1 Einleitung

↓1

Die Gruppe der Nichtsteroidalen Antiphlogistika (Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs) weist eine lange Geschichte in der Medizin auf. Seit der ersten Anwendung von Aspirin 1899 bei einer Arthritis haben die NSAIDs aufgrund ihrer antientzündlichen, antipyretischen und analgetischen Eigenschaften und den daraus resultierenden vielfältigen therapeutischen Einsatzmöglichkeiten einen hohen Stellenwert erlangt. Das Spektrum reicht von der Behandlung von Kopfschmerzen bis zur Therapie kardiovaskulärer, entzündlicher und rheumatischer Erkrankungen. Seit einiger Zeit wird auch ihr chemopräventiver Einsatz in bezug auf verschiedene Krebserkrankungen diskutiert. Mehrere epidemiologische Studien haben gezeigt, daß durch die Einnahme von Aspirin und anderen NSAIDs das Risiko, an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken, deutlich gesenkt wird [1,2]. Bei Patienten mit Familiärer adenomatöser Polyposis (FAP) konnten durch Gabe von Sulindac sowohl die Größe als auch die Anzahl der Polypen signifikant reduziert werden [3,4].

Derzeit laufen bereits Phase II/III-Studien zum Einsatz von Celecoxib (Celebrex® von Pharmacia/Pfizer) als neoadjuvantes Therapeutikum bei metastasierendem Brustkrebs, Bronchialkarzinomen, kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, Kopf-Hals-Tumoren und Melanomen [5].

Jedoch wird der Mechanismus, über den die NSAIDs ihre chemopräventiven Effekte vermitteln, derzeit kontrovers diskutiert, denn die Ergebnisse von Zellkulturexperimenten und Tierversuchen zeichnen ein sehr vielfältiges Bild mit teils widersprüchlichen Erkenntnissen.

↓2

Der seit langem bekannte Angriffspunkt dieser Medikamente in der Zelle besteht in der Inhibition des Enzyms Cyclooxygenase (COX), auch genannt Prostaglandin Endoperoxid H Synthase (PGH-Synthase, PHS) [6].

Insbesondere die COX-2, eine Isoform der Cyclooxygenase, rückte in den letzten Jahren ins Zentrum wissenschaftlichen Interesses, da dieses Enzym in Zusammenhang mit Tumorentstehung und -progression gebracht werden konnte [7].

Kürzlich veröffentlichte Ergebnisse der Arbeitsgruppe zeigen, daß die COX-2 einen unabhängigen Prognosefaktor in Ovarialkarzinomen darstellt [8].

↓3

In dieser Arbeit soll die Wirkung des selektiven COX-2-Inhibitors NS-398 auf epitheliale Ovarialkarzinome in der Zellkultur untersucht werden.

1.1 Das klassische Target der NSAIDs: Die Cyclooxygenase

1.1.1 Die physiologische Rolle der Cyclooxygenase

Die Cyclooxygenase ist ein Schlüsselenzym des Arachidonsäurestoffwechsels (Abb.1). Sie ist neben der Lipoxygenase maßgeblich an der Herstellung von Eikosanoiden beteiligt. Eikosanoide stellen einen Oberbegriff für Prostaglandine, Thromboxane und Leukotriene dar. Hierbei handelt es sich um Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren, speziell der Arachidonsäure. Diese Verbindungen werden in den meisten tierischen Geweben produziert. Dort vermitteln sie z.B.

Reaktionen auf hormonelle Stimuli oder Entzündungsreize.

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Abbildung 1 : Die Phospholipase A2 spaltet aus Membranphospholipiden die Arachidonsäure ab. Durch die Cyclooxygenase wird zunächst die Säure durch Oxidation zum instabilen Prostaglandin G2 zyklisiert und anschließend durch die Peroxidaseaktivität der COX zum Prostaglandin H2 (PGH2) oxidiert. Ausgehend davon werden je nach enzymatischer Ausstattung der Zelle weitere Prostaglandine hergestellt.

Die Stimuli zur Herstellung der Prostaglandine umfassen vielfältige zellspezifische, physiologische, physikalische und pharmakologische Reize [9]. Beispiele physiologischer Stimuli sind Histamin, Bradykinin, Arginin Vasopressin, Platelet Activating Factor, Angiotensin II, Interleukin-1, Leukotriene und Thrombin. Diese bewirken typischerweise über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren der Zellmembran die Aktivierung der Phospholipase und somit die Freisetzung der Arachidonsäure. Zu den physikalischen Stimuli zählen z.B. endotheliale Scherkräfte. Pharmakologische Stimuli sind u.a. Substanzen, die die intrazelluläre Ca2+-Konzentration erhöhen, da das Wirkoptimum der Phospholipasen bei höheren Ca2+-Konzentrationen liegt. Es gibt auch Hinweise auf eine direkte Aktivierung der Phospholipasen durch Proteinkinase C-abhängige Phosphorylierung.

