen, die DNA durch Zugabe von 3 ml 70%igem Ethanol gewaschen und wiederum 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Nachdem der dabei entstehende Überstand abgegossen worden war, wurden die Proben für 30 min auf dem Kopf stehend auf Zellstoffpapier gestellt, so dass der verbliebene Alkohol abtropfen und verdunsten konnte. Im vorletzten Arbeitsschritt wurde die DNA über mindestens 12h bei 55° C in 200 μl TE-Puffer aufgelöst. Daraufhin konnte die DNA photometrisch quantifiziert werden. Auch die Qualität der Extrakte ließ sich durch den Quotienten der Extraktion bei 280/ 260 nm einschätzen, der zwischen 1,6 und 2,0 liegen sollte. Werte unter 1,5 deuteten auf eine Proteinverunreinigung hin. Schließlich wurde die DNA bei 4°C bis zur PCR-Analyse in sterilen Reaktionsgefäßen aufbewahrt. Chemikalien und Lösungen siehe Tab. 8. Die Analyse der genomischen DNA erfolgte mithilfe einer Kombination aus Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und, nachdem die vervielfältigte DNA durch Restriktionsenzyme verdaut und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt wurde, Darstellung der so genannten Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP).

Abbildung 2: Amplifizierung einer spezifischen DNA-Sequenz durch die Polymerase-Kettenreaktion (aus Löffler, 2001)

Bei der PCR handelt es sich um eine In-vitro-Technik, die die gezielte Amplifizierung von DNA-Abschnitten unter Zuhilfenahme von DNA-Polymerasen erlaubt. Zur Durchführung einer PCR wird zum einen ein Thermocycler, der die vollautomatische Steuerung von Temperaturzyklen gewährleistet, und zum anderen eine hitzestabile DNA-Polymerase, die bei Temperaturen von 90-95° C nicht denaturiert, benötigt. Als Starthilfe der PCR dienen einzelsträngige Oligonukleotidprimer, die an komplementäre Enden der Sequenzen einer DNA-Matrize (Template) binden können. Die hitzestabile DNA-Polymerase, eine geringe Menge doppelsträngige DNA, Desoxyribonukleosidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und zwei DNA-Startmoleküle werden im Rahmen der PCR in einer geeigneten Reaktionspufferlösung inkubiert. Die Aufgabe der DNA-Polymerase besteht darin, Primer in 5’-3’-Richtung entlang einsträngiger, denaturierter DNA-Matrizen in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung zu verlängern. Die Sequenzen der dabei entstehenden DNA-Abschnitte sind komplementär zu denen ihrer Matrizen. Die DNA-Abschnitte werden temperaturgesteuert in Reaktionszyklen amplifiziert. Dabei besteht jeder Zyklus aus drei Schritten. Im ersten Schritt werden beide Stränge der DNA-Doppelhelix durch Temperaturerhöhung getrennt (Denaturierung, 94° C), woraufhin sich nach Abkühlen auf 57-60° C im zweiten Schritt die Primer komplementär an die entsprechenden Stellen der einsträngigen DNA-Matrize anlagern können (sog. Annealing). Im dritten Schritt erfolgt bei einer für die Funktion der DNA-Polymerase optimalen Reaktionstemperatur die Verlängerung der Primer (Extension, 72° C). Am Ende dieses Zyklus’ liegen neu synthetisierte Doppelstränge vor, die zunächst noch keine definierte Länge haben. Da sie aber im nächsten Zyklus selbst als Matrizen verwendet werden und an ihren Enden die Oligonukleotidsequenz der Primer tragen, entstehen ab dem dritten Durchlauf nur noch Produkte gewünschter Länge. Ab dem vierten Durchlauf erfolgt eine exponentielle Amplifizierung der Zielsequenz. Nach über 30 Durchläufen liegt die DNA theoretisch 2³⁰ mal vor, allerdings begrenzt bei molarem Überschuss meist die Enzymmenge die Reaktion und damit die Zahl der Zyklen. Darüber hinaus denaturiert die DNA-Polymerase im Laufe der Reaktion, und mit zunehmender Konzentration hybridisieren die gewünschten Stränge auch untereinander. Der letzte Elongationsschritt wird auf mehrere Minuten verlängert, so dass die vollständige Synthese aller Schritte gewährleistet ist.

