Aus der Klinik mit Schwerpunkt Kardiologie, Angiologie und Pneumologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Einfluss der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase-Inhibitoren auf die Aktivität des Proteasoms

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Britt Friedel
aus Karl - Marx - Stadt

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. K. Stangl
2. Prof. Dr. Dr. I. Cascorbi
3. Prof. Dr. rer. nat. B. Dahlmann

eingereicht im Februar 2004

Datum der Promotion: 26. Juli 2005

Abstrakt

Statine werden in der Therapie von Hypercholesterolämie sehr effektiv eingesetzt. Durch ihren Eingriff in den Cholesterolstoffwechsel über eine Hemmung der HMG-CoA-Reduktase wird die Bildung des Cholesterols verhindert. Aus therapeutischer Sicht wirken sie sich auf diese Weise sehr günstig auf atherosklerotische Veränderungen aus.

In zahlreichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass β-clasto Lactacystin, ein bekannter Proteasominhibitor, und die CSE-Hemmer gemeinsame biologische Wirkungen aufweisen. Weiterhin ließ sich eine strukturelle Ähnlichkeit, in Form des β-Laktonrings, zwischen den Statinen und β-clasto Lactacystin erkennen [Rao 1999]. Aufgrund dieser Parallelitäten wurde vermutet, dass die Statine ihre Wirkung zum Teil über eine Hemmung des Proteasoms entfalten.

In Zellkulturexperimenten wurden die Effekte von Simvastatin (Prodrug), Atorvastatin, Pravastatin und dem Proteasomhemmer Lactacystin auf zwei Endothelzelllinien (CPAE und Ea.hy926) und primäre vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) bezüglich ihres Verhaltens auf die Morphologie, die Proliferation, die Viabilität und die Proteasomaktivität untersucht. Sowohl die Statine als auch Lactacystin induzierten vergleichbare morphologische Veränderungen und beeinflussten die Proliferation von CPAE-Zellen. In den eigenen Versuchen konnten die durch Statine induzierten Effekte durch Mevalonat revertiert werden. Die durch Lactacystin verursachten Veränderungen wurden durch Mevalonsäure nicht beeinflusst. Wie erwartet hemmte Lactacystin in den untersuchten CPAE-Zellen signifikant die proteasomale Aktivität. Im Gegensatz dazu blieb die Proteasomaktivität nach einer Statinbehandlung unbeeinflusst. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in den Ea.hy926 und den VSMCs deutlich. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sogar hohe Dosen der Statine die Aktivität der gereinigten 20S Proteasomen nicht modulieren.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass die ähnlichen biologischen Effekte der Statine und des Lactacystins nicht über einen gemeinsamen Mechanismus der Proteasominhibition funktionieren.

Die Statine spielen bei der Regulation des Cholesterolstoffwechsels eine entscheidende Rolle. Diese Substanzen können sehr erfolgreich in der Therapie atherosklerotischer Erkrankungen [Seite 7↓]eingesetzt werden. Ihre positiven Eigenschaften lassen sich nicht durch eine Modulation der Proteasomaktivität erklären.

Eigene Schlagworte: β-clasto Lactacystin, Strukturähnlichkeit, Morphologie, Modulation der Proteasomaktivität

Abstract

Statins are utilised very efficient in the treatment of hypercholesterolemia. By their direct intervention in the metabolism of cholesterol via an inhibition of HMG-CoA-reductase a formation of cholesterol is prevented. Thus these substances have a beneficial effect on atherosclerotic changes.

In a lot of studies β-clasto lactacystin, a well known inhibitor of the proteasome, and statins were shown to have common biological effects. The statins and β-clasto lactacystin have a similarity in structure in form of a β-lactone ring. Because of these parallelisms it was assumed that statins deploy their effects partly though inhibition of the proteasome.

The effect of simvastatin, atorvastatin and pravastatin as well as of the proteasome inhibitor β-clasto lactacystin was studied on morphology, proliferation, viability and on proteasomal activity in two mammalian endothelial cell lines (CPAE and Ea.hy926) and in primary vascular smooth muscle cells (VSMCs). Both statins and lactacystin induced comparable morphological changes and attenuated proliferation of CPAE. Whereas the statin-induced effects were reversed by mevalonic acid, however, the lactacystin-induced alterations were not influenced by mevalonic acid. As expected, lactacystin caused a significant loss of proteasomal activity measured in the extracts of treated cells. The extracts of statin-treated CPAEs exhibited unchanged activities. This result was also confirmed in Ea.hy926 cells and in primary rat VSMCs. It is shown, that even high dosis of statins do not modulate the activity of purified human 20S proteasomes.

