Aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Einfluß des Cyclooxygenase-2-Inhibitors NS-398 auf Proliferation und Apoptose von Ovarialkarzinomzellinien

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Antje Fürstenberg
aus Rathenow

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Steffen Hauptmann
2. Prof. Dr. Peter Dall
3. Prof. Dr. Sigurd Lax

Datum der Promotion:10.05.2004

Abstract

Several studies have provided evidence that the Cyclooxygenase-2 (COX-2) plays a key role in tumorigenesis and that this enzyme is linked to malignancy and prognosis of cancer. Therefore, COX-2-inhibitors are already evaluated in clinical trials as chemotherapeutics against diverse cancers, such as breast, prostate and colorectal cancer. COX-2 is the inducible isoform of cyclooxygenase - the enzyme catalyzing the synthesis of prostaglandins and other eicosanoids. Several studies suggest that COX-2 plays an important role in tumor development and progression. The usefulness of cyclooxygenase-inhibitors (Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs) as drugs against cancer has already been investigated in animal models and cell culture experiments. The results of these studies have shown, however, that it is not clear, whether the observed antitumor effects of NSAIDs are due to inhibition of the COX-enzyme or mediated via a COX-independent mechanism through a so-called non-COX-target.

In the present study we investigated effects of inhibition of COX isoforms by the NSAID

NS-398, a selective COX-2-inhibitor, as well as by COX-isoform specific RNA interference (RNAi) in the human ovarian carcinoma cell lines OVCAR-3 and SKOV-3. OVCAR-3 cells showed a constitutive expression of COX-1 and a highly inducible expression of COX-2 after stimulation with interleukin-1ß resulting in production of high levels of Prostaglandin E2 (PGE2). SKOV-3 cells were negative for both COX isoforms. While COX-2-inhibition with RNAi reduced PGE2-levels in the supernatants of OVCAR-3, COX-1-inhibition by RNAi had no influence on PGE2-production measured by PGE2-specific ELISA. Therefore COX-2 seems to be the main source of PGE2 in OVCAR-3 cells. In these cells PGE2-synthesis - and thus the COX-2-enzyme activity - was completely inhibited by NS-398 in concentrations of 1µM. Increasing amounts of NS-398 (>10µM) had an additional antiproliferative effect. This growth inhibition was also observed in the COX-negative cell line SKOV-3 and could not be reverted by exogenous addition of PGE2 (10µM). Flowcytometric analysis revealed, that this growth inhibition was based on a G0/G1-cell-cycle-arrest. There was no evidence for apoptosis induced by NS-398. In contrast, neither COX-1 nor COX-2-inhibition by RNAi led to similar effects on proliferation and cell cycle progression as observed with NS-398. COX-RNAi also did not induce apoptosis.

These results suggest that a COX-independent mechanism is responsible for the NS-398 induced G0/G1-arrest. Further investigations are needed to elucidate how NS-398 induces cell cycle arrest. Hopefully, this would make it possible to increase the specificity of NS-398 and other NSAIDs as chemotherapeutics.