Schließlich kann die Arachidonsäure auch selbst die Herstellung von Prostaglandinen aktivieren. Sie soll der interzellulären Kommunikation dienen, indem sie von einer Zelle freigesetzt zur vermehrten Prostaglandinherstellung in der Nachbarzelle führen kann. Auf diese Art wird z.B. in Makrophagen die Thromboxansynthese durch Thrombozyten aktiviert.

1.1.2 Die Prostaglandine

↓5

Prostaglandine wirken sowohl autokrin als auch parakrin. Sie werden vermutlich durch Carrier aus der Zelle herausgeschleust. Die Rezeptoren der Prostaglandine sind second messenger –gekoppelt, teils via Adenylatzyklaseaktivierung und resultierendem cAMP-Anstieg, teils durch IP3-vermittelten Ca2+-Anstieg. Die Funktionen der Prostaglandine sind je nach Art und Gewebe äußerst verschieden und oftmals gegensätzlich. Sie reichen von Vasokonstriktion vs. Vasodilatation, Stimulation vs. Inhibition der Plättchenaggregation bis zu Immunsuppression bzw. -modulation (Tab.1). Einige Arbeiten zeigen, daß exogen applizierte Prostaglandine die Proliferation von Tumorzellen fördern [10,11].

Tabelle 1 : Auswahl von Funktionen und Rezeptoren der Prostaglandine [6,12]

Prostaglandin

Vorkommen

Funktion

Rezeptoren

Prostaglandin D2

(PGD2)

Mastzellen, Gehirn

inhibiert Plättchenaggregation, Bronchokonstriktion, Schlafinduktion

DP1, DP2

Prostaglandin E2

(PGE2)

Gehirn, Niere, glatter Muskel von Blutgefäßen, Thrombozyten

 

EP1, EP2,

EP3, EP4

Prostaglandin F2α

(PGF2α)

Uterus, Lunge, glatter Muskel von Blutgefäßen, Auge

 

FPα, FPβ

Prostacyclin

(PGI2)

Endothel, Niere, Thrombozyten,

Gehirn

inhibiert Plättchenaggregation,

Vasodilatation

IP3

Thromboxan A2

(TXA2)

Thrombozyten,

glatter Muskel von Blutgefäßen, Makrophagen, Niere

Plättchenaggregation,

Vasokonstriktion

TPα, TPβ

1.1.3 Die Isoformen der Cyclooxygenase

Seit 1993 ist nachgewiesen, daß die Cyclooxygenase in zwei Isoformen existiert [13]. Die Gene befinden sich auf verschiedenen Chromosomen: COX-1 auf Chromosom 9, COX-2 auf Chromosom 1. Die Proteine sind zu 61% identisch, haben denselben Reaktionsmechanismus und ähnliche Affinität für ihr Substrat Arachidonsäure. Allerdings unterscheiden sie sich deutlich im Expressionsmuster und in ihrer Sensitivität gegenüber NSAIDs. Die COX-1 ist konstitutiv in den meisten Geweben exprimiert. Sie versorgt die Zellen mit den notwendigen Prostaglandinen zur Wahrnehmung physiologischer Funktionen, z.B. als Magenschleimhautschutz oder zur Regulation des renalen Blutflusses. Hingegen wird die COX-2 nur in einigen Organen im Rahmen von Adaptationsvorgängen physiologisch exprimiert, so z.B. bei Wundheilung, Ovulation, Weheninduktion. In Entzündungsgebieten wird die COX-2 durch inflammatorische Stimuli induziert. Ihre Expression ist stark reguliert (Tab.2).

↓6

Mittlerweile wurde auch die Existenz weiterer Isoformen der COX (COX-3, PCOX-1a) beschrieben [14]. Da jedoch bisher zuwenig Informationen über deren Expression und Rolle vorliegen, kann im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter darauf eingegangen werden.

Tabelle 2 : Die Isoenzyme der Cyclooxygenase [7,13]

 

COX-1

COX-2

Regulation

konstitutiv

induzierbar durch TNF, Lipopolysaccharid, IL-1,

Phorbolester, TPA

Molekulargewicht

72kDa

72kDa und 74kDa

Größe des Gens

22 kB

8.3 kB

humanes Chromosom

Chromosom 9

Chromosom 1

Größe der mRNA

2.7 kB

4.5 kB

Lokalisation

Endoplasmatisches Retikulum,

Kernhülle

Endoplasmatisches Retikulum,

Kernhülle

Gewebeexpression

ubiquitär

Niere, Kolon, Gehirn, Rückenmark, Ductus deferens, Entzündungsgebiete, Malignome

Promotor

 

