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4  Ergebnisse

4.1 Zelluläre Wirkung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern

Bei der Genese atherosklerotischer Prozesse bieten Endothelzellen und glatte Gefäßmuskelzellen einen wesentlichen Angriffspunkt. Daher wurden für die Untersuchungen CPAE- und EA.hy926-Zellen als Vertreter endothelialer Zellen sowie glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC) verwendet. Zur mikroskopischen Beurteilung der phänotypischen Merkmale wurden die verschiedenen Zelllinien mit den Substanzen Simvastatin (Prodrug), Atorvastatin und Pravastatin behandelt. Simvastatin gehört in dieser Gruppe der Lipidsenker zu den ersten Substanzen. Diese werden bei einer medikamentösen Verabreichung erst in der Leber durch enzymatische Hydrolyse [Istvan 2001] in die aktive Wirkform umgewandelt. Die metabolisch aktive Form hemmt ihr Zielenzym, die HMG-CoA-Reduktase, sehr effektiv. In den Versuchen wurde die Substanz in ihrer Vorstufenform verwendet. Atorvastatin und Pravastatin liegen bereits als aktive Metabolite vor. Sie benötigen daher keine Spaltung des β-Laktonrings, um in die Wirkform überführt zu werden. Auf diese Weise sollten Differenzen sowie Parallelitäten zwischen den einzelnen Wirkformen, der geschlossenen und offenen β-Laktonringform, der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer herausgearbeitet werden.

4.1.1 Phänotypische Merkmale und Veränderungen

Die Behandlung mit den Statinen führte zu mikroskopisch beobachtbaren phänotypischen Veränderungen. Die Zellen wurden länglich. Dabei gab es sichtbare Unterschiede in der Stärke der Ausprägung zwischen den verschiedenen Zelllinien. Die Ausbildung dieses Phänotyps war bei den CPAE-Zellen am deutlichsten. Die Behandlung mit der inaktiven Vorstufe Simvastatin und mit Atorvastatin brachte ähnlich potente Wirkeffekte hervor. Pravastatin zeigte im Vergleich zu Simvastatin und Atorvastatin zeigte deutlich schwächere Effekte.

Die verschiedenen Zellen wurden bei einer 80 %igen Konfluenz mit Konzentrationen von 1 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM und 50 µM des jeweiligen CSE-Hemmers behandelt. Mit steigender Konzentration der Wirksubstanz wurde die Zelldichte stark verringert und degenerative Veränderungen traten auf. Bei hohen Konzentrationen zeigten die Zellen Anzeichen des [Seite 46↓]Absterbens. Die Zellen verloren ihre längliche Form, wurden rund und lösten sich von der Unterlage ab. Die beschriebenen Merkmale waren nach einer Behandlungsdauer von 6 Stunden mäßig und nach 24 Stunden vollständig ausgeprägt. Im Gegensatz zu den Endothelzellen schienen die glatten Gefäßmuskelzellen nach einer Behandlung über 24 Stunden mit den geringeren Konzentrationen strukturell weniger verändert. Erst ab der hohen Konzentration von 20 µM zeichneten sich bei den VSMCs deutlich sichtbare Zellveränderungen ab.

4.1.1.1 Behandlung der Endothelzelllinie CPAE mit Statinen

Die mikroskopischen Phänomene sollen anhand der CPAE-Zellen ausführlich dargestellt werden. Die Zellen wurden über 24 Stunden mit Simvastatin (Prodrug) inkubiert. Folgende Effekte ließen sich mikroskopisch beobachten:

  • Ethanol 0,1 %:

Die Zellen waren zu 80 % konfluent. Die Zellen zeigten die normale Form und Größe der Zelllinie. Veränderungen waren nicht erkennbar.

  • 1 µM:

Die Zelldichte war mit der der Lösungsmittelkontrolle vergleichbar. Es zeigten sich erste Zellveränderungen in Form einer Streckung der Zellen.

  • 5 µM:

Die Zelldichte verringerte sich um etwa 20 bis 30 %. Die Zellen lösten sich vermehrt von der Unterlage ab. Die CPAE-Zellen waren länglich.

  • 10 µM:

Eine weitere Verminderung der Konfluenz der Zellen war zu erkennen. Nur noch etwa 55 % der Zellen hafteten fest an. Diese Zellen waren sehr lang gestreckt.

  • 20 µM:

Die Zellen rundeten sich zunehmend und lösten sich ab. Die degenerativen Erscheinungen nahmen weiter zu.

  • 50 µM:

Die meisten Zellen, zwischen 65 bis 75 %, waren abgeschwommen. Die verbliebenen Zellen sahen sehr geschädigt und avital aus.


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Mit steigender Konzentration der Vorstufenform Simvastatin nahmen die Zellveränderungen zu. Der Phänotyp der untersuchten Zelllinie hatte sich vollständig verändert. Zu ähnlichen Strukturveränderungen führte die Behandlung mit der offenen Laktonringform Atorvastatin. Diese Effekte waren etwas geringer ausgeprägt. Bei der Behandlung mit Pravastatin waren die beobachteten Merkmale weniger deutlich. Somit lässt sich zusammenfassen, dass 1 µM Simvastatin im Vergleich zu den beiden anderen untersuchten Substanzen gleicher Konzentration die ursprüngliche Struktur der Zellen stärker veränderte.

Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 24 Stunden behandelt. Die bereits beschriebenen Unterschiede und Parallelitäten der verschiedenen Ringformen, der geschlossene β-Laktonring und der offene Ring, der Statine sollten mit Hilfe der Abbildungen belegt werden. Dabei wurde Simvastatin (Abb. 6 a-f) als Vertreter der geschlossenen Ringform und Atorvastatin (Abb. 7 a-f) stellvertretend für die offene Laktonringform verwendet.


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Abb. 6: CPAE-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Simvastatin (geschlossener β-Laktonring):

a) Ethanolkontrolle 0,1 %

b) 1 µM

c) 5 µM

d) 10 µM

e) 20 µM

f) 50 µM


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Abb. 7: CPAE-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Atorvastatin (offener β-Laktonring):

a) DMSO-Kontrolle 0,1 %

b) 1 µM

c) 5 µM

d) 10 µM

e) 20 µM

f) 50 µM


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4.1.1.2  Merkmale einer Behandlung der Zellen mit dem irreversiblen Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin

Die CPAE-Zellen wurden zu diesem Zweck mit 1 µM und 10 µM des bekannten Proteasominhibitors β-clasto Lactacystin behandelt. Eine 24-stündige Inkubation der CPAE-Zellen mit einer Konzentration von 1 µM β-clasto Lactacystin führte zu deutlichen strukturellen Veränderungen. Verglichen mit der Lösungsmittelkontrolle waren die Zellen lang gestreckt, lösten sich teilweise von der Unterlage ab und waren weniger dicht. Eine Steigerung der Konzentration auf 10 µM Lactacystin verstärkte die Effekte weiter.

Die mikroskopisch sichtbaren Erscheinungen nach einer Inkubation mit dem Proteasominhibitor und Statinen waren weitgehend vergleichbar. Bei beiden Behandlungen konnten zellschädigende Eigenschaften beobachtet werden. Insgesamt hatte die Gabe von Lactacystin eine potentere Wirkung. Bereits eine Konzentration von 1 µM Lactacystin genügte, um strukturelle Veränderungen zu erzielen (Abb. 8 e-f).