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Das klassische Target der NSAIDs: Die Cyclooxygenase
    • 1.1.1 Die physiologische Rolle der Cyclooxygenase
    • 1.1.2 Die Prostaglandine
    • 1.1.3 Die Isoformen der Cyclooxygenase
    • 1.1.4 Inhibitoren der COX-1 und COX-2 - selektive COX-Hemmer
    • 1.1.5 COX-2-Expression und Malignität
    • 1.1.6 Erklärungsmodelle zu den tumorigenen Eigenschaften der COX-2
      • 1.1.6.1 Inhibition der Apoptose – Steigerung der Proliferation
      • 1.1.6.2 Steigerung der Angiogenese
      • 1.1.6.3 Steigerung der Invasivität
      • 1.1.6.4 Modulation von Inflammation und Immunosuppression
      • 1.1.6.5 Konversion von Prokarzinogenen zu Karzinogenen
    • 1.1.7 Chemotherapie mit COX-2-Inhibitoren
      • 1.1.7.1 Apoptoseinduktion
      • 1.1.7.2 Beeinflussung der Invasivität und Metastasierung
      • 1.1.7.3 Hemmung der Zellproliferation
  • 1.2 Die non-COX-Targets
    • 1.2.1 Targets in Signaltransduktionswegen der Apoptose
    • 1.2.2 Targets mit Einfluß auf die Zellproliferation
  • 1.3 Ovarialkarzinome, COX-2 und NSAIDs
• 2 Zielstellung
• 3 Material und Methoden
  • 3.1 Antikörper, Chemikalien und Kits
  • 3.2 Instrumente, Software und Verbrauchsmaterial
  • 3.3 Gele, Puffer und Lösungen
  • 3.4 Zellinien und Zellkultur
  • 3.5 XTT-Proliferationsassay
  • 3.6 siRNA-Transfektion
  • 3.7 PGE2-ELISA
  • 3.8 Durchflußzytometrie
    • 3.8.1 Annexin V/PI
      • 3.8.1.1 Der Zellzyklus in der Durchflußzytometrie
    • 3.8.2 DNA-Färbung nach Nicoletti
    • 3.8.3 BrdU/PI-Labeling
  • 3.9 Western Blot
  • 3.10 Signifikanztestung
• 4 Ergebnisse
  • 4.1 Beeinflussung der Zellproliferation durch Cyclooxygenase-2-Inhibition
    • 4.1.1 Einfluß von NS-398 auf die Proliferation
      • 4.1.1.1 Inhibition der PGE2-Produktion durch NS-398
      • 4.1.1.2 PGE2-Einfluß auf die Proliferationshemmung durch NS-398
    • 4.1.2 Einfluß von Indomethacin auf die Proliferation
    • 4.1.3 Proliferationseinfluß von COX-1- und COX-2-siRNA
      • 4.1.3.1 PGE2-Synthese bei der COX-2-Auschaltung durch siRNA
  • 4.2 Beeinflussung der Apoptose durch Cyclooxygenase-2-Inhibition
    • 4.2.1 Einfluß von NS-398 auf die Apoptose
      • 4.2.1.1 Apoptosemessung mit der Nicoletti-Färbung
      • 4.2.1.2 Apoptosemessung mit der Annexin V/PI-Färbung
    • 4.2.2 Einfluß auf die Apoptose durch COX-1-, COX-2-siRNA
  • 4.3 COX-2-Inhibition - Einfluß auf den Zellzyklus
    • 4.3.1 Einfluß von NS-398 auf den Zellzyklus
    • 4.3.2 Beeinflussung des Zellzyklus durch COX-1- und COX-2-siRNA
    • 4.3.3 Einfluß von NS-398 auf die S-Phase des Zellzyklus
• 5 Diskussion
  • 5.1 Einfluß von NS-398 auf Proliferation und Apoptose von Ovarialkarzinomzellinien
    • 5.1.1 NS-398 führt in den untersuchten Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3 zu Proliferations-hemmung durch Akkumulation der Zellen in der G0/G1-Phase
    • 5.1.2 Die Transfektion von OVCAR-3 mit COX-1- bzw. COX-2-siRNA bewirkt keine Proliferationshemmung
    • 5.1.3 NS-398 bewirkt keine Apoptose in den Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3
    • 5.1.4 Die Transfektion von OVCAR-3 mit COX-1- bzw. COX-2-siRNA bewirkt keine Apoptose
    • 5.1.5 Die durch NS-398 induzierte Proliferationshemmung ist vermutlich COX-1- und COX-2-unabhängig
  • 5.2 Mögliche Zellzyklus-Targets der NSAIDs
  • 5.3 Apoptosepriming durch NSAIDs – klinische Perspektiven
• 6 Zusammenfassung und Ausblick
• Literaturverzeichnis
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1 : Auswahl von Funktionen und Rezeptoren der Prostaglandine [6,12]
• Tabelle 2 : Die Isoenzyme der Cyclooxygenase [7,13]
• Tabelle 3 : Experimentelle Untersuchungen zum Zusammenhang von Tumormalignität und COX-2-Expression
• Tabelle 4 : Experimentelle Hinweise für Apoptoseinduktion durch COX-2-Hemmer im Zellinien-modell
• Tabelle 5 : Effekt von NS-398 und IL-1ß auf den Zellzyklus in zwei Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von mindestens drei unabhängigen Experimenten. t-Test: zweiseitig, gepaart, * NS-398 vs. Kontrolle; ⁺NS-398/IL-1ß vs. Kontrolle/IL-1ß
• Tabelle 6 : Effekt der siRNA-Transfektion auf den Zellzyklus bei OVCAR-3. Die Zellen wurden nach 24h Inkubation mit siRNA (je 60pM) mit und ohne IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) geerntet, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von mindestens drei unabhängigen Experimenten
•   Tabelle 7 : Proliferationshemmung durch selektive COX-2-Inhibitoren und Expressions-steigerung (↑) oder Expressionsminderung (↓) von Zellzyklusproteinen als mögliche Targets der NSAIDs