The conclusion was that similar biological effects of statins and the well known proteasome inhibitor lactacystin in vascular cells are not caused by a common inhibitory mechanism of action on the proteasome.

Statins play an important role in the regulation of metabolism of cholesterol. These substances are used successful in the therapy of atherosclerotic lesions. However their positive features cannot be defined by modulation of proteasome activity.

Keywords: Statins, β-clasto lactacystin, similarity in structure, morphology, modulation of proteasome activity

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Statine – Eingriff in den Stoffwechselweg des Cholesterols auf Ebene der Mevalonsäure
    • 1.1.1 Definition der Statine
    • 1.1.2  Die Wirkung der Statine
    • 1.1.3 Die pleiotropen Effekte der CSE-Hemmer
      • 1.1.3.1  Direkte vaskuläre Effekte
        • 1.1.3.1.1 Verbesserung der Funktion des Endothels
        • 1.1.3.1.2 Verminderung der Proliferation glatter Muskelzellen
        • 1.1.3.1.3 Statine und thrombotische Ereignisse
        • 1.1.3.1.4 Wirkung auf zerebrale ischämische Ereignisse
      • 1.1.3.2  Weitere Beispiele für pleiotrope Effekte
  • 1.2  Das Ubiquitin-Proteasom-System - Ubiquitinierung, Degradation und Proteasom
    • 1.2.1 Der strukturelle Aufbau des Proteasoms und dessen Funktion
      • 1.2.1.1  Das 26S Proteasom
      • 1.2.1.2  Der 19S Regulatorkomplex
      • 1.2.1.3 Das 20S Proteasom
        • 1.2.1.3.1 Die α-Untereinheiten
        • 1.2.1.3.2  Die β-Untereinheiten
    • 1.2.2  Das Proteasom und seine Funktion
    • 1.2.3  Die Inhibition des Ubiquitin-Proteasomweges
    • 1.2.4 Statine und ihr Einfluss auf das Proteasom
• 2  Herleitung - Statine und das Proteasom
  • 2.1 Das Ubiquitin-Proteasom-System hat Bedeutung bei der Regulation wichtiger zellphysiologischer Prozesse
    • 2.1.1 Zytotoxizität
    • 2.1.2 Anti-Tumor Effekt
    • 2.1.3 Hemmung der Antigenpräsentation
    • 2.1.4  Antiinflammatorische Aktivität
  • 2.2  Die antiinflammatorische Wirkung der Statine
  • 2.3 Mechanismus der Proteasominhibition
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 Zellkultur
    • 3.1.1 Material
    • 3.1.2 Zusammensetzung der Nährlösungen
      • 3.1.2.1 Nährmedium für VSMC-Zellen und EA.hy926-Zellen
      • 3.1.2.2  Behandlungsmedium für VSMC-Zellen und EA.hy926-Zellen
      • 3.1.2.3 Nährmedium und Behandlungsmedium für CPAE-Zellen
        • 3.1.2.3.1 Herstellung des Behandlungsmediums für CPAE-Zellen
    • 3.1.3 Gewinnung von VSMC (Primärkultur) aus der A. carotis der Ratte
      • 3.1.3.1 Material
      • 3.1.3.2 Herstellung der Kollagenase
      • 3.1.3.3  Präparation der glatten Muskelzellen
      • 3.1.3.4 Passagieren
    • 3.1.4  Behandlung der Zellen mit CSE-Hemmern und Mevalonsäure
      • 3.1.4.1 Material
      • 3.1.4.2 Verfahrensweise
    • 3.1.5 Färbung mit Trypanblau – Erstellung einer Wachstumskurve
    • 3.1.6 XTT – Test: Testung der Viabilität nach Behandlung
      • 3.1.6.1 Funktionsprinzip
      • 3.1.6.2  Material
      • 3.1.6.3 Prozedur
    • 3.1.7 Darstellung der Zellen durch Färbung mit Phalloidin und DAPI
      • 3.1.7.1 Funktionsprinzip der Färbung
      • 3.1.7.2  Material
      • 3.1.7.3 Färbung mit Phalloidin
      • 3.1.7.4 DAPI–Kernfärbung
    • 3.1.8  Ernte und Lyse der Zellen
