[Seite 32↓]

3  Material und Methoden

3.1 Zellkultur

3.1.1 Material

  • DMEM (1000 mg/l Glukose)

Gibco – Invitrogen Corporation

  • MEM

Gibco – Invitrogen Corporation

  • Natriumhydrogencarbonat

Merck

  • Natriumpyruvat

Boehringer Mannheim GmbH

  • FCS, hitzeinaktiviert bei 57oC

Gibco – Invitrogen Corporation

  • Penicillin / Streptomycin (10000 U/10000 µg/ml)

Biochrom AG

  • PBS

Gibco – Invitrogen Corporation

  • Trypsin–EDTA

Invitrogen Corporation

  • Sterilfilter (150 ml easy flow)

Falcon

  • Zellkulturschalen (Durchmesser: 60 mm, 100 mm)

Falcon – Becton Dickinson

  • Zellkulturschale (Durchmesser: 150 mm)

Greiner bio-one

  • Zellkulturflasche (75 mm2)

Falcon

  • Hämozytometer (Neubauer–Zählkammer)

Poly Optik

  • Lichtmikroskop

Leica

  • Trypan blue (modifiziert) 0,4 % Lösung in PBS

ICN Biomedicals Inc.

3.1.2 Zusammensetzung der Nährlösungen

3.1.2.1 Nährmedium für VSMC-Zellen und EA.hy926-Zellen

DMEM (1000 mg/l Glukose) + 10 % FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin


[Seite 33↓]

3.1.2.2  Behandlungsmedium für VSMC-Zellen und EA.hy926-Zellen

DMEM (1000 mg/l Glukose) + 3 % FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin

3.1.2.3 Nährmedium und Behandlungsmedium für CPAE-Zellen

MEM (1000 mg/l Glukose) + 5 % FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin

3.1.2.3.1 Herstellung des Behandlungsmediums für CPAE-Zellen

MEM wird in pulverisierter Form zur Verfügung gestellt. Dem Pulver werden 1500 mg NaHCO3 und 110 mg Natriumpyruvat zugefügt. Die Substanzen werden in 1l Aqua bidest. gelöst. Anschließend werden der Lösung 50 ml hitzeinaktiviertes Serum und 10 ml Penicillin / Streptomycin zugegeben. Im Anschluss daran wird die gesamte Lösung steril filtriert.

3.1.3 Gewinnung von VSMC (Primärkultur) aus der A. carotis der Ratte

3.1.3.1 Material

  • Wistar Ratte (männlich; ca. 60 Tage alt; 300 bis 350 g)

Charles River

  • Thiopental–Natrium (Trapanal)

Byk Gulden

  • Präparationsbesteck

 

  • Kollagenase: Worthington Typ II (215 U/mg)

Biochemical Corporation

  • Zentrifuge (Laborfuge 400 R)

Heraeus Instruments

3.1.3.2 Herstellung der Kollagenase

Zur Herstellung der Kollagenaselösung (Worthington–Collagenase Typ II 215 U/ml) werden 70 mg der pulverisierten Form in 50 ml serumfreiem Nährmedium aufgelöst. Die hergestellte Lösung wird mit einem Einmalfilter steril filtriert, aliquotiert und bei –20oC gelagert.


[Seite 34↓]

3.1.3.3  Präparation der glatten Muskelzellen

Dem Versuchstier werden 75 mg des Lokalanästhetikums injiziert und abgewartet, bis sämtliche Reflexe des Tieres erloschen sind. Wenn dies sichergestellt ist, wird die Ratte auf einem Präparationstisch befestigt und mit Alkohol desinfiziert. In Anschluss daran wird der Thorax präpariert und die Halsregion freigelegt. Zu beiden Seiten der Trachea befindet sich die A. carotis. Die beiden Gefäße werden aus der bindegewebigen Hülle entfernt. Die präparierten Karotiden werden in eine mit PBS gefüllte 60 mm Zellkulturschale gegeben, worin adhärentes Fettgewebe sowie Bindegewebe entfernt werden. Anschließend werden die Gefäße in etwa 2 bis 3 mm dicke Ringe geschnitten. Die gesamte Präparation wird unter semisterilen Bedingungen durchgeführt.

