Die Bedeutung genetischer Polymorphismen im Enzym Cytochrom P450 2C9 für Pharmakokinetik und Wirkungen der Nichtsteroidalen Antiphlogistika Diclofenac und IbuprofenGeorg Freytag11.11.1.111.1.221.23605#3601.31.3.14604#2351.3.25605#991.41.4.161.4.21.4.2.171.4.2.21.4.31.4.3.181.4.3.21.4.49604#135603#434101.4.51112131.51.6141522.12.1.1152.1.216604#2112.1.317603#1932.1.42.1.5182.1.62.1.72.1.8192.1.92.1.102.1.11202.1.122.1.132.2212.2.1603#2592.2.222599#3542.2.3603#359232.2.42.2.524603#286605#179604#12425604#467603#3692.32.3.12.3.1.1262.3.1.2272.3.1.3282.3.2584#290590#5472.3.2.1292.3.2.22.3.2.3302.3.3584#22831590#5782.3.3.12.3.3.2322.3.3.32.3.42.3.4.1332.3.4.22.3.4.3342.42.4.135603#3662.4.22.4.32.53633637595#4253.13.1.1603#5183.1.1.138894#5403.1.1.2393.1.2605#52540971#5783.23.2.1604#559413.2.1.13.2.1.23.2.1.3423.2.1.4901#5293.2.243604#59144899#59344.14.1.1454.1.1.14.1.1.246474.1.24.1.2.1484.1.2.24.24.2.1494.2.1.14.2.2504.2.351AbkürzungenLiteraturverzeichnisErklärung an Eides Statt Publikationsliste Zur PersondeInhaltsverzeichnisHilfeAus dem Institut für Klinische Pharmakologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin BerlinDISSERTATIONDie Bedeutung genetischer Polymorphismen im Enzym Cytochrom P450 2C9 für Pharmakokinetik und Wirkungen der Nichtsteroidalen Antiphlogistika Diclofenac und IbuprofenZur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité
Universitätsmedizin Berlinvon Georg Freytag aus Uslar Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen
Prof. Dr. med. Martin Paul Prof. Dr. med. I. Roots Prof. Dr. med. J. Brockmöller PD Dr. med. K. L. Rost Datum der Promotion: 7.4.2005 Die Bedeutung genetischer Polymorphismen im Enzym Cytochrom P450 2C9 für Pharmakokinetik und Wirkungen von Diclofenac und Ibuprofen

Es wird angenommen, dass Cytochrom-P450 2C9 die 4’-Hydroxylierung des Nichtsteroidalen Antiphlogistikums Diclofenac und die Hydroxylierung von S-Ibuprofen beim Menschen katalysiert. Es existieren zwei Varianten von Cyp2C9. Deren Auswirkungen auf die Diclofenac- bzw. Ibuprofen-Pharmakokinetik und die Hemmung von Cox-1 und -2 wurde an 21 gesunden Probanden, die sämtliche Kombination der genetischen Varianten *2 und *3 aufwiesen, untersucht. Es zeigten sich keinerlei Hinweise auf eine Einschränkung des Metabolismus von Diclofenac bei heterozygoten und homozygoten Trägern der Cyp2C9- Allele *2 und *3 . Darüber hinaus lagen auch die Serumkonzentrationen des Metaboliten 4’-OH-Diclofenac bei Trägern der Allele Cyp2C9 *2 und *3 nicht niedriger. Obwohl verschiedene in vitro -Untersuchungen Cyp2C9 als metabolisierendes Enzym identifizierten, ist die Pharmakokinetik von Diclofenac ist beim Menschen entweder überhaupt nicht oder nur in geringem Ausmaß von Cyp2C9-Aminosäurenpolymorphismen abhängig. Möglicherweise sind die Auswirkungen der Cyp2C9-Aminosäurenvarianten substratabhängig, oder es ist in vivo ein anderes Enzym als Cyp2C9 verantwortlich für die Bildung von 4’-OH-Diclofenac. Im Unterschied dazu hing die Pharmakokinetik von razemischem und von S-Ibuprofen vom Cyp2C9 *3 -Polymorphismus ab. Die Bildung von Tx B 2 (Cox-1) hing signifikant von Cyp2C9 *3 -Polymorphismus ab, derselbe Trend ließ sich auch für Pg E 2 (Cox-2) beobachten. Die eingeschränkte Clearance von S-Ibuprofen, die mit einer erhöhten pharmakodynamischen Aktivität einhergeht, legt nahe, dass Träger des Allels Cyp2C9*3 ein höheres Risiko tragen, nach Einnahme einer oralen Standarddosis unerwünschte Nebenwirkungen zu erleiden.Cytochrom P450, Cyp 2C9, Diclofenac, Ibuprofen, Cox-1, Cox-2