  • 3.2  Quantitative Proteinbestimmung mit Bicinchinonsäure (BCA)-Assay
    • 3.2.1 Funktionsprinzip der BCA-Proteinbestimmung
    • 3.2.2 Material
    • 3.2.3 Arbeitsschritte
  • 3.3  Messung der Proteasomaktivität mit fluorogenen Substraten
    • 3.3.1 Funktionsweise der fluorogenen Substrate
    • 3.3.2 Material
      • 3.3.2.1  Herstellung des 2 x 26S – Inkubationspuffers
      • 3.3.2.2 Ansatz des Mastermixes
    • 3.3.3 Messung der Proteasomaktivität im Zellextrakt
    • 3.3.4 Aktivitätsbestimmung am gereinigten 20S Proteasom
      • 3.3.4.1 Material
  • 3.4  Auswertung und Statistik
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Zelluläre Wirkung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern
    • 4.1.1 Phänotypische Merkmale und Veränderungen
      • 4.1.1.1 Behandlung der Endothelzelllinie CPAE mit Statinen
      • 4.1.1.2  Merkmale einer Behandlung der Zellen mit dem irreversiblen Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin
      • 4.1.1.3 Einfluss der alleinigen Behandlung mit Mevalonsäure und Effekte von Mevalonsäure β-clasto Lactacystin und in Kombination mit Statinen
    • 4.1.2 Einfluss der Statine und die simultane Mevalonsäuregabe auf die Viabilität der CPAE-Zellen
    • 4.1.3  Vitalität und Wachstum der EA.hy926-Zellen nach 24-Stunden-Behandlung mit Statinen
  • 4.2  Der Eingriff in den Cholesterolstoffwechselweg und seine Effekte auf die Aktivität des Proteasoms
    • 4.2.1 Die Wirkung der CSE-Hemmer auf die proteasomale Aktivität vaskulärer Zelllinien
      • 4.2.1.1  CPAE-Zellen: Ergebnisse einer Statinbehandlung über 6 Stunden
        • 4.2.1.1.1 Simvastatin (Prodrug)
        • 4.2.1.1.2  Atorvastatin
        • 4.2.1.1.3 Pravastatin
        • 4.2.1.1.4  Einfluss von Mevalonsäure in Kombination mit Statinen auf die Proteasomaktivität
      • 4.2.1.2 EA.hy926-Zellen: Ergebnisse einer Statinbehandlung über 6 Stunden
      • 4.2.1.3  CPAE-Zellen: Ergebnisse einer Statinbehandlung über 24 Stunden
        • 4.2.1.3.1 Simvastatin (Prodrug)
        • 4.2.1.3.2 Atorvastatin
        • 4.2.1.3.3 Pravastatin
        • 4.2.1.3.4 Einfluss einer simultanen Gabe von Mevalonsäure auf die Proteasomaktivität
      • 4.2.1.4  EA.hy926-Zellen: Ergebnisse einer Statinbehandlung nach 24 Stunden
      • 4.2.1.5 VSMC: Ergebnisse einer Statinbehandlung nach 24 Stunden
    • 4.2.2 Zusammenfassung der Ergebnisse der Statinbehandlung
    • 4.2.3 Die Wirkung von Mevalonsäure auf das Proteasom der Zelle
  • 4.3  Das isolierte 20S Proteasom - Wirkung von der Statine und Mevalonsäure
    • 4.3.1 Effekte von 100 µM HMG-CoA-Reduktase-Hemmer auf 20S Proteasomen
    • 4.3.2 Effekte der Inkubation mit Mevalonsäure
  • 4.4 Zusammenfassung der Ergebnisse
• 5  Diskussion
  • 5.1 Statine und ihre Wirkung auf das Proteasom
    • 5.1.1 Statine waren keine Hemmer des 20S Proteasoms
    • 5.1.2  Mevalonsäure hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität
    • 5.1.3 Wirkmechanismus der Statine und des Proteasominhibitors Lactacystin
      • 5.1.3.1 Statine und β-clasto Lactacystin induzierten massive Zellveränderungen
        • 5.1.3.1.1  Pravastatin zeigte weniger deutlich ausgeprägte Struktureffekte
        • 5.1.3.1.2 Die Wirkung der Statine auf die verschiedenen Zelllinien stand in Abhängigkeit der Zelleigenschaften
