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1  Einleitung

1.1 Statine – Eingriff in den Stoffwechselweg des Cholesterols auf Ebene der Mevalonsäure

1.1.1 Definition der Statine

Statine werden für die Pharmakotherapie der Hypercholesterolämie eingesetzt. Sie greifen durch die Hemmung der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A-(HMG–CoA)-Reduktase in den Stoffwechsel des Cholesterols ein. Dies führt zu einer Senkung der Plasmakonzentration von Cholesterol und insgesamt zu einer positiven Veränderung des Lipidprofils. Besonders das LDL, das low density lipoprotein, einer der Hauptfaktoren in der Genese atherosklerotischer Erkrankungen, wird durch vermehrten Abbau und eine Erhöhung der Syntheserate der LDL–Rezeptoren in der Leber deutlich gesenkt. Weiterhin führt eine Behandlung mit diesen Pharmaka zu einer Steigerung der HDL-Komponente (high density lipoprotein) [Forth 1996].

Abb. 1: Stoffwechselweg des Cholesterols: Statine blockieren die Synthese von Cholesterol. Auf diese Weise wird die Bildung von Mevalonsäure und der isoprenoiden Zwischenprodukte verhindert. Durch diesen Eingriff wird die Modifikation verschiedener Proteine beeinflusst (modifiziert nach [Laufs 2000, Goldstein 1990]).


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1.1.2  Die Wirkung der Statine

In primären (WOSCOPS, MIRACLE) ebenso wie in sekundären Präventionsstudien (4S, MAAS, MRFIT) konnte gezeigt werden, dass durch die Behandlung mit Statinen die Morbidität und die Mortalität signifikant abnahmen. Bei der Patientengruppe in der 4S Studie waren bereits nach einer Behandlungsdauer von 6 Wochen die Cholesterolwerte um durchschnittlich 28 % und die LDL-Werte um 38 % gesunken. Diese Therapie ging, im Vergleich zu den mit Placebo behandelten Patienten, mit einer 42 %igen Reduktion des Risikos einher, am koronaren Herztod zu versterben. Diese Zahl verdeutlichte, dass sich die Überlebenschance nach einem akuten kardiovaskulären Ereignis unter der Therapie mit Statinen verbesserte [MAAS 1994].

Die Untersuchungsergebnisse der WOSCOP–Studie wiesen darauf hin, dass mit einer durchschnittlichen Senkung der LDL–Werte um 24 % der Nutzen der Therapie, welcher bei einer 45prozentigen Reduktion des Risikos bezüglich kardiovaskulärer Ereignisse liegt, weitgehend ausgeschöpft ist. Eine weitere Senkung konnte den Erfolg der Therapie nicht wesentlich steigern. Außerdem wurde festgestellt, dass ein Therapienutzen auch unabhängig vom Basalwert des LDL sowie des HDL erzielt werden konnte. Darüber hinaus gab es eindeutige Belege dafür, dass eine frühzeitige Behandlung mit Simvastatin das Risiko senkt, dass sich der Patient einer koronaren Bypass-Operation oder einer Angioplastie (PTCA) unterziehen muss [WOSCOP 1998]. Jedoch schien diese Wirkung auf die koronare Herzerkrankung erst nach einer einjährigen Behandlungsdauer zu beginnen [4S 1994]. Die angiographisch darstellbare Progression bezüglich des Durchmessers der Stenose trat in der Simvastatingruppe weniger häufig auf. Im Gegenteil, es wurde sogar eine Regression der pathologischen Veränderungen beobachtet [MAAS 1994]. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Untersuchungen der Plaquegröße mittels MRI gesehen: Nach einer 12monatigen Therapie wurden eine signifikante Reduktion der Wanddicke sowie des Gefäßwandareals, ohne Veränderungen in der Lumengröße, beobachtet. Langfristig vergrößerte eine effektive Behandlung mit Statinen auch signifikant den Durchmesser des Gefäßes, was durch eine fortschreitende Umbildung der Arterienwand erreicht wurde [Corti 2002].