 Consequences of genetic polymorphisms in Cytochrome P450 2C9 for pharmacokinetics and effects of Diclofenac and Ibuprofen.

Cytochrome-P450 2C9 is considered to catalyse the 4’-hydroxylation of the nonsteroidal analgesic drug diclofenac and the hydroxylation of S-ibuprofen in humans. There are two variants of Cyp2C9. Their impact on diclofenac/ ibuprofen pharmacokinetics and on the inhibition of cyclooxygenases 1 and 2 was studied in 21 healthy volunteers with all combinations of the Cyp2C9 variants *2 and *3. Blood concentrations of diclofenac/ racemic ibuprofen (and of S-ibuprofen and R-ibuprofen) were measured by HPLC. Thromboxane B 2 and prostaglandin E 2 were measured with use of an enzyme immunoassay. There was no evidence of impaired metabolism of diclofenac in heterozygous and homozygous carriers of the Cyp2C9 alleles *2 and *3 compared to the wildtype. Furthermore, plasma concentrations of the metabolite 4’-OH-diclofenac were not lower in carriers of Cyp2C9 *2 and *3. Marked diclofenac mediated inhibition of Cox-1- and Cox-2 activity was detected in all individuals without any Cyp2C9 genotype dependent differences. Even though several in vitro studies identified Cyp2C9 as the metabolising enzyme, Diclofenac pharmacokinetics in humans is either not or only to a minor extend dependent on the Cyp2C9 amino acid polymorphisms. It may be that the Cyp2C9 amino acid variants have differential effects depending on the substrates. Alternatively, an enzyme other than Cyp2C9 may be responsible for 4’-OH-Diclofenac formation in vivo.In contrast, the pharmacokinetics of racemic and of S-ibuprofen depended on the Cyp2C9 *3-polymorphism. The Cyp2C9 variant *2 exhibited no significant effect. Formation of Tx B2 (cox-1) depended significantly on the Cyp2C9 polymorphism, the same trend was observed for Pg E2 (cox-2). The reduced S-ibuprofen total clearance accompanied by increased pharmacodynamic activity indicates an increased risk for carriers of Cyp2C9*3 to suffer from adverse effects after intake of a standard oral dose.