      • 5.1.3.2 Mevalonsäure hob die lactacystin-induzierten Strukturveränderungen nicht auf
      • 5.1.3.3  Durch die Hemmung der HMG-CoA-Reduktase könnten Veränderungen am Aktinzytoskelett auftreten
      • 5.1.3.4 Lactacystin führte über einen bisher unbekannten Mechanismus zu den Zellveränderungen
    • 5.1.4  Im Zellmodell hatten die Statine nur einen geringen Einfluss auf das Proteasom
      • 5.1.4.1 Atorvastatin, die offene Ringform, hemmte leicht die TL in den CPAE-Zellen und die ChTL in den VSMC-Zellen
      • 5.1.4.2 Keine Proteasominhibition durch die Statine
      • 5.1.4.3 Mevalonsäure konnte nicht als Modulator der Proteasomaktivität erkannt werden
  • 5.2  Statine und ihr Einfluss auf die Zellen
    • 5.2.1 Statine hatten antiproliferative Eigenschaften
  • 5.3  Die Auswirkungen einer Hemmung des Proteasoms
    • 5.3.1 Die geringen Atorvastatineffekte sind physiologisch nicht bedeutsam
• 6  Zusammenfassung
• Abkürzungen
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tab. 1: Zusätzliche pleiotrope Wirkungen von CSE-Hemmern, die das kardiovaskuläre System nicht direkt betreffen (in Anlehnung an [Fenton II 2002]).
• Tab. 2: Physiologische Funktion und ausgewählte Proteinsubstrate des Proteasomweges (abgewandelt nach [Kisselev 2001]).
• Tab. 3: Darstellung der Effekte einer simultanen Mevalonsäuregabe auf die Viabilität der CPAE-Zellen im Vergleich zu der alleinigen Inkubation mit 10 µM Statin. Die Werte wurden bezüglich der Kontrolle errechnet. Die Effekte von Simvastatin (Prodrug) und Atorvastatin auf die Viabilität dieser Endothelzelllinie wurden durch Mevalonat vollständig aufgehoben.
• Tab. 4: Darstellung der Einflüsse einer Statinbehandlung auf vaskuläre Zellen. In der Zusammenstellung der einzelnen Ergebnisse zeigte sich, dass Statine nur einen minimalen Einfluss auf die Proteasomaktivität hatten. Atorvastatin konnte nach der 6-Stunden-Inkubation in den CPAE-Zellen die TL und nach 24 Stunden die ChTL in den VSMC-Zellen hemmen. Die anderen beiden Substanzen hatten keine Wirkung auf das zelluläre Proteasom.
• Tab. 5: Tabellarisch dargestellt ist die Proteasomaktivität der CPAE-Zellen nach einer 6-stündigen Behandlung mit 10 µM Statin und 400 µM Mevalonsäure. Die Proteasomaktivität wurde der Aktivität nach alleiniger Inkubation mit 10 µM Statin gegenübergestellt. Alle Aktivitätswerte wurden bezüglich der Lösungsmittelkontrolle ausgewertet. Die Aktivität lag vergleichbar auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Die gleichzeitige Gabe von Mevalonsäure blieb ohne Einfluss auf die Proteasomaktivität.
• Tab. 6: Proteasomaktivität nach einer 24-Stunden-Behandlung der CPAE-Zellen mit Simvastatin (Prodrug) und β-clasto Lactacystin. Durch die Gabe von Simvastatin konnte im Gegensatz zu Lactacystin keine signifikante Hemmung der Proteasomaktivität erzeugt werden. Die Inkubation mit Simvastatin (Prodrug) blieb ohne direkten Effekt auf die proteasomale Aktivität dieser Endothelzellen.
• Tab. 7: Diese Tabelle gibt einen Überblick über die Proteasomaktivität der CPAE-Zellen nach einer 24-stündigen Inkubation mit der gleichzeitigen Gabe von 400 µM Mevalonat und 10 µM Statin sowie der alleinigen 10 µM Statinbehandlung. Bezüglich der alleinigen Statinbehandlung zeichneten sich keine Veränderungen ab. Die simultane Mevalonsäuregabe hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität.