Der pathophysiologische Mechanismus des Wiederaufbaus der ursprünglichen Gefäßstruktur ist noch nicht im Detail geklärt. Das Zusammenspiel einzelner komplexer Faktoren könnte bei andauernder Therapie einen positiven Einfluss ausüben. Zu diesen Faktoren zählen zum Beispiel die Hemmung der durch LDL–Cholesterol vermittelten Entzündungsvorgänge, eine verbesserte [Seite 15↓]Endothelfunktion, der Rückgang des Einflusses von oxidativem Stress sowie das sinkende Thromboserisiko. In der Langzeittherapie schien der Hauptgrund für eine bessere Überlebensmöglichkeit die Stabilisierung koronarer Läsionen zu sein.

Andererseits wiesen die Cholesterolsyntheseenzym-(CSE)–Hemmer bereits innerhalb weniger Wochen heilsame physiologische Effekte auf. Neben der effektiven Senkung der Blutfette verbesserten Statine nach einem akuten koronaren Ereignis die Endothelfunktion [RECIFE Trial 1999], verminderten die Aggregationsfähigkeit der Plättchen und reduzierten die Ablagerung von Thromben. Von diesen Mechanismen profitierten die Patienten vor allem in der frühen Phase nach einem akuten Koronarsyndrom [MIRACLE 2001]. Diese so genannten pleiotropen Effekte der Statine sind in der Therapie neben einer Regulation der Blutfettwerte von entscheidender Bedeutung.

1.1.3 Die pleiotropen Effekte der CSE-Hemmer

Durch das pleiotrope Wirkspektrum von CSE-Hemmern wird bei Patienten mit koronarer Herzerkrankung eine verbesserte Perfusion des Myokards erreicht. Insgesamt wird die NO-abhängige Endothelfunktion gebessert. Aller Wahrscheinlichkeit nach werden diese Effekte durch eine Hemmung der Funktionsfähigkeit der kleinen G-Proteine, wie Rho und Rac, hervorgerufen. Des Weiteren wird ein direkter Einfluss der Statine auf die Gefäßwand angenommen [Werner 2002], da diese Effekte bereits nach kurzzeitiger Therapiedauer beobachtet werden.

Es gibt klinische und experimentelle Anhaltspunkte dafür, dass verschiedene wichtige Gene, die für die Kontrolle der endothelialen Funktion, der Entzündung und der Plaquestabilität von zentraler Bedeutung sind, durch CSE–Hemmer reguliert werden. Dazu gehören zum Beispiel die endotheliale NO-Synthetase (eNOS), Endothelin [Hernandez-Perera 2000] sowie MHC-II [Werner 2002].


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1.1.3.1  Direkte vaskuläre Effekte

Mit dem Eingriff in den Stoffwechselweg des Cholesterols wird neben der Entstehung von Mevalonsäure auch die Bildung weiterer Zwischenprodukte wie Farnesylpyrophosphat (FPP) und Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) gehemmt. Diese Isoprenoide sind wichtig für die posttranslationale Modifizierung verschiedener Proteine [Werner 2002]. Dies hat besonders für die kleinen GTP-bindenden Proteine Ras und die Ras-ähnlichen, wie Rho, Rab, Rac und andere, Bedeutung. Durch die Prenylierung gehen die Proteine aus dem inaktiven GDP-gebundenen in ihren aktiven GTP-gebundenen Zustand über und können eine Reihe von Signalkaskaden auslösen [Laufs, Liao 1998].

Bei den vaskulären Prozessen spielt besonders Rho eine wichtige Rolle. Rho wird durch die Anwesenheit von GGPP in seine aktive Form gebracht [Laufs 2000]. Über diesen Weg kann das Aktinzytoskelett verändert und Einfluss auf den intrazellulären Transport, mRNA-Stabilität und die Transkription von Genen genommen werden [Laufs und Liao 2000]. Durch den Eingriff in die zelluläre Signaltransduktion können folglich Signalantworten wie die DNA-Synthese, mRNA-Synthese sowie Proteinsynthese und Proteinexpression reguliert werden [Fenton II 2002]. Dieser Mechanismus soll an einigen ausgewählten Beispielen erklärt werden.