NFκB, NF-IL6, CRE, TCF

1.1.4 Inhibitoren der COX-1 und COX-2 - selektive COX-Hemmer

Die Cyclooxygenase ist das Target der NSAIDs. Diese Substanzen interagieren mit dem aktiven Zentrum des Enzyms, indem sie die Bindung von Arachidonsäure unterdrücken. Sie haben jedoch keinen Einfluß auf die Peroxidaseaktivität [6]. Die COX-Hemmung durch Aspirin ist aufgrund der kovalenten Bindung irreversibel und dadurch von großer pharmakologischer Bedeutung insbesondere bei der Thrombozytenaggregationshemmung. Thrombozyten sind aufgrund ihres fehlenden Zellkerns nicht in der Lage, das Enzym nachzubilden. Daher wirkt die Hemmung über die gesamte Lebensdauer der Zelle, die ungefähr fünf Tage beträgt. Bei der dauerhaften Anwendung von Aspirin und anderen nichtselektiven NSAIDs tritt als unerwünschte Nebenwirkung ein erhöhtes Risiko für Plättchendysfunktion, Blutungen und Bildung von gastrointestinalen Ulzera und Nierenschäden auf, denn mit der Inhibition der COX-1 wird die Produktion von physiologisch notwendigen Prostaglandinen gehemmt. Aus diesem Grund wurde versucht, die Selektivität der NSAIDs für die COX-2 zu erhöhen. Da sich die Isoenzyme an der NSAID-Bindungsstelle in einer Aminosäure unterscheiden, war es möglich, durch chemische Modifizierung funktioneller Gruppen selektive COX-2-Inhibitoren herzustellen (Abb.2).

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Abbildung 2 : Selektivitäten der NSAIDs nach Warner [15]

Seit einigen Jahren sind Rofecoxib (Vioxx® von MSD) und Celecoxib (Celebrex® von Pharmacia/Pfizer) in der klinischen Anwendung. Besonders für Dauertherapien und hochdosierte Therapien z.B. bei der Rheumatoiden Arthritis ist die Einnahme selektiver COX-2-Hemmer gegenüber klassischen NSAIDs zu bevorzugen, da die gastrointestinalen Nebenwirkungen deutlich geringer sind. Allerdings kommt es bei langfristiger Einnahme von COX-2-Hemmern oder in Kombination mit ASS ebenfalls zu einer Zunahme von gastrointestinalen Ulzera und Blutungen.
Klinische Studien zur Untersuchung des Einsatzes von COX-2-Hemmern bei Familiärer adenomatöser Polyposis (FAP) haben ergeben, daß durch Celecoxibeinnahme die Polypenzahl um 30% reduziert werden konnte [16]. Aufgrund dieser Studien hat die Food and Drug Agency 1999 in den USA Celecoxib für die Behandlung von FAP zugelassen.
Obwohl Celecoxib bereits in diversen klinischen Studien auf seinen adjuvanten Einsatz bei Krebserkrankungen untersucht wird, bleibt der Mechanismus noch immer umstritten, der für die zell- und tierexperimentell beobachtete Wirksamkeit von NSAIDs gegen Tumoren verantwortlich ist.

1.1.5 COX-2-Expression und Malignität

In malignen Tumoren konnte eine verstärkte Expression der Cyclooxygenase-2 festgestellt werden, so z.B. in kolorektalen Karzinomen [17], in Adenokarzinomen von Lunge [18,19], Prostata [20], Pankreas [21], Magen [22] und in Kopf- und Halstumoren [23].
Zur experimentellen Untersuchung der Familiären adenomatösen Polyposis wurden entsprechend FAP-Knockout-Mäuse hergestellt, welche sich als brauchbares Modell der FAP erwiesen haben. Da, wie oben beschrieben, die COX-2-Hemmung bei Patienten mit FAP günstige Effekte hatte, wurden COX-2-Knockout-Mäuse mit FAP-Knockout-Mäusen gekreuzt. Die COX-2/FAP-Knockouts entwickelten wesentlich weniger Polypen als die FAP-Knockout-Tiere. Außerdem konnte durch zusätzliche Gabe eines COX-2-Inhibitors die Polypenzahl der FAP-Knockout-Mäuse weiter drastisch reduziert werden [24]. Aufgrund dieser Ergebnisse wies man der COX-2 eine Schlüsselrolle bei der Tumorentwicklung des kolorektalen Karzinoms zu.
Eine andere Arbeit zeigt, daß die Überexpression der COX-2 in den Milchdrüsen von transgenen Mäusen zu Dysplasien und Tumorbildung führt [25].
Es ergaben sich ferner Hinweise auf eine Korrelation der COX-2-Expression mit der Prognose der Erkrankung:

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Bei Magenkarzinomen ist die COX-2-mRNA-Expression signifikant mit Stadium und Tumorgröße korreliert [26]. Duke’s stage, Tumorgröße und -differenzierung korrelierten auch bei kolorektalen Karzinomen mit vermehrter COX-2-Expression [27].