Bilder

• Abb. 1: Stoffwechselweg des Cholesterols: Statine blockieren die Synthese von Cholesterol. Auf diese Weise wird die Bildung von Mevalonsäure und der isoprenoiden Zwischenprodukte verhindert. Durch diesen Eingriff wird die Modifikation verschiedener Proteine beeinflusst (modifiziert nach [Laufs 2000, Goldstein 1990]).
• Abb. 2: Zusammenfassung der Einflüsse von Statinen auf das kardiovaskuläre System (Abwandlung der Vorgabe nach [Takemoto 2001])
• Abb. 3: Aufbau des 26S Proteasoms. Das Zellpartikel ist aus einem Regulatorkomplex und dem proteolytisch aktiven 20S Kernpartikel aufgebaut. Der Regulatorkomplex ist für die Substratbindung (Kappe), dessen Entfaltung sowie die Translokation (Basis) zuständig (verändert nach [Kisselev 2001]).
• Abb. 4: Der strukturelle Aufbau des 20S Proteasoms (modifiziert nach [Kisselev 2000]).
• Abb. 5: Strukturvergleich zwischen HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren und β-clasto Lactacystin. Die strukturelle Parallelität wird anhand der Laktonringe deutlich. Die Esterbindung des Laktonrings von Lactacystin ist entscheidend für die Hemmung des Proteasoms.
• Abb. 6: CPAE-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Simvastatin (geschlossener β-Laktonring):
• Abb. 7: CPAE-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Atorvastatin (offener β-Laktonring):
• Abb. 8: CPAE-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit 10 µM Statin plus 400 µM Mevalonsäure und Lactacystin:
• Abb. 9: Effekte von Simvastatin (geschlossener Laktonring), Atorvastatin und Pravastatin (Substanzen mit dem offenen Laktonring) auf die Lebendigkeit der Endothelzelllinie in der Zellkultur. Die Aktivität wurde in Bezug auf die Lösungsmittelkontrolle berechnet. Die Viabilität der CPAE-Zellen wurde durch die 24-Stunden-Inkubation mit Simvastatin und Atorvastatin deutlich beeinträchtigt. Die Stoffwechselaktivität der Zelllinie war nach der Pravastatinbehandlung kaum verändert.
• Abb. 10: Nettoproliferation (PD/d: Zellverdopplung pro Tag) der EA.hy926-Zellen während einer 24-stündigen Behandlung mit HMG-CoA-Reduktase-Hemmern. Durch die Behandlung mit den Statinen sank die Nettowachstumsrate in den EA.hy926-Zellen. Höhere Konzentrationen der Statine führten zu einer Hemmung der Proliferation. Dieser Effekt konnte durch die Gabe von 400 µM Mevalonat (Mev) zu 10 µM Simvastatin und Atorvastatin aufgehoben werden. Auf die Behandlung mit 10 µM Pravastatin hatte Mevalonsäure keinen Einfluss.
• Abb. 11: Proteasomaktivität der CPAE-Zellen nach einer 6-Stunden-Inkubation mit Simvastatin (Prodrug) und 10 µM β-clasto Lactacystin. Im Gegensatz zum bekannten Proteasomhemmer Lactacystin konnte durch Simvastatin das Proteasom nicht gehemmt werden. Simvastatin hatte in der kurzzeitigen Behandlung keinen Einfluss auf das Proteasom dieser Endothelzelllinie. Die Proteasomaktivität war nicht signifikant verändert.
• Abb. 12: Dosis-Wirkungskurve einer 6-stündigen Inkubation der CPAE-Zellen mit Atorvastatin. Atorvastatin verursachte eine leichte Hemmung der TL-Aktivität. Die anderen beiden proteasomalen Untereinheiten wurden nicht signifikant verändert. Die Aktivität der ChTL und der CaspL wurden durch Atorvastatin nicht signifikant beeinflusst. Die Aktivität lag auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle.
• Abb. 13: Proteasomaktivität der CPAE-Zellen nach einer 6-Stunden-Behandlung mit Pravastatin. Pravastatin konnte in dieser Endothelzelllinie keine Hemmung der Proteasomaktivität erzeugen. Mit steigender Konzentration an Pravastatin veränderten sich die einzelnen proteolytischen Einheiten nicht signifikant. Pravastatin hatte somit keinen direkten Effekt auf die Proteasomaktivität.