1.1.3.1.1 Verbesserung der Funktion des Endothels

Die endotheliale Dysfunktion resultiert aus schädigenden Einflüssen auf die Innenschicht der Gefäßwand. Zahlreiche exogene sowie endogene Noxen fördern ein Fortschreiten und begünstigen die Ausbildung von Atherosklerose. Durch diese strukturellen Veränderungen der Gefäßwand wird die Bioverfügbarkeit von NO herabgesetzt, was wiederum die Progression der Atherosklerose begünstigt. Statine greifen in diesen Kreislauf positiv ein.

Die Dysfunktion des Endothels charakterisiert sich durch eine beeinträchtigte Erweiterung (Dilatation) der Gefäße. Sie entsteht vorwiegend durch eine verringerte Synthese, Freisetzung und Aktivität des endothelabhängigen Stickstoffmonoxides. NO seinerseits gewährleistet eine suffiziente Relaxation des Gefäßes und verhindert die Aggregation von Thrombozyten. Weiterhin wird das Wachstum der glatten Muskelzellen ebenso wie die Interaktion zwischen Endothel und Leukozyten durch NO reguliert. Wenn durch pathologische Veränderungen die natürliche Funktion des Endothels nicht mehr gewährleistet ist, kann an dieser Stelle durch [Seite 17↓]Statine positiv entgegengewirkt werden. Statine steigern die Bioverfügbarkeit von NO. Die verbesserte Bioverfügbarkeit wiederum wird durch eine hochregulierte Expression von eNOS erreicht. Es wird angenommen, dass die Hemmung der kleinen GTP-bindenden Proteine, in dem Fall Rho, den zugrunde liegenden Mechanismus bilden. Durch die Inhibition von Rho bleibt die Rho-Kinase inaktiv, worüber die Halbwertzeit der mRNA von eNOS verlängert wird [Laufs 2000].

1.1.3.1.2 Verminderung der Proliferation glatter Muskelzellen

Einen weiteren pathogenetischen Faktor der Atherosklerose stellt der pathologische Proliferationsreiz für die glatten Muskelzellen dar [Stobbe 1996]. Über verschiedene Wege wird der stark mitogene Faktor PDGF vermehrt gebildet, was eine Proliferation der Muskelzellen verursacht. Die Proliferation der Zellen wird in Abhängigkeit der kleinen GTP-bindenden Proteine reguliert [Negre-Aminou 1997]. Diese Proteine greifen insofern in den Zellzyklus ein, als dass sie die Aktivität von Zyklinen und den zyklinabhängigen Kinasen beeinflussen [Laufs 2000]. Somit können bei Senkungen des zellulären Gehalts an Mevalonsäure durch Statine wachstumshemmende Effekte beobachtet werden.

Der entscheidende Schritt liegt auf der Ebene der Formation von Isoprenoidderivaten. Wird deren Bildung gehemmt, sinkt die PDGF-induzierte DNA-Synthese in den glatten Muskelzellen der Mediaschicht des Gefäßes. Daraufhin wird die Hyperphosphorylierung des PDGF-induzierten Retinoblastomproteins erniedrigt und die Aktivität der cdk sinkt ab. Auf diese Weise steigt die Menge an vor allem p27Kip 1, einem cdk–Inhibitor, an und die Proliferation wird zwischen der G1-Phase und der S-Phase des Zellzyklus blockiert [Takemoto 2001].