Schlechtere Überlebensraten wurden bei COX-2-positiven kolorektalen Karzinomen [27], Bronchialkarzinomen [28,29] und bei Ovarialkarzinomen [8] festgestellt.

Es konnten Zusammenhänge zwischen der COX-2-Überexpression in Tumoren und Apoptoseresistenz der Zellen nachgewiesen werden. Des weiteren haben COX-2-positive Tumoren einen höheren Vaskularisationsgrad, größere Invasivität und ein höheres Metastasierungspotential als COX-2-negative Tumoren (Tab.3).

↓9

Tabelle 3 : Experimentelle Untersuchungen zum Zusammenhang von Tumormalignität und COX-2-Expression

Apoptoseresistenz

in intestinalen Epithelzellen von Ratten, die mit einem COX-2-Expressionsvektor transfiziert wurden, nahm die Resistenz gegenüber Butyrat-induzierter Apoptose zu

die Apoptoseinhibition wurde durch Gabe von Sulindac Sulfid aufgehoben [30]

Metastasierung

bei Patienten mit hoher Expression von COX-2 im Primärtumor (Magenkarzinom bzw. kolorektales Karzinom) traten vermehrt Lymphknotenmetastasen auf [26,27]

der Anteil an Tumorzellen mit vermehrter COX-2-Expression lag in Lymphknotenmetastasen wesentlich höher als im Primärtumor (Bronchialkarzinom) [29]

Angiogenese

die Dichte der Mikrogefäße in Tumoren stieg mit der COX-2-Expression [27,31]

Invasivität und Adhäsivität

eine Zunahme von Invasivität [30] und Adhäsivität an die extrazelluläre Matrix [30] wurde bei Kolonkarzinom-zellinien beobachtet, die durch Vektortransfektion zur COX-2-Überexpression gebracht wurden

Es gibt verschiedene Theorien zu den molekularen Wirkmechanismen, über welche die COX-2 die Malignität von Tumoren beeinflussen kann. Diese sollen im folgenden dargestellt werden.

1.1.6 Erklärungsmodelle zu den tumorigenen Eigenschaften der COX-2

1.1.6.1 Inhibition der Apoptose – Steigerung der Proliferation

Prostaglandine, die Hauptprodukte der COX,davon insbesondere PGE2, sollen antiapoptotische bzw. wachstumsfördernde Effekte haben [11]. Bei der Untersuchung von Kolonkarzinomen wurden im Tumorgewebe signifikant erhöhte PGE2-Level gegenüber normaler Mukosa gefunden [32]. Kolonkarzinomzellinien zeigten bei Behandlung mit COX-2-Inhibitoren eine 1,5-fache Steigerung der Apoptose, der Effekt war rückläufig unter PGE2-Zugabe [33]. Andere Studien konnten nur proliferative jedoch keine antiapoptotischen Prostaglandinwirkungen feststellen [11,34].

↓10

Es gibt jedoch bisher nur wenige Hinweise auf einen Signaltransduktionsweg, durch den Prostaglandine direkt Apoptose oder Proliferation beeinflussen können. Ansatzpunkte dafür bieten folgende Arbeiten:

Die Peroxisom Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPARs), bei denen u.a. Eicosanoide als Liganden fungieren [35,36] sind Mitglieder der Klasse der Nukleären Hormonrezeptoren, die als Transkriptionsfaktoren bei Wachstum, Differenzierung und Apoptose der Zellen eine wichtige Rolle spielen. Eine vermehrte kolokalisierte Expression von PPAR + und COX-2 wurde in kolorektalen Karzinomen gezeigt [37]. Dieser Rezeptor steht in Zusammenhang mit Karzinogenese, da er apoptoseinhibierende Effekte vermittelt [38]. PPAR + wird in kolorektalen Karzinomzellen durch Prostacyclin (PGI2) aktiviert [37], d.h., die Apoptoseinhibition in Kolonkarzinomzellen könnte auf diesem Wege durch ein Prostaglandin vermittelt werden.

Andererseits gibt es auch die Beobachtung, daß PGJ2 (ein Metabolit von PGD2) als Ligand an PPARγ durch Induktion von Apoptose das Wachstum von Brochialkarzinomzellen inhibieren konnte [36]. Aufgrund dieser unterschiedlichen Ergebnisse wird vermutet, daß die Rolle der COX-2 bei der Apoptosemodulation und intestinalen Tumorigenese u.a. in ihrer Fähigkeit begründet liegt, das Spektrum der PPAR-Liganden zu verändern [38].
Weitere Hinweise für die Vermutung, daß PGE2 eher auf antiapoptotische Signaltransduktionswege wirkt, ergaben sich aus der Beobachtung, daß in Kolonkarzinomzellen durch PGE2-Gabe die Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 gesteigert wurde [33]. Analog dazu wurde in einer anderen Arbeit gezeigt, daß die vektorielle Überexpression der COX-2 in intestinalen Epithelzellen von Ratten zu Apoptoseresistenz und damit einhergehender vermehrter Bcl-2-Produktion führte [30]. Außerdem konnte in einer weiteren Studie durch selektive COX-2-Inhibition mit NS-398 in Prostatakarzinomzellen die Bcl-2-Expression verringert werden [39]. Andererseits war bei Celecoxib-induzierter Apoptose ebenfalls in Prostatakarzinomzellen keine Veränderung der bcl-2-Level nachweisbar. Auch die vektorielle Überexpression von bcl-2 stellte keinen Schutz gegen Celecoxib-vermittelte Apoptose dar [40].