Nachfolgende Schritte laufen unter sterilen Bedingungen ab. Die Gefäßstücke werden vorsichtig mit einer Pinzette in ein 15 ml Falcon-Gefäß gegeben, mit 300 µl Kollagenase und 50 µl Trypsin–EDTA (im Verhältnis 6:1) versetzt. Die Karotidenstücke werden für 6 Stunden im Brutschrank (Heraeus Instruments), in 90 % wasserdampfgesättigter Atmosphäre, bei 37oC und 5 % CO2, inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Reaktion mit 5 ml Nährmedium gestoppt. Die Zellsuspension wird 5 Minuten bei 1000 rpm und RT zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, das Pellet mit Nährmedium resuspendiert und auf eine 60 mm Zellkulturschale pipettiert. Die Zellen werden mit einem Gesamtvolumen von 3,5 ml Nährmedium in standardisierter Atmosphäre kultiviert. Alle 3 bis 4 Tage wird das Medium erneuert. Die Präparation und die Kultivierung der glatten Muskelzellen werden in Anlehnung an die Vorgaben von Chamley-Campbell et al. durchgeführt [Chamley-Campbell 1979].

3.1.3.4 Passagieren

Das Nährmedium wird abgesaugt. Anschließend werden die Zellen mit sterilem PBS gewaschen und trypsiniert. Für Experimente werden diese Primärzellen zwischen der Passage 3 und 7 verwendet.

Für Untersuchungen werden die CPAE-Zellen bis Passage 11 verwendet.


[Seite 35↓]

3.1.4  Behandlung der Zellen mit CSE-Hemmern und Mevalonsäure

3.1.4.1 Material

  • Behandlungsmedium

Gibco

  • β-clasto Lactacystin (10 mM Stammlösung in DMSO)

Calbiochem

  • Simvastatin, β-Laktonring (50 mM Stammlösung in 95 % Ethanol)

Calbiochem

  • Atorvastatin (50 mM Stammlösung in 100 % DMSO)

Calbiochem

  • Pravastatin (50 mM Stammlösung in 100 % DMSO)

Calbiochem

  • D,L – Mevalonsäure (5 M Stammlösung in 95 % Ethanol)

Sigma

3.1.4.2 Verfahrensweise

Die Zellen werden mit PBS gewaschen, trypsiniert und in definierter Zahl (EA.hy926: 6,5x105 Zellen, CPAE: 1,0x106 Zellen und VSMC: 6,5x105 Zellen) auf 60 mm Zellkulturschalen ausgesät (jeweils Doppelwerte). Zur Adhäsion der Zellen an die Unterlage werden die Kulturschalen unter Standartbedingungen kultiviert (EA.hy926: 24 Stunden, CPAE: 48 Stunden, VSMC: 3 Tage). Nach dieser Zeit werden die EA.hy926-Zellen und die glatten Muskelzellen gründlich mit PBS-Lösung gewaschen und zur Adaptation an das neue Medium über 24 Stunden serumarm weiterkultiviert. Anschließend werden die Zellen bei einer gegebenen Zelldichte von 75 bis 80 % Konfluenz behandelt. Die Zellen erhalten alle in gleicher Weise 2 bzw. 3 ml Medium (48 Stunden):

  • Leerwertkontrolle:

Behandlungsmedium

  • Lösungsmittel:

0,1 %

  • Statin:

1 µM, 5 µM, 10 µM

  • Statin mit Mevalonat:

10 µM + 400 µM

  • Positivkontrolle (β— clasto Lactacystin):

10 µM

  • Mevalonsäure:

400 µM, 800 µM, 1 mM, 5 mM


[Seite 36↓]

Die Zellen werden über 6 bzw. 24 Stunden mit Statinen behandelt oder 24 bzw. 48 Stunden mit Mevalonat.

3.1.5 Färbung mit Trypanblau – Erstellung einer Wachstumskurve

Nach Ende der Inkubationszeit werden die Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA trypsiniert. Die Reaktion wird nach einer Reaktionszeit von 1,5 Minuten mit 2 ml Behandlungsmedium gestoppt. Anschließend wird die Zellsuspension in ein 15 ml Falcon pipettiert. Von den 3 ml Gesamtvolumen der Suspension werden 20 µl in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß gegeben und 20 µl Trypanblau dazu pipettiert. Von dieser Menge werden 10 µl in eine Neubauer-Zählkammer gefüllt und im Anschluss daran die Gesamtzellzahl ermittelt.