4.1.1.3 Einfluss der alleinigen Behandlung mit Mevalonsäure und Effekte von Mevalonsäure β-clasto Lactacystin und in Kombination mit Statinen

Die alleinige Behandlung der Zellen mit Konzentrationen zwischen 400 µM und 5 mM Mevalonsäure verursachte keine auffälligen Veränderungen. Der Phänotyp und die Zelldichte waren mit der Lösungsmittelkontrolle vergleichbar. Somit hatte Mevalonsäure keinen direkt mikroskopisch verifizierbaren Effekt auf die behandelten Zellen.

Mevalonsäure war nicht in der Lage, die durch Proteasominhibition verursachten degenerativen Veränderungen aufzuheben. Die Zellen behielten ihr gestrecktes Aussehen bei.

Die simultane Gabe von 400 µM Mevalonat zu 10 µM Statin führte zu einer vollständigen Aufhebung der statin-induzierten phänotypischen Erscheinungen. Mikroskopisch stimmte der Phänotyp mit dem der Lösungsmittelkontrolle überein. Die unterschiedliche Laktonringform der Statine hatte keinen Einfluss (Abb. 8 a-d). Somit wurde gezeigt, dass die phänotypischen Veränderungen keine Folge der Proteasominhibition waren, sondern auf die Hemmung der HMG-CoA-Reduktase zurückzuführen waren.


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Abb. 8: CPAE-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit 10 µM Statin plus 400 µM Mevalonsäure und Lactacystin:

a) Lösungsmittel 0,1 %

b) 10 µM Simvastatin plus 400 µM Mevalonat

c) Lösungsmittel 0,1 %

d) 10 µM Atorvastatin plus 400 µM Mevalonat

e) 1 µM β-clasto Lactacystin

f) 10 µM β-clasto Lactacystin


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Bei der Behandlung der Zellen fiel auf, dass sich die ursprüngliche Form der Zellen veränderte. Die Zellen wurden länglich. Mit Zunahme der Konzentration der Statine zeichneten sich degenerative Veränderungen ab. Mikroskopisch betrachtet sahen die Zellen vital beeinträchtigt aus. Somit war die Testung der Viabilität notwendig.

4.1.2 Einfluss der Statine und die simultane Mevalonsäuregabe auf die Viabilität der CPAE-Zellen

Die konfluenten Zellen wurden über 24 Stunden separat mit den verschiedenen Statinkonzentrationen behandelt. Nach dieser Zeit wurde die metabolische Aktivität als Korrelat der Viabilität mit XTT gemessen.

Abb. 9: Effekte von Simvastatin (geschlossener Laktonring), Atorvastatin und Pravastatin (Substanzen mit dem offenen Laktonring) auf die Lebendigkeit der Endothelzelllinie in der Zellkultur. Die Aktivität wurde in Bezug auf die Lösungsmittelkontrolle berechnet. Die Viabilität der CPAE-Zellen wurde durch die 24-Stunden-Inkubation mit Simvastatin und Atorvastatin deutlich beeinträchtigt. Die Stoffwechselaktivität der Zelllinie war nach der Pravastatinbehandlung kaum verändert.


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Der Eingriff in den Cholesterolstoffwechsel der Zellen mit CSE-Hemmern führte zu einer deutlichen Verringerung der Viabilität im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle. Am stärksten beeinträchtigte Simvastatin (Prodrug) die Zellaktivität. Bereits 1µM Simvastatin veränderte die Viabilität. Bei der Konzentration von 5 µM betrug die Viabilität nur noch 75 %. Eine Steigerung der Konzentration auf 20 µM führte zu einer Aktivitätsverminderung der Zellen auf 55 %. Durch 50 µM Simvastatin wurde die Stoffwechselaktivität nicht weiter beeinträchtigt. Ähnlich starke Effekte zeigte die Behandlung mit Atorvastatin. Mit steigender Konzentration an Atorvastatin zeigte sich eine Abnahme der Viabilität um etwa 40 %. So ließ sich im Viabilitätsassay die höhere Zytotoxität einer Behandlung mit Simvastatin (Prodrug) und Atorvastatin objektivieren. Pravastatin hatte kaum Einfluss auf die Stoffwechselaktivität der CPAE-Zellen.

Tab. 3: Darstellung der Effekte einer simultanen Mevalonsäuregabe auf die Viabilität der CPAE-Zellen im Vergleich zu der alleinigen Inkubation mit 10 µM Statin. Die Werte wurden bezüglich der Kontrolle errechnet. Die Effekte von Simvastatin (Prodrug) und Atorvastatin auf die Viabilität dieser Endothelzelllinie wurden durch Mevalonat vollständig aufgehoben.

 

geschlossener Ring

offener Ring

 

Simvastatin

Atorvastatin

Pravastatin

Lösungsmittelkontrolle

100 %

100 %

100 %

10 µM Statin

66,5 %

91,4 %

97,1 %

plus 400 µM Mevalonsäure

102,0 %

105,3 %

92,3 %

Durch die gleichzeitige Zugabe von 400 µM Mevalonsäure zu 10 µM Statin wurden die mikroskopisch beobachteten Statineffekte aufgehoben. Diese Ergebnisse ließen sich auch in der Viabilitätstestung verifizieren. Die Zellen hatten dadurch dieselbe Stoffwechselaktivität wie die Zellen der Lösungsmittelkontrolle. Somit konnte durch Mevalonsäure die reduzierte Stoffwechselaktivität nach alleiniger Statinbehandlung vollständig wiederhergestellt werden.


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4.1.3  Vitalität und Wachstum der EA.hy926-Zellen nach 24-Stunden-Behandlung mit Statinen

Die Trypanblau-Färbung der EA.hy926-Zellen diente der Erstellung einer Nettowachstumskurve. Stark geschädigte Zellen, in denen die Zellmembran ihre Barrierefunktion verloren hatte, konnten mit diesem Farbstoff markiert werden. Somit konnten die toten, noch im Zellverband integrierten Zellen identifiziert werden. Nicht mehr adhärente Zellen gingen nicht in die Zählung mit ein. Aus der Anzahl vitaler Zellen konnte die Proliferationsrate während der Behandlung mit Statinen errechnet werden.

Es fiel auf, dass mit steigender Konzentration der Statine die Zahl vitaler Zellen und somit die Proliferationsrate (Abb. 10) der Zellen abnahm. Obwohl die EA.hy926-Zellen in definierter Zahl ausplattiert wurden, veränderte sich die Anzahl der Endothelzellen mit steigender Dosis der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer. Im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle proliferierten die Zellen nicht mehr so schnell. 1 µM Simvastatin (Prodrug) und 1 µM Pravastatin hatte noch keinen Einfluss auf das Wachstum. Mit 10 µM Simvastatin (Prodrug) war keine Proliferation mehr nachweisbar. Es starben mehr Zellen, als sich teilten. Das Wachstum war bei dieser Simvastatinkonzentration gehemmt. Im Vergleich zu Simvastatin war bereits mit 5 µM Pravastatin das Zellwachstum potent gehemmt. Im Gegensatz dazu zeigte Atorvastatin auch in sehr geringen Dosen eine effektive Verringerung der Proliferation. Durch die Gabe von 1 µM Atorvastatin konnte die Zellproliferation fast vollständig gehemmt werden. Eine weitere Dosissteigerung von Atorvastatin bis auf 10 µM führte zu einer kompletten Inhibition der Zellteilungsrate. Aus diesen Beobachtungen heraus resultierte die Schlussfolgerung, dass Statine in den Wachstumszyklus von Zellen eingreifen. Die niedrigen Konzentrationen zwischen 1 µM und 10 µM Statin waren ausreichend, um das Wachstum deutlich zu limitieren.

Die simultane Gabe von 400 µM Mevalonsäure zu 10 µM Statin konnte den Einfluss auf die Proliferation bei Simvastatin sowie Atorvastatin revertieren. Bei Pravastatin bewirkte die Zugabe von Mevalonat keine Aufhebung der Wachstumsinhibition.