1.1.3.1.3 Statine und thrombotische Ereignisse

Im Rahmen der Atherogenese kommt es im Gefäßbett zur Entstehung von Plaques. Ein weiteres Fortschreiten der atherosklerotischen Läsion kann dazu führen, dass der Plaque rupturiert und die extrinsische Gerinnungskaskade aktiviert wird. Dabei wirkt eine Hypercholesterolämie steigernd auf die Reaktivität der Plättchen. Als Folge erleidet der betreffende Patient ein akutes Koronarsyndrom oder im schlimmeren Fall einen totalen Verschluss des Gefäßes [Takemoto 2001]. Durch die Behandlung mit CSE–Hemmern wird über den Mechanismus der limitierten [Seite 18↓]Proteinprenylierung eine chronische Generation von Thrombin auf zellulärer Ebene durch ein Absinken des Plasmagehalts an Gewebefaktor (TF) und Plasminaktivator-Inhibitor 1(PAI 1) gehemmt. Da PAI 1 somit nicht genügend vorhanden ist, um die Reaktion des geweblichen Plasminaktivators zu neutralisieren, kann ausreichend Plasmin gebildet werden. Auf diese Weise kann effektiv in thrombolytische Prozesse eingegriffen werden [Fenton II 2001].

1.1.3.1.4 Wirkung auf zerebrale ischämische Ereignisse

Untersuchungen ergaben, dass die Gehirndurchblutung und der zerebrale Gefäßtonus durch das endogen gebildete NO reguliert wurden [Harrison 1997]. Weitere Experimente, in denen nach einem kleinen ischämischen Infarkt eine gesteigerte Perfusion durch die Hemmung der Rho-GTP-Bindung erreicht wurde, verdeutlichten die vorhandenen Ergebnisse. Die Applikation von HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren erhöhte über den bereits erklärten Mechanismus die Expression von eNOS und führte somit zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit von NO [Endes 1998]. So fiel bei Patienten mit CSE-Hemmer-Therapie nach einem Gefäßverschluss die Größe des betroffenen Infarktgebiets geringer aus. Insgesamt konnte durch die Therapie mit Statinen die zerebrale Durchblutung durch die verbesserte Funktion von eNOS und die sich daraus ergebende vermehrte Bildung von NO positiv beeinflusst werden [Laufs 2000]. Die Antiplättchen- und Antileukozytenfunktion von NO widerspiegelte sich in verstärkten Kollateralflüssen und einer zunehmenden Mikrozirkulation.

Die verbesserte Endothelfunktion spielte eine wesentliche Rolle, jedoch konnten diese Ergebnisse nicht ausschließlich dieser Tatsache zugeschrieben werden. Es müssen weitere Faktoren der Atherogenese in Betracht gezogen werden, die durch die Statine positiv beeinflusst werden.


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1.1.3.2  Weitere Beispiele für pleiotrope Effekte

Tab. 1: Zusätzliche pleiotrope Wirkungen von CSE-Hemmern, die das kardiovaskuläre System nicht direkt betreffen (in Anlehnung an [Fenton II 2002]).

Aktivität und Effekt

  • G1–Phase Wachstum von CHO-Zellen sinkt

  • Überleben nach Lipopolysaccharid-induzierter Sepsis steigt bei Mäusen

  • Förderung der Angiogenese

  • Zunahme der Knochendichte bei verringerter Osteoklastenaktivität

  • Frakturrisiko nimmt ab

  • Entzündungsreaktion und die atherosklerotische Aktivität sinken

  • die Histokompatibilität und die Antwort der T-Zellen werden erniedrigt

  • Entwicklung des Diabetes mellitus Typ 2 wird gebremst

  • abnehmende Häufigkeit von Demenzen


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Abb. 2: Zusammenfassung der Einflüsse von Statinen auf das kardiovaskuläre System (Abwandlung der Vorgabe nach [Takemoto 2001])

Die Ursachen der Statineffekte, die scheinbar unabhängig vom Mevalonsäureweg sind, wurden bisher noch nicht vollständig aufgeklärt.

Zahlreiche Untersuchungen weisen darauf hin, dass CSE-Hemmer und Proteasominhibitoren, wie beispielsweise Lactacystin und MG 132, gemeinsame Eigenschaften in ihrer biologischen Wirkung haben. Zum Beispiel: die Regulation von Zellzyklusfaktoren wie p27, ihren Einfluss auf das Wachstum sowie die Differenzierung glatter Muskelzellen der Gefäße. Die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren zeigen ähnliche regulatorische Muster auf die Aktivität von eNOS und die Wirkungsweise von Entzündungsmediatoren. So stellt sich Frage, ob die Parallelität der Effekte sich über einen gleichen Wirkmechanismus, namentlich der Hemmung des Ubiquitin–Proteasomweges, erklären lässt [Rao 1999].