Durch ein Anfärben der Zellen mit Trypanblau kann festgestellt werden, ob die Zellen noch eine intakte Zellmembran besitzen. Sobald eine Schädigung der Membran auftritt, kann der Farbstoff ins Zytoplasma eindringen und eine Blaufärbung der Zelle verursachen. Eine nicht mehr funktionstüchtige Zellmembran wird als Marker für avitale Zellen angesehen. Diese Zellen sind noch im Zellverband adhärent.

3.1.6 XTT – Test: Testung der Viabilität nach Behandlung

3.1.6.1 Funktionsprinzip

Bei diesem Test handelt es sich um ein kolorimetrisches Assaysystem. Das gelbe Tetrazoliumsalz XTT wird durch die Zugabe des Elektronenkopplers in metabolisch aktiven Zellen zu dem wasserlöslichen orangefarben Formazansalz umgewandelt. Mittels dieser Farbreaktion kann spektrophotometrisch die Lebendigkeit der Zellen quantifiziert werden. Die Absorption des Formazanprodukts wird bei einer Wellenlänge zwischen 450 bis 500 nm und einem Referenzbereich von mehr als 650 nm mit einem ELISA–Reader gemessen.


[Seite 37↓]

3.1.6.2  Material

  • Cell Proliferation Kit (XTT)

Roche

XTT-markierte Reagenz

 

Elektronkopplungslösung

 

  • 96well Mikrotiterplatte (durchsichtig)

Greiner bio-one

  • ELISA-Reader Anthos HT III

 

3.1.6.3 Prozedur

Die zu untersuchenden Zellen werden auf einer 96well Mikrotiterplatte in einer definierten Zellzahl mit einem Gesamtvolumen von 100 µl pro well ausplattiert. Nach Adhäsion der Zellen werden diese wie unter Punkt 3.1.4 beschrieben mit entsprechenden Konzentrationen der Wirksubstanzen behandelt. Nach Abschluss der Inkubationszeit wird die XTT-Lösung (Endkonzentration: 0,3 mg/ml) zu jeweils 50 µl dazu pipettiert und im Brutschrank unter Standardbedingungen inkubiert. Die Platte wird über einen Zeitraum von 4 Stunden stündlich mit einem ELISA-Reader gemessen.

3.1.7 Darstellung der Zellen durch Färbung mit Phalloidin und DAPI

3.1.7.1 Funktionsprinzip der Färbung

Zur bildlichen Darstellung morphologischer Besonderheiten nach einer Behandlung der Zellen mit Statinen, eignet sich eine Färbung mit Phalloidin und im Anschluss daran ein Färben der Kernelemente mit DAPI. Phalloidin bindet mit hoher Affinität an Aktinfilamente, die Bestandteil des Zytoskeletts jeder Zelle sind. FITC, sein fluoreszierendes Konjugat, sendet bei 495 nm Licht aus. DAPI wird selektiv an AT-reiche Abschnitte der DNA gebunden, so dass sich die Zellkerne auf diese Weise gut anfärben lassen. Bei einer Wellenlänge von 340 nm bilden sich mit hoher Spezifität fluoreszierende DNA-DAPI-Farbkomplexe aus.


[Seite 38↓]

3.1.7.2  Material

  • 4 % Paraformaldehyd (Lösung in PBS)

Sigma

  • 1 % Triton (Lösung in 1 x TBS)

Sigma

  • Phalloidin (Lösung 1:200 in PBS)

Sigma

  • DAPI (Lösung 1:1000 in PBS)

Roche

  • Zeiss-Kamera

Zeiss

  • Axiovert 3,0 Software

Zeiss

3.1.7.3 Färbung mit Phalloidin

3.1.7.4 DAPI–Kernfärbung


[Seite 39↓]

3.1.8  Ernte und Lyse der Zellen

Nach der Behandlung werden die Zellen unter einem Lichtmikroskop betrachtet, um phänotypische Veränderungen zu erkennen. Darauf folgend werden die Zellen einer hypotonischen Lyse mit destilliertem Wasser unterzogen.