Cytochrom P450, Cyp 2C9, Diclofenac, Ibuprofen, Cox-1, Cox-2

Inhaltsverzeichnis

  • 1 Einleitung

    • 1.1 Biotransformation

      • 1.1.1 Biotransformation und arzneimetabolisierende Enzyme

      • 1.1.2 Erbliche Polymorphismen arzneimetabolisierender Enzyme

    • 1.2 Das Cytochrom P450-Enzymsystem

    • 1.3 Das Enzym Cytochrom P450 2C9

      • 1.3.1 Das Cytochrom P450 2C9 und seine Funktion im Arzneistoffwechsel

      • 1.3.2 Genetische Polymorphismen von Cytochrom P450 2C9

    • 1.4 Nichtsteroidale Antiphlogistika

      • 1.4.1 Entwicklung und Bedeutung der Nichsteroidalen Antiphlogistika

      • 1.4.2 Indikationen der Nichtsteroidalen Antiphlogistika

        • 1.4.2.1 Indikationen für Diclofenac

        • 1.4.2.2 Indikationen für Ibuprofen

      • 1.4.3 Pharmakokinetik der Nichtsteroidalen Antiphlogistika

        • 1.4.3.1 Pharmakokinetik von Diclofenac

        • 1.4.3.2 Pharmakokinetik von Ibuprofen

      • 1.4.4 Wirkung der Nichtsteroidalen Antiphlogistika

      • 1.4.5 Nebenwirkungen der Nichtsteroidalen Antiphlogistika

    • 1.5 Phänotypisierung und Genotypisierung

    • 1.6 Herleitung der Aufgabenstellung

  • 2 Material und Methoden

    • 2.1 Probandenrekrutierung und Studiendurchführung

      • 2.1.1 Studiendesign

      • 2.1.2 Probandenauswahl und Einschlusskriterien

      • 2.1.3 Ausschlusskriterien

      • 2.1.4 Art und Dosis der verwendeten Arzneimittel

      • 2.1.5 Diätetische Maßnahmen

      • 2.1.6 Überprüfung der Probandencompliance und Vorsichtsmaßnahmen

      • 2.1.7 Studienablauf

      • 2.1.8 Dokumentation der Studie

      • 2.1.9 Datenschutz und Vertraulichkeit der Daten

      • 2.1.10 Erfassung von Nebenwirkungen

      • 2.1.11 Fehlerminimierung

      • 2.1.12 Versicherungsschutz

      • 2.1.13 Weiterverarbeitung und Aufarbeitung der Proben zur Messung der Medikamenten- und Prostanoidkonzentrationen

    • 2.2 Genotypisierung

      • 2.2.1 Erythrozyten-Lyse

      • 2.2.2 DNA-Extraktion

      • 2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

      • 2.2.4 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP)

      • 2.2.5 Bestimmung des Cyp2C9-Allels durch PCR-RFLP-Tests

    • 2.3 Bestimmung von Medikamentenkonzentrationen mittels HPLC-Analyse

      • 2.3.1 Prinzip der Bestimmung von Medikamentenkonzentrationen mittels HPLC-Analyse

        • 2.3.1.1 Vorbereitung der HPLC

        • 2.3.1.2 Durchführung der HPLC

        • 2.3.1.3 Statistische Qualitätskontrolle der Analyseergebnisse

      • 2.3.2 HPLC von Diclofenac und 4’-OH-Diclofenac

        • 2.3.2.1 Vorbereitung der HPLC von Diclofenac und 4’-OH-Diclofenac

        • 2.3.2.2 Durchführung der HPLC von Diclofenac und 4’-OH-Diclofenac.

        • 2.3.2.3 Statistische Qualitätskontrolle für Diclofenac und 4’-OH-Diclofenac.

      • 2.3.3 HPLC von Ibuprofen und OH-Ibuprofen

        • 2.3.3.1 Vorbereitung der HPLC von Ibuprofen und OH-Ibuprofen.

        • 2.3.3.2 Durchführung der HPLC von razemischem Ibuprofen und OH-Ibuprofen.

        • 2.3.3.3 Statistische Qualitätskontrolle von razemischem Ibuprofen und OH-Ibuprofen.

      • 2.3.4 HPLC von R- und S-Ibuprofen

        • 2.3.4.1 Vorbereitung der HPLC von R- und S-Ibuprofen.

        • 2.3.4.2 Durchführung der HPLC von R- und S-Ibuprofen.

        • 2.3.4.3 Statistische Qualitätskontrolle von R- und S-Ibuprofen.

    • 2.4 Konzentrationsbestimmung von Tx B2 und Pg E2 mittels ELISA

      • 2.4.1 Funktionsprinzip des ELISA

      • 2.4.2 Bestimmung der Tx B2- und Pg E2–Plasmakonzentrationen

      • 2.4.3 Statistische Qualitätskontrolle

    • 2.5 Analyse der Messdaten und Statistik

  • 3 Ergebnisse

    • 3.1 Ergebnisse für Diclofenac

      • 3.1.1 Pharmakokinetische Parameter von Diclofenac und 4’-OH-Diclofenac

        • 3.1.1.1 Pharmakokinetik von Diclofenac in Abhängigkeit vom Cyp2C9-Genotyp

        • 3.1.1.2 Pharmakokinetik von 4’-OH-Diclofenac in Abhängigkeit vom Cyp2C9-Genotyp