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1.2  Das Ubiquitin-Proteasom-System - Ubiquitinierung, Degradation und Proteasom

1.2.1 Der strukturelle Aufbau des Proteasoms und dessen Funktion

1.2.1.1  Das 26S Proteasom

Das 26S Proteasom wird als das aktive Partikel für den Abbau von Zellproteinen betrachtet. Es ist für den ATP-abhängigen Abbau ubiquitinierter und einiger nicht ubiquitinierter Proteine in eukaryotischen Zellen zuständig. Aus Untersuchungen ging hervor, dass das 20S Proteasom zwar in vitro aktiv sein kann, jedoch in der Zelle nur mittels eines gebundenen regulatorischen Komplexes seine Aufgabe erfüllte [DeMartino 1999]. Demzufolge setzt sich in vivo das Proteasom aus dem proteolytischen Kernpartikel (20S) und einem Regulatorkomplex als Kappe zusammen [Löwe 1995]. Dieser Regulatorkomplex wird ATP-abhängig an das 20S Proteasom gebunden. Somit ist der Aufbau des 26S Proteasoms ein ATP-abhängiger Prozess [Coux 1996, Ferrell 2000].

Abb. 3: Aufbau des 26S Proteasoms. Das Zellpartikel ist aus einem Regulatorkomplex und dem proteolytisch aktiven 20S Kernpartikel aufgebaut. Der Regulatorkomplex ist für die Substratbindung (Kappe), dessen Entfaltung sowie die Translokation (Basis) zuständig (verändert nach [Kisselev 2001]).


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1.2.1.2  Der 19S Regulatorkomplex

Der 19S Komplex besitzt eine Sequenz, mit der polyubiquitinierte Substanzen erkannt werden. Durch die Aktivität der Isopeptidase kann die Polyubiquitinkette zu Ubiquitin-Monomeren gespalten werden [Ferrell 2000]. Mittels Bindung an die beiden Enden des 20S Abschnittes wird die Öffnung in den engen Kanal in das Innere des proteolytischen Komplexes reguliert [Groll 2000]. Bevor die Proteine den Eingang passieren können, müssen sie erst entfaltet werden, wofür ebenfalls die Regulatorkomplexe verantwortlich sind.

1.2.1.3 Das 20S Proteasom

Der strukturelle Aufbau dieses multikatalytischen Zellpartikels wurde mit Hilfe der Röntgenkristallstruktur in verschiedenen Untersuchungen an Hefe und dem Archaebakterium Thermoplasma acidophilum dargestellt. Hierbei handelt es sich um ein zylinderähnliches Partikel, das sich aus vier aufeinander gestapelten Ringen bildet. Die beiden äußeren Ringe setzen sich ausschließlich aus α-Untereinheiten zusammen, während die inneren beiden β—Untereinheiten sind. Pro Ring sind jeweils weitere sieben verschiedene Untereinheiten zu verzeichnen, die sich in ihrer Reihenfolge im gegenüberliegenden anderen Ring wiederholen. Da sich das 20S Proteasom aus zwei identischen Hälften aufbaut, entsteht eine siebenfache Symmetrie des Partikels [Coux 1996]. Der zentrale Penetrationskanal stellt sich im Inneren als Hohlraum dar. Dieser verengt sich nach beiden Seiten zur Peripherie hin [Löwe 1995].

Die Struktur der α- sowie der β—Untereinheit zeigt eine auffallende Ähnlichkeit. Außerdem ist die Bindung zwischen den beiden Strukturelementen sehr eng [Löwe 1995].

1.2.1.3.1 Die α-Untereinheiten

Diese Untereinheit ermöglicht dem Proteasom die beschriebene Ringstruktur auszubilden. Außerdem ist sie notwendig, um die β-Ringe zu formen. Durch den Komplex α—Untereinheiten wird eine physiologische Barriere gewährleistet. Dadurch wird der Einstrom zytosolischer Proteine in das Innere des proteolytischen Partikels begrenzt. Von der äußeren Seite binden regulatorische Komplexe, welche die Aktivität der Proteolyse modulieren [Coux 1996].