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Abb. 10: Nettoproliferation (PD/d: Zellverdopplung pro Tag) der EA.hy926-Zellen während einer 24-stündigen Behandlung mit HMG-CoA-Reduktase-Hemmern. Durch die Behandlung mit den Statinen sank die Nettowachstumsrate in den EA.hy926-Zellen. Höhere Konzentrationen der Statine führten zu einer Hemmung der Proliferation. Dieser Effekt konnte durch die Gabe von 400 µM Mevalonat (Mev) zu 10 µM Simvastatin und Atorvastatin aufgehoben werden. Auf die Behandlung mit 10 µM Pravastatin hatte Mevalonsäure keinen Einfluss.


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4.2  Der Eingriff in den Cholesterolstoffwechselweg und seine Effekte auf die Aktivität des Proteasoms

Zur Untersuchung der Statineffekte auf die drei proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms wurden die mikroskopisch ausgewerteten Zelllinien verwendet. Die Proteasomaktivität der beiden Endothelzelllinien wurde nach einer kurzzeitigen 6-Stunden-Behandlung sowie einer 24-Stunden-Behandlung beurteilt. Die proteolytische Aktivität der VSMC-Zellen wurde nur nach einer 24-stündigen Statinbehandlung gemessen. Diese Überlegung begründete sich aus der Tatsache, dass die glatten Muskelzellen eine niedrige Proliferationsrate hatten und eine Kurzzeitbehandlung mikroskopisch keine Wirkung zeigte. Die Zellen wurden mit Konzentrationen von 1 µM, 5 µM und 10 µM der HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren inkubiert. Diese Konzentration wurde als optimal herausgefunden, da Konzentrationen über 10 µM zytotoxisch waren. Die Untersuchung der Proteasomaktivität sollte nicht durch eine Abnahme der Stoffwechselleistung der Zelle aufgrund anderer Statineffekte verfälscht werden. Als Positivkontrolle wurde der bekannte irreversible Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin verwendet. Weiterhin wurde die Wirkung von Mevalonsäure, deren Bildung durch die Statine gehemmt wird, auf die Proteasomaktivität untersucht. In den Versuchen wurde die Wirkung von Mevalonsäure untersucht und die simultane Gabe zu 10 µM Statin.

4.2.1 Die Wirkung der CSE-Hemmer auf die proteasomale Aktivität vaskulärer Zelllinien

Aus den Untersuchungen resultierte, dass die Statine sowohl bei einer Behandlung über 6 Stunden als auch bei einer Behandlung über 24 Stunden das Proteasom im Vergleich zur Lactacystinkontrolle nicht wirkungsvoll hemmen konnten. Statine hatten in diesem Versuchsaufbau nur einen geringen Einfluss auf den Aktivitätszustand des Proteasoms. Insgesamt lag die Proteasomaktivität nach einer Behandlung mit Statinen bei 100 % ± 30 %.

Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse sagen aus, dass aus einer Behandlung mit den untersuchten HMG-CoA-Reduktase-Hemmern keine kontinuierliche Hemmung des proteolytischen Zellpartikels resultierte.


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Tab. 4: Darstellung der Einflüsse einer Statinbehandlung auf vaskuläre Zellen. In der Zusammenstellung der einzelnen Ergebnisse zeigte sich, dass Statine nur einen minimalen Einfluss auf die Proteasomaktivität hatten. Atorvastatin konnte nach der 6-Stunden-Inkubation in den CPAE-Zellen die TL und nach 24 Stunden die ChTL in den VSMC-Zellen hemmen. Die anderen beiden Substanzen hatten keine Wirkung auf das zelluläre Proteasom.

6-Stunden-Behandlung

 

geschlossener Ring

offener Ring

 

Simvastatin

Atorvastatin

Pravastatin

CPAE

TL ⇓

EA.hy926

24-Stunden-Behandlung

CPAE

EA.hy926

VSMC

ChTL ⇓

Atorvastatin, die offene Laktonringform, hatte einen geringen Einfluss auf die proteasomale Aktivität. Nach einer 6-stündigen Behandlung mit dieser Substanz war die TL in den CPAE-Zellen leicht gehemmt. Nach einer 24-stündigen Inkubation der VSMC-Zellen mit Atorvastatin zeichnete sich eine leicht inhibitorische Wirkung auf die ChTL ab. Die Untersuchung der beiden anderen CSE-Hemmer brachte nicht dasselbe Ergebnis hervor. Simvastatin (Prodrug) und Pravastatin hatten sowohl in der kurzzeitigen wie auch der langzeitigen Behandlung keinen Einfluss auf das Proteasom der untersuchten Zelllinien. Eine Proteasomhemmung im Sinne von β-clasto Lactacystin konnte in den vaskulären Zelllinien nicht oder nicht kontinuierlich nachgewiesen werden.

Im Folgenden sollen die einzelnen Ergebnisse der Untersuchung detaillierter ausgeführt werden.


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4.2.1.1  CPAE-Zellen: Ergebnisse einer Statinbehandlung über 6 Stunden

4.2.1.1.1 Simvastatin (Prodrug)

Eine kurzzeitige Behandlung mit Simvastatin erzeugte keine Inhibition der proteasomalen Aktivität. Alle 3 proteolytisch aktiven Zentren des Kernpartikels zeigten eine leichte Erhöhung ihrer Umsatzrate bezogen auf die Ethanolkontrolle. Am deutlichsten lag die ChTL-Aktivität über dem Niveau der Ethanolkontrolle. Durch die Behandlung mit 1 µM Simvastatin (Prodrug) erreichte die chymotrypsin-ähnliche Aktivität eine Rate von 126,4 % ± 10,7. Durch höhere Konzentrationen sank die Aktivität langsam auf das Niveau der Lösungsmittelkontrolle (Abb. 11A) ab. Da eine Konzentrationssteigerung keine weitere Erhöhung der ChTL-Aktivität hervorrief, ließ sich Simvastatin in dieser Versuchsreihe auch nicht als Aktivator der ChTL-Proteasomaktivität identifizieren (P=0,08).

Ähnliche Resultate ergaben sich aus Untersuchungen der caspase-ähnlichen Aktivität (Abb. 11B). Die Aktivität lag bei 109,9 % ± 8,3 nach Gabe von 1 µM, bei 108,7 % ± 8,9 nach einer Dosis von 5 µM und bei einer Endkonzentration von 10 µM bei 103,1 % ± 5,7. Im Durchschnitt lagen die Aktivitätswerte der CaspL auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle (P=0,303). Simvastatin hatte keinen Einfluss auf diese proteasomale Aktivität.

Auch die trypsin-ähnliche Aktivität des Proteasoms lag nach einer geringen Dosis von 1 µM mit 111,6 % ± 10,6 geringfügig über der Aktivität der Kontrolle. Mit zunehmender Dosis an Simvastatin verringerte sich die Aktivität auf das Aktivitätsniveau der Kontrollzellen (P=0,636). Auch anhand dieser Resultate wird deutlich, dass Simvastatin keinen direkten Einfluss auf die trypsin-ähnliche Aktivität hatte (Abb. 11C).

Zum direkten Vergleich sollten den Resultaten einer Statinbehandlung die Ergebnisse einer Behandlung mit dem bekannten irreversiblen Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin gegenübergestellt werden. Eine kurzzeitige Behandlung mit Lactacystin führte zu einer effektiven Hemmung der Proteasomaktivität. Wie erwartet war die ChTL-Aktivität mit einer Restaktivität von 4,2 % ± 0,8 (P<0,001) am stärksten gehemmt. Die anderen beiden Aktivitäten, die CaspL und die TL, hatten jeweils eine höhere Restaktivität. Die CaspL-Aktivität sank auf 57,3 % ± 2,9 (P=0,002). Die TL-Aktivität war bis auf eine relative Aktivität von 28,3 % ± 1,4 (P<0,001) gehemmt.