↓11

Als ein anderer Mechanismus der Apoptoseinduktion durch NSAIDs wird eine Schlüsselfunktion der Arachidonsäure - das Substrat der COX - diskutiert. In Zellen, die mit COX-Inhibitoren behandelt werden, steigt die Arachidonsäurekonzentration an, da das Substrat nicht mehr verstoffwechselt werden kann. Die Arachidonsäure kann einerseits selbst Apoptosesignal sein [41,42], andererseits führt ein Anstieg der Arachidonsäurekonzentration zur Stimulation der Sphingomyelinase, die Sphingomyelin in Ceramid umwandelt, welches ein potenter Apoptoseinduktor ist. Ceramid führt zu Veränderungen der Mitochondrienmembran, was den Austritt von Cytochrom-c zur Folge hat und somit die Apoptose einleitet [34]. Diese Theorie wird durch den analogen Befund gestützt, daß durch Lipoxygenase–Inhibition bewirkter Arachidonsäureanstieg in der Zelle ebenfalls zu Apoptose führen kann [43].

Auch die Caspase-3, ein zentrales Enzym im Prozeß der Apoptose, findet sich unter den möglichen zellulären Proteinen, durch die eine COX-2-abhängige Beeinflussung des Zelltods erklärt wird. Apoptose, die mit der Aktivierung von Caspase-3 einherging, konnte sowohl durch

NS-398 in Bronchialkarzinomzellen [44] als auch durch Celecoxib in Prostatakarzinomzellen [40] induziert werden. Phäochromozytomzellen, in denen die COX-2 vektoriell exprimiert wurde, zeigten gegenüber Zellen ohne COX-2-Expression vermehrte Apoptoseresistenz beim Entzug des Überlebensfaktors Nerve Growth Factor (NGF). In COX-negativen Zellen, die mit PGE2 behandelt wurden sowie in COX-2-positiven Zellen war die Aktivität der proapoptotischen Caspase-3 vermindert, was als mögliche Erklärung für die geringere Apoptose dienen könnte [45]. Zusätzlich fanden die Autoren, daß durch COX-2-Überexpression oder durch PGE2-Applikation die Expression des Proteinihibitors (PIN) der neuronalen NO-Synthase (nNOS) erhöht wurde. Die nNOS vermittelt in mehreren Zellsystemen Apoptose durch Produktion von NO, welches durch Reaktion mit Superoxiden als apoptotisches Signal wirken kann. Es wird daher vermutet, daß die COX-2 durch Hemmung der nNO-Synthase-Aktivität protektiv gegenüber apoptotischen Stimuli wirkt [46].

↓12

In Mammakarzinomzellen, die COX-2 exprimieren und große Mengen PGE2 produzieren, wurden gleichzeitig die zu Onkogenen mutierten Ki-ras und H-ras gefunden, wohingegen in Zellen, die keine ras-Deletion aufwiesen, auch keine COX-2-Überexpression nachweisbar war [47]. Mutationen der ras-Gene oder der ras-regulierenden Gene können Tumoren hervorrufen.

1.1.6.2 Steigerung der Angiogenese

Tumorzellen sichern ihr Wachstum durch Sekretion von Angiogenesestimulatoren, dazu gehören vor allem VEGF (vascular endothelial growth factor), aber auch bFGF (basic fibroblast growth factor; synonym FGF-2) und PDGF (platelet derived growth factor).

Die Synthese von VEGF, der als einer der wichtigsten Faktoren gilt, kann durch die COX-2 bzw. durch deren Produkt PGE2 stimuliert werden. In Kunststoffimplantaten (subkutane Schwamm-Implantate) bei Ratten, einem Modell zur Untersuchung von Angiogenese, wurde vermehrte COX-2-mRNA-Expression hauptsächlich in den neovaskularisierten Endothelzellen gefunden. Injektion von bFGF stimulierte gleichsam COX-2-mRNA- und VEGF-mRNA-Expression und die Angiogenese in den Implantaten. COX-2-Inhibition führte dagegen zu verminderten VEGF-mRNA-Levels und zu reduzierter Gefäßneubildung. Die Produktion des VEGF erfolgte vor allem in Fibroblasten-ähnlichen Zellen, die um neugebildete Endothelzellen angesiedelt sind, was auf eine parakrine Kommunikation zwischen beiden Zellarten hindeutet [48].