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1.2.1.3.2  Die β-Untereinheiten

In diesem Strukturelement befinden sich diejenigen Abschnitte, die der eigentlichen proteolytischen Aktivität dienen. Die aktive Seite ist im Inneren des zentralen Zylinders lokalisiert. Durch die Arbeit mit fluorogenen Substraten konnten drei verschiedene Aktivitäten identifiziert werden, die sich in ihrer proteolytischen Spezifität unterscheiden. Die β5-Untereinheit weist eine chymotrypsin-ähnliche Aktivität (ChTL) auf und spaltet Proteine vorzugsweise nach hydrophoben Resten. Die auf β1 lokalisierte caspase-ähnliche Aktivität (CaspL) spaltet bevorzugt die gebundenen Proteine nach sauren Resten. Der historische Name dieser Aktivität ist Peptidylglytamylpeptidhydrolase (PGPH), jedoch wurde er verlassen, da die Spaltung nach Aspartatresten schneller erfolgt als nach Glutamat. Auf der β2-Untereinheit ist die trypsin-ähnliche Aktivität (TL) gelegen, die Proteine nach basischen Aminosäuren spaltet [Kisselev 2001].

Abb. 4: Der strukturelle Aufbau des 20S Proteasoms (modifiziert nach [Kisselev 2000]).


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1.2.2  Das Proteasom und seine Funktion

Das Zusammenspiel vieler zellulärer Proteine wird durch das proteolytische System kontrolliert. Der multikatalytische Proteasekomplex, welcher sowohl im Zytoplasma als auch im Nukleus lokalisiert ist, stellt daher das zentrale Element des Proteinabbaus dar. Es werden eine Vielzahl kurzlebiger, aber auch langlebiger Proteine über diesen Weg entfernt. Die Funktion des 26S Proteasoms ist bei vielen biologischen Prozessen von entscheidender Bedeutung, denn dieses System ist in die Regulation vieler zellulärer Vorgänge einbezogen [Desterro 2000]. An physiologischen Prozessen beteiligte Proteine werden über diesen Weg in ihrer Aktivität in ein Gleichgewicht gebracht.

Tab. 2: Physiologische Funktion und ausgewählte Proteinsubstrate des Proteasomweges (abgewandelt nach [Kisselev 2001]).

Funktion

Substrate

  • Progression des Zellzyklus:

p27Kip1, p21, Zykline

  • Apoptose:

p53, p27 Kip1, bax, IκB

  • Regulation der Genexpression:

c-Jun, E2F1, β-Catenin

  • Entzündung:

IκB

  • Phosphorylierung:

Proteinkinase A (regulatorische Untereinheit)

  • Regulation metabolischer Wege:

Ornithin Dekarboxylase, HMG-CoA-Reduktase

  • Immunüberwachung:

zytosolische und nukleäre Proteine


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1.2.3  Die Inhibition des Ubiquitin-Proteasomweges

Die Proteasomen gehören in die Gruppe der N-terminal nukleophilen Hydrolasen. An den Seitenketten der β-Untereinheiten liegen N-terminal Serin-, Threonin- oder Cysteinreste [Kisselev 2001]. Aus Mutationsstudien ging hervor, dass vorwiegend die Hydroxylgruppe des terminalen Threoninrestes als katalytisches Nukleophil genutzt wird. Die abzubauenden Polypeptidketten werden komplett in kleine Peptide zwischen 3 und 20 Resten gespalten. Die weitere Hydrolyse wird durch andere Proteasen übernommen [Lee 1998].