Die so entstandenen amplifizierten DNA-Stücke werden zum Zweck der RFLP-Analyse mit Restrikitionsendonukleasen verdaut. Letztere, auch als Restriktionsenzyme bezeichnet, stammen ursprünglich aus Bakterien und können doppelsträngige DNA an spezifischen Stellen mit palindromischer Struktur spalten. Punktmutationen in der DNA können dazu führen, dass ursprüngliche Schnittstellen nicht mehr erkannt werden oder zusätzliche Schnittstellen entstehen. Das Vorliegen unterschiedlich langer DNA-Fragmente nach Verdau durch Restriktionsenzyme wird als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus bezeichnet. Die vervielfältigte und geschnittene DNA kann im nächsten Schritt durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht werden. Die Fragmente wandern abhängig von ihrer Größe unterschiedlich schnell durch die netzähnlichen Polysaccharidstrukturen des Agarosegels und werden schließlich durch intercalierende Farbstoffe wie Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Zur Bestimmung des Cytochrom P450 2C9-Genotyps wird 1 μl genomischer DNA 25 μl des in Tab.12 beschriebenen PCR-Mastermix’ zugesetzt. Im Thermocycler wird die DNA danach in 35 Zyklen amplifiziert. Die erfolgreiche Durchführung der PCR wird im nächsten Schritt kontrolliert, indem ein Gemisch aus 5 μl PCR-Produkt und 10 μl Bromphenolblaupuffer auf 1% Agarosegel aufgetragen werden, woraufhin nach Elektrophorese in einer Protrans-Kammer für 30 min bei 120 Volt im Fall von Cyp2C9*2 eine 372 bp-Bande, im Fall von Cyp 2C9*3 eine 137 bp-Bande entstehen sollte. Das Ergebnis wird, wie in Abbildung 3 dargestellt, photographisch festgehalten. Im Erfolgsfall werden 10 μl PCR-Produkt mit 10 μl Enzymmastermix versetzt und über Nacht bei 37°C schüttelnd inkubiert. Zur Auswertung in der Elektrophorese wird die Probe nach Zugabe von 10 μl Bromphenolblaupuffer auf 3,5% Agarosegel aufgetragen und für 60 min bei 100 Volt aufgetrennt. Die entstehenden Restriktionsmuster für die unterschiedlichen Genotypen können dann abgelesen und zu Dokumentationszwecken fotografiert werden. Sie sind in Tabelle 12 im Detail dargestellt.

Abbildung 3: Elektrophoretische Auftrennung der durch PCR-RFLP amplifizierten und geschnittenen DNA bei Trägern der Genotypen Cyp2C9 *3/*3, *1/*3 und *1/*1

Bei dem ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) wird ein für das zu detektierende Antigen (in diesem Falle Tx B2 oder Pg E2) spezifischer Antikörper fest an eine polymere Matrix gebunden. Nach Zugabe des Antigens (zum Beispiel einer Serumprobe) bilden sich Antigen-Antikörper-Komplexe. Anschließend werden nicht gebundene Antigene durch Waschen entfernt. Im nächsten Schritt wird ein zweiter Antikörper, der eine andere Stelle des Antigens erkennt, hinzugefügt und erneut gewaschen. Die an die Platte gebundene Menge dieses Antikörpers ist der des Antigens proportional. Der zweite Antikörper ist mit einem Enzym verknüpft, das die Umwandlung eines farblosen Substrats zu einem farbigen Produkt oder eines nicht fluoreszierenden Substrats zu einem fluoreszierenden Produkt katalysiert. Folglich ist die Menge des zugegebenen Antigens proportional zur entstehenden Farbstoffintensität.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der A rbeitsschritte bei der ELISA (aus Stryer,1996)

Die Quantifizierung von Tx B2 und Pg E2 (Patrignani et al., 1994; Patrono et al., 1980a; Patrono et al., 1980b) wurde mithilfe eines kommerziellen Enzym-Immunoassays (Fa. Biotrend) durchgeführt. Für die Detektion der Farbänderung wurden der Mikrotitrierplattenreader SLT Spectra II (SLT Labinstruments) und die Software Magellan^® (Spectra II, SLT, Tecan Grailsheim) verwendet. Die Serumproben wurden gemäß der Assay-Arbeitsanleitung aufbereitet und gegebenenfalls mit Assay-Puffer verdünnt, so dass Konzentrationen in den definierten Kalibrationsspannen erhalten wurden.

Für Tx B 2 lag die Bestimmungsgrenze bei 7,98 ng/L. Die Intra-assay-Varianz betrug 1,6% bis 4,0% für den Konzentrationsbereich von 760 ng/L bis 2600 ng/L. Die Inter-assay-Varianz lag für Konzentrationen von 44 ng/L bis 3000 ng/L zwischen 3,6 % und 7,6 %.Für Pg E 2 betrug die Bestimmungsgrenze 36 ng/L. Die Intra-assay-Varianz lag für Konzentrationen von 116 ng/L bis 2416 ng/L zwischen 5,8 % und 17,5%, die Inter-assay-Varianz zwischen 3,0 % und 5,1 % für einen Konzentrationsbereich von 111 ng/L bis 1902 ng/L.