↓13

Auch COX-2-Überexpression bei Kolonkarzinomzellen in Kokultur mit Endothelzellen führte zu verstärkter Produktion von Angiogenesefaktoren sowie zur Stimulation von Kapillarröhrenbildung und endothelialer Migration. Durch Gabe von NS-398 und Aspirin konnte die Angiogenese inhibiert werden. Andererseits stellten auch COX-1- und COX-2-negative Karzinomzellen Angiogenesefaktoren her und stimulierten Angiogenese, die durch Aspirin, nicht dagegen durch NS-398, inhibiert wurde. Bei Implantation dieser COX-negativen Zellen als Xenograft in Mäuse konnte eine Wachstumshemmung des Tumors nur durch Aspirin, nicht aber durch COX-2-selektive Inhibitoren erreicht werden. Diese Feststellung ließ die Autoren an eine mögliche Rolle der COX-1 in den Epithelzellen denken. Es konnte gezeigt werden, daß die antisense-COX-1-Ausschaltung in den Epithelzellen zu verminderter Kapillarröhrenbildung führte. Daraus wurde geschlossen, daß sowohl COX-1 in Endothelzellen für die Regulation der Angiogenese verantwortlich ist als auch COX-2, die die Produktion von Angiogenesefaktoren durch Tumorzellen moduliert [49].

Zu den Auswirkungen der Prostaglandine auf das Gefäßwachstum ist weiterhin bekannt, daß PGE2 die Produktion von Interleukin-6 (IL-6) in humanen Osteoblasten [50] und in Mastzellen [51] induzieren kann. Es gibt Hinweise für eine IL-6-vermittelte Beeinflussung der Angiogenese in Magenkarzinomen durch Modulation von VEGF [52].

In einer anderen Arbeit wird Thromboxan A2 (TXA2), das von aktiviertem Gefäßendothel produziert wird, als Mediator für COX-2-abhängige korneale Endothelmigration und Vaskularisation verantwortlich gemacht [53].

1.1.6.3 Steigerung der Invasivität

↓14

Mit COX-2 transfizierte Kolonkarzinomzellen zeigten erhöhte Invasivität, die mit der Aktivierung von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) korrelierte [54]. Sulindac Sulfid, ein COX-Inhibitor, konnte diesen Effekt inhibieren. Die Expression der MMPs ist sowohl mit erhöhter Invasivität von Tumorzellen durch Basalmembranen und Blutgefäßendothelien als auch mit verstärkter Metastasenbildung assoziiert [55].

1.1.6.4 Modulation von Inflammation und Immunosuppression

Das Wachstum von Tumorzellen ist häufig mit gleichzeitigen immunsuppressiven Effekten des Tumors auf das Stroma assoziiert. Der Wachstumsfaktor CSF (Colony stimulating factor) wird von Tumorzellen freigesetzt und stimuliert Monozyten und Makrophagen PGE2 herzustellen. PGE2 wiederum hemmt die Produktion von immunregulatorischen Zytokinen, z.B. TNF, sowie die T- und B-Zell-Proliferation und NK-Zellen. Außerdem verstärkt PGE2 die Interleukin-10-Synthese. Damit hat PGE2 vorwiegend immunsuppressive Eigenschaften [56].

1.1.6.5 Konversion von Prokarzinogenen zu Karzinogenen

Die Peroxidaseaktivität der COX kann durch die Oxidation von Xenobiotica für die Bildung von Mutagenen verantwortlich sein [57]. Hochreaktive Nebenprodukte der Arachidonsäureoxidation können mit DNA interagieren. Aufgrund seiner permanenten Xenobiotica-Exposition ist dieses besonders für den Darmtrakt bedeutsam und wird als mögliche Erklärung für das geringere Risiko, bei jahrelanger NSAID-Einnahme an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken, angeführt.

↓15

Angesichts dieser Ergebnisse erscheint es höchst vielversprechend, den chemotherapeutischen Einsatz selektiver COX-2-Hemmer bei Tumoren zu prüfen, auch wenn aufgrund der Vielzahl experimenteller Systeme noch nicht klar ist, welche NSAID-Wirkungen biologisch am bedeutsamsten sind.