Unterschiedliche Proteasominhibitoren modifizieren kovalent vor allem den Threoninrest der β-Untereinheiten. Die Inhibitoren MG 132 und MG 262 binden reversibel, β-clasto Lactacystin und Epoxomicin irreversibel. Auf diese Weise wird der Abbau von Proteinen reduziert. Dabei ist es prinzipiell nicht notwendig, dass alle aktiven Zentren des 26S Partikels gehemmt werden. Die Inaktivierung der ChTL-Aktivität reicht aus, um die Abbaurate signifikant zu verringern [Kisselev 2001].

1.2.4 Statine und ihr Einfluss auf das Proteasom

Zu diesem speziellen Thema bietet die Literatur nur eine sehr geringe Zahl publizierter Arbeiten. Diese sind in ihren Ergebnissen widersprüchlich und berichten von einer Hemmung des Proteasoms über keinen nachzuweisenden Effekt bis hin zu einer Aktivitätssteigerung durch Statine. Erstmals wurden im Jahr 1999 Untersuchungen hinsichtlich der Substanzklasse Statine und ihrer Wirkung auf das Proteasom durch Rao und Mitarbeiter veröffentlicht. Sie fanden heraus, dass Lovastatin über eine Hemmung des proteasomalen Systems den Zellzyklus in der G1-Phase blockiert, wobei die Proteine p21 und p27 stabilisiert werden. Diese Stabilisierung wurde durch die Vorstufenform des Lovastatins, welche ähnlich dem Proteasominhibitor Lactacystin einen geschlossenen β-Laktonring ausbildet, hervorgerufen. Dabei zeigte sich, dass diese Form das eigentliche Zielenzym, die HMG-CoA-Reduktase, nicht hemmte. Weiterhin wurde festgestellt, dass nicht ausschließlich strukturelle Eigenschaften von Lovastatin, sondern auch viele der Wirkungen durch die Vorstufenform mit dem spezifischen Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin übereinstimmten. Lovastatin (Prodrug) hemmte dosisabhängig das Proteasom, wobei mit einer Konzentration von 40 µM eine halbmaximale Hemmung der über 36 Stunden [Seite 26↓]behandelten Brustkrebszelllinie erreicht wurde. Mevalonsäure, das Stoffwechselprodukt der HMG-CoA-Reduktase, hob sowohl die durch die Vorstufe induzierte Hemmung des Proteasoms als auch die durch den spezifischen Inhibitor Lactacystin induzierte auf. Sie führte sogar zu einer gesteigerten Peptidaseaktivität des Proteasoms von 300 bis 500 %, wenn die Zellen mit steigenden Konzentrationen an Mevalonsäure vorbehandelt wurden. Diese Aktivierung resultierte in einer Zunahme der Zellteilung [Rao 1999].

Andere Ergebnisse zeigte die Arbeit um die Gruppe von C. Wojcik. Sie konnten Lovastatin und Simvastatin als Modulatoren der aus der Rinderhypophyse gereinigten 20S Proteasomen identifizieren. Ausschließlich durch die Vorstufe der Wirkformen wurde die ChTL-Aktivität leicht stimuliert und die PGPH ihrerseits gehemmt, während die TL-Aktivität unverändert blieb. Die aktive Wirkform von Lovastatin hatte einen geringen inhibitorischen Effekt auf die ChTL-Aktivität. Weiterhin wirkte Mevalonat auf die präparierten 20S Proteasomen leicht inhibitorisch. Die Effekte der beiden CSE-Hemmer auf die proteasomale Aktivität wurden durch Mevalonsäure nicht verändert. Untersuchungen am Zellkulturmodell mit der Kolonkarzinomzelllinie C-26 zeigten bei einer Konzentration von 100 µM Lovastatin zytotoxische Effekte. Diese konnten bei der Vorstufenform durch eine Zugabe von Mevalonsäure nicht aufgehoben werden. In Zelllysaten wurde nach einer Behandlung eine erhöhte ChTL-Aktivität gemessen. Die beiden anderen proteolytischen Einheiten blieben unbeeinflusst. Die Effekte auf das gereinigte 20S Proteasom korrelierten wenig mit den Ergebnissen, die im Zelllysat gemessen wurden. Dies könnte laut Wojcik seine Ursache darin haben, dass in der vollständigen Zelle das 20S Proteasom mit verschiedenen regulatorischen Einheiten zu dem aktiven 26S Partikel assoziiert ist. Daraus wurde geschlussfolgert, dass die Statine, unabhängig von der HMG-CoA-Reduktase, weitere Ziele in der Zelle besitzen. Auf das proteasomale System bezogen, wurde aus den gewonnenen Daten abgeleitet, dass die untersuchten Statine keinen hemmenden Einfluss aufwiesen [Wojcik 2000].