Zunächst wird das Medium abgesaugt. Dann werden die Zellen zweimalig mit eiskalter PBS-Lösung gewaschen. Zum Schluss wird die Schale gründlich abgesaugt. Vorsichtig werden 45 bis maximal 80 µl, in Abhängigkeit von der Zelldichte sowie der Zellgröße, eiskaltes Aqua bidest. auf die Schalen pipettiert. Die Zellen werden mit einem Zellschaber von der Unterlage abgekratzt. Die Zellsuspension wird in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß pipettiert und sofort in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff (-196oC) gegeben. Ist die Suspension gefroren, wird sie bei Raumtemperatur wieder aufgetaut. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt. Die Proben werden anschließend bei -80oC gelagert bzw. zur Proteinbestimmung weiter aufgearbeitet.

Dazu müssen die Proben bei 4oC, 14000 rpm, über 30 Minuten abzentrifugiert werden (Centrifuge 5810R, Eppendorf). Dabei trennen sich die intrazytoplasmatischen Proteine sowie auch Kernproteine, im Speziellen natürlich die Proteasomen, von den übrigen Zellbestandteilen ab. Danach wird der vorhandene Überstand in ein gesondertes Eppendorfgefäß pipettiert und das Pellet verworfen.


[Seite 40↓]

3.2  Quantitative Proteinbestimmung mit Bicinchinonsäure (BCA)-Assay

3.2.1 Funktionsprinzip der BCA-Proteinbestimmung

Proteine sind in der Lage zweiwertiges Kupfer zu reduzieren. Das bei dieser Reaktion entstehende einwertige Kupfer reagiert mit dem in der Lösung vorhandenen BCA zu einem spezifischen Farbkomplex. Die Absorption des Farbkomplexes wird mittels eines Spektrophotometers gemessen. Dabei korreliert die Farbstoffintensität direkt mit der Konzentration der reagierenden Gruppen [Lottspeich 1998].

3.2.2 Material

  • Pierce Protein Assay Kit

Pierce

BCA Protein Assay Reagenz A

 

BCA Protein Assay Reagenz B

 

Albumin Standard (BSA – bovine serum albumin, Fraction V)

 

  • 96well Platte (durchsichtig)

Greiner

  • ELISA-Reader Anthos HT III

 

3.2.3 Arbeitsschritte


[Seite 41↓]

3.3  Messung der Proteasomaktivität mit fluorogenen Substraten

3.3.1 Funktionsweise der fluorogenen Substrate

Diese Substrate werden zur Messung der Aktivität von Peptidasen eingesetzt. Eine kurze Peptidsequenz ist mit dem 7-Amino-4-Methylcoumarin (MCA) konjugiert, welches durch aktive Peptidasen abgespalten wird. Das bei dieser Reaktion entstandene freie, fluoreszierende MCA wird dann mittels eines Spektrofluorometers gemessen. MCA–Substrate sind besonders für Peptidasen geeignet, die substratspezifisch sind. Es bildet sich eine Interaktion zwischen dem Peptidrest des Substrates und der Substratseite des reaktiven Zentrums des Enzyms aus, wobei die Reste des Substrates N-terminal bezüglich der festen Bindung lokalisiert sind. In Abhängigkeit der Proteasomaktivität wird eine definierte Menge an MCA frei, die als Korrelat der Aktivität bewertet wird.

3.3.2 Material

  • fluorogene Substrate und MCA–Standard

Bachem

SLLVY

 

BzVGR

 

ZLLE

Calbiochem

  • Tris

Roth

  • Kaliumchlorid (KCl)

Roth

  • Magnesium-Acetat (Mg-Ac)

Roth

  • Magnesiumchlorid (MgCl2)

Merck

  • ATP (Lösung in 100 mM Tris pH 9,5 mit End-pH 7,0)

Roche

  • Dithiothreitol (DTT)

Sigma

  • Phosphokreatinkinase (PCK)

Merck

  • Kreatinphosphat (PC)

Merck

  • 96well Platte (dunkel)

Greiner bio-one

  • SpectraMax GeminiEM Microplate Reader

Molecular Devices


[Seite 42↓]

3.3.2.1  Herstellung des 2 x 26S – Inkubationspuffers

  • 450 mM Tris-HCl, pH 8,2 (RT)