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Abb. 11: Proteasomaktivität der CPAE-Zellen nach einer 6-Stunden-Inkubation mit Simvastatin (Prodrug) und 10 µM β-clasto Lactacystin. Im Gegensatz zum bekannten Proteasomhemmer Lactacystin konnte durch Simvastatin das Proteasom nicht gehemmt werden. Simvastatin hatte in der kurzzeitigen Behandlung keinen Einfluss auf das Proteasom dieser Endothelzelllinie. Die Proteasomaktivität war nicht signifikant verändert.


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4.2.1.1.2  Atorvastatin

Abb. 12: Dosis-Wirkungskurve einer 6-stündigen Inkubation der CPAE-Zellen mit Atorvastatin. Atorvastatin verursachte eine leichte Hemmung der TL-Aktivität. Die anderen beiden proteasomalen Untereinheiten wurden nicht signifikant verändert. Die Aktivität der ChTL und der CaspL wurden durch Atorvastatin nicht signifikant beeinflusst. Die Aktivität lag auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle.

Nach einer 6-stündigen Behandlung der CPAE-Zellen mit Atorvastatin konnte die TL-Aktivität konzentrationsabhängig um 20 % gehemmt werden (P=0,046). Mit 1 µM Atorvastatin sank die TL-Aktivität auf 84,9 % ± 9,9 ab. Bei der Endkonzentration von 10 µM Atorvastatin betrug die TL-Aktivität noch 80,5 % ± 9,4. Verglichen mit einer Behandlung mit 10 µM β-clasto Lactacystin (verbleibende TL-Aktivität von 28,3 % ± 1,4) war diese Inhibition gering.

Auf die beiden anderen Aktivitäten, die ChTL (P=0,178) und die CaspL (P=0,966), hatte Atorvastatin keinen Einfluss. 1 µM Atorvastatin beeinträchtigte die ChTL-Aktivität sowie die caspase-ähnliche Aktivität nicht. Die gemessenen Aktivitäten lagen bei 95,2 % ± 4,1 für ChTL und bei 96,7 % ± 7,2 für die CaspL-Aktivität. Eine Steigerung der Konzentration auf 5 µM dieses CSE-Inhibitors senkte die chymotrypsin-ähnliche Aktivität auf 81,1 % ± 19,5 und die caspase-ähnliche Aktivität auf 96,3 % ± 10,7. Durch die Zugabe von 10 µM der Wirksubstanz veränderte sich die Aktivität von ChTL geringfügig auf 90,9 % ± 29,2. Die CaspL wurde bei dieser Konzentration in ihrer Aktivität nicht verändert.


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Anhand der Ergebnisse konnte hergeleitet werden, dass die 6-Stunden-Behandlung mit Atorvastatin die trypsin-ähnliche Aktivität leicht hemmte.

4.2.1.1.3 Pravastatin

Nach einer 6-stündigen Behandlung mit Pravastatin zeichneten sich keine Aktivitätsveränderungen ab. Pravastatin ist kein Inhibitor des zellulären Proteasoms.

1 µM Pravastatin hatte auf die ChTL (Abb. 13A) und die caspase-ähnlichen Aktivität (Abb. 13B) keinen Einfluss. Die Proteasomaktivität lag auf dem Niveau der DMSO-Kontrolle. Mit einer Erhöhung der Pravastatinkonzentration auf 5 µM sank die ChTL leicht auf 85,9 % ± 30,2 ab. Bei der Konzentration von 10 µM Pravastatin hatte das Proteasom eine ChTL-Aktivität von 93,0 % ± 33,3 (P=0,868). Die CaspL-Aktivität wurde durch die Gabe von höheren Dosen Pravastatin nicht beeinflusst (P=0,821). 1 µM Pravastatin verursachte bei der trypsin-ähnlichen Aktivität eine Aktivitätssenkung von 19 % auf 80,9 % ± 10,4. Bei einer Dosiserhöhung auf 5 µM blieb dieser verringerte Aktivitätszustand erhalten. Nach der Inkubation mit 10 µM Pravastatin hatte die TL eine mit der Lösungsmittelkontrolle vergleichbare Aktivität (Abb. 13C). Anhand der statischen Auswertung ließ sich ablesen, dass Pravastatin die TL nicht signifikant hemmen konnte (P=0,095).


[Seite 62↓]

Abb. 13: Proteasomaktivität der CPAE-Zellen nach einer 6-Stunden-Behandlung mit Pravastatin. Pravastatin konnte in dieser Endothelzelllinie keine Hemmung der Proteasomaktivität erzeugen. Mit steigender Konzentration an Pravastatin veränderten sich die einzelnen proteolytischen Einheiten nicht signifikant. Pravastatin hatte somit keinen direkten Effekt auf die Proteasomaktivität.


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4.2.1.1.4  Einfluss von Mevalonsäure in Kombination mit Statinen auf die Proteasomaktivität

In der Arbeit von Rao et al. konnte gezeigt werden, dass Mevalonat die hemmenden Effekte der CSE-Inhibitoren auf das Proteasom aufhob. Diese Untersuchungsergebnisse wurden so erklärt, dass Mevalonat die Proteasomaktivität induziert [Rao 1999].

Tab. 5: Tabellarisch dargestellt ist die Proteasomaktivität der CPAE-Zellen nach einer 6-stündigen Behandlung mit 10 µM Statin und 400 µM Mevalonsäure. Die Proteasomaktivität wurde der Aktivität nach alleiniger Inkubation mit 10 µM Statin gegenübergestellt. Alle Aktivitätswerte wurden bezüglich der Lösungsmittelkontrolle ausgewertet. Die Aktivität lag vergleichbar auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Die gleichzeitige Gabe von Mevalonsäure blieb ohne Einfluss auf die Proteasomaktivität.

  

Lösungsmittel

10 µM Statin

  

 

 

plus 400 µM Mevalonat

Simvastatin (Prodrug)

ChTL

100 %

110,6 % ± 9,7

81,0 % ±27,5

CaspL

103,1 % ± 5,7

86,4 % ± 20,3

TL

105,1 % ± 17,9

95,3 % ± 8,7

Atorvastatin

ChTL

100 %

90,9 % ± 29,0

95,5 % ± 4,8

CaspL

96,2 % ± 17,0

95,4 % ± 4,0

TL

80,5 % ± 7,0

96,1 % ± 8,7

Pravastatin

ChTL

100 %

93,0 % ± 33,0

90,8 % ± 20,3

CaspL

103,6 % ± 10,0

93,0 % ± 14,9

TL

99,0 % ± 14,8

95,4 % ± 2,9


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Die verringerte TL-Aktivität nach Atorvastatinbehandlung lag nach Mevalonsäuregabe wieder auf dem Niveau der Kontrolle. Bei der simultanen Gabe zu Simvastatin (Prodrug) wurde eine geringere proteasomale Aktivität im Vergleich zu einer alleinigen Simvastatinbehandlung gemessen. Die Zugabe von Mevalonsäure zu Pravastatin führte zu keiner Veränderung der proteasomalen Aktivität.

Somit konnten in den eigenen Experimenten keine modulatorischen Effekte bei einer simultanen Gabe von 400 µM Mevalonat zu 10 µM Statin beobachtet werden. Alle 3 proteolytisch aktiven Zentren blieben unbeeinflusst.