Bilder

• Abbildung 1 : Die Phospholipase A₂ spaltet aus Membranphospholipiden die Arachidonsäure ab. Durch die Cyclooxygenase wird zunächst die Säure durch Oxidation zum instabilen Prostaglandin G₂ zyklisiert und anschließend durch die Peroxidaseaktivität der COX zum Prostaglandin H₂ (PGH₂) oxidiert. Ausgehend davon werden je nach enzymatischer Ausstattung der Zelle weitere Prostaglandine hergestellt.
• Abbildung 2 : Selektivitäten der NSAIDs nach Warner [15]
• Abbildung 3: Darstellung der Inhalte der Quadranten bei der Annexin V-FITC/PI-Messung
• Abbildung 4: Phasen des Zellzyklus im DNA-Histogramm
• Abbildung 5 : SubG1-Peak als Ausdruck von apoptotischer DNA-Fragmentierung
• Abbildung 6 : Darstellung der S-Phase des Zellzyklus mittels BrdU-Färbung
• Abbildung 7 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von NS-398 (1µM-500µM) für 72h, unstimuliert oder unter COX-2-Stimulation durch IL-1ß (10ng/ml). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.
• Abbildung 8 : Einfluß des NS-398-Lösungsmittels DMSO auf die Proliferation unter COX-2-Stimulation mit IL-1ß (10ng/ml). Die höchste DMSO-Konzentration (5µM) entspricht der höchsten NS-398-Konzentration in allen gezeigten Experimenten (500µM). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.
• Abbildung 9: Produktion von PGE2 in OVCAR-3. Die Zellen wurden 48h mit verschiedenen Konzentrationen NS-398 (1µM-50µM) inkubiert und 24h vor Abnahme der Überstände mit  IL-1ß (10ng/ml) stimuliert. Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 10 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien, nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von NS-398 (100-500µM) für 72h, mit und ohne PGE2-Zugabe (10µM). Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus drei unabhängigen Experimenten mit je Vierfachansätzen.
• Abbildung 11 : Zellwachstumskurven, dargestellt in Prozent der Kontrolle für zwei Ovarialkarzinomzellinien, nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Indomethacin (50-500µM) für 72h. Ergebnisse (Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes) aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 12 : Western Blot: COX-2-Expression in OVCAR-3 nach COX-2-siRNA-Transfektion. Als Transfektionskontrolle diente Lamin A/C-siRNA. Inkubation für 72h und Stimulation mit IL-1ß (10ng/ml) 24h vor der Zellernte. Der ß-Aktin-Antikörper wurde als Western Blot Kontrolle benutzt zum Vergleich der jeweils aufgetragenen Proteinmengen.
• Abbildung 13 : Zellwachstum, dargestellt in Prozent der Kontrolle für OVCAR-3 nach Transfektion mit COX-1-, COX-2- und Lamin A/C-siRNA (jeweils 60pM) und Inkubation mit NS-398 (200µM) für 72h, mit IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) Ergebnisse (Mittelwert und Standardabweichung) aus drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 14 : Produktion von PGE2 bei OVCAR-3. Die Zellen wurden 72h mit der jeweiligen siRNA (60pM) bzw. als Kontrolle Oligofectamin inkubiert und 24h vor Abnahme der Überstände mit IL-1ß (10ng/ml) stimuliert. Ergebnisse (Mittelwerte und Standardabweichungen) von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 15 : Nicoletti-Färbung und durchflußzytometrische Bestimmung von OVCAR-3 und SKOV-3 nach 72h Behandlung mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml). Der Zelltod wird angegeben in Prozent (unter dem Balken) aller gemessenen Zellen. Darstellung eines repräsentativen Experiments von drei Experimenten.
• Abbildung 16 : Zelltod in % bei OVCAR-3 und SKOV-3 nach Behandlung mit NS-398 (50µM und 200µM) und NS-398 mit IL-1ß-Stimulation (10ng/ml) für 72h. Der Zelltod wurde mit der Annexin V/PI-Färbung bestimmt. Als Kontrolle diente das NS-398-Lösungsmittel DMSO in der höchsten Inhibitor-Konzentration. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 17 : Auswirkung der siRNA-Transfektion auf die Apoptose. OVCAR-3 wurden für 48h mit der Transfektionskontrolle Lamin A/C-siRNA, COX-1-siRNA, COX-2-siRNA (je 60pM) bzw. COX-1/COX-2-siRNA (je 30pM) inkubiert, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Die Apoptoserate ist unterhalb des Markers in Prozent dargestellt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 18 : Auswirkung der siRNA-Transfektion auf die Apoptose. OVCAR-3 wurden für 48h mit der Transfektionskontrolle Lamin A/C-siRNA, COX-1-siRNA, COX-2-siRNA (je 60pM) bzw. COX-1/COX-2-siRNA (je 30pM) inkubiert, mit Annexin V-FITC/PI gefärbt und durchflußzytometrisch bestimmt. Die Apoptoserate ist innerhalb bzw. neben den Quadranten in Prozent dargestellt. Ein repräsentatives Experiment von drei unabhängigen Experimenten mit  48-72h-Inkubation.
• Abbildung 19 : Effekt von NS-398 und IL-1ß auf den Zellzyklus in zwei Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) bzw. NS-398 und IL-1ß (10ng/ml) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnis eines repräsentativen Experiments von mindestens drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 20 : Effekt der Transfektion mit COX-2-siRNA (60pM) auf den Zellzyklus bei OVCAR-3. Die Zellen wurden nach 24h Inkubation mit siRNA geerntet, mit der Nicoletti-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Ergebnis eines repräsentativen Experiments von mindestens drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 21 : Effekt von NS-398 auf die S-Phase der Zellinien OVCAR-3 und SKOV-3. Die Zellen wurden 24h mit NS-398 (200µM) inkubiert. Als Kontrolle diente das Lösungsmittel DMSO. Die Zellen wurden mit der BrdU-Methode aufbereitet und durchflußzytometrisch bestimmt. Die S-Phase wurde mit der Software CellQuest analysiert. Ergebnis (Mittelwert und Standardabweichung) von drei (OVCAR-3) bzw. zwei (SKOV-3) unabhängigen Experimenten.