1.1.7 Chemotherapie mit COX-2-Inhibitoren

1.1.7.1 Apoptoseinduktion

Mehrere Untersuchungen zeigen, daß COX-2-Hemmer in vitro Apoptose induzieren können. Diese sind in folgender Tabelle zusammenfassend dargestellt:

Tabelle 4 : Experimentelle Hinweise für Apoptoseinduktion durch COX-2-Hemmer im Zellinien-modell

NSAID

Zellinie

Konzentration des NSAIDs zur Apoptose-induktion

Apoptose durch PGE2-Gabe antagonisierbar

Apoptose auch bei

COX-2-negativen Zellen

NS-398

Kolorektales Karzinom, Adenom [58]

60-70µM

nein

ja

NS-398

Ösophageales Adenokarzinom [59]

0,1-10µM

nicht untersucht

nein

NS-398

Ösophageales Karzinom [60]

100µM

ja

nein

NS-398

Prostatakarzinom [39]

100µM

nicht untersucht

nein, allerdings wurden hier fetale Prostata-Fibroblasten verwendet

Nimesulid

Bronchialkarzinom [61]

100µM

nicht untersucht

ja

Celecoxib

Prostatakarzinom [40]

50µM

nicht untersucht

nicht untersucht

JTE-522

Magenkarzinom [62]

250µM

nicht untersucht

nicht untersucht

SC-58125

Kolonkarzinom [33]

25µM

ja

nicht untersucht

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Auch verschiedenste nichtselektive NSAIDs wie z.B. Aspirin, Indomethacin, Naproxen, Piroxicam, Sulindac Sulfon, Sulindac Sulfid und Sulindac zeigten in Kolonkarzinomzellinien proapoptotische Effekte [zusammengefaßt in 63].

1.1.7.2 Beeinflussung der Invasivität und Metastasierung

Aspirin und NS-398 konnten bei Hepatomzellen die durch HGF (Hepatocyte Growth Factor) induzierte Invasivität der Zellen im Matrigel-Invasionsassay hemmen [64].

COX-2-selektive Inhibitoren hemmten außerdem die Matrigel-Invasion von Bronchialkarzinomen sowie die Spontanmetastasierung in SCID-Mäusen [29].

1.1.7.3 Hemmung der Zellproliferation

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SC-58125, ein selektiver COX-2-Inhibitor, führte bei Xenograft-Mäusen mit menschlichen Kolonkarzinomzellen zu Wachstumshemmung der Tumoren. Es konnte keine Apoptose festgestellt werden statt dessen aber eine verzögerte Zellzyklusprogression beim G2/M-Phasen-Übergang [65].

Aspirin und Indomethacin reduzierten das Zellwachstum von Bronchialkarzinomzellen in vitro und in Xenograft-Mäusen [66]. NS-398 (50µM) konnte unabhängig von der COX-2-Expression das Zellwachstum von hepatozellulären Karzinomen hemmen [67].

1.2 Die non-COX-Targets

Bereits seit einigen Jahren mehren sich die Hinweise dafür, daß die antitumorigenen Eigenschaften der NSAIDs nicht nur COX-1- oder COX-2-abhängig sind, sondern auch über sogenannte non-COX-Targets vermittelt werden. Auffällig erscheinen besonders die im Vergleich zur IC50 der COX meist viel höheren Konzentrationen, die zur Apoptoseinduktion oder Proliferationshemmung notwendig sind. Außerdem wurden vergleichbare antiproliferative bzw. apoptotische Effekte auch in COX-2-negativen Zellen erzielt (Tab.4). Die erzielten Effekte waren oftmals nicht durch Gabe von Prostaglandinen antagonisierbar, was zusätzlich einen Prostaglandin-unabhängigen Mechanismus vermuten läßt [Tab.4;68].

↓18

Im Rattenmodell mit Azoxymethan-induzierten Kolonmalignomen konnte durch Gabe von Sulindac-Sulfon, einem Metaboliten von Sulindac, der keine COX-Inhibition bewirkt, in gleicher Weise wie durch Sulindac und Piroxicam Anzahl und Größe an Adenomen und Karzinomen verringert werden [69].

Diese und andere Hinweise motivierten zur Suche nach COX-unabhängigen Targets. Dabei divergieren die Ergebnisse teilweise sehr stark zwischen den einzelnen NSAIDs und den untersuchten Zellarten.

1.2.1 Targets in Signaltransduktionswegen der Apoptose

Als mögliches COX-unabhängiges Target wird z.B. der Nuclear Factor kappa B (NFB) diskutiert. Dieser gilt als Überlebens- und Proliferationsfaktor, kann aber auch Apoptose induzieren – je nach Zelltyp und Induktor [70]. Z.B. ist NFB-Expression vermutlich mit Mammakarzinomen assoziiert, da hohe Konzentrationen dieses Faktors in den Zellkernen von Mammkarzinomen gefunden wurden, während die Zellkerne von normalem Epithel der Mamma nur sehr wenig NFB aufwiesen [71].

↓19

Untersuchungen zeigten, daß Aspirin, Salizylat und Sulindac durch Verhinderung der NFB-Aktivierung die Apoptose beeinflussen [72,73]. Durch diese Medikamente wird die Abspaltung des IB von NFB blockiert, wodurch NFB nicht aktiviert wird, d.h. nicht in den Zellkern translozieren und die Expression von verschiedenen Genen regulieren kann.