In den CPAE-Zellen konnten die pleiotropen Veränderungen einer effektiven Statinbehandlung durch die Zugabe von 400 µM Mevalonsäure aufgehoben werden. Diese Resultate ließen sich nicht auf die Aktivitätssteigerung des Proteasoms nach Mevalonatgabe zurückführen. Effekte, die die proteasomale Aktivität modulieren, konnten diese Wirkung von Mevalonat auf die Strukturveränderungen durch Statine nicht erklären.

4.2.1.2 EA.hy926-Zellen: Ergebnisse einer Statinbehandlung über 6 Stunden

Bei der humanen Endothelzelllinie EA.hy926 zeichneten sich ähnliche Ergebnisse ab, die bereits ausführlich anhand der CPAE-Zellen beschrieben wurden. Die gemessene proteasomale Aktivität nach Statingabe lag im Durchschnitt auf dem Niveau der Kontrolle.

Die Inkubation mit Simvastatin (Prodrug) ergab keine signifikanten Veränderungen der proteasomalen Aktivität. Die Aktivität aller proteolytischen Einheiten blieb mit 100 % ± 10 auf dem Niveau der Kontrolle. Dieselben Resultate wurden nach einer Behandlung der Zellen mit Atorvastatin erzielt. Auch Pravastatin hatte keinen Einfluss auf das zelluläre Proteasom der EA.hy926-Zellen.

Durch die Behandlung mit 1 µM Pravastatin wurde die ChTL auf 78,7 % ± 16,7 verringert. Mit der Konzentration von 5 µM wurde keine weitere Aktivitätsminderung erzielt. Nach einer weiteren Erhöhung auf 10 µM Pravastatin nahm die ChTL-Aktivität wieder zu und ging auf das Niveau der Kontrolle zurück (P=0,783). Die Aktivität der CaspL-Einheit blieb unverändert auf dem Niveau der Kontrolle (P=0,912). 1 µM dieses Statins erhöhte die TL-Aktivität um 13 % auf [Seite 65↓]113,2 % ± 28,6. Mit 10 µM Pravastatin hatte die TL eine Aktivität von 118 % ± 32,5 (P=0,400). Aufgrund der statischen Auswertung konnten die gemessenen Aktivitätsänderungen der TL nicht als proteasommodulatorische Effekte interpretiert werden.

Abb. 14: Dosis-Wirkungskurve einer 6-Stunden-Behandlung der EA.hy926-Zellen mit Pravastatin. Am Beispiel von Pravastatin sollten die Effekte der Statinbehandlung graphisch dargestellt werden. Bei der Behandlung dieser humanen Endothelzelllinie zeigten sich keine signifikanten konzentrationsabhängigen Veränderungen der Proteasomaktivität. Die Statine hatte keinen Einfluss auf die proteolytische Funktion des Proteasoms der EA.hy926-Zellen.

Im Vergleich zu dem bekannten Proteasominhibitor Lactacystin konnten die Statine die Aktivität des Proteasoms nicht hemmen. Nach einer 6-Stunden-Behandlung mit Lactacystin lag die ChTL bei 13,6 % ± 0,1 (P<0,001), die CaspL bei 84,3 % ± 5,4 (P=0,054) und die TL bei 51,3 % ± 8,8 (P=0,016).

Die Zugabe von 400 µM Mevalonsäure zu 10 µM Statin zeigte keinen Unterschied in den Untersuchungen der EA.hy926-Zellen zu den bereits beschriebenen Effekten in den CPAE-Zellen.


[Seite 66↓]

4.2.1.3  CPAE-Zellen: Ergebnisse einer Statinbehandlung über 24 Stunden

4.2.1.3.1 Simvastatin (Prodrug)

Tab. 6: Proteasomaktivität nach einer 24-Stunden-Behandlung der CPAE-Zellen mit Simvastatin (Prodrug) und β-clasto Lactacystin. Durch die Gabe von Simvastatin konnte im Gegensatz zu Lactacystin keine signifikante Hemmung der Proteasomaktivität erzeugt werden. Die Inkubation mit Simvastatin (Prodrug) blieb ohne direkten Effekt auf die proteasomale Aktivität dieser Endothelzellen.

 

 

Simvastatin

Lactacystin

 

Kontrolle

1 µM

5 µM

10 µM

10 µM

ChTL

100 %

90,6 % ± 21,2

80,7 % ± 6,0

66,4 % ±2,7

29,0 % ± 0,9

CaspL

99,0 % ± 11,9

99,8 % ± 10,8

93,0 % ± 11,7

96,0 % ± 4,6

TL

95,6 % ± 16,0

108,2 % ± 18,4

97,9 % ± 6,8

64,5 % ± 4,1

Die 24-Stunden-Behandlung der CPAE-Zellen mit Simvastatin (Prodrug) konnte die ChTL-Aktivität scheinbar konzentrationsabhängig verändern. 1 µM Simvastatin brachte noch keine Veränderungen. Durch 5 µM sank die ChTL-Aktivität in Bezug auf die Lösungsmittelkontrolle um 20 % auf einen Aktivitätswert von 80 %. Eine Erhöhung der Simvastatindosis auf 10 µM führte zu einer weiteren Abnahme dieser proteolytischen Einheit des Proteasoms. Die behandelten Zellen noch eine ChTL-Aktivität von 66 %. In der statistischen Auswertung zeigte sich jedoch, dass diese Aktivitätsminderung der ChTL nicht als signifikant zu bewerten war (P=0,089). Somit hatte Simvastatin (Prodrug) keinen Einfluss auf die ChTL-Aktivität.

Im Vergleich dazu zeigte sich mit dem bekannten Lactacystin nach einer 24-stündigen Behandlung wie erwartet ein stark inhibitorischer Effekt (P<0,001).

Die beiden anderen proteolytischen Einheiten wurden durch die 24-Stunden-Inkubation mit Simvastatin in ihrem Aktivitätszustand nicht verändert. Hier blieb in allen Konzentrationen die Aktivität im Bereich der Lösungsmittelkontrolle (CaspL (P=0,802) und die TL (P=0,785)). B-clasto Lactacystin, der bekannte Proteasominhibitor, zeigte im Vergleich zu dem CSE-Hemmer eine echte Inhibition sowohl der ChTL- (P<0,001) wie auch der TL-Aktivität (P=0,007). Eine [Seite 67↓]Hemmung der CaspL-Aktivität war nach einer 24-Stunden-Behandlung der CPAE-Zellen mit Lactacystin nicht zu messen (P=0,339). Die Aktivität lag auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle.

Simvastatin (Prodrug) hatte auch nach einer Langzeitbehandlung keinen Effekt auf die Funktion des Proteasoms in den CPAE-Zellen.

4.2.1.3.2 Atorvastatin

Abb. 15: Dosis-Wirkungskurve der CPAE-Zellen nach der Inkubation mit Atorvastatin über 24 Stunden. Die Aktivität des zellulären Proteasoms war durch die Gabe verschiedener Konzentrationen Atorvastatin kaum verändert. Mit 1 µM Atorvastatin konnte ein leichtes Absinken der proteolytischen Aktivität gemessen werden. Mit der Steigerung der Dosis setzte sich dieser Effekt nicht fort. Atorvastatin konnte in der Langzeitbehandlung das Proteasom nicht signifikant hemmen.