• Abb. 14: Dosis-Wirkungskurve einer 6-Stunden-Behandlung der EA.hy926-Zellen mit Pravastatin. Am Beispiel von Pravastatin sollten die Effekte der Statinbehandlung graphisch dargestellt werden. Bei der Behandlung dieser humanen Endothelzelllinie zeigten sich keine signifikanten konzentrationsabhängigen Veränderungen der Proteasomaktivität. Die Statine hatte keinen Einfluss auf die proteolytische Funktion des Proteasoms der EA.hy926-Zellen.
• Abb. 15: Dosis-Wirkungskurve der CPAE-Zellen nach der Inkubation mit Atorvastatin über 24 Stunden. Die Aktivität des zellulären Proteasoms war durch die Gabe verschiedener Konzentrationen Atorvastatin kaum verändert. Mit 1 µM Atorvastatin konnte ein leichtes Absinken der proteolytischen Aktivität gemessen werden. Mit der Steigerung der Dosis setzte sich dieser Effekt nicht fort. Atorvastatin konnte in der Langzeitbehandlung das Proteasom nicht signifikant hemmen.
• Abb. 16: Aktivitätsgraph der TL nach einer 24-Stunden-Inkubation der CPAE-Zellen mit Pravastatin. 1 µM Pravastatin hatte keine Wirkung auf die Proteasomaktivität. Durch die Konzentration von 5 µM Pravastatin konnte die TL-Aktivität leicht gehemmt werden. Mit 10 µM Pravastatin ging die TL-Aktivität wieder auf das Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Pravastatin hatte keinen konzentrationsabhängigen signifikanten Einfluss auf die Proteasomaktivität.
• Abb. 17: Dosis-Wirkungskurve einer 24-Stunden-Inkubation der EA.hy926-Zellen mit Simvastatin (Prodrug). Am Beispiel von Simvastatin sollten die Effekte der Statinwirkung auf die humane Endothelzelllinie dargestellt werden. Die Statine verursachten keine signifikante Aktivitätsänderung des Proteasoms. Alle 3 proteolytischen Zentren hatten eine Aktivität, die mit der Aktivität der Kontrollzellen vergleichbar war.
• Abb. 18: Darstellung der ChTL-Aktivität der VSMC-Zellen nach der 24-stündigen Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen Atorvastatin im Vergleich zu 10 µM β-clasto Lactacystin. Durch Atorvastatin konnte diese proteasomale Aktivität leicht gehemmt werden. Die Konzentration von 1 µM Atorvastatin war noch nicht effektiv. Erst ab einer Konzentration von 5 µM wurde eine leichte Hemmung der ChTL deutlich.
• Abb. 19: Dosis-Wirkungskurve nach der 48-Stunden-Behandlung der CPAE-Zellen mit Mevalonsäure. Die Aktivität aller 3 proteolytischen Untereinheiten lag auf dem Niveau der Kontrollzellen (ChTL (P=0,960), CaspL (P=0,853) und TL (P=0,484)). Mevalonsäure blieb ohne Wirkung auf den proteasomalen Funktionszustand. Aus diesen Ergebnissen heraus konnte Mevalonat nicht als Aktivator des Proteasoms identifiziert werden.
• Abb. 20: Proteasomaktivität des hoch gereinigten 20S Proteasoms nach einer 2,5-Stunden-Behandlung mit 100 µM der verschiedenen CSE-Hemmer und 10 µM β-clasto Lactacystin. Durch die Behandlung mit den verschiedenen Statinen konnte die ChTL-Aktivität leicht bis 15 % erhöht werden. Auf die anderen proteolytischen Einheiten des Proteasoms hatten die Statine keinen Einfluss. Im Vergleich dazu war die Proteasomaktivität nach Lactacystinbehandlung fast vollständig gehemmt.
• Abb. 21: Dosis-Wirkungskurve einer 2,5-stündigen Inkubation der isolierten 20S Proteasomen mit verschiedenen Konzentrationen Mevalonat. Alle drei proteolytischen Einheiten blieben durch die Behandlung unverändert. Die Aktivität lag auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Es erfolgte keine Modulation der Proteasomaktivität durch die Behandlung mit Mevalonsäure.
• Abb. 22: Modell über die Entstehung der Zellveränderungen durch die Behandlung mit HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (verändert nach der Vorgabe von [Laufs und Liao 2000]).