      • 3.1.2 Pharmakodynamische Parameter von Diclofenac

    • 3.2 Ergebnisse für Ibuprofen

      • 3.2.1 Pharmakokinetische Parameter von Ibuprofen und OH-Ibuprofen

        • 3.2.1.1 Pharmakokinetik von razemischem Ibuprofen in Abhängigkeit vom Cyp2C9-Genotyp

        • 3.2.1.2 Pharmakokinetik von R-Ibuprofen in Abhängigkeit vom Cyp2C9-Genotyp

        • 3.2.1.3 Pharmakokinetik von S-Ibuprofen in Abhängigkeit vom Cyp2C9-Genotyp

        • 3.2.1.4 Pharmakokinetik von OH-Ibuprofen in Abhängigkeit vom Cyp2C9-Genotyp

      • 3.2.2 Pharmakodynamische Parameter von Ibuprofen

  • 4 Diskussion

    • 4.1 Diskussion der Diclofenac-Ergebnisse

      • 4.1.1 Auswirkungen von Cyp2C9-Genpolymorphismen auf den Diclofenac-Metabolismus

        • 4.1.1.1 Vergleich der gefundenen Daten mit anderen in vivo-Untersuchungen

        • 4.1.1.2 Denkbare Ursachen für die Diskrepanz zwischen In vitro- und In vivo-Daten

      • 4.1.2 Auswirkungen von Cyp2C9-Genpolymorphismen auf die Diclofenac-Pharmakodynamik

        • 4.1.2.1 Besonderheiten der Tx B2-Konzentrationsverläufe und deren mögliche Ursachen

        • 4.1.2.2 Hemmung der Cyclooxygenase-Isoenzyme durch Diclofenac

    • 4.2 Diskussion der Ibuprofen-Ergebnisse

      • 4.2.1 Auswirkungen von Cyp2C9-Genpolymorphismen auf den Ibuprofen-Metabolismus

        • 4.2.1.1 Besonderheiten der Pharmakokinetik (Konversion von R-Ibuprofen zu S-Ibuprofen)

      • 4.2.2 Auswirkungen von Cyp2C9-Genpolymorphismen auf die Ibuprofen-Pharmakodynamik

      • 4.2.3 Zusammenfassung und Ausblick

  • Abkürzungen

  • Literaturverzeichnis

  • Erklärung an Eides Statt

  • Publikationsliste

  • Zur Person

Bilder

  • Abbildung 1: Biosynthese von Cyclooxygenaseprodukten des Arachidonsäurestoffwechsels und der Angriffspunkt von Nichtsteroidalen Antiphlogistika bzw. Thromboxan-Synthese-Hemmstoffen (aus Forth et al., 1996)

  • Abbildung 2: Amplifizierung einer spezifischen DNA-Sequenz durch die Polymerase-Kettenreaktion (aus Löffler, 2001)

  • Abbildung 3: Elektrophoretische Auftrennung der durch PCR-RFLP amplifizierten und geschnittenen DNA bei Trägern der Genotypen Cyp2C9 *3/*3, *1/*3 und *1/*1

  • Abbildung 4: Schematische Darstellung der A rbeitsschritte bei der ELISA (aus Stryer,1996)

  • Abbildung 5: Orale Diclofenac-Clearance bzw. AUC von 4’-OH-Diclofenac in Abhängigkeit vom Cyp2C9- Genotyp (Cl/F: Clearance/Orale Bioverfügbarkeit)

  • Abbildung 6: TxB2- und PgE2-Konzentrationen nach Diclofenac-Gabe bei Probanden mit homozygotem Cyp2C9-Genotyp

  • Abbildung 7: Orale Clearances von razemischem Ibuprofen, R-Ibuprofen und S-Ibuprofen in Abhängigkeit vom Cyp2C9-Genotyp  (CL/F: Clearance/Orale Bioverfügbarkeit)

  • Abbildung 8: TxB2 und PgE2-Konzentrations-Zeit-Verläufe nach Ibuprofen-Gabe in Abhängigkeit vom Cyp2C9-Genotyp