Aus den Messungen ging hervor, dass die ChTL, mit steigender Dosis nicht effektiv verringert werden konnte (P=0,486). Es zeigte sich zwar, dass mit einer Endkonzentration von 10 µM Atorvastatin die Aktivität dieser Einheit um 18,4 % auf 81,6 % ± 8,6 vermindert war. Dieser Effekt konnte in der statistischen Auswertung nicht als signifikant erkannt werden. Die caspase-ähnliche Aktivität hatte bei einer Konzentration von 1 µM dieses HMG-CoA-Reduktase-Hemmers nur eine Aktivität von 73,3 % ± 18,5. Mit einer Steigerung der Atorvastatindosis nahm [Seite 68↓]die Aktivität jedoch nicht weiter ab. Im Gegenteil, die Aktivität stieg auf Werte an, die mit der Kontrolle vergleichbar waren (P=0,340). Die TL-Aktivität wurde durch die Behandlung nicht beeinflusst (P=0,355).

Eine 24-stündige Behandlung mit Atorvastatin zeigte keine Wirkung auf die Proteasomaktivität der CPAE-Zellen. Im Vergleich zu einer 6-stündigen Inkubation konnte die TL-Aktivität durch diese Substanz nicht verringert werden. Atorvastatin war in dieser Versuchsreihe nicht als TL-Inhibitor zu identifizieren.

4.2.1.3.3 Pravastatin

Abb. 16: Aktivitätsgraph der TL nach einer 24-Stunden-Inkubation der CPAE-Zellen mit Pravastatin. 1 µM Pravastatin hatte keine Wirkung auf die Proteasomaktivität. Durch die Konzentration von 5 µM Pravastatin konnte die TL-Aktivität leicht gehemmt werden. Mit 10 µM Pravastatin ging die TL-Aktivität wieder auf das Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Pravastatin hatte keinen konzentrationsabhängigen signifikanten Einfluss auf die Proteasomaktivität.

Die 24-Stunden-Behandlung mit Pravastatin hatte einen geringen Effekt auf die Aktivität des Proteasoms. Ausschließlich die Dosis von 5 µM Pravastatin konnte die proteolytische TL-Aktivität leicht um 25,2 % ± 2,6 inhibieren (P=0,046). Die Gabe von 1 µM und 10 µM Pravastatin konnten keine Hemmung der TL erzeugen. Somit konnte Pravastatin die TL-Aktivität nicht hemmen (Abb. 16). Ähnliche Ergebnisse zeichneten sich auch bei der Messung [Seite 69↓]der beiden anderen proteolytischen Untereinheiten ab. Die chymotrypsin-ähnliche Einheit wurde durch das Einwirken von Pravastatin leicht beeinflusst. 10 µM Pravastatin verringerten die Aktivität auf 87,7 % ± 17,9 bezüglich der Kontrolle. Diese kontinuierlich sinkende Aktivität konnte nicht als hemmender Effekt betrachtet werden (P=0,768). Die CaspL-Aktivität wurde durch die Gabe von Pravastatin nicht berührt. Es zeigten sich Aktivitätswerte, die mit der Lösungsmittelkontrolle vergleichbar waren (P=0,800). Die Ergebnisse machten deutlich, dass Pravastatin nach der Inkubation über 24 Stunden keine Wirkung auf das Proteasom der CPAE-Zellen hatte.

4.2.1.3.4 Einfluss einer simultanen Gabe von Mevalonsäure auf die Proteasomaktivität

Die simultane Gabe von 400 µM Mevalonat zu 10 µM Statin hatte keinen aktivierenden Effekt auf die proteasomale Aktivität. Mevalonsäure konnte in diesem Versuchsansatz nicht als Modulator der Proteasomaktivität identifiziert werden.

In Bezug auf die Lösungsmittelkontrolle wurde die proteasomale Aktivität durch die gleichzeitige Gabe von Mevalonat und Statin nicht verändert. Alle 3 proteolytischen Untereinheiten hielten sich auf dem Aktivitätsniveau der Kontrollzellen. Auch der Vergleich der unterschiedlichen Statine zeigte keine Differenzen.

Summa summarum konnte mit diesen Versuchen gezeigt werden, dass die zellulären Veränderungen nach einer simultanen Mevalonatgabe nicht aus einer Modulation der Proteasomaktivität resultierten. Die Aktivierung oder die Wiederherstellung der proteasomalen Aktivität konnte nicht die Ursache der Aufhebung der pleiotropen Wirkung der Statine durch Mevalonsäure sein.


[Seite 70↓]

Tab. 7: Diese Tabelle gibt einen Überblick über die Proteasomaktivität der CPAE-Zellen nach einer 24-stündigen Inkubation mit der gleichzeitigen Gabe von 400 µM Mevalonat und 10 µM Statin sowie der alleinigen 10 µM Statinbehandlung. Bezüglich der alleinigen Statinbehandlung zeichneten sich keine Veränderungen ab. Die simultane Mevalonsäuregabe hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität.

  

Lösungsmittel

10 µM Statin

  

 

 

plus 400 µM Mevalonsäure

Simvastatin

ChTL

100 %

66,4 % ± 2,7

98,8 % ± 25,5

CaspL

93,1 % ± 11,7

98,3 % ± 11,6

TL

97,9 % ± 6,7

97,6 % ± 5,8

Atorvastatin

ChTL

100 %

81,6 % ± 8,6

107,6 % ± 10,6

CaspL

89,6 % ± 27,0

111,7 % ± 8,0

TL

102,0 % ± 12,6

105,1 % ± 4,2

Pravastatin

ChTL

100 %

87,7 % ± 17,9

97,9 % ± 3,0

CaspL

99,1 % ± 9,4

94,9 % ± 1,7

TL

97,2 % ± 14,3

94,0 % ± 4,0


[Seite 71↓]

4.2.1.4  EA.hy926-Zellen: Ergebnisse einer Statinbehandlung nach 24 Stunden

Abb. 17: Dosis-Wirkungskurve einer 24-Stunden-Inkubation der EA.hy926-Zellen mit Simvastatin (Prodrug). Am Beispiel von Simvastatin sollten die Effekte der Statinwirkung auf die humane Endothelzelllinie dargestellt werden. Die Statine verursachten keine signifikante Aktivitätsänderung des Proteasoms. Alle 3 proteolytischen Zentren hatten eine Aktivität, die mit der Aktivität der Kontrollzellen vergleichbar war.

Simvastatin (Prodrug) hatte keinen Einfluss auf den Funktionszustand des Proteasoms der EA.hy926-Zellen. Die Aktivität der einzelnen Proteolyseeinheiten blieb auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle. Die Untersuchungen mit Atorvastatin zeigten ein vergleichbares Bild. Die Konzentration von 5 µM Atorvastatin verringerte die ChTL-Aktivität auf 84,4 % ± 17,5. Die Dosis von 10 µM Atorvastatin setze diese Aktivitätsänderung nicht fort, sondern kehrte sie wieder um. Es war eine ChTL-Aktivität von 104,5 % ± 11,3 zu messen (P=0,331). Die beiden anderen Proteolysezentren wurden in ihrer Aktivität nicht verändert. Die Aktivität blieb auf dem Niveau der Kontrolle. Atorvastatin konnte die proteasomale Funktion nicht hemmen. Pravastatin hatte ebenso keinen Effekt auf Aktivität des Proteasoms. Durch 1 µM Pravastatin sank die gemessene ChTL-Aktivität auf 84,6 % ± 12,9 bezüglich der Kontrolle. Mit der Dosissteigerung auf 10 µM hatte das Proteasom eine Aktivität von 79,7 % ± 3,0. In der statischen Auswertung konnte Pravastatin nicht als Inhibitor der ChTL erkannt werden (P=0,275). Die CaspL-Aktivität (P=0,984) und die TL-Aktivität (P=0,616) wurden ebenfalls nicht verändert.


[Seite 72↓]

Im Vergleich dazu konnten 10 µM des bekannten Proteasominhibitors Lactacystin die ChTL nach 24 Stunden um 30 % verringern (P=0,083). Die Untersuchung der caspase-ähnlichen Aktivität zeigte einen Funktionsanstieg auf 128,8 % (P=0,192). Die Aktivität des trypsin-ähnlichen Zentrums lag bei 92,7 % (P=0,502). Nach dieser Zeit konnte keine signifikante Hemmung des Proteasoms mit dem bekannten Proteasominhibitors gemessen werden. Möglicherweise lag der Fehler in der Behandlung der EA.hy926-Zellen.

Die gleichzeitige Zugabe von 400 µM Mevalonsäure zu den Statinen hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität. Somit zeigte sich auch nach einer 24-stündigen Inkubation kein direkt modulatorischer Effekt der Mevalonsäure auf das Zellproteasom.

4.2.1.5 VSMC: Ergebnisse einer Statinbehandlung nach 24 Stunden

Abb. 18: Darstellung der ChTL-Aktivität der VSMC-Zellen nach der 24-stündigen Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen Atorvastatin im Vergleich zu 10 µM β-clasto Lactacystin. Durch Atorvastatin konnte diese proteasomale Aktivität leicht gehemmt werden. Die Konzentration von 1 µM Atorvastatin war noch nicht effektiv. Erst ab einer Konzentration von 5 µM wurde eine leichte Hemmung der ChTL deutlich.

In den glatten Muskelzellen verursachte die Gabe von Atorvastatin eine leichte Hemmung der [Seite 73↓]ChTL-Aktivität (Abb. 18). Mit der Dosis von 5 µM Atorvastatin konnte eine Abnahme der proteasomalen ChTL-Aktivität auf 83,2 % ± 7,3 erzeugt werden. 10 µM Atorvastatin verringerten die Aktivität nicht weiter, so dass die ChTL-Aktivität insgesamt um 14,4 % ± 3,3 inhibiert war (P=0,019). Im Vergleich zu β-clasto Lactacystin fiel die Hemmung der proteasomalen Untereinheit nach Atorvastatingabe deutlich geringer aus. Nach 10 µM Lactacystin betrug die ChTL-Aktivität nur noch 71,5 % ± 15,1. Atorvastatin hatte keinen Effekt auf die CaspL-Aktivität und die TL-Aktivität. Die Aktivität blieb auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle.

Die Gabe von Simvastatin (Prodrug) hatte keinen Einfluss auf den Funktionszustand des Proteasoms. Die Aktivität lag bei allen 3 proteolytischen Einheiten auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle um 100 % ± 13.

1 µM und 5 µM Pravastatin führten zu einem leichten Absinken der ChTL und der TL. Die CaspL-Aktivität blieb völlig unverändert. 10 µM Pravastatin senkte die Aktivität aller 3 Proteolyseeinheiten auf etwa 70 %. Anhand der statistische Analyse konnte dieses Absinken jedoch nicht als signifikant gesehen werden (ChTL (P=0,476), CaspL (P=0,343) und TL (P=0,162)). Die Behandlung mit Pravastatin war ebenfalls ohne Wirkung auf die Proteasomaktivität.

Mevalonat modulierte auch in den VSMCs die Proteasomaktivität nicht. Die Aktivität des Proteasoms lag auf dem Niveau der Lösungsmittelkontolle.

4.2.2 Zusammenfassung der Ergebnisse der Statinbehandlung

Bei der Auswertung der Ergebnisse der Statinbehandlung konnten nur punktuell Veränderungen der proteasomalen Aktivität gefunden werden. Lediglich die Gabe von Atorvastatin führte zu einer geringen Senkung der TL-Aktivität in den CPAE-Zellen nach 6-Stunden-Inkubation und der ChTL-Aktivität in den glatten Muskelzellen nach einer 24-Stunden-Behandlung. Die durch Atorvastatin erzeugte Hemmung fiel im Vergleich zu dem bekannten Proteasomhemmer Lactacystin deutlich geringer aus. Nach der Atorvastatinbehandlung hatten die Zellen noch eine Restaktivität von etwa 80 %. Weitere Effekte konnten durch Atorvastatin nicht erzeugt werden. [Seite 74↓]Die Behandlung mit Simvastatin (Prodrug) und Pravastatin hatte keinen Einfluss auf den Aktivitätszustand des Proteasoms. Die in diesen Versuchen gemessenen Veränderungen waren nicht signifikant.

Die Behandlung vaskulärer Zelllinien mit den in der cholesterolsenkenden Therapie effektiv eingesetzten Statinen brachte nur vereinzelt eine Verringerung der proteasomalen Aktivität hervor. Somit konnten die phänotypischen Erscheinungen einer Statinbehandlung nicht auf eine Hemmung der proteasomalen Aktivität zurückgeführt werden. Des Weiteren verdeutlichten diese Ergebnisse, dass Statine in diesen moderaten Konzentrationen nicht als echte Hemmer des Proteasoms betrachtet werden konnten.

Die simultane Gabe von Mevalonsäure modulierte nicht die Proteasomaktivität. Somit ließen sich die mikroskopisch beobachteten Strukturveränderungen nicht auf proteasommodulatorische Effekte zurückführen.

4.2.3 Die Wirkung von Mevalonsäure auf das Proteasom der Zelle

Die zu untersuchenden Zelllinien wurden mit sehr hohen Konzentrationen dieses Zwischenproduktes des Cholesterolstoffwechsels behandelt. Es wurden Dosen zwischen 400 µM und 5 mM über eine Dauer von jeweils 24 und 48 Stunden verabreicht. Ziel dieser Versuche war, die These aufzugreifen, dass Mevalonat ein Aktivator der proteasomalen Aktivität sei [Rao 1999]. Die Resultate zeigten, dass Mevalonat in diesem Versuchsaufbau nicht als Aktivator der Proteasomaktivität zu werten war. Die proteasomale Aktivität blieb auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Auch in den sehr hohen Konzentrationen blieb die Aktivität des Proteasoms bei 100 % ± 10. Daher ließen sich keine konzentrationsabhängigen Veränderungen nachweisen. Dieselben Ergebnisse ergaben sich auch bei einer 24-stündigen Behandlung mit dieser Substanz. Die Untersuchung der anderen Zelllinien brachte identische Ergebnisse hervor. Es konnte kein aktivitätssteigernder Einfluss beobachtet werden.


[Seite 75↓]

Abb. 19: Dosis-Wirkungskurve nach der 48-Stunden-Behandlung der CPAE-Zellen mit Mevalonsäure. Die Aktivität aller 3 proteolytischen Untereinheiten lag auf dem Niveau der Kontrollzellen (ChTL (P=0,960), CaspL (P=0,853) und TL (P=0,484)). Mevalonsäure blieb ohne Wirkung auf den proteasomalen Funktionszustand. Aus diesen Ergebnissen heraus konnte Mevalonat nicht als Aktivator des Proteasoms identifiziert werden.

Schlussfolgernd aus diesen Ergebnissen lässt sich sagen, dass Mevalonat keinen modulatorischen Effekt auf das Proteasom hatte. Dieses Ergebnis deckte sich auch mit den Beobachtungen des Phänotyps.