Sulindac als auch die Metabolite Sulindac Sulfid und Sulindac Sulfon inhibierten in Kolonkarzinomzellen die NFB-Aktivierung und induzierten Apoptose [72]. Sulindac Sulfon besitzt keine COX-inhibitorischen Eigenschaften.

Aspirin konnte die Invasivität von Epstein-Barr-Virus-assoziierten Tumorzellen in vivo und in vitro durch Verringerung der Bildung von Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) reduzieren [74]– einhergehend mit einer Inhibition der NFB-Aktivierung. Die MMP-9-Expression wird durch NFB reguliert [75].

↓20

Andererseits wird über Kolonkarzinomzellen berichtet, daß nach Behandlung mit Aspirin NFB durch komplette Degradation von IBα, dem NFB-inhibierenden Protein, aktiviert wird, was ebenfalls mit vermehrter Apoptose einherging [76].

Diese vermutlich aufgrund unterschiedlicher Zellsysteme und der eingesetzten Konzentrationen widersprüchlich erscheinenden Daten weisen auf zelltypspezifische sowohl positive als auch negative Regulation des NFB durch NSAIDs hin; es liegt offensichtlich kein einheitlicher Mechanismus vor. Zusätzlich kann NFB möglicherweise auch indirekt über andere zelluläre Targets der NSAIDs beeinflußt werden:

Über Celecoxib wurde berichtet, daß es Apoptose in Prostatakarzinomen induziert, indem es die Phosphorylierung der Proteinkinase B (PKB/Akt) hemmt und somit auch deren antiapoptotische Aktivität [40]. Dieser Aspekt ist insofern interessant, da die PKB wiederum NFB aktivieren kann: In humanen Leukämiezellen führte die PKB-Überexpression zu Apoptoseresistenz und vermehrter NFB-Aktivierung [77].

↓21

Die zuvor bereits erwähnten Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPARs, vgl.1.1.6), die durch NSAIDs inhibiert werden, wurden ebenfalls in Zusammenhang mit COX-unabhängigen Mechanismen der NSAIDs gebracht: PPAR + -Aktivität konnte sowohl durch Sulindac als auch durch Sulindac Sulfon, ein Metabolit ohne COX-inhibitorische Eigenschaften, gehemmt werden, was die Autoren darauf zurückführen, daß einige NSAIDs die Bindung von PPAR + an die DNA direkt inhibieren [78].

Des weiteren können Liganden an PPARγ, zu denen auch das COX-Produkt PGJ2 zählt, die Aktivierung von NFB in Kolonkarzinomzellen inhibieren [79], so daß eine indirekte Beeinflussung des NFB durch NSAIDs vorliegen könnte.

Daher kann man hier sowohl von COX-abhängiger als auch -unabhängiger Regulation ausgehen.

↓22

Erwähnt werden soll als weiteres COX-unabhängiges Target der Nerve Growth Factor induced clone B (NGFI-B, synonym Nur77 oder TR3). Dieser Faktor führt nach Aktivierung durch apoptotische Stimuli zu Cytochrom-c-Freisetzung aus den Mitochondrien und somit zum programmierten Zelltod [80]. Indomethacin konnte in Kolonkarzinomzellen Apoptose hervorrufen, die mit Nur77-Induktion assoziiert war [81].

1.2.2 Targets mit Einfluß auf die Zellproliferation

Weitere Arbeiten zeigen NSAID-Targets im Zellzyklus (p21, p27, p53, CDKs, Cycline) und in der Streßantwort von Zellen (MAP-Kinase-Kaskade: IKK, Erk1/2, p38, JNK, p90RSK; Hitzeschockproteine: HSF-1, Hsp70) [zusammengefaßt in 70]. Auf Zellzyklustargets der NSAIDs bzw. der COX-2-Inhibitoren soll im Zusammenhang mit der Diskussion dieser Arbeit (vgl. 5.2) noch genauer eingegangen werden.

Die Vielfalt der Ergebnisse bei der Suche nach einem allgemeingültigen Prinzip für die Wirkung der NSAIDs auf die Zelle ist vermutlich in den erheblichen Strukturunterschieden der NSAIDs selbst begründet und in der Vielfältigkeit der untersuchten Zellen, in vivo wie in vitro.

1.3 Ovarialkarzinome, COX-2 und NSAIDs

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Laut den amerikanischen Cancer Statistics 2002 [82] und den geschätzten Daten des Robert Koch-Instituts für die BRD machen Ovarialkarzinome 4% aller neu auftretenden Krebserkrankungen von Frauen aus, ihre Letalität ist aber von den gynäkologischen Krebserkrankungen am höchsten. Ovarialkarzinome werden oftmals erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert