Statine werden in der Therapie von Hypercholesterolämie sehr effektiv eingesetzt. Durch ihren Eingriff in den Cholesterolstoffwechsel über eine Hemmung der HMG-CoA-Reduktase wird die Bildung des Cholesterols verhindert. Aus therapeutischer Sicht wirken sie sich auf diese Weise sehr günstig auf atherosklerotische Veränderungen aus.
In zahlreichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass β-clasto Lactacystin, ein bekannter Proteasominhibitor, und die CSE-Hemmer gemeinsame biologische Wirkungen aufweisen. Weiterhin ließ sich eine strukturelle Ähnlichkeit, in Form des β-Laktonrings, zwischen den Statinen und β-clasto Lactacystin erkennen [Rao 1999]. Aufgrund dieser Parallelitäten wurde vermutet, dass die Statine ihre Wirkung zum Teil über eine Hemmung des Proteasoms entfalten.
In Zellkulturexperimenten wurden die Effekte von Simvastatin (Prodrug), Atorvastatin, Pravastatin und dem Proteasomhemmer Lactacystin auf zwei Endothelzelllinien (CPAE und Ea.hy926) und primäre vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) bezüglich ihres Verhaltens auf die Morphologie, die Proliferation, die Viabilität und die Proteasomaktivität untersucht. Sowohl die Statine als auch Lactacystin induzierten vergleichbare morphologische Veränderungen und beeinflussten die Proliferation von CPAE-Zellen. In den eigenen Versuchen konnten die durch Statine induzierten Effekte durch Mevalonat revertiert werden. Die durch Lactacystin verursachten Veränderungen wurden durch Mevalonsäure nicht beeinflusst. Wie erwartet hemmte Lactacystin in den untersuchten CPAE-Zellen signifikant die proteasomale Aktivität. Im Gegensatz dazu blieb die Proteasomaktivität nach einer Statinbehandlung unbeeinflusst. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in den Ea.hy926 und den VSMCs deutlich. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sogar hohe Dosen der Statine die Aktivität der gereinigten 20S Proteasomen nicht modulieren.
Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass die ähnlichen biologischen Effekte der Statine und des Lactacystins nicht über einen gemeinsamen Mechanismus der Proteasominhibition funktionieren.
Die Statine spielen bei der Regulation des Cholesterolstoffwechsels eine entscheidende Rolle. Diese Substanzen können sehr erfolgreich in der Therapie atherosklerotischer Erkrankungen
Statins are utilised very efficient in the treatment of hypercholesterolemia. By their direct intervention in the metabolism of cholesterol via an inhibition of HMG-CoA-reductase a formation of cholesterol is prevented. Thus these substances have a beneficial effect on atherosclerotic changes.
In a lot of studies β-clasto lactacystin, a well known inhibitor of the proteasome, and statins were shown to have common biological effects. The statins and β-clasto lactacystin have a similarity in structure in form of a β-lactone ring. Because of these parallelisms it was assumed that statins deploy their effects partly though inhibition of the proteasome.
The effect of simvastatin, atorvastatin and pravastatin as well as of the proteasome inhibitor β-clasto lactacystin was studied on morphology, proliferation, viability and on proteasomal activity in two mammalian endothelial cell lines (CPAE and Ea.hy926) and in primary vascular smooth muscle cells (VSMCs). Both statins and lactacystin induced comparable morphological changes and attenuated proliferation of CPAE. Whereas the statin-induced effects were reversed by mevalonic acid, however, the lactacystin-induced alterations were not influenced by mevalonic acid. As expected, lactacystin caused a significant loss of proteasomal activity measured in the extracts of treated cells. The extracts of statin-treated CPAEs exhibited unchanged activities. This result was also confirmed in Ea.hy926 cells and in primary rat VSMCs. It is shown, that even high dosis of statins do not modulate the activity of purified human 20S proteasomes.
The conclusion was that similar biological effects of statins and the well known proteasome inhibitor lactacystin in vascular cells are not caused by a common inhibitory mechanism of action on the proteasome.
Statins play an important role in the regulation of metabolism of cholesterol. These substances are used successful in the therapy of atherosclerotic lesions. However their positive features cannot be defined by modulation of proteasome activity.
Statine werden für die Pharmakotherapie der Hypercholesterolämie eingesetzt. Sie greifen durch die Hemmung der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A-(HMG–CoA)-Reduktase in den Stoffwechsel des Cholesterols ein. Dies führt zu einer Senkung der Plasmakonzentration von Cholesterol und insgesamt zu einer positiven Veränderung des Lipidprofils. Besonders das LDL, das low density lipoprotein, einer der Hauptfaktoren in der Genese atherosklerotischer Erkrankungen, wird durch vermehrten Abbau und eine Erhöhung der Syntheserate der LDL–Rezeptoren in der Leber deutlich gesenkt. Weiterhin führt eine Behandlung mit diesen Pharmaka zu einer Steigerung der HDL-Komponente (high density lipoprotein) [Forth 1996].
In primären (WOSCOPS, MIRACLE) ebenso wie in sekundären Präventionsstudien (4S, MAAS, MRFIT) konnte gezeigt werden, dass durch die Behandlung mit Statinen die Morbidität und die Mortalität signifikant abnahmen. Bei der Patientengruppe in der 4S Studie waren bereits nach einer Behandlungsdauer von 6 Wochen die Cholesterolwerte um durchschnittlich 28 % und die LDL-Werte um 38 % gesunken. Diese Therapie ging, im Vergleich zu den mit Placebo behandelten Patienten, mit einer 42 %igen Reduktion des Risikos einher, am koronaren Herztod zu versterben. Diese Zahl verdeutlichte, dass sich die Überlebenschance nach einem akuten kardiovaskulären Ereignis unter der Therapie mit Statinen verbesserte [MAAS 1994].
Die Untersuchungsergebnisse der WOSCOP–Studie wiesen darauf hin, dass mit einer durchschnittlichen Senkung der LDL–Werte um 24 % der Nutzen der Therapie, welcher bei einer 45prozentigen Reduktion des Risikos bezüglich kardiovaskulärer Ereignisse liegt, weitgehend ausgeschöpft ist. Eine weitere Senkung konnte den Erfolg der Therapie nicht wesentlich steigern. Außerdem wurde festgestellt, dass ein Therapienutzen auch unabhängig vom Basalwert des LDL sowie des HDL erzielt werden konnte. Darüber hinaus gab es eindeutige Belege dafür, dass eine frühzeitige Behandlung mit Simvastatin das Risiko senkt, dass sich der Patient einer koronaren Bypass-Operation oder einer Angioplastie (PTCA) unterziehen muss [WOSCOP 1998]. Jedoch schien diese Wirkung auf die koronare Herzerkrankung erst nach einer einjährigen Behandlungsdauer zu beginnen [4S 1994]. Die angiographisch darstellbare Progression bezüglich des Durchmessers der Stenose trat in der Simvastatingruppe weniger häufig auf. Im Gegenteil, es wurde sogar eine Regression der pathologischen Veränderungen beobachtet [MAAS 1994]. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Untersuchungen der Plaquegröße mittels MRI gesehen: Nach einer 12monatigen Therapie wurden eine signifikante Reduktion der Wanddicke sowie des Gefäßwandareals, ohne Veränderungen in der Lumengröße, beobachtet. Langfristig vergrößerte eine effektive Behandlung mit Statinen auch signifikant den Durchmesser des Gefäßes, was durch eine fortschreitende Umbildung der Arterienwand erreicht wurde [Corti 2002].
Der pathophysiologische Mechanismus des Wiederaufbaus der ursprünglichen Gefäßstruktur ist noch nicht im Detail geklärt. Das Zusammenspiel einzelner komplexer Faktoren könnte bei andauernder Therapie einen positiven Einfluss ausüben. Zu diesen Faktoren zählen zum Beispiel die Hemmung der durch LDL–Cholesterol vermittelten Entzündungsvorgänge, eine verbesserte
Andererseits wiesen die Cholesterolsyntheseenzym-(CSE)–Hemmer bereits innerhalb weniger Wochen heilsame physiologische Effekte auf. Neben der effektiven Senkung der Blutfette verbesserten Statine nach einem akuten koronaren Ereignis die Endothelfunktion [RECIFE Trial 1999], verminderten die Aggregationsfähigkeit der Plättchen und reduzierten die Ablagerung von Thromben. Von diesen Mechanismen profitierten die Patienten vor allem in der frühen Phase nach einem akuten Koronarsyndrom [MIRACLE 2001]. Diese so genannten pleiotropen Effekte der Statine sind in der Therapie neben einer Regulation der Blutfettwerte von entscheidender Bedeutung.
Durch das pleiotrope Wirkspektrum von CSE-Hemmern wird bei Patienten mit koronarer Herzerkrankung eine verbesserte Perfusion des Myokards erreicht. Insgesamt wird die NO-abhängige Endothelfunktion gebessert. Aller Wahrscheinlichkeit nach werden diese Effekte durch eine Hemmung der Funktionsfähigkeit der kleinen G-Proteine, wie Rho und Rac, hervorgerufen. Des Weiteren wird ein direkter Einfluss der Statine auf die Gefäßwand angenommen [Werner 2002], da diese Effekte bereits nach kurzzeitiger Therapiedauer beobachtet werden.
Es gibt klinische und experimentelle Anhaltspunkte dafür, dass verschiedene wichtige Gene, die für die Kontrolle der endothelialen Funktion, der Entzündung und der Plaquestabilität von zentraler Bedeutung sind, durch CSE–Hemmer reguliert werden. Dazu gehören zum Beispiel die endotheliale NO-Synthetase (eNOS), Endothelin [Hernandez-Perera 2000] sowie MHC-II [Werner 2002].
Mit dem Eingriff in den Stoffwechselweg des Cholesterols wird neben der Entstehung von Mevalonsäure auch die Bildung weiterer Zwischenprodukte wie Farnesylpyrophosphat (FPP) und Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) gehemmt. Diese Isoprenoide sind wichtig für die posttranslationale Modifizierung verschiedener Proteine [Werner 2002]. Dies hat besonders für die kleinen GTP-bindenden Proteine Ras und die Ras-ähnlichen, wie Rho, Rab, Rac und andere, Bedeutung. Durch die Prenylierung gehen die Proteine aus dem inaktiven GDP-gebundenen in ihren aktiven GTP-gebundenen Zustand über und können eine Reihe von Signalkaskaden auslösen [Laufs, Liao 1998].
Bei den vaskulären Prozessen spielt besonders Rho eine wichtige Rolle. Rho wird durch die Anwesenheit von GGPP in seine aktive Form gebracht [Laufs 2000]. Über diesen Weg kann das Aktinzytoskelett verändert und Einfluss auf den intrazellulären Transport, mRNA-Stabilität und die Transkription von Genen genommen werden [Laufs und Liao 2000]. Durch den Eingriff in die zelluläre Signaltransduktion können folglich Signalantworten wie die DNA-Synthese, mRNA-Synthese sowie Proteinsynthese und Proteinexpression reguliert werden [Fenton II 2002]. Dieser Mechanismus soll an einigen ausgewählten Beispielen erklärt werden.
Die endotheliale Dysfunktion resultiert aus schädigenden Einflüssen auf die Innenschicht der Gefäßwand. Zahlreiche exogene sowie endogene Noxen fördern ein Fortschreiten und begünstigen die Ausbildung von Atherosklerose. Durch diese strukturellen Veränderungen der Gefäßwand wird die Bioverfügbarkeit von NO herabgesetzt, was wiederum die Progression der Atherosklerose begünstigt. Statine greifen in diesen Kreislauf positiv ein.
Die Dysfunktion des Endothels charakterisiert sich durch eine beeinträchtigte Erweiterung (Dilatation) der Gefäße. Sie entsteht vorwiegend durch eine verringerte Synthese, Freisetzung und Aktivität des endothelabhängigen Stickstoffmonoxides. NO seinerseits gewährleistet eine suffiziente Relaxation des Gefäßes und verhindert die Aggregation von Thrombozyten. Weiterhin wird das Wachstum der glatten Muskelzellen ebenso wie die Interaktion zwischen Endothel und Leukozyten durch NO reguliert. Wenn durch pathologische Veränderungen die natürliche Funktion des Endothels nicht mehr gewährleistet ist, kann an dieser Stelle durch
Einen weiteren pathogenetischen Faktor der Atherosklerose stellt der pathologische Proliferationsreiz für die glatten Muskelzellen dar [Stobbe 1996]. Über verschiedene Wege wird der stark mitogene Faktor PDGF vermehrt gebildet, was eine Proliferation der Muskelzellen verursacht. Die Proliferation der Zellen wird in Abhängigkeit der kleinen GTP-bindenden Proteine reguliert [Negre-Aminou 1997]. Diese Proteine greifen insofern in den Zellzyklus ein, als dass sie die Aktivität von Zyklinen und den zyklinabhängigen Kinasen beeinflussen [Laufs 2000]. Somit können bei Senkungen des zellulären Gehalts an Mevalonsäure durch Statine wachstumshemmende Effekte beobachtet werden.
Der entscheidende Schritt liegt auf der Ebene der Formation von Isoprenoidderivaten. Wird deren Bildung gehemmt, sinkt die PDGF-induzierte DNA-Synthese in den glatten Muskelzellen der Mediaschicht des Gefäßes. Daraufhin wird die Hyperphosphorylierung des PDGF-induzierten Retinoblastomproteins erniedrigt und die Aktivität der cdk sinkt ab. Auf diese Weise steigt die Menge an vor allem p27Kip 1, einem cdk–Inhibitor, an und die Proliferation wird zwischen der G1-Phase und der S-Phase des Zellzyklus blockiert [Takemoto 2001].
Im Rahmen der Atherogenese kommt es im Gefäßbett zur Entstehung von Plaques. Ein weiteres Fortschreiten der atherosklerotischen Läsion kann dazu führen, dass der Plaque rupturiert und die extrinsische Gerinnungskaskade aktiviert wird. Dabei wirkt eine Hypercholesterolämie steigernd auf die Reaktivität der Plättchen. Als Folge erleidet der betreffende Patient ein akutes Koronarsyndrom oder im schlimmeren Fall einen totalen Verschluss des Gefäßes [Takemoto 2001]. Durch die Behandlung mit CSE–Hemmern wird über den Mechanismus der limitierten
Untersuchungen ergaben, dass die Gehirndurchblutung und der zerebrale Gefäßtonus durch das endogen gebildete NO reguliert wurden [Harrison 1997]. Weitere Experimente, in denen nach einem kleinen ischämischen Infarkt eine gesteigerte Perfusion durch die Hemmung der Rho-GTP-Bindung erreicht wurde, verdeutlichten die vorhandenen Ergebnisse. Die Applikation von HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren erhöhte über den bereits erklärten Mechanismus die Expression von eNOS und führte somit zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit von NO [Endes 1998]. So fiel bei Patienten mit CSE-Hemmer-Therapie nach einem Gefäßverschluss die Größe des betroffenen Infarktgebiets geringer aus. Insgesamt konnte durch die Therapie mit Statinen die zerebrale Durchblutung durch die verbesserte Funktion von eNOS und die sich daraus ergebende vermehrte Bildung von NO positiv beeinflusst werden [Laufs 2000]. Die Antiplättchen- und Antileukozytenfunktion von NO widerspiegelte sich in verstärkten Kollateralflüssen und einer zunehmenden Mikrozirkulation.
Die verbesserte Endothelfunktion spielte eine wesentliche Rolle, jedoch konnten diese Ergebnisse nicht ausschließlich dieser Tatsache zugeschrieben werden. Es müssen weitere Faktoren der Atherogenese in Betracht gezogen werden, die durch die Statine positiv beeinflusst werden.
Die Ursachen der Statineffekte, die scheinbar unabhängig vom Mevalonsäureweg sind, wurden bisher noch nicht vollständig aufgeklärt.
Zahlreiche Untersuchungen weisen darauf hin, dass CSE-Hemmer und Proteasominhibitoren, wie beispielsweise Lactacystin und MG 132, gemeinsame Eigenschaften in ihrer biologischen Wirkung haben. Zum Beispiel: die Regulation von Zellzyklusfaktoren wie p27, ihren Einfluss auf das Wachstum sowie die Differenzierung glatter Muskelzellen der Gefäße. Die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren zeigen ähnliche regulatorische Muster auf die Aktivität von eNOS und die Wirkungsweise von Entzündungsmediatoren. So stellt sich Frage, ob die Parallelität der Effekte sich über einen gleichen Wirkmechanismus, namentlich der Hemmung des Ubiquitin–Proteasomweges, erklären lässt [Rao 1999].
Das 26S Proteasom wird als das aktive Partikel für den Abbau von Zellproteinen betrachtet. Es ist für den ATP-abhängigen Abbau ubiquitinierter und einiger nicht ubiquitinierter Proteine in eukaryotischen Zellen zuständig. Aus Untersuchungen ging hervor, dass das 20S Proteasom zwar
Der 19S Komplex besitzt eine Sequenz, mit der polyubiquitinierte Substanzen erkannt werden. Durch die Aktivität der Isopeptidase kann die Polyubiquitinkette zu Ubiquitin-Monomeren gespalten werden [Ferrell 2000]. Mittels Bindung an die beiden Enden des 20S Abschnittes wird die Öffnung in den engen Kanal in das Innere des proteolytischen Komplexes reguliert [Groll 2000]. Bevor die Proteine den Eingang passieren können, müssen sie erst entfaltet werden, wofür ebenfalls die Regulatorkomplexe verantwortlich sind.
Der strukturelle Aufbau dieses multikatalytischen Zellpartikels wurde mit Hilfe der Röntgenkristallstruktur in verschiedenen Untersuchungen an Hefe und dem Archaebakterium
Die Struktur der α- sowie der β—Untereinheit zeigt eine auffallende Ähnlichkeit. Außerdem ist die Bindung zwischen den beiden Strukturelementen sehr eng [Löwe 1995].
Diese Untereinheit ermöglicht dem Proteasom die beschriebene Ringstruktur auszubilden. Außerdem ist sie notwendig, um die β-Ringe zu formen. Durch den Komplex α—Untereinheiten wird eine physiologische Barriere gewährleistet. Dadurch wird der Einstrom zytosolischer Proteine in das Innere des proteolytischen Partikels begrenzt. Von der äußeren Seite binden regulatorische Komplexe, welche die Aktivität der Proteolyse modulieren [Coux 1996].
In diesem Strukturelement befinden sich diejenigen Abschnitte, die der eigentlichen proteolytischen Aktivität dienen. Die aktive Seite ist im Inneren des zentralen Zylinders lokalisiert. Durch die Arbeit mit fluorogenen Substraten konnten drei verschiedene Aktivitäten identifiziert werden, die sich in ihrer proteolytischen Spezifität unterscheiden. Die β5-Untereinheit weist eine chymotrypsin-ähnliche Aktivität (ChTL) auf und spaltet Proteine vorzugsweise nach hydrophoben Resten. Die auf β1 lokalisierte caspase-ähnliche Aktivität (CaspL) spaltet bevorzugt die gebundenen Proteine nach sauren Resten. Der historische Name dieser Aktivität ist Peptidylglytamylpeptidhydrolase (PGPH), jedoch wurde er verlassen, da die Spaltung nach Aspartatresten schneller erfolgt als nach Glutamat. Auf der β2-Untereinheit ist die trypsin-ähnliche Aktivität (TL) gelegen, die Proteine nach basischen Aminosäuren spaltet [Kisselev 2001].
Das Zusammenspiel vieler zellulärer Proteine wird durch das proteolytische System kontrolliert. Der multikatalytische Proteasekomplex, welcher sowohl im Zytoplasma als auch im Nukleus lokalisiert ist, stellt daher das zentrale Element des Proteinabbaus dar. Es werden eine Vielzahl kurzlebiger, aber auch langlebiger Proteine über diesen Weg entfernt. Die Funktion des 26S Proteasoms ist bei vielen biologischen Prozessen von entscheidender Bedeutung, denn dieses System ist in die Regulation vieler zellulärer Vorgänge einbezogen [Desterro 2000]. An physiologischen Prozessen beteiligte Proteine werden über diesen Weg in ihrer Aktivität in ein Gleichgewicht gebracht.
Die Proteasomen gehören in die Gruppe der N-terminal nukleophilen Hydrolasen. An den Seitenketten der β-Untereinheiten liegen N-terminal Serin-, Threonin- oder Cysteinreste [Kisselev 2001]. Aus Mutationsstudien ging hervor, dass vorwiegend die Hydroxylgruppe des terminalen Threoninrestes als katalytisches Nukleophil genutzt wird. Die abzubauenden Polypeptidketten werden komplett in kleine Peptide zwischen 3 und 20 Resten gespalten. Die weitere Hydrolyse wird durch andere Proteasen übernommen [Lee 1998].
Unterschiedliche Proteasominhibitoren modifizieren kovalent vor allem den Threoninrest der β-Untereinheiten. Die Inhibitoren MG 132 und MG 262 binden reversibel, β-clasto Lactacystin und Epoxomicin irreversibel. Auf diese Weise wird der Abbau von Proteinen reduziert. Dabei ist es prinzipiell nicht notwendig, dass alle aktiven Zentren des 26S Partikels gehemmt werden. Die Inaktivierung der ChTL-Aktivität reicht aus, um die Abbaurate signifikant zu verringern [Kisselev 2001].
Zu diesem speziellen Thema bietet die Literatur nur eine sehr geringe Zahl publizierter Arbeiten. Diese sind in ihren Ergebnissen widersprüchlich und berichten von einer Hemmung des Proteasoms über keinen nachzuweisenden Effekt bis hin zu einer Aktivitätssteigerung durch Statine. Erstmals wurden im Jahr 1999 Untersuchungen hinsichtlich der Substanzklasse Statine und ihrer Wirkung auf das Proteasom durch Rao und Mitarbeiter veröffentlicht. Sie fanden heraus, dass Lovastatin über eine Hemmung des proteasomalen Systems den Zellzyklus in der G1-Phase blockiert, wobei die Proteine p21 und p27 stabilisiert werden. Diese Stabilisierung wurde durch die Vorstufenform des Lovastatins, welche ähnlich dem Proteasominhibitor Lactacystin einen geschlossenen β-Laktonring ausbildet, hervorgerufen. Dabei zeigte sich, dass diese Form das eigentliche Zielenzym, die HMG-CoA-Reduktase, nicht hemmte. Weiterhin wurde festgestellt, dass nicht ausschließlich strukturelle Eigenschaften von Lovastatin, sondern auch viele der Wirkungen durch die Vorstufenform mit dem spezifischen Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin übereinstimmten. Lovastatin (Prodrug) hemmte dosisabhängig das Proteasom, wobei mit einer Konzentration von 40 µM eine halbmaximale Hemmung der über 36 Stunden
Andere Ergebnisse zeigte die Arbeit um die Gruppe von C. Wojcik. Sie konnten Lovastatin und Simvastatin als Modulatoren der aus der Rinderhypophyse gereinigten 20S Proteasomen identifizieren. Ausschließlich durch die Vorstufe der Wirkformen wurde die ChTL-Aktivität leicht stimuliert und die PGPH ihrerseits gehemmt, während die TL-Aktivität unverändert blieb. Die aktive Wirkform von Lovastatin hatte einen geringen inhibitorischen Effekt auf die ChTL-Aktivität. Weiterhin wirkte Mevalonat auf die präparierten 20S Proteasomen leicht inhibitorisch. Die Effekte der beiden CSE-Hemmer auf die proteasomale Aktivität wurden durch Mevalonsäure nicht verändert. Untersuchungen am Zellkulturmodell mit der Kolonkarzinomzelllinie C-26 zeigten bei einer Konzentration von 100 µM Lovastatin zytotoxische Effekte. Diese konnten bei der Vorstufenform durch eine Zugabe von Mevalonsäure nicht aufgehoben werden. In Zelllysaten wurde nach einer Behandlung eine erhöhte ChTL-Aktivität gemessen. Die beiden anderen proteolytischen Einheiten blieben unbeeinflusst. Die Effekte auf das gereinigte 20S Proteasom korrelierten wenig mit den Ergebnissen, die im Zelllysat gemessen wurden. Dies könnte laut Wojcik seine Ursache darin haben, dass in der vollständigen Zelle das 20S Proteasom mit verschiedenen regulatorischen Einheiten zu dem aktiven 26S Partikel assoziiert ist. Daraus wurde geschlussfolgert, dass die Statine, unabhängig von der HMG-CoA-Reduktase, weitere Ziele in der Zelle besitzen. Auf das proteasomale System bezogen, wurde aus den gewonnenen Daten abgeleitet, dass die untersuchten Statine keinen hemmenden Einfluss aufwiesen [Wojcik 2000].
Ein weiterer Ansatz zu dieser Thematik wurde durch Untersuchungen an differenzierten Neuroblastomzellen geliefert. Die Arbeitsgruppe um Kumar stellte nach einer Behandlung mit Mevastatin degenerative Veränderungen in Form einer Fragmentation der Neuriten an den Zellen sowie eine reduzierte Viabilität der Zellen fest. Im Zellextrakt der differenzierten Neuroblastomzellen konnte Mevastatin dosisabhängig das proteolytische System des Proteasoms inhibieren. Daraus wurde die Hypothese abgeleitet, dass die beobachteten Veränderungen das
Neuere Erkenntnisse wurden durch die Tätigkeit von Murray
Das Proteasom ist ein wichtiger Bestandteil der Zelle. Seine Hemmung hat somit einen entscheidenden Einfluss auf die Funktionsfähigkeit der lebenden Zelle. Als Konsequenz einer Inhibition wird der Proteinabbau in der Zelle erniedrigt, so dass kurzlebige und langlebige Proteine in der Zelle akkumulieren [Craiu 1996]. Dies wiederum führt in der Zelle zu Veränderungen im Stoffwechsel und der Signaltransduktion.
Verschiedene Faktoren, die bei der Zellteilung eine wichtige Rolle spielen, werden über den proteasomalen Weg abgebaut [Kisselev 2001]. In Studien konnte gezeigt werden, dass in proliferierenden Zelllinien eine Hemmung der proteasomalen Aktivität zu morphologischen und biochemischen Veränderungen führt, die mit dem apoptotischen Zelltod assoziiert sind [Drexler 2000].
Aufgrund des nachgewiesenen Einflusses auf den Zellzyklus könnten Proteasominhibitoren in der Behandlung proliferativer Erkrankungen eingesetzt werden [Kisselev 2001].
Das Proteasom hat eine Schlüsselfunktion bei der Immunüberwachung. Durch den Abbau von Proteinen entstehen Peptidreste, die auf der Oberfläche der Zellen über das MHC-I Molekül den zytotoxischen T-Lymphozyten präsentiert werden. Durch eine Verhinderung des Abbaus zytosolischer Proteine führt eine proteasomale Hemmung zu einer verminderten Generation von Peptiden, die über MHC-I-Klasse Moleküle präsentiert werden [Rock 1994].
Bei der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB spielt das Proteasom eine entscheidende Rolle. Aufgrund eines exogenen Stimulus, beispielsweise eine Entzündungsreaktion im Rahmen einer Reperfusion nach abgelaufener Ischämie [Pye 2003], wird der Transkriptionsregulator aus seinem inaktiven Zustand in den aktiven überführt. Dies geschieht durch den Abbau des gebundenen hemmenden Proteins IκB [Kisselev 2001].IκB wird durch einen IκB-Kinasekomplex phosphoryliert, wodurch dieses Protein einer Ubiquitinierung zugänglich gemacht wird. Im Anschluss daran wird das polyubiquitinierte Protein rasch durch das Proteasom abgebaut. Dabei wird der Transkriptionsfaktor NFκB, welcher die Expression der mRNA vieler inflammatorischer Mediatoren und Enzyme induziert, aktiviert und in den Kern transportiert. Dort wird die Transkription der von diesem Faktor abhängigen Proteine eingeleitet. Mittels einer effektiven Proteasominhibition kann die Degradation von IκB verhindert werden [Gao 2000]. Damit bleibt das inhibitorische Protein stabil im Komplex mit NFκB gebunden und der Transkriptionsfaktor verbleibt im Zytoplasma. Auf diese Weise könnte Proteasominhibition eine potente antiinflammatorische Funktion ausüben, da der Signalweg wichtiger Entzündungsmediatoren wie TNF und verschiedene Interleukine gehemmt wird [Yeh 2002].
Über die beschriebenen Mechanismen besteht die Möglichkeit, in die Entstehung einer Restenose effektiv einzugreifen. Infolge atherosklerotischer Prozesse bildet sich bei 20 bis 50 % der Patienten, die sich einer Ballondilatation mit Stentimplantation unterziehen mussten, erneut eine Engstelle aus. Da bei der Genese von Stenosen proliferative, entzündliche und apoptotische Prozesse eine entscheidende Rolle spielen, hat die Inhibition des Proteasoms möglicherweise einen günstigen Einfluss auf die Verhinderung einer Restenose. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit spezifischen Proteasominhibitoren die Proliferation glatter Muskelzellen hemmte, die Aktivierung der Entzündungskaskade wurde durch die Stabilisierung von IκB blockiert und in den Gefäßmuskelzellen wurde Apoptose induziert [Meiners 2002].
Wie bereits dargestellt, greifen die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren vielfältig in atherosklerotische Prozesse ein. Neben den erwähnten Effekten modulieren die Statine ebenfalls die Aktivität von inflammatorischen Transkriptionsfaktoren, wobei NFκB ein Schlüsselmediator ist. Durch eine Inhibition der Aktivität von NFκB werden pro-inflammatorische Zytokine, Chemokine und andere Mediatoren wie COX-2 [Hernandez-Presa 2002] weniger exprimiert [Ortego 1999]. Ähnlich der Proteasomhemmung führte eine Behandlung mit HMG-CoA-Reduktase-Hemmern in Endothelzellen zur Stabilisierung des zytosolischen Inhibitors IκB-α[Dichtl 2003]. Damit bleibt NFκB mit IκB im Komplex gebunden, so dass der Transkriptionsfaktor in seiner inaktiven Form im Zytosol vorliegt.
PPARs, welches Transkriptionsfaktoren sind, die eine antientzündliche Wirkung zeigen, wurden in ihrer Aktivität pravastatinvermittelt gesteigert [Zelvyte 2001]. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Hemmung von NFκB und die daraus resultierend vermindert zirkulierenden pro-entzündlichen Moleküle ein sehr gutes therapeutisches Ziel bieten würden. Über diesen Mechanismus kann wirksam in inflammatorische Regelkreise, die auch bei der Entstehung sowie der Progredienz atherosklerotischer Prozesse eine wichtige Rolle spielen, eingegriffen werden.
Wie bereits im einleitenden Teil eingegangen, zeigten Statine durch ihre pleiotrope Wirkungsweise ähnliche Effekte, wie sie nach einer Proteasominhibition beobachtet wurden. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zwischen dem spezifischen Proteasominhibitor β—clasto Lactacystin und den Statinen liegt die Arbeitshypothese nahe, dass die vielfältig eingesetzten CSE-Hemmer über eine Hemmung des proteasomalen Proteinabbaus wirken könnten [Rao 1999].
Das Proteasom besitzt an den β-Untereinheiten N-terminal gelegene Threoninreste als aktive Zentren für die nukleophile Hydrolyse [Kisselev 2001]. Eine intramolekulare Esterbindung im β-Laktonring von β-clasto-Lactacystin wird durch die Hydroxylgruppe von Threonin angegriffen. Dadurch bildet sich eine stabile Esterbindung zwischen der proteolytischen Einheit und dem Inhibitor [Kisselev 2000] aus. Durch die Modifizierung der katalytischen OH-Gruppe durch den β-Laktonring können andere Substrate nicht abgebaut werden.
Durch die Strukturähnlichkeit könnten die Statine mittels dieses Mechanismus das proteolytisch aktive Zentrum des 20S Partikels modifizieren. Dadurch könnten die meisten intrazellulären Proteine nicht mehr gespalten werden und würden im Zytoplasma akkumulieren. Darüber könnten sich die vielzähligen cholesterolunabhängigen Effekte der Statine erklären lassen.
Aus den Überlegungen heraus würden sich weitere Einsatzgebiete der Substanzgruppe erschließen. Weiterhin können sich modellhafte Vorstellungen ergeben, die die HMG-CoA-Reduktase-Hemmer neu in zelluläre Vorgänge einordnen.
DMEM (1000 mg/l Glukose) + 10 % FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin
DMEM (1000 mg/l Glukose) + 3 % FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin
MEM (1000 mg/l Glukose) + 5 % FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin
MEM wird in pulverisierter Form zur Verfügung gestellt. Dem Pulver werden 1500 mg NaHCO3 und 110 mg Natriumpyruvat zugefügt. Die Substanzen werden in 1l
Zur Herstellung der Kollagenaselösung (Worthington–Collagenase Typ II 215 U/ml) werden 70 mg der pulverisierten Form in 50 ml serumfreiem Nährmedium aufgelöst. Die hergestellte Lösung wird mit einem Einmalfilter steril filtriert, aliquotiert und bei –20oC gelagert.
Dem Versuchstier werden 75 mg des Lokalanästhetikums injiziert und abgewartet, bis sämtliche Reflexe des Tieres erloschen sind. Wenn dies sichergestellt ist, wird die Ratte auf einem Präparationstisch befestigt und mit Alkohol desinfiziert. In Anschluss daran wird der Thorax präpariert und die Halsregion freigelegt. Zu beiden Seiten der Trachea befindet sich die
Nachfolgende Schritte laufen unter sterilen Bedingungen ab. Die Gefäßstücke werden vorsichtig mit einer Pinzette in ein 15 ml Falcon-Gefäß gegeben, mit 300 µl Kollagenase und 50 µl Trypsin–EDTA (im Verhältnis 6:1) versetzt. Die Karotidenstücke werden für 6 Stunden im Brutschrank (Heraeus Instruments), in 90 % wasserdampfgesättigter Atmosphäre, bei 37oC und 5 % CO2, inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Reaktion mit 5 ml Nährmedium gestoppt. Die Zellsuspension wird 5 Minuten bei 1000 rpm und RT zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, das Pellet mit Nährmedium resuspendiert und auf eine 60 mm Zellkulturschale pipettiert. Die Zellen werden mit einem Gesamtvolumen von 3,5 ml Nährmedium in standardisierter Atmosphäre kultiviert. Alle 3 bis 4 Tage wird das Medium erneuert. Die Präparation und die Kultivierung der glatten Muskelzellen werden in Anlehnung an die Vorgaben von Chamley-Campbell
Das Nährmedium wird abgesaugt. Anschließend werden die Zellen mit sterilem PBS gewaschen und trypsiniert. Für Experimente werden diese Primärzellen zwischen der Passage 3 und 7 verwendet.
Für Untersuchungen werden die CPAE-Zellen bis Passage 11 verwendet.
Die Zellen werden mit PBS gewaschen, trypsiniert und in definierter Zahl (EA.hy926: 6,5x105 Zellen, CPAE: 1,0x106 Zellen und VSMC: 6,5x105 Zellen) auf 60 mm Zellkulturschalen ausgesät (jeweils Doppelwerte). Zur Adhäsion der Zellen an die Unterlage werden die Kulturschalen unter Standartbedingungen kultiviert (EA.hy926: 24 Stunden, CPAE: 48 Stunden, VSMC: 3 Tage). Nach dieser Zeit werden die EA.hy926-Zellen und die glatten Muskelzellen gründlich mit PBS-Lösung gewaschen und zur Adaptation an das neue Medium über 24 Stunden serumarm weiterkultiviert. Anschließend werden die Zellen bei einer gegebenen Zelldichte von 75 bis 80 % Konfluenz behandelt. Die Zellen erhalten alle in gleicher Weise 2 bzw. 3 ml Medium (48 Stunden):
Nach Ende der Inkubationszeit werden die Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA trypsiniert. Die Reaktion wird nach einer Reaktionszeit von 1,5 Minuten mit 2 ml Behandlungsmedium gestoppt. Anschließend wird die Zellsuspension in ein 15 ml Falcon pipettiert. Von den 3 ml Gesamtvolumen der Suspension werden 20 µl in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß gegeben und 20 µl Trypanblau dazu pipettiert. Von dieser Menge werden 10 µl in eine Neubauer-Zählkammer gefüllt und im Anschluss daran die Gesamtzellzahl ermittelt.
Durch ein Anfärben der Zellen mit Trypanblau kann festgestellt werden, ob die Zellen noch eine intakte Zellmembran besitzen. Sobald eine Schädigung der Membran auftritt, kann der Farbstoff ins Zytoplasma eindringen und eine Blaufärbung der Zelle verursachen. Eine nicht mehr funktionstüchtige Zellmembran wird als Marker für avitale Zellen angesehen. Diese Zellen sind noch im Zellverband adhärent.
Bei diesem Test handelt es sich um ein kolorimetrisches Assaysystem. Das gelbe Tetrazoliumsalz XTT wird durch die Zugabe des Elektronenkopplers in metabolisch aktiven Zellen zu dem wasserlöslichen orangefarben Formazansalz umgewandelt. Mittels dieser Farbreaktion kann spektrophotometrisch die Lebendigkeit der Zellen quantifiziert werden. Die Absorption des Formazanprodukts wird bei einer Wellenlänge zwischen 450 bis 500 nm und einem Referenzbereich von mehr als 650 nm mit einem ELISA–Reader gemessen.
Die zu untersuchenden Zellen werden auf einer 96well Mikrotiterplatte in einer definierten Zellzahl mit einem Gesamtvolumen von 100 µl pro well ausplattiert. Nach Adhäsion der Zellen werden diese wie unter Punkt 3.1.4 beschrieben mit entsprechenden Konzentrationen der Wirksubstanzen behandelt. Nach Abschluss der Inkubationszeit wird die XTT-Lösung (Endkonzentration: 0,3 mg/ml) zu jeweils 50 µl dazu pipettiert und im Brutschrank unter Standardbedingungen inkubiert. Die Platte wird über einen Zeitraum von 4 Stunden stündlich mit einem ELISA-Reader gemessen.
Zur bildlichen Darstellung morphologischer Besonderheiten nach einer Behandlung der Zellen mit Statinen, eignet sich eine Färbung mit Phalloidin und im Anschluss daran ein Färben der Kernelemente mit DAPI. Phalloidin bindet mit hoher Affinität an Aktinfilamente, die Bestandteil des Zytoskeletts jeder Zelle sind. FITC, sein fluoreszierendes Konjugat, sendet bei 495 nm Licht aus. DAPI wird selektiv an AT-reiche Abschnitte der DNA gebunden, so dass sich die Zellkerne auf diese Weise gut anfärben lassen. Bei einer Wellenlänge von 340 nm bilden sich mit hoher Spezifität fluoreszierende DNA-DAPI-Farbkomplexe aus.
Zellen 2x vorsichtig mit PBS waschen (je 3 Minuten auf Wippe) → PBS vollständig absaugen
Zellen 20 Minuten bei RT mit 1 ml 4 % Paraformaldehyd pro well fixieren
zweimaliges Waschen in PBS (je 3 Minuten auf Wippe)
Permeabilisierung der Zellen mit 1 ml 1 % Tritonlösung pro well über 10 Minuten bei RT
3x mit PBS waschen
freie Bindungsstellen mit je 1 ml 1 % FCS (Lösung in PBS) bei RT, 30 Minuten blockieren (auf Wippe)
zur Färbung der Zellen Inkubation mit 100 µl Phalloidin pro well 37oC (in Alufolie gewickelt)
3x mit PBS waschen
Inkubation mit 500 µl/well DAPI–Farbstoff: 15 Minuten, RT (dunkel, in Alufolie gewickelt)
zweimal gründlich mit PBS waschen (jeweils 3 Minuten auf Wippe)
Foto mit Zeiss-Kamera und Auswertung mit Axiovert 3,0 Software
Nach der Behandlung werden die Zellen unter einem Lichtmikroskop betrachtet, um phänotypische Veränderungen zu erkennen. Darauf folgend werden die Zellen einer hypotonischen Lyse mit destilliertem Wasser unterzogen.
Zunächst wird das Medium abgesaugt. Dann werden die Zellen zweimalig mit eiskalter PBS-Lösung gewaschen. Zum Schluss wird die Schale gründlich abgesaugt. Vorsichtig werden 45 bis maximal 80 µl, in Abhängigkeit von der Zelldichte sowie der Zellgröße, eiskaltes
Dazu müssen die Proben bei 4oC, 14000 rpm, über 30 Minuten abzentrifugiert werden (Centrifuge 5810R, Eppendorf). Dabei trennen sich die intrazytoplasmatischen Proteine sowie auch Kernproteine, im Speziellen natürlich die Proteasomen, von den übrigen Zellbestandteilen ab. Danach wird der vorhandene Überstand in ein gesondertes Eppendorfgefäß pipettiert und das Pellet verworfen.
Proteine sind in der Lage zweiwertiges Kupfer zu reduzieren. Das bei dieser Reaktion entstehende einwertige Kupfer reagiert mit dem in der Lösung vorhandenen BCA zu einem spezifischen Farbkomplex. Die Absorption des Farbkomplexes wird mittels eines Spektrophotometers gemessen. Dabei korreliert die Farbstoffintensität direkt mit der Konzentration der reagierenden Gruppen [Lottspeich 1998].
Proteinprobe 1:5 mit
Proteinsuspension auf 96well Platte pipettieren
zu 1 Teil Probe 20 Teile frische Reaktionsreagenz geben
Mischung der Nachweisreagenzien Reagenz A (BCA) und B (Kupfersulfat) im Verhältnis 50:1
Inkubation des Nachweisansatzes bei 37oC über 30 Minuten
Messung der Absorption mittels ELISA-Reader, Messfilter 570 nm
Proteinkonzentration anhand der BSA-Standardkurve in µg/µl mit WinRead 2.1 errechnen
Diese Substrate werden zur Messung der Aktivität von Peptidasen eingesetzt. Eine kurze Peptidsequenz ist mit dem 7-Amino-4-Methylcoumarin (MCA) konjugiert, welches durch aktive Peptidasen abgespalten wird. Das bei dieser Reaktion entstandene freie, fluoreszierende MCA wird dann mittels eines Spektrofluorometers gemessen. MCA–Substrate sind besonders für Peptidasen geeignet, die substratspezifisch sind. Es bildet sich eine Interaktion zwischen dem Peptidrest des Substrates und der Substratseite des reaktiven Zentrums des Enzyms aus, wobei die Reste des Substrates N-terminal bezüglich der festen Bindung lokalisiert sind. In Abhängigkeit der Proteasomaktivität wird eine definierte Menge an MCA frei, die als Korrelat der Aktivität bewertet wird.
Für die Bestimmung der Proteasomaktivität im Zellextrakt (Gewinnung der Extrakte siehe Abschnitt Ernte und Lyse), das aus den mit den zu untersuchenden Substanzen behandelten Zellen gewonnen worden ist, werden für die Messung der chymotrypsin-ähnliche Aktivität (ChTL) 10 µg Protein eingesetzt. Für die anderen beiden Aktivitäten, namentlich die caspase-ähnliche (CaspL) und die trypsin-ähnliche (TL), werden dagegen 20 µg Protein verwendet. Insgesamt werden 20 µl Proteinsuspension pro well der 96well Platte angesetzt. Die dem Volumen fehlende Menge wird mit
Die enzymatische Aktivität wird als prozentuale Aktivität im Vergleich zur Kontrolle berechnet.
Der Messansatz für die Wirkung der zu testenden Substanzen auf gereinigte 20 S Proteasomen wird in Anlehnung an die Vorgaben von Wojcik
Ausgewertet und graphisch zusammengestellt werden die Messergebnisse mit Microsoft Excel. Die Standardabweichungen der einzelnen Versuche sind mit Hilfe von Excel ermittelt. Die statistische Analyse der erhaltenen Daten erfolgt mit dem OneWay ANOVA Test von SigmaStat 2.0. Als statistisch signifikant werden die Werte P<0,05 angenommen.
Bei der Genese atherosklerotischer Prozesse bieten Endothelzellen und glatte Gefäßmuskelzellen einen wesentlichen Angriffspunkt. Daher wurden für die Untersuchungen CPAE- und EA.hy926-Zellen als Vertreter endothelialer Zellen sowie glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC) verwendet. Zur mikroskopischen Beurteilung der phänotypischen Merkmale wurden die verschiedenen Zelllinien mit den Substanzen Simvastatin (Prodrug), Atorvastatin und Pravastatin behandelt. Simvastatin gehört in dieser Gruppe der Lipidsenker zu den ersten Substanzen. Diese werden bei einer medikamentösen Verabreichung erst in der Leber durch enzymatische Hydrolyse [Istvan 2001] in die aktive Wirkform umgewandelt. Die metabolisch aktive Form hemmt ihr Zielenzym, die HMG-CoA-Reduktase, sehr effektiv. In den Versuchen wurde die Substanz in ihrer Vorstufenform verwendet. Atorvastatin und Pravastatin liegen bereits als aktive Metabolite vor. Sie benötigen daher keine Spaltung des β-Laktonrings, um in die Wirkform überführt zu werden. Auf diese Weise sollten Differenzen sowie Parallelitäten zwischen den einzelnen Wirkformen, der geschlossenen und offenen β-Laktonringform, der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer herausgearbeitet werden.
Die Behandlung mit den Statinen führte zu mikroskopisch beobachtbaren phänotypischen Veränderungen. Die Zellen wurden länglich. Dabei gab es sichtbare Unterschiede in der Stärke der Ausprägung zwischen den verschiedenen Zelllinien. Die Ausbildung dieses Phänotyps war bei den CPAE-Zellen am deutlichsten. Die Behandlung mit der inaktiven Vorstufe Simvastatin und mit Atorvastatin brachte ähnlich potente Wirkeffekte hervor. Pravastatin zeigte im Vergleich zu Simvastatin und Atorvastatin zeigte deutlich schwächere Effekte.
Die verschiedenen Zellen wurden bei einer 80 %igen Konfluenz mit Konzentrationen von 1 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM und 50 µM des jeweiligen CSE-Hemmers behandelt. Mit steigender Konzentration der Wirksubstanz wurde die Zelldichte stark verringert und degenerative Veränderungen traten auf. Bei hohen Konzentrationen zeigten die Zellen Anzeichen des
Die mikroskopischen Phänomene sollen anhand der CPAE-Zellen ausführlich dargestellt werden. Die Zellen wurden über 24 Stunden mit Simvastatin (Prodrug) inkubiert. Folgende Effekte ließen sich mikroskopisch beobachten:
Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 24 Stunden behandelt. Die bereits beschriebenen Unterschiede und Parallelitäten der verschiedenen Ringformen, der geschlossene β-Laktonring und der offene Ring, der Statine sollten mit Hilfe der Abbildungen belegt werden. Dabei wurde Simvastatin (Abb. 6 a-f) als Vertreter der geschlossenen Ringform und Atorvastatin (Abb. 7 a-f) stellvertretend für die offene Laktonringform verwendet.
Die CPAE-Zellen wurden zu diesem Zweck mit 1 µM und 10 µM des bekannten Proteasominhibitors β-clasto Lactacystin behandelt. Eine 24-stündige Inkubation der CPAE-Zellen mit einer Konzentration von 1 µM β-clasto Lactacystin führte zu deutlichen strukturellen Veränderungen. Verglichen mit der Lösungsmittelkontrolle waren die Zellen lang gestreckt, lösten sich teilweise von der Unterlage ab und waren weniger dicht. Eine Steigerung der Konzentration auf 10 µM Lactacystin verstärkte die Effekte weiter.
Die mikroskopisch sichtbaren Erscheinungen nach einer Inkubation mit dem Proteasominhibitor und Statinen waren weitgehend vergleichbar. Bei beiden Behandlungen konnten zellschädigende Eigenschaften beobachtet werden. Insgesamt hatte die Gabe von Lactacystin eine potentere Wirkung. Bereits eine Konzentration von 1 µM Lactacystin genügte, um strukturelle Veränderungen zu erzielen (Abb. 8 e-f).
Die alleinige Behandlung der Zellen mit Konzentrationen zwischen 400 µM und 5 mM Mevalonsäure verursachte keine auffälligen Veränderungen. Der Phänotyp und die Zelldichte waren mit der Lösungsmittelkontrolle vergleichbar. Somit hatte Mevalonsäure keinen direkt mikroskopisch verifizierbaren Effekt auf die behandelten Zellen.
Mevalonsäure war nicht in der Lage, die durch Proteasominhibition verursachten degenerativen Veränderungen aufzuheben. Die Zellen behielten ihr gestrecktes Aussehen bei.
Die simultane Gabe von 400 µM Mevalonat zu 10 µM Statin führte zu einer vollständigen Aufhebung der statin-induzierten phänotypischen Erscheinungen. Mikroskopisch stimmte der Phänotyp mit dem der Lösungsmittelkontrolle überein. Die unterschiedliche Laktonringform der Statine hatte keinen Einfluss (Abb. 8 a-d). Somit wurde gezeigt, dass die phänotypischen Veränderungen keine Folge der Proteasominhibition waren, sondern auf die Hemmung der HMG-CoA-Reduktase zurückzuführen waren.
Die konfluenten Zellen wurden über 24 Stunden separat mit den verschiedenen Statinkonzentrationen behandelt. Nach dieser Zeit wurde die metabolische Aktivität als Korrelat der Viabilität mit XTT gemessen.
Durch die gleichzeitige Zugabe von 400 µM Mevalonsäure zu 10 µM Statin wurden die mikroskopisch beobachteten Statineffekte aufgehoben. Diese Ergebnisse ließen sich auch in der Viabilitätstestung verifizieren. Die Zellen hatten dadurch dieselbe Stoffwechselaktivität wie die Zellen der Lösungsmittelkontrolle. Somit konnte durch Mevalonsäure die reduzierte Stoffwechselaktivität nach alleiniger Statinbehandlung vollständig wiederhergestellt werden.
Die Trypanblau-Färbung der EA.hy926-Zellen diente der Erstellung einer Nettowachstumskurve. Stark geschädigte Zellen, in denen die Zellmembran ihre Barrierefunktion verloren hatte, konnten mit diesem Farbstoff markiert werden. Somit konnten die toten, noch im Zellverband integrierten Zellen identifiziert werden. Nicht mehr adhärente Zellen gingen nicht in die Zählung mit ein. Aus der Anzahl vitaler Zellen konnte die Proliferationsrate während der Behandlung mit Statinen errechnet werden.
Es fiel auf, dass mit steigender Konzentration der Statine die Zahl vitaler Zellen und somit die Proliferationsrate (Abb. 10) der Zellen abnahm. Obwohl die EA.hy926-Zellen in definierter Zahl ausplattiert wurden, veränderte sich die Anzahl der Endothelzellen mit steigender Dosis der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer. Im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle proliferierten die Zellen nicht mehr so schnell. 1 µM Simvastatin (Prodrug) und 1 µM Pravastatin hatte noch keinen Einfluss auf das Wachstum. Mit 10 µM Simvastatin (Prodrug) war keine Proliferation mehr nachweisbar. Es starben mehr Zellen, als sich teilten. Das Wachstum war bei dieser Simvastatinkonzentration gehemmt. Im Vergleich zu Simvastatin war bereits mit 5 µM Pravastatin das Zellwachstum potent gehemmt. Im Gegensatz dazu zeigte Atorvastatin auch in sehr geringen Dosen eine effektive Verringerung der Proliferation. Durch die Gabe von 1 µM Atorvastatin konnte die Zellproliferation fast vollständig gehemmt werden. Eine weitere Dosissteigerung von Atorvastatin bis auf 10 µM führte zu einer kompletten Inhibition der Zellteilungsrate. Aus diesen Beobachtungen heraus resultierte die Schlussfolgerung, dass Statine in den Wachstumszyklus von Zellen eingreifen. Die niedrigen Konzentrationen zwischen 1 µM und 10 µM Statin waren ausreichend, um das Wachstum deutlich zu limitieren.
Die simultane Gabe von 400 µM Mevalonsäure zu 10 µM Statin konnte den Einfluss auf die Proliferation bei Simvastatin sowie Atorvastatin revertieren. Bei Pravastatin bewirkte die Zugabe von Mevalonat keine Aufhebung der Wachstumsinhibition.
Zur Untersuchung der Statineffekte auf die drei proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms wurden die mikroskopisch ausgewerteten Zelllinien verwendet. Die Proteasomaktivität der beiden Endothelzelllinien wurde nach einer kurzzeitigen 6-Stunden-Behandlung sowie einer 24-Stunden-Behandlung beurteilt. Die proteolytische Aktivität der VSMC-Zellen wurde nur nach einer 24-stündigen Statinbehandlung gemessen. Diese Überlegung begründete sich aus der Tatsache, dass die glatten Muskelzellen eine niedrige Proliferationsrate hatten und eine Kurzzeitbehandlung mikroskopisch keine Wirkung zeigte. Die Zellen wurden mit Konzentrationen von 1 µM, 5 µM und 10 µM der HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren inkubiert. Diese Konzentration wurde als optimal herausgefunden, da Konzentrationen über 10 µM zytotoxisch waren. Die Untersuchung der Proteasomaktivität sollte nicht durch eine Abnahme der Stoffwechselleistung der Zelle aufgrund anderer Statineffekte verfälscht werden. Als Positivkontrolle wurde der bekannte irreversible Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin verwendet. Weiterhin wurde die Wirkung von Mevalonsäure, deren Bildung durch die Statine gehemmt wird, auf die Proteasomaktivität untersucht. In den Versuchen wurde die Wirkung von Mevalonsäure untersucht und die simultane Gabe zu 10 µM Statin.
Aus den Untersuchungen resultierte, dass die Statine sowohl bei einer Behandlung über 6 Stunden als auch bei einer Behandlung über 24 Stunden das Proteasom im Vergleich zur Lactacystinkontrolle nicht wirkungsvoll hemmen konnten. Statine hatten in diesem Versuchsaufbau nur einen geringen Einfluss auf den Aktivitätszustand des Proteasoms. Insgesamt lag die Proteasomaktivität nach einer Behandlung mit Statinen bei 100 % ± 30 %.
Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse sagen aus, dass aus einer Behandlung mit den untersuchten HMG-CoA-Reduktase-Hemmern keine kontinuierliche Hemmung des proteolytischen Zellpartikels resultierte.
Atorvastatin, die offene Laktonringform, hatte einen geringen Einfluss auf die proteasomale Aktivität. Nach einer 6-stündigen Behandlung mit dieser Substanz war die TL in den CPAE-Zellen leicht gehemmt. Nach einer 24-stündigen Inkubation der VSMC-Zellen mit Atorvastatin zeichnete sich eine leicht inhibitorische Wirkung auf die ChTL ab. Die Untersuchung der beiden anderen CSE-Hemmer brachte nicht dasselbe Ergebnis hervor. Simvastatin (Prodrug) und Pravastatin hatten sowohl in der kurzzeitigen wie auch der langzeitigen Behandlung keinen Einfluss auf das Proteasom der untersuchten Zelllinien. Eine Proteasomhemmung im Sinne von β-clasto Lactacystin konnte in den vaskulären Zelllinien nicht oder nicht kontinuierlich nachgewiesen werden.
Im Folgenden sollen die einzelnen Ergebnisse der Untersuchung detaillierter ausgeführt werden.
Eine kurzzeitige Behandlung mit Simvastatin erzeugte keine Inhibition der proteasomalen Aktivität. Alle 3 proteolytisch aktiven Zentren des Kernpartikels zeigten eine leichte Erhöhung ihrer Umsatzrate bezogen auf die Ethanolkontrolle. Am deutlichsten lag die ChTL-Aktivität über dem Niveau der Ethanolkontrolle. Durch die Behandlung mit 1 µM Simvastatin (Prodrug) erreichte die chymotrypsin-ähnliche Aktivität eine Rate von 126,4 % ± 10,7. Durch höhere Konzentrationen sank die Aktivität langsam auf das Niveau der Lösungsmittelkontrolle (Abb. 11A) ab. Da eine Konzentrationssteigerung keine weitere Erhöhung der ChTL-Aktivität hervorrief, ließ sich Simvastatin in dieser Versuchsreihe auch nicht als Aktivator der ChTL-Proteasomaktivität identifizieren (P=0,08).
Ähnliche Resultate ergaben sich aus Untersuchungen der caspase-ähnlichen Aktivität (Abb. 11B). Die Aktivität lag bei 109,9 % ± 8,3 nach Gabe von 1 µM, bei 108,7 % ± 8,9 nach einer Dosis von 5 µM und bei einer Endkonzentration von 10 µM bei 103,1 % ± 5,7. Im Durchschnitt lagen die Aktivitätswerte der CaspL auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle (P=0,303). Simvastatin hatte keinen Einfluss auf diese proteasomale Aktivität.
Auch die trypsin-ähnliche Aktivität des Proteasoms lag nach einer geringen Dosis von 1 µM mit 111,6 % ± 10,6 geringfügig über der Aktivität der Kontrolle. Mit zunehmender Dosis an Simvastatin verringerte sich die Aktivität auf das Aktivitätsniveau der Kontrollzellen (P=0,636). Auch anhand dieser Resultate wird deutlich, dass Simvastatin keinen direkten Einfluss auf die trypsin-ähnliche Aktivität hatte (Abb. 11C).
Zum direkten Vergleich sollten den Resultaten einer Statinbehandlung die Ergebnisse einer Behandlung mit dem bekannten irreversiblen Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin gegenübergestellt werden. Eine kurzzeitige Behandlung mit Lactacystin führte zu einer effektiven Hemmung der Proteasomaktivität. Wie erwartet war die ChTL-Aktivität mit einer Restaktivität von 4,2 % ± 0,8 (P<0,001) am stärksten gehemmt. Die anderen beiden Aktivitäten, die CaspL und die TL, hatten jeweils eine höhere Restaktivität. Die CaspL-Aktivität sank auf 57,3 % ± 2,9 (P=0,002). Die TL-Aktivität war bis auf eine relative Aktivität von 28,3 % ± 1,4 (P<0,001) gehemmt.
Nach einer 6-stündigen Behandlung der CPAE-Zellen mit Atorvastatin konnte die TL-Aktivität konzentrationsabhängig um 20 % gehemmt werden (P=0,046). Mit 1 µM Atorvastatin sank die TL-Aktivität auf 84,9 % ± 9,9 ab. Bei der Endkonzentration von 10 µM Atorvastatin betrug die TL-Aktivität noch 80,5 % ± 9,4. Verglichen mit einer Behandlung mit 10 µM β-clasto Lactacystin (verbleibende TL-Aktivität von 28,3 % ± 1,4) war diese Inhibition gering.
Auf die beiden anderen Aktivitäten, die ChTL (P=0,178) und die CaspL (P=0,966), hatte Atorvastatin keinen Einfluss. 1 µM Atorvastatin beeinträchtigte die ChTL-Aktivität sowie die caspase-ähnliche Aktivität nicht. Die gemessenen Aktivitäten lagen bei 95,2 % ± 4,1 für ChTL und bei 96,7 % ± 7,2 für die CaspL-Aktivität. Eine Steigerung der Konzentration auf 5 µM dieses CSE-Inhibitors senkte die chymotrypsin-ähnliche Aktivität auf 81,1 % ± 19,5 und die caspase-ähnliche Aktivität auf 96,3 % ± 10,7. Durch die Zugabe von 10 µM der Wirksubstanz veränderte sich die Aktivität von ChTL geringfügig auf 90,9 % ± 29,2. Die CaspL wurde bei dieser Konzentration in ihrer Aktivität nicht verändert.
Nach einer 6-stündigen Behandlung mit Pravastatin zeichneten sich keine Aktivitätsveränderungen ab. Pravastatin ist kein Inhibitor des zellulären Proteasoms.
1 µM Pravastatin hatte auf die ChTL (Abb. 13A) und die caspase-ähnlichen Aktivität (Abb. 13B) keinen Einfluss. Die Proteasomaktivität lag auf dem Niveau der DMSO-Kontrolle. Mit einer Erhöhung der Pravastatinkonzentration auf 5 µM sank die ChTL leicht auf 85,9 % ± 30,2 ab. Bei der Konzentration von 10 µM Pravastatin hatte das Proteasom eine ChTL-Aktivität von 93,0 % ± 33,3 (P=0,868). Die CaspL-Aktivität wurde durch die Gabe von höheren Dosen Pravastatin nicht beeinflusst (P=0,821). 1 µM Pravastatin verursachte bei der trypsin-ähnlichen Aktivität eine Aktivitätssenkung von 19 % auf 80,9 % ± 10,4. Bei einer Dosiserhöhung auf 5 µM blieb dieser verringerte Aktivitätszustand erhalten. Nach der Inkubation mit 10 µM Pravastatin hatte die TL eine mit der Lösungsmittelkontrolle vergleichbare Aktivität (Abb. 13C). Anhand der statischen Auswertung ließ sich ablesen, dass Pravastatin die TL nicht signifikant hemmen konnte (P=0,095).
In der Arbeit von Rao
Somit konnten in den eigenen Experimenten keine modulatorischen Effekte bei einer simultanen Gabe von 400 µM Mevalonat zu 10 µM Statin beobachtet werden. Alle 3 proteolytisch aktiven Zentren blieben unbeeinflusst.
In den CPAE-Zellen konnten die pleiotropen Veränderungen einer effektiven Statinbehandlung durch die Zugabe von 400 µM Mevalonsäure aufgehoben werden. Diese Resultate ließen sich nicht auf die Aktivitätssteigerung des Proteasoms nach Mevalonatgabe zurückführen. Effekte, die die proteasomale Aktivität modulieren, konnten diese Wirkung von Mevalonat auf die Strukturveränderungen durch Statine nicht erklären.
Bei der humanen Endothelzelllinie EA.hy926 zeichneten sich ähnliche Ergebnisse ab, die bereits ausführlich anhand der CPAE-Zellen beschrieben wurden. Die gemessene proteasomale Aktivität nach Statingabe lag im Durchschnitt auf dem Niveau der Kontrolle.
Die Inkubation mit Simvastatin (Prodrug) ergab keine signifikanten Veränderungen der proteasomalen Aktivität. Die Aktivität aller proteolytischen Einheiten blieb mit 100 % ± 10 auf dem Niveau der Kontrolle. Dieselben Resultate wurden nach einer Behandlung der Zellen mit Atorvastatin erzielt. Auch Pravastatin hatte keinen Einfluss auf das zelluläre Proteasom der EA.hy926-Zellen.
Durch die Behandlung mit 1 µM Pravastatin wurde die ChTL auf 78,7 % ± 16,7 verringert. Mit der Konzentration von 5 µM wurde keine weitere Aktivitätsminderung erzielt. Nach einer weiteren Erhöhung auf 10 µM Pravastatin nahm die ChTL-Aktivität wieder zu und ging auf das Niveau der Kontrolle zurück (P=0,783). Die Aktivität der CaspL-Einheit blieb unverändert auf dem Niveau der Kontrolle (P=0,912). 1 µM dieses Statins erhöhte die TL-Aktivität um 13 % auf
Im Vergleich zu dem bekannten Proteasominhibitor Lactacystin konnten die Statine die Aktivität des Proteasoms nicht hemmen. Nach einer 6-Stunden-Behandlung mit Lactacystin lag die ChTL bei 13,6 % ± 0,1 (P<0,001), die CaspL bei 84,3 % ± 5,4 (P=0,054) und die TL bei 51,3 % ± 8,8 (P=0,016).
Die Zugabe von 400 µM Mevalonsäure zu 10 µM Statin zeigte keinen Unterschied in den Untersuchungen der EA.hy926-Zellen zu den bereits beschriebenen Effekten in den CPAE-Zellen.
Die 24-Stunden-Behandlung der CPAE-Zellen mit Simvastatin (Prodrug) konnte die ChTL-Aktivität scheinbar konzentrationsabhängig verändern. 1 µM Simvastatin brachte noch keine Veränderungen. Durch 5 µM sank die ChTL-Aktivität in Bezug auf die Lösungsmittelkontrolle um 20 % auf einen Aktivitätswert von 80 %. Eine Erhöhung der Simvastatindosis auf 10 µM führte zu einer weiteren Abnahme dieser proteolytischen Einheit des Proteasoms. Die behandelten Zellen noch eine ChTL-Aktivität von 66 %. In der statistischen Auswertung zeigte sich jedoch, dass diese Aktivitätsminderung der ChTL nicht als signifikant zu bewerten war (P=0,089). Somit hatte Simvastatin (Prodrug) keinen Einfluss auf die ChTL-Aktivität.
Im Vergleich dazu zeigte sich mit dem bekannten Lactacystin nach einer 24-stündigen Behandlung wie erwartet ein stark inhibitorischer Effekt (P<0,001).
Die beiden anderen proteolytischen Einheiten wurden durch die 24-Stunden-Inkubation mit Simvastatin in ihrem Aktivitätszustand nicht verändert. Hier blieb in allen Konzentrationen die Aktivität im Bereich der Lösungsmittelkontrolle (CaspL (P=0,802) und die TL (P=0,785)). B-clasto Lactacystin, der bekannte Proteasominhibitor, zeigte im Vergleich zu dem CSE-Hemmer eine echte Inhibition sowohl der ChTL- (P<0,001) wie auch der TL-Aktivität (P=0,007). Eine
Simvastatin (Prodrug) hatte auch nach einer Langzeitbehandlung keinen Effekt auf die Funktion des Proteasoms in den CPAE-Zellen.
Aus den Messungen ging hervor, dass die ChTL, mit steigender Dosis nicht effektiv verringert werden konnte (P=0,486). Es zeigte sich zwar, dass mit einer Endkonzentration von 10 µM Atorvastatin die Aktivität dieser Einheit um 18,4 % auf 81,6 % ± 8,6 vermindert war. Dieser Effekt konnte in der statistischen Auswertung nicht als signifikant erkannt werden. Die caspase-ähnliche Aktivität hatte bei einer Konzentration von 1 µM dieses HMG-CoA-Reduktase-Hemmers nur eine Aktivität von 73,3 % ± 18,5. Mit einer Steigerung der Atorvastatindosis nahm
Eine 24-stündige Behandlung mit Atorvastatin zeigte keine Wirkung auf die Proteasomaktivität der CPAE-Zellen. Im Vergleich zu einer 6-stündigen Inkubation konnte die TL-Aktivität durch diese Substanz nicht verringert werden. Atorvastatin war in dieser Versuchsreihe nicht als TL-Inhibitor zu identifizieren.
Die 24-Stunden-Behandlung mit Pravastatin hatte einen geringen Effekt auf die Aktivität des Proteasoms. Ausschließlich die Dosis von 5 µM Pravastatin konnte die proteolytische TL-Aktivität leicht um 25,2 % ± 2,6 inhibieren (P=0,046). Die Gabe von 1 µM und 10 µM Pravastatin konnten keine Hemmung der TL erzeugen. Somit konnte Pravastatin die TL-Aktivität nicht hemmen (Abb. 16). Ähnliche Ergebnisse zeichneten sich auch bei der Messung
Die simultane Gabe von 400 µM Mevalonat zu 10 µM Statin hatte keinen aktivierenden Effekt auf die proteasomale Aktivität. Mevalonsäure konnte in diesem Versuchsansatz nicht als Modulator der Proteasomaktivität identifiziert werden.
In Bezug auf die Lösungsmittelkontrolle wurde die proteasomale Aktivität durch die gleichzeitige Gabe von Mevalonat und Statin nicht verändert. Alle 3 proteolytischen Untereinheiten hielten sich auf dem Aktivitätsniveau der Kontrollzellen. Auch der Vergleich der unterschiedlichen Statine zeigte keine Differenzen.
Summa summarum konnte mit diesen Versuchen gezeigt werden, dass die zellulären Veränderungen nach einer simultanen Mevalonatgabe nicht aus einer Modulation der Proteasomaktivität resultierten. Die Aktivierung oder die Wiederherstellung der proteasomalen Aktivität konnte nicht die Ursache der Aufhebung der pleiotropen Wirkung der Statine durch Mevalonsäure sein.
Simvastatin (Prodrug) hatte keinen Einfluss auf den Funktionszustand des Proteasoms der EA.hy926-Zellen. Die Aktivität der einzelnen Proteolyseeinheiten blieb auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle. Die Untersuchungen mit Atorvastatin zeigten ein vergleichbares Bild. Die Konzentration von 5 µM Atorvastatin verringerte die ChTL-Aktivität auf 84,4 % ± 17,5. Die Dosis von 10 µM Atorvastatin setze diese Aktivitätsänderung nicht fort, sondern kehrte sie wieder um. Es war eine ChTL-Aktivität von 104,5 % ± 11,3 zu messen (P=0,331). Die beiden anderen Proteolysezentren wurden in ihrer Aktivität nicht verändert. Die Aktivität blieb auf dem Niveau der Kontrolle. Atorvastatin konnte die proteasomale Funktion nicht hemmen. Pravastatin hatte ebenso keinen Effekt auf Aktivität des Proteasoms. Durch 1 µM Pravastatin sank die gemessene ChTL-Aktivität auf 84,6 % ± 12,9 bezüglich der Kontrolle. Mit der Dosissteigerung auf 10 µM hatte das Proteasom eine Aktivität von 79,7 % ± 3,0. In der statischen Auswertung konnte Pravastatin nicht als Inhibitor der ChTL erkannt werden (P=0,275). Die CaspL-Aktivität (P=0,984) und die TL-Aktivität (P=0,616) wurden ebenfalls nicht verändert.
Die gleichzeitige Zugabe von 400 µM Mevalonsäure zu den Statinen hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität. Somit zeigte sich auch nach einer 24-stündigen Inkubation kein direkt modulatorischer Effekt der Mevalonsäure auf das Zellproteasom.
In den glatten Muskelzellen verursachte die Gabe von Atorvastatin eine leichte Hemmung der
Die Gabe von Simvastatin (Prodrug) hatte keinen Einfluss auf den Funktionszustand des Proteasoms. Die Aktivität lag bei allen 3 proteolytischen Einheiten auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle um 100 % ± 13.
1 µM und 5 µM Pravastatin führten zu einem leichten Absinken der ChTL und der TL. Die CaspL-Aktivität blieb völlig unverändert. 10 µM Pravastatin senkte die Aktivität aller 3 Proteolyseeinheiten auf etwa 70 %. Anhand der statistische Analyse konnte dieses Absinken jedoch nicht als signifikant gesehen werden (ChTL (P=0,476), CaspL (P=0,343) und TL (P=0,162)). Die Behandlung mit Pravastatin war ebenfalls ohne Wirkung auf die Proteasomaktivität.
Mevalonat modulierte auch in den VSMCs die Proteasomaktivität nicht. Die Aktivität des Proteasoms lag auf dem Niveau der Lösungsmittelkontolle.
Bei der Auswertung der Ergebnisse der Statinbehandlung konnten nur punktuell Veränderungen der proteasomalen Aktivität gefunden werden. Lediglich die Gabe von Atorvastatin führte zu einer geringen Senkung der TL-Aktivität in den CPAE-Zellen nach 6-Stunden-Inkubation und der ChTL-Aktivität in den glatten Muskelzellen nach einer 24-Stunden-Behandlung. Die durch Atorvastatin erzeugte Hemmung fiel im Vergleich zu dem bekannten Proteasomhemmer Lactacystin deutlich geringer aus. Nach der Atorvastatinbehandlung hatten die Zellen noch eine Restaktivität von etwa 80 %. Weitere Effekte konnten durch Atorvastatin nicht erzeugt werden.
Die Behandlung vaskulärer Zelllinien mit den in der cholesterolsenkenden Therapie effektiv eingesetzten Statinen brachte nur vereinzelt eine Verringerung der proteasomalen Aktivität hervor. Somit konnten die phänotypischen Erscheinungen einer Statinbehandlung nicht auf eine Hemmung der proteasomalen Aktivität zurückgeführt werden. Des Weiteren verdeutlichten diese Ergebnisse, dass Statine in diesen moderaten Konzentrationen nicht als echte Hemmer des Proteasoms betrachtet werden konnten.
Die simultane Gabe von Mevalonsäure modulierte nicht die Proteasomaktivität. Somit ließen sich die mikroskopisch beobachteten Strukturveränderungen nicht auf proteasommodulatorische Effekte zurückführen.
Die zu untersuchenden Zelllinien wurden mit sehr hohen Konzentrationen dieses Zwischenproduktes des Cholesterolstoffwechsels behandelt. Es wurden Dosen zwischen 400 µM und 5 mM über eine Dauer von jeweils 24 und 48 Stunden verabreicht. Ziel dieser Versuche war, die These aufzugreifen, dass Mevalonat ein Aktivator der proteasomalen Aktivität sei [Rao 1999]. Die Resultate zeigten, dass Mevalonat in diesem Versuchsaufbau nicht als Aktivator der Proteasomaktivität zu werten war. Die proteasomale Aktivität blieb auf dem Niveau der Lösungsmittelkontrolle. Auch in den sehr hohen Konzentrationen blieb die Aktivität des Proteasoms bei 100 % ± 10. Daher ließen sich keine konzentrationsabhängigen Veränderungen nachweisen. Dieselben Ergebnisse ergaben sich auch bei einer 24-stündigen Behandlung mit dieser Substanz. Die Untersuchung der anderen Zelllinien brachte identische Ergebnisse hervor. Es konnte kein aktivitätssteigernder Einfluss beobachtet werden.
Schlussfolgernd aus diesen Ergebnissen lässt sich sagen, dass Mevalonat keinen modulatorischen Effekt auf das Proteasom hatte. Dieses Ergebnis deckte sich auch mit den Beobachtungen des Phänotyps.
Mit den Untersuchungen an isolierten 20S Proteasomen sollten direkte Effekte der HMG-CoA-Reduktase-Inhibtitoren und der Mevalonsäure auf die proteolytische Aktivität dieses Partikels dargelegt werden. Da in diesem Versuchsaufbau keinerlei zelluläre Elemente eine Rolle spielten, war es möglich, die sehr hohe Konzentration von 100 µM Statin zu verwenden. Es sollte gewährleistet werden, dass eine ausreichend hohe Konzentration der zu untersuchenden Substanzen im Reaktionsansatz war, um auch einen geringen Einfluss zu erkennen. Weiterhin fielen die verschiedenen zellulären Signalwege weg, so dass die Voraussetzung geschaffen war, direkte Effekte auf das Proteasom nachweisen zu können. Für die Messungen mit Mevalonsäure wurden dieselben Konzentrationen verwendet wie bei der zellulären Behandlung. Die isolierten 20S Partikel wurden in Anlehnung an die Arbeit von Wojcik über einen Zeitraum von 2,5 Stunden mit den Substanzen inkubiert [Wojcik 2000]. Der bekannte Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin wurde als Positivkontrolle verwendet.
Aus der Abbildung 20A geht hervor, dass die ChTL-Aktivität des Proteasoms durch die Statine sehr leicht erhöht und nicht gehemmt wurde. Die Behandlung mit Simvastatin (Prodrug) zeigte einen sehr geringen Effekt. Die Aktivität konnte, bezogen auf die Lösungsmittelkontrolle, auf 107,1 % ± 0,6 gesteigert werden (P=0,04). Nach der Behandlung mit 100 µM Atorvastatin lag die Aktivität bei 117,1 % ± 2,9 (P=0,014). Pravastatin erhöhte die Aktivität des isolierten 20S Proteasoms auf 116,9 % ± 3,5 (P=0,021). Im Vergleich dazu war die ChTL-Aktivität des Proteasoms nach einer Behandlung mit β-clasto Lactacystin fast vollständig gehemmt.
Auf die caspase-ähnliche Aktivität hatten die Statine keinen Einfluss. Die Aktivität lag nach 100 µM Simvastatin (Prodrug), 100 µM Atorvastatin und 100 µM Pravastatin vergleichbar auf dem Level der Lösungsmittelkontrolle. Durch Lactacystin wurde die CaspL-Aktivität erwartungsgemäß signifikant gehemmt. Auch hier wurde deutlich, dass die Statine das proteasomale Proteolysesystem nicht im Sinne von β-clasto Lactacystin inhibierten (Abb. 20B).
Bei den Versuchen am isolierten 20S Proteasom führte die Behandlung mit den Statinen nicht zu einer Hemmung der Proteasomfunktion. Die ChTL-Aktivität wurde durch die Statine leicht erhöht. Da diese Aktivierung mit einer sehr hohen Dosis erreicht wurde, kann davon ausgegangen werden, dass moderate Konzentrationen keinen Einfluss auf die proteasomale Aktivität haben würden. Dabei spielte die unterschiedliche Laktonringform der Statine keine Rolle. Anhand dieser Resultate konnte gezeigt werden, dass die proteasomale Aktivität durch die Statine nicht direkt moduliert wird.
Das Zwischenprodukt des Cholesterolstoffwechsels Mevalonsäure hatte keinen modulierenden Einfluss auf den Funktionszustand des isolierten 20S Proteasoms.
Mit den verschiedenen CSE-Hemmern wurde in den Cholesterolstoffwechsel der untersuchten Zellen eingegriffen. Dies führte zu strukturellen Zellveränderungen, Veränderungen im Wachstumsverhalten und einer veränderten Viabilität der Zellen. Mit steigender Konzentration der Statine wurden die Zellen länglich, rundeten sich ab und lösten sich von der Unterlage ab. In Konzentrationen über 10 µM wurden die vaskulären Zellen zytotoxisch verändert und die Nettowachstumsrate sank.
Atorvastatin konnte im zellulären System ein leichtes Absinken der ChTL (CPAE-Zellen - endotheliale Zelllinie) und der TL (VSMCs) erzeugen. Ansonsten hatten die Statine in diesem Versuchsaufbau keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität.
In den Versuchen mit isolierten 20S Proteasomen konnten 100 µM Statin die ChTL-Aktivität leicht erhöhen. Die anderen Aktivitäten wurden nicht beeinflusst. Anhand dieser Resultate zeigte sich, dass die CSE-Hemmer keinen direkten Einfluss auf das Proteasom hatten.
Die Statine waren weder als Inhibitoren noch als Aktivatoren des Proteasoms zu erkennen. Auch bestanden keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Laktonringformen. Aus den
Mevalonsäure hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität.
Die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren und die Mevalonsäure sind keine Modulatoren der proteasomalen Aktivität.
Die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren und der bekannte Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin haben große Ähnlichkeit im strukturellen Aufbau. Außerdem konnten viele der von der Enzymhemmung der HMG-CoA-Reduktase unabhängigen Effekte auch mit einem spezifischen Proteasomhemmer erreicht werden. Im Einzelnen wurden die pleiotropen Effekte der Statine auf das kardiovaskuläre System wie Regulation der eNOS, Verbesserung der Plaquestabilität und die Verhinderung der Zellproliferation auch bei der Proteasominhibition mit β-clasto Lactacystin beobachtet. Wegen dieser vergleichbaren biologischen Wirkung der beiden Substanzengruppen könnte neben dem Cholesterolstoffwechsel das Proteasom ein weiteres System sein, in das Statine regulatorisch eingreifen. Aus diesem Grund sollten die HMG-CoA-Reduktase-Hemmer hinsichtlich ihrer direkten Wirkung auf das 20S Proteasom untersucht werden.
Die Untersuchungen am aus Vollblut von Kaninchen gereinigten 20S Proteasomen konnten die Hypothese der direkten inhibitorischen Wirkung der Statine auf das Proteasom nicht bestätigen. Die ChTL-Aktivität wurde durch die Zugabe von 100 µM CSE-Hemmer leicht erhöht. Besonders Atorvastatin und Pravastatin steigerten die ChTL-Aktivität um 15 %, während die Aktivitätserhöhung durch Simvastatin (Prodrug) bei 7 % lag. Die anderen beiden Aktivitäten wurden nicht beeinflusst. Somit sind die Statine keine Inhibitoren des 20S Proteasoms im Sinne von β-clasto Lactacystin. Mit 10 µM des bekannten Proteasominhibitors konnte die Funktion der ChTL-Aktivität praktisch vollständig gehemmt werden. Die Aktivität der beiden anderen proteolytischen Untereinheiten wurde ebenfalls signifikant verringert.
In diesem Proteasommodell wurden die CSE-Hemmer in den sehr hohen Konzentrationen als sehr leichte Aktivatoren der ChTL-Aktivität identifiziert. Derartig hohe Konzentrationen an Statinen würden im Zellsystem nicht erreicht. Diese Konzentration lag weit oberhalb der Plasmakonzentration der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer und kann daher
Diesen beiden 20S Proteasommodellen stehen die Untersuchungen am Zellextrakt gegenüber. Hier wurde jeweils eine konzentrationsabhängige Inhibition mit der geschlossenen Laktonringform der Statine erzielt. Sowohl in MDA-MB-157-Zellen [Rao 1999], einer Brustkebszelllinie, sowie in differenzierten Neuroblastomzellen [Kumar 2002] inhibierte die geschlossene Ringform von Lovastatin konzentrationsabhängig die ChTL-Aktivität. In beiden Untersuchungen stellte sich deutlich heraus, dass die offene Ringform diese Hemmung nicht erzeugte. Anhand dieser Ergebnisse wurde bewiesen, dass die Statine mit der offenen Ringform ihr eigentliches Zielenzym, die HMG-CoA-Reduktase, hemmen, aber keinen Einfluss auf die proteolytischen Einheiten des Proteasoms haben [Rao 1999].
In den eigenen Studien haben weder die geschlossene Laktonringform, Simvastatin, noch die offenen Ringformen, Atorvastatin und Pravastatin, einen Einfluss auf die Aktivität des Proteasoms.
Die eigenen Erkenntnisse beruhen ausschließlich auf der Messung der proteasomalen Aktivität mit den fluorogenen Substraten. Aufgrund dieser Untersuchungsergebnisse können die Statine nicht als Modulatoren der proteasomalen Aktivität betrachtet werden. Somit bieten die Statine nicht die strukturellen Voraussetzungen, um wie Lactacystin das aktive Zentrum der proteolytischen Einheiten kovalent zu modifizieren, so dass eine Hemmung der Aktivität entstehen kann. Daraus ergibt sich, dass die pleiotropen Effekte, von denen vermutet wurde, dass sie sich durch eine direkte Hemmung der Proteasomaktivität erklären lassen, nicht über diesen Mechanismus entstehen.
Die proteasomale Aktivität wurde durch die Gabe von Mevalonat nicht verändert. Somit entfaltet Mevalonsäure ihre Wirkung nicht aufgrund einer direkten Einwirkung auf das 20S Proteasom. Deswegen kann sie nicht als Aktivator des Proteasoms, wie in der Arbeit von Rao
Es bestanden keine direkten Interaktionen zwischen den CSE-Hemmern, der Mevalonsäure und dem isolierten 20S Proteasom. Im zellulären System zeigten sich nach der Behandlung jedoch vergleichbare Struktureffekte zwischen den einzelnen Wirksubstanzen. Somit könnten zellulär vermittelte Signalwege eine Rolle spielen.
Durch die Behandlung vaskulärer Zelllinien mit Statinen und dem bekannten Proteasominhibitor β-clasto Lactacystin konnten verschiedene phänotypische Veränderungen beobachtet werden. Bereits geringe Konzentrationen der jeweiligen Substanzen führten zu starken zellulären Veränderungen. Mikroskopisch betrachtet zeichneten sich vergleichbare strukturelle Zellveränderungen ab. Diese parallele Wirkung zwischen den Statinen und den Proteasominhibitoren wurde auch in einer Brustkrebszelllinie [Rao 1999] beobachtet.
Zwischen den beiden Strukturformen der Statine, der geschlossenen Laktonringform und der offenen Form, gab es keine ausgeprägten Differenzen. Je höher die CSE-Hemmer konzentriert wurden, desto deutlicher waren degenerative Veränderungen ausgeprägt. Auch in C-26-Zellen [Wojcik 2000] und in murinen Neuroblastomzellen [Kumar 2002] waren diese Effekte nachgewiesen worden.
Nach einer Behandlung mit Pravastatin waren die Zellen weniger beeinträchtigt. Die degenerativen Veränderungen waren nicht so stark ausgeprägt. Sie waren jedoch sichtbar und nicht völlig abwesend, wie anhand von Versuchen an NB-Zellen von Kumar
Die eigenen Untersuchungen verdeutlichten, dass die endothelialen Zelllinien durch die Behandlung mit HMG-CoA-Reduktase-Hemmern deutlich stärker in ihrem Phänotyp verändert waren, als dies bei den glatten Muskelzellen der Fall war. Besonders die CPAE-Zellen waren durch die Inkubation mit Statinen stärker degenerativ verändert.
Die Wirkung der Statine in extrahepatischen Geweben hing davon ab, wie und ob die CSE-Hemmer in das Innere der Zelle gelangen [van Vliet 1995]. Ein unterschiedlicher Rezeptoren- und Transporterbesatz der verschiedenen Zelllinien stellte den limitierenden Faktor dar. Andererseits wäre es denkbar, dass sich die phänotypischen Differenzen durch ein unterschiedliches intrazelluläres Enzym- und Effektormuster erklären ließen. Eine weitere Erklärung wäre, dass die Menge an intrazytoplasmatischer HMG-CoA-Reduktase ebenfalls einen Einfluss hatte.
Statine werden in der Therapie von Hypercholesterolämie sehr wirkungsvoll eingesetzt. Bei der Genese atherosklerotischer Prozesse spielen vor allem endotheliale Vorgänge eine Rolle. Auch die pleiotropen Effekte der Statine beziehen sich vorwiegend auf das Endothel. Dies würde die sichtbaren Veränderungen der verschiedenen Zelllinien unter anderen erklären. Weiterhin könnte
In allen vaskulären Zelllinien konnte die simultane Gabe von Mevalonat die statin-induzierten Effekte vollständig aufheben. Die Zellen hatten ein vergleichbares Aussehen wie die unbehandelten Kontrollzellen. In den Arbeitsgruppen um Wojcik [Wojcik 2000] und Kumar [Kumar 2002] führte die simultane Inkubation der Zellen mit den Statinen und Mevalonat zu demselben Ergebnis. Durch die Gabe von Mevalonat konnten Effekte der HMG-CoA-Reduktase-Hemmung nachgewiesen werden.
In der Literatur stellte sich die Frage, ob Mevalonat als Aktivator der Proteasomaktivität zu sehen war [Rao 1999]. Die Ergebnisse zeigten, dass Mevalonsäure keinen Einfluss auf die strukturellen Veränderungen, die durch β-clasto Lactacystin verursacht wurden, hatte. Der Phänotyp war derselbe wie nach alleiniger Behandlung mit Lactacystin. Somit wurde nachgewiesen, dass auch auf struktureller Ebene die Statine nicht über eine Inhibition des Proteasoms wirkten. Die durch die CSE-Hemmer hervorgerufenen zellulären Veränderungen waren nicht auf eine Proteasomhemmung zurückzuführen, da durch Mevalonat die lactacystin-induzierten Veränderungen nicht aufgehoben wurden. Außerdem zeigte sich in Versuchen am isolierten 20S Proteasom, dass Mevalonsäure das Proteasom nicht beeinflusste. Dadurch wurde verständlich, dass die Aufhebung der strukturellen Veränderungen mittels gleichzeitiger Gabe von Mevalonat nicht durch eine Aktivitätsänderung des Proteasoms bedingt war. Die zellulären Veränderungen der Statine entstanden durch den Eingriff in den Stoffwechselweg des Cholesterols. So liefen die ähnlichen Strukturveränderungen im Zellsystem über andere Wege ab, dass heißt, es bestand ein Unterschied zwischen den statin-induzierten und den lactacystin-induzierten Effekten.
Das Zielsubstrat des Laktonrings der Statine ist die HMG-CoA-Reduktase. Dieser Ring bietet ein HMG-CoA-ähnliches Motiv, wodurch die Statine kompetitiv an der aktiven Seite des Enzyms binden können [Istvan 2001, Istvan 2003]. Damit wird Einfluss auf die Biosynthese von Isoprenoiden und Cholesterol genommen. Durch die Bindung an die HMG-CoA-Reduktase unterbleibt auch die Bildung der Isoprenylderivate [Goldstein 1990]. Durch die Gabe dieser Stoffwechselmetabolite wurden die Effekte komplett verhindert. Somit spielen die Isoprenoide bei der Regulation zellulärer Veränderungen eine spezifische Rolle.
Durch das Aktinzytoskelett werden eine Reihe wichtiger biologischer Funktionen vermittelt. Über diesen Weg werden strukturelle Voraussetzungen wie Zellform, die zelluläre Polarität sowie dynamische Prozesse wie Zellteilung und Wanderung reguliert [Hall 1998]. Vertreter der
Die Veränderungen im Zytoskelett der Zelle durch die Wirkung der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer hätten so einen direkten antiatherosklerotischen Effekt [Bellosta 1998].
Mittels des geschlossenen Laktonrings konnte β-clasto Lactacystin [Dick 1996] spezifisch an die N-terminalen Threoninreste der aktiven Zentren des Proteasoms binden. Durch die Modifikation der Threoninreste können die katalytischen Untereinheiten ubiquitinierte Proteine nicht mehr abbauen. Somit wurde die proteolytische Funktion des Proteasoms unterbrochen [Fenteany 1995].
Möglicherweise basierten die strukturellen Veränderungen durch β-clasto Lactacystin ebenfalls auf den Eingriff in das Aktinzytoskelett. Diese Strukturänderungen könnten möglicherweise mit den Folgen der Proteasomhemmung im Zusammenhang stehen.
Die Statine konnten weder in Untersuchungen am isolierten 20S Proteasom noch durch die mikroskopisch beobachteten Phänotypveränderungen als Proteasominhibitoren identifiziert werden. Konnte die Messung der zellulären Proteasomaktivität diese Aussage bekräftigen?
Im Zellsystem konnte Atorvastatin als leichter Inhibitor der proteasomalen Aktivität identifiziert werden. Nach einer 6-Stunden-Behandlung war die TL der CPAE-Zellen um 20 % gehemmt. Nach der 24-stündigen Inkubation mit Atorvastatin war die ChTL-Aktivität der glatten Muskelzellen um 15 % inhibiert. Die Inhibition mit Atorvastatin fiel verglichen mit der durch den bekannten Proteasomhemmer Lactacystin induzierten deutlich geringer aus. Weiterhin war zu bemerken, dass diese inhibitorischen Effekte ausschließlich bei der TL in CPAE-Zellen und der ChTL-Aktivität in VSMC-Zellen auftraten. Daher spielte vermutlich die geringe Hemmung der beiden proteolytischen Untereinheiten durch die offene Ringform Atorvastatin keine physiologische Rolle. In allen anderen untersuchten Zelllinien wurde die proteasomale Aktivität durch Atorvastatin nicht beeinflusst. Auch die unterschiedliche Dauer der Inkubation brachte keine Unterschiede hervor. Aus diesem Grund musste zu dem Ergebnis kritisch bemerkt werden, dass Atorvastatin nicht allgemeingültig als Proteasominhibitor bezeichnet werden konnte. Aufgrund dessen konnte die Schlussfolgerung gezogen werden, dass Atorvastatin kein direkter Proteasominhibitor im Sinne von β-clasto Lactacystin war. Eine vitale Beeinträchtigung der Zellen könnte möglicherweise die Ursache dieser Ergebnisse gewesen sein. Weiterhin ist bekannt, dass die Statine in den Zellzyklus [Laufs, Marra 1999] eingreifen. Dadurch konnten sich intrazellulär verschiedene Signalwege verändern, die möglicherweise zu diesen Resultaten führten.
Die untersuchten Statine, Simvastatin (Prodrug), Atorvastatin und Pravastatin, hatten keinen Einfluss auf den Aktivitätszustand des Proteasoms. Da alle Statine denselben Effekt hatten, konnte dementsprechend kein Unterschied zwischen der geschlossenen und der offenen β-Laktonringform gefunden werden. Anhand dieser Ergebnisse konnte nachgewiesen werden, dass die zellulären Strukturveränderungen nicht durch eine Proteasomhemmung erklärbar waren. Da das Proteasom nicht inhibiert war, konnten auch nicht davon ausgegangen werden, dass es zellulär vermittelte Signalwege gab, die eine Proteasomhemmung induzieren konnten.
Mit den Resultaten von Rao und Mitarbeitern [Rao 1999] übereinstimmend war die Tatsache, dass durch die offene Ringform der Statine keine Inhibition des Proteasoms erreicht wurde. Atorvastatin und Pravastatin hatten keinen Einfluss auf die proteasomale Aktivität in vaskulären Zelllinien. Anhand der untersuchten Zelllinien wurde gezeigt, dass das Proteasom weder durch die Vorstufenform noch durch die metabolische aktive Form der CSE-Hemmer verändert wurde. Diese Resultate fanden Zustimmung mit den Untersuchungen an differenzierten Neuroblastomzellen [Kumar 2002]. Hier wurde die proteasomale Aktivität durch die Vorstufenform von Lovastatin nicht gehemmt. Auch in anderen Versuchen konnte die offene Ringform keine Hemmung der proteasomalen Aktivität erzeugen [Wojcik 2000, Kumar 2002, Murray 2002]. Eine Aktivitätszunahme der ChTL wie sie die Ergebnisse von Wojcik
Die Resultate begründeten sich auf der Tatsache, dass die Statine sehr spezifische Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase sind [Istvan 2001]. Es genügten bereits geringe Dosen, um die HMG-CoA-Reduktase wirkungsvoll zu inhibieren. Wie anhand der isolierten 20S Partikel bewiesen wurde, bestand keine direkte Affinität zu den Strukturen des zellulären Proteasoms, die dazu geführt hätte, die Proteasomaktivität zu verändern. Im Zellkulturmodell standen die durch die starke Bindung an die HMG-CoA-Reduktase erzeugten Signalwege im Vordergrund.
Insgesamt hatten die Statine keinen einheitlichen Effekt auf die bisher untersuchten Zelllinien, was sich in der Literatur deutlich widerspiegelte. Es wurden vereinzelt Effekte beobachtet, die sich in allen untersuchten Zellmodellen unterschieden. Im zellulären System wurden sowohl inhibitorische als auch aktivitätssteigernde Effekte gesehen. Auf die Proteasomaktivität der vaskulären Zelllinien hatten die Statine keinen Einfluss. Somit kann nicht davon ausgegangen
Die simultane Gabe von Mevalonat hatte keine Auswirkungen auf die Proteasomaktivität. Ebenfalls in anderen Aktivitätsmessungen im Zellextrakt [Kumar 2002] wurde gezeigt, dass Mevalonsäure keinen Einfluss auf die proteasomale Aktivität in Kombination mit einer Statinbehandlung hatte. So sind diese Messergebnisse konträr zu den Resultaten, die Rao
Andere Effekte der Mevalonsäure konnten in Kombination mit den Statinen nicht beobachtet werden. Anhand der Experimente wurde herausgefunden, dass die Statine nicht mit dem Proteasom wechselwirkten, so dass eine Inhibition entsteht konnte. Weiterhin zeigte eine simultane Zugabe von Mevalonat keinen Effekt auf die Proteasomaktivität. Somit stellt sich aus diesen Untersuchungen heraus, dass Mevalonsäure nicht als Modulator des zellulären Proteasoms betrachtet werden kann.
Die Behandlung mit Mevalonsäure hatte keinen Effekt auf die proteasomale Aktivität.
Es ist bekannt, dass Statine durch die Hemmung der HMG-CoA-Reduktase einen antiproliferativen Einfluss auf das Zellwachstum haben. Dies hat seine Ursache in der Tatsache, dass die CSE-Hemmer durch ihren Eingriff in den Syntheseweg des Cholesterols die Bildung der Isoprenoidderivate [Goldstein 1990] verhindern. Dadurch konnten die kleinen GTP-bindenden Proteine nicht isoprenyliert werden, was dazu führte, dass diese inaktiv blieben. Rho spielt bei der Aufrechterhaltung und der Wiederherstellung der Zellmembran eine entscheidende Rolle. Dessen Inaktivierung durch die Statine führte dazu, dass die Zellen apoptotisch wurden [Guijarro 1998]. Dies geschah durch die Herunterregulation der Expression von Bcl-2, einem Inhibitor der Apoptose [Blanco-Colio 2002]. Zusätzlich wurde gezeigt, dass HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren die Aktivität der Caspase 9 [Blanco-Colio 2002] induzierten. Dadurch wurde die Zellmembran der Zelllinien zerstört, was sich wiederum in der Nettowachstumsrate widerspiegelte. Andererseits wurde beschrieben, dass die CSE-Hemmer effektiv in den Zellzyklus eingriffen, indem bestimmte Proteine des Zyklus, wie beispielsweise p27kip1 [Laufs, Marra 1999] und p21, nicht herunterreguliert wurden. Indem die DNA-Synthese verhindert wurde, blieb eine Zellteilung aus.
Dieser antiproliferative Effekt konnte in den eigenen Untersuchungen ebenfalls gesehen werden. Auf diese Weise konnte herausgearbeitet werden, dass die Statinbehandlung unter diesen Bedingungen und in diesen Konzentrationen wirksam war. Bereits in den niedrigen Konzentrationen, die für die Versuche verwendet wurden, zeichnete sich eine deutliche Verringerung des Zellwachstums ab. Durch die Statine wurde das Wachstum vollständig gehemmt oder sogar ein Rückgang der Zelldichte erreicht. Die verschiedenen Wirkformen der CSE-Hemmer unterschieden sich in dieser Eigenschaft kaum.
Durch diese Mechanismen könnten die Statine therapeutisch sehr effektiv in der Behandlung proliferativer Prozesse im Rahmen atherosklerotischer Veränderungen eingesetzt werden.
Mit Atorvastatin konnte die TL-Aktivität der CPAE-Zellen um 20 % und die ChTL-Aktivität der VSMCs um 15 % gehemmt werden. Diese Hemmung war von der Stärke weit von der entfernt, die durch Lactacystin erzielt wurde. Um physiologisch bedeutsame Effekte der Proteasomhemmung zu erkennen, bedurfte es einer stärkeren Inhibition, als sie durch Atorvastatin erzeugt wurde. Außerdem waren nur einzelne proteolytische Zentren betroffen.
Die ChTL-Aktivität scheint die geschwindigkeitsbestimmende Aktivität für den Abbau der Proteine zu sein [Kisselev 2001]. Somit hätte eine Inhibition dieser Peptidaseaktivität entscheidende Auswirkungen auf zelluläre Vorgänge. In den eigenen Versuchen wurde eine vollständige Hemmung mit Atorvastatin nicht erreicht. Somit spielte die 15 %ige Hemmung der ChTL keine physiologische Rolle. In anderen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Intensivierung der ChTL-Hemmung nicht direkt in Beziehung mit der Reduktion des Proteinabbaus stand. Eine stärkere Hemmung der ChTL regulierte entsprechend die Umsatzrate der beiden anderen Aktivitäten hoch [Kisselev 2001].
Anhand vorheriger Ergebnisse gezeigte sich, dass eine selektive Hemmung der TL-Aktivität praktisch keine Veränderung der Abbaurate zur Folge hatte. Die Größe der Peptidfragmente blieb erhalten. Es änderte sich lediglich das Peptidprodukt [Kisselev 1999].
Hauptsächlich die Hemmung der chymotrypsin-ähnlichen Aktivität führte zu einer starken Veränderung des Proteinabbaus [Rock 1994, Heinemeyer 1997]. Um die therapeutisch günstigen Effekte der Proteasominhibition zu erreichen, wäre es aus diesem Grund sinnvoll, die ChTL-Aktivität effektiv zu hemmen. Somit könnte ein günstiges Profil der Regulation geschaffen werden, um die positiven Einflüsse der Proteasomhemmung auf das kardiovaskuläre System zu nutzen. Zu diesem Zweck der Atheroskleroseregulation können die Statine nicht verwendet werden, da sie kein proteasominhibitorisches Potential besitzen.
Statine werden in der Therapie von Hypercholesterolämie sehr effektiv eingesetzt. Durch ihren Eingriff in den Cholesterolstoffwechsel über eine Hemmung der HMG-CoA-Reduktase wird die Bildung des Cholesterols verhindert. Aus therapeutischer Sicht wirken sie sich auf diese Weise sehr günstig auf atherosklerotische Veränderungen aus.
In zahlreichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass β-clasto Lactacystin, ein bekannter Proteasominhibitor, und die CSE-Hemmer gemeinsame biologische Wirkungen aufweisen. Weiterhin ließ sich eine strukturelle Ähnlichkeit, in Form des β-Laktonrings, zwischen den Statinen und β-clasto Lactacystin erkennen [Rao 1999]. Aufgrund dieser Parallelitäten wurde vermutet, dass die Statine ihre Wirkung zum Teil über eine Hemmung des Proteasoms entfalten.
In Zellkulturexperimenten wurden die Effekte von Simvastatin (Prodrug), Atorvastatin, Pravastatin und dem Proteasomhemmer Lactacystin auf zwei Endothelzelllinien (CPAE und Ea.hy926) und primäre vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) bezüglich ihres Verhaltens auf die Morphologie, die Proliferation, die Viabilität und die Proteasomaktivität untersucht. Sowohl die Statine als auch Lactacystin induzierten vergleichbare morphologische Veränderungen und beeinflussten die Proliferation von CPAE-Zellen. In den eigenen Versuchen konnten die durch Statine induzierten Effekte durch Mevalonat revertiert werden. Die durch Lactacystin verursachten Veränderungen wurden durch Mevalonsäure nicht beeinflusst. Wie erwartet hemmte Lactacystin in den untersuchten CPAE-Zellen signifikant die proteasomale Aktivität. Im Gegensatz dazu blieb die Proteasomaktivität nach einer Statinbehandlung unbeeinflusst. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in den Ea.hy926 und den VSMCs deutlich. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sogar hohe Dosen der Statine die Aktivität der gereinigten 20S Proteasomen nicht modulieren.
Anhand der Ergebnisse zeigt sich, dass die ähnlichen biologischen Effekte der Statine und des Lactacystins nicht über den gemeinsamen Mechanismus der Proteasominhibition funktionieren.
Die Statine spielen bei der Regulation des Cholesterolstoffwechsels eine entscheidende Rolle. Sie werden sehr erfolgreich in der Therapie atherosklerotischer Erkrankungen eingesetzt. Ihre positiven Eigenschaften lassen sich nicht durch eine Modulation der Proteasomaktivität erklären.
Ich bedanke mich bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Karl Stangl für die Bereitstellung dieses interessanten wissenschaftlichen Themas zur Erstellung einer Doktorarbeit. Ich danke für die Betreuung.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern und meiner Familie. Durch ihre Unterstützung, ihren Beistand und vor allem ihre Geduld war es mir möglich, mich intensiv auf die Arbeit an diesem wissenschaftlichen Thema zu konzentrieren.
Weiterhin danke ich meiner persönlichen Betreuerin Frau Dr. Antje Ludwig für die intensive Betreuung, die gewinnbringenden Diskussionen und die zahlreichen Denkanstöße. Weiterhin gilt mein besonderer Dank den beiden MTA Frau Susanne Metzkow und Frau Andrea Weller für die gute und herzliche Zusammenarbeit im Labor. Durch sie habe ich eine Menge gelernt. Außerdem bedanke ich mich bei den anderen MitarbeiterInnen für die herzliche Aufnahme und die sehr hilfreichen Ratschläge. Für die fruchtbaren Diskussionen, vielzähligen Hinweise sowie die Unterstützung bin ich sehr dankbar. Die interessante Tätigkeit und das wunderbare Klima haben mir die Zeit sehr angenehm gestaltet. Danke.
Abschließend danke ich der Arbeitsgruppe um Herr Dr. T. Grune für die Bereitstellung der isolierten 20S Proteasomen. Damit war es mir möglich meine Doktorarbeit weiter zu detaillieren.
Mit dieser Schrift erkläre ich, dass diese Dissertation von mir selbst und ohne die unzulässige Hilfe dritter Personen verfasst wurde.
Weiterhin erkläre ich, dass keine Auszüge anderer Arbeiten in dieser Promotionsarbeit verwendet wurden.
Ich bestätige, dass alle benutzten Hilfsmittel angegeben wurden und dass alle verwendeten literarischen Quellen im Literaturverzeichnis vollständig sind.
Mit meiner Unterschrift bestätige ich die Angaben.