[Seite 76↓]

4.3  Das isolierte 20S Proteasom - Wirkung von der Statine und Mevalonsäure

Mit den Untersuchungen an isolierten 20S Proteasomen sollten direkte Effekte der HMG-CoA-Reduktase-Inhibtitoren und der Mevalonsäure auf die proteolytische Aktivität dieses Partikels dargelegt werden. Da in diesem Versuchsaufbau keinerlei zelluläre Elemente eine Rolle spielten, war es möglich, die sehr hohe Konzentration von 100 µM Statin zu verwenden. Es sollte gewährleistet werden, dass eine ausreichend hohe Konzentration der zu untersuchenden Substanzen im Reaktionsansatz war, um auch einen geringen Einfluss zu erkennen. Weiterhin fielen die verschiedenen zellulären Signalwege weg, so dass die Voraussetzung geschaffen war, direkte Effekte auf das Proteasom nachweisen zu können. Für die Messungen mit Mevalonsäure wurden dieselben Konzentrationen verwendet wie bei der zellulären Behandlung. Die isolierten 20S Partikel wurden in Anlehnung an die Arbeit von Wojcik über einen Zeitraum von 2,5 Stunden mit den Substanzen inkubiert [Wojcik 2000]. Der bekannte Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin wurde als Positivkontrolle verwendet.

4.3.1 Effekte von 100 µM HMG-CoA-Reduktase-Hemmer auf 20S Proteasomen

Aus der Abbildung 20A geht hervor, dass die ChTL-Aktivität des Proteasoms durch die Statine sehr leicht erhöht und nicht gehemmt wurde. Die Behandlung mit Simvastatin (Prodrug) zeigte einen sehr geringen Effekt. Die Aktivität konnte, bezogen auf die Lösungsmittelkontrolle, auf 107,1 % ± 0,6 gesteigert werden (P=0,04). Nach der Behandlung mit 100 µM Atorvastatin lag die Aktivität bei 117,1 % ± 2,9 (P=0,014). Pravastatin erhöhte die Aktivität des isolierten 20S Proteasoms auf 116,9 % ± 3,5 (P=0,021). Im Vergleich dazu war die ChTL-Aktivität des Proteasoms nach einer Behandlung mit β-clasto Lactacystin fast vollständig gehemmt.

Auf die caspase-ähnliche Aktivität hatten die Statine keinen Einfluss. Die Aktivität lag nach 100 µM Simvastatin (Prodrug), 100 µM Atorvastatin und 100 µM Pravastatin vergleichbar auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle. Durch Lactacystin wurde die CaspL-Aktivität erwartungsgemäß signifikant gehemmt. Auch hier wurde deutlich, dass die Statine das proteasomale Proteolysesystem nicht im Sinne von β-clasto Lactacystin inhibierten (Abb. 20B).


[Seite 77↓]

Abb. 20: Proteasomaktivität des hoch gereinigten 20S Proteasoms nach einer 2,5-Stunden-Behandlung mit 100 µM der verschiedenen CSE-Hemmer und 10 µM β-clasto Lactacystin. Durch die Behandlung mit den verschiedenen Statinen konnte die ChTL-Aktivität leicht bis 15 % erhöht werden. Auf die anderen proteolytischen Einheiten des Proteasoms hatten die Statine keinen Einfluss. Im Vergleich dazu war die Proteasomaktivität nach Lactacystinbehandlung fast vollständig gehemmt.


[Seite 78↓]

Die Resultate der TL-Aktivitätsmessung zeigten ein vergleichbares Bild zu den bereits dargelegten Ergebnissen der CaspL-Aktivität. 100 µM Statin hatten keinen Einfluss auf die TL-Aktivität des isolierten Proteasoms. Die Aktivität lag nach Behandlung mit den 3 CSE-Hemmern unverändert auf dem Niveau der Kontrolle. Auch hier zeigte sich wie erwartet β-clasto Lactacystin als starker Inhibitor der trypsin-ähnlichen Aktivität. So konnte diese proteolytische Einheit durch das Einwirken der Statine im Vergleich zu dem irreversiblen Proteasominhibitor nicht gehemmt werden (Abb. 20C).

Bei den Versuchen am isolierten 20S Proteasom führte die Behandlung mit den Statinen nicht zu einer Hemmung der Proteasomfunktion. Die ChTL-Aktivität wurde durch die Statine leicht erhöht. Da diese Aktivierung mit einer sehr hohen Dosis erreicht wurde, kann davon ausgegangen werden, dass moderate Konzentrationen keinen Einfluss auf die proteasomale Aktivität haben würden. Dabei spielte die unterschiedliche Laktonringform der Statine keine Rolle. Anhand dieser Resultate konnte gezeigt werden, dass die proteasomale Aktivität durch die Statine nicht direkt moduliert wird.

4.3.2 Effekte der Inkubation mit Mevalonsäure

Abb. 21: Dosis-Wirkungskurve einer 2,5-stündigen Inkubation der isolierten 20S Proteasomen mit verschiedenen Konzentrationen Mevalonat. Alle drei proteolytischen Einheiten blieben durch die Behandlung unverändert. Die Aktivität lag auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Es erfolgte keine Modulation der Proteasomaktivität durch die Behandlung mit Mevalonsäure.


[Seite 79↓]

Aus den Ergebnissen einer 2,5-stündigen Behandlung der isolierten 20S Partikel mit Mevalonat ließ sich kein proteasommodulatorischer Effekt ablesen (Abb. 21). Nach der Behandlung mit den zu testenden Konzentrationen Mevalonat lag die Proteasomaktivität auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Die ChTL pegelte sich auf dem Niveau von 100 % ± 8 ein (P=0,104). Die CaspL-Aktivität lag nach den verschiedenen Dosen an Mevalonat bei etwa 100 % ± 7 (P=0,061). Die TL-Aktivität verhielt sich ähnlich wie die beiden anderen beschriebenen Proteasomaktivitäten. Auffallend war, dass bei der Dosis von 5 mM ein leichtes Absinken der TL-Aktivität auf 85,6 % ± 1,9 zu erkennen war. Dieses Absinken der Aktivität konnte jedoch nicht als eine Hemmung betrachtet werden (P=0,251). Somit blieb die proteasomale Aktivität durch die Einwirkung von Mevalonat unberührt.

Das Zwischenprodukt des Cholesterolstoffwechsels Mevalonsäure hatte keinen modulierenden Einfluss auf den Funktionszustand des isolierten 20S Proteasoms.

4.4 Zusammenfassung der Ergebnisse

Mit den verschiedenen CSE-Hemmern wurde in den Cholesterolstoffwechsel der untersuchten Zellen eingegriffen. Dies führte zu strukturellen Zellveränderungen, Veränderungen im Wachstumsverhalten und einer veränderten Viabilität der Zellen. Mit steigender Konzentration der Statine wurden die Zellen länglich, rundeten sich ab und lösten sich von der Unterlage ab. In Konzentrationen über 10 µM wurden die vaskulären Zellen zytotoxisch verändert und die Nettowachstumsrate sank.

Atorvastatin konnte im zellulären System ein leichtes Absinken der ChTL (CPAE-Zellen - endotheliale Zelllinie) und der TL (VSMCs) erzeugen. Ansonsten hatten die Statine in diesem Versuchsaufbau keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität.

In den Versuchen mit isolierten 20S Proteasomen konnten 100 µM Statin die ChTL-Aktivität leicht erhöhen. Die anderen Aktivitäten wurden nicht beeinflusst. Anhand dieser Resultate zeigte sich, dass die CSE-Hemmer keinen direkten Einfluss auf das Proteasom hatten.

Die Statine waren weder als Inhibitoren noch als Aktivatoren des Proteasoms zu erkennen. Auch bestanden keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Laktonringformen. Aus den [Seite 80↓]dargelegten Ergebnissen konnte herausgestellt werden, dass die strukturellen Effekte mit der Proteasomaktivität nicht korrelierten.

Mevalonsäure hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität.

Die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren und die Mevalonsäure sind keine Modulatoren der proteasomalen Aktivität.


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25.11.2005