Ein weiterer Ansatz zu dieser Thematik wurde durch Untersuchungen an differenzierten Neuroblastomzellen geliefert. Die Arbeitsgruppe um Kumar stellte nach einer Behandlung mit Mevastatin degenerative Veränderungen in Form einer Fragmentation der Neuriten an den Zellen sowie eine reduzierte Viabilität der Zellen fest. Im Zellextrakt der differenzierten Neuroblastomzellen konnte Mevastatin dosisabhängig das proteolytische System des Proteasoms inhibieren. Daraus wurde die Hypothese abgeleitet, dass die beobachteten Veränderungen das [Seite 27↓]Ergebnis einer Proteasomhemmung waren. Pravastatin, welches bereits in der Wirkform verabreicht wurde, zeigte dagegen keine phänotypischen Veränderungen. Sonstige Effekte wurden mit Pravastatin nicht beobachtet. Innerhalb der differenzierten Neuroblastomzellen akkumulierte ausschließlich die geschlossene β-Laktonringstruktur. Daher ging man davon aus, dass die Zellen die auf die HMG-CoA-Reduktase wirksame Form nicht aufnehmen. Dieser Fakt würde auch erklären, warum eine Behandlung mit Pravastatin keine Wirkung zeigte. Die Zugabe von Mevalonsäure verhinderte vollständig die vorher beobachteten degenerativen Veränderungen und verbesserte das Überleben der Zellen. Diese neuroprotektiven Einflüsse ließen sich durch eine verminderte Aufnahme von Mevastatin erklären. Morphologische Veränderungen, die durch Lactacystin induziert wurden, konnten nicht durch Mevalonat aufgehoben werden. Zusammenfassend wurde vorgeschlagen, dass Mevastatin allosterisch an das Proteasom bindet und durch die Präparation abdissoziierte. Möglicherweise werden Aktivatoren des Proteasoms gehemmt oder endogene Inhibitoren aktiviert. Jedenfalls scheint ein anderer Wirkmechanismus vorzuliegen, als bei der durch Lactacystin vermittelten irreversiblen Hemmung [Kumar 2002].

Neuere Erkenntnisse wurden durch die Tätigkeit von Murray et al. veröffentlicht. Deren Resultate ergaben sich aus Versuchen an hoch gereinigten 20S Proteasomen, die aus dem Vollblut von Kaninchen gewonnen wurden, und murinen MC3T3-E1 Osteoblasten. Lovastatin stimulierte die ChTL-Aktivität des 20S Proteasoms. Dabei wurde bei einer Behandlung zwischen 0,001 µM und 5 µM eine dosisabhängige signifikante Aktivitätssteigerung gemessen. In der Zellkultur stellten sich nach einer einstündigen Inkubation der Präosteoblasten und Osteoblastenzellen mit 1, 5 oder 10 µM Lovastatin morphologische Veränderungen in Form von Zellabrundung, Ablösung und verringerter Adhäsion dar. Diese phänotypischen Erscheinungen waren durch eine Vorbehandlung mit 20 µM Mevalonsäure nicht mehr so stark ausgeprägt. Die chymotrypsin-ähnliche Aktivität nahm nach einer 48-stündigen Behandlung der Präosteoblasten mit 1 und 5 µM Lovastatin bis zum 3,5-fachen bezüglich der Kontrolle zu. Im Gegensatz dazu zeigten die differenzierten Osteoblasten nach einer Inkubation mit 1 µM Lovastatin über 2 Tage nur eine mäßige Aktivitätserhöhung der ChTL [Murray 2002].


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25.11.2005