  • 90 mM KCl

  • 15 mM Mg-Acetat x 4 H2O

  • 15 mM MgCl2 x 6 H2O

3.3.2.2 Ansatz des Mastermixes

  • 2 x 26 S Inkubationspuffer:

60 µl

  • Aqua bidest.:

23,3 µl

  • DTT (0,5 M Stammlösung):

0,22 µl

  • ATP (100 mM Stammlösung):

6 µl

  • fluorogenes Substrat (2 mM Stammlösung in DMSO):

10 µl

  • PCK (1 U/µl Stammlösung):

0,2 µl

  • PC (1 M Stammlösung):

0,5 µl

3.3.3 Messung der Proteasomaktivität im Zellextrakt

Für die Bestimmung der Proteasomaktivität im Zellextrakt (Gewinnung der Extrakte siehe Abschnitt Ernte und Lyse), das aus den mit den zu untersuchenden Substanzen behandelten Zellen gewonnen worden ist, werden für die Messung der chymotrypsin-ähnliche Aktivität (ChTL) 10 µg Protein eingesetzt. Für die anderen beiden Aktivitäten, namentlich die caspase-ähnliche (CaspL) und die trypsin-ähnliche (TL), werden dagegen 20 µg Protein verwendet. Insgesamt werden 20 µl Proteinsuspension pro well der 96well Platte angesetzt. Die dem Volumen fehlende Menge wird mit Aqua bidest. aufgefüllt. Im Anschluss daran werden jeder Probe 100 µl des vorbereiteten, kühl und lichtgeschützt gelagerten Mastermixes zugegeben. Des Weiteren wird die Platte zur Kontrolle sowie zum Abgleich mit MCA–Standard (Gesamtvolumen von 120 µl) versehen. Die Platte wird sofort abgedeckt und dunkel über einen Zeitraum von 30 Minuten (SLLVY) bzw. 60 Minuten (ZLLE, BzVGR) bei 37oC im Brutschrank [Seite 43↓]inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wird die Platte in einem Fluoreszenzmessgerät, SpectraMax GeminiEM, bei einer Exzitation von 370 nm und einer Emission von 445 nm gemessen. Die Emissionswerte korrelieren mit der relativen Aktivität des Proteasoms. Je höher die Aktivität dieses multikatalytischen Komplexes ist, desto intensiver ist die Fluoreszenz.

Die enzymatische Aktivität wird als prozentuale Aktivität im Vergleich zur Kontrolle berechnet.

3.3.4 Aktivitätsbestimmung am gereinigten 20S Proteasom

3.3.4.1 Material

  • 20 S Proteasom, aus Vollblut gereinigt [1 µg/µl]

freundlicherweise durch die Arbeits gruppe von T. Grune zur Verfügung gestellt

  • Tris 0,05 M pH 7,2 (RT)

 

  • Wirksubstanzen

 

Lösungsmittel [0,1 %]

 

Statine [100 µM]

Calbiochem

Mevalonat [400 µM, 800 µM, 1 mM, 5 mM]

Sigma

β-clasto Lactacystin [10 µM]

Calbiochem

Der Messansatz für die Wirkung der zu testenden Substanzen auf gereinigte 20 S Proteasomen wird in Anlehnung an die Vorgaben von Wojcik et al. angesetzt [Wojcik 2000]. Dabei wird 1 µg Proteasom in 0,05 M Trispuffer mit der entsprechenden Wirksubstanz in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß pipettiert. Im Anschluss daran wird der Ansatz 150 Minuten bei 37oC im Thermomixer inkubiert. Nach dem Ende der Reaktionszeit werden die Tripelwerte für die Bestimmung der proteasomalen Aktivität mit dem Reaktionsansatz versehen und gemessen. Die Messung wird wie im vorherigen Abschnitt beschrieben durchgeführt. Die Aktivität wird bezüglich der Lösungsmittelkontrolle bewertet.


[Seite 44↓]

3.4  Auswertung und Statistik

Ausgewertet und graphisch zusammengestellt werden die Messergebnisse mit Microsoft Excel. Die Standardabweichungen der einzelnen Versuche sind mit Hilfe von Excel ermittelt. Die statistische Analyse der erhaltenen Daten erfolgt mit dem OneWay ANOVA Test von SigmaStat 2.0. Als statistisch signifikant werden die Werte P<0,05 angenommen.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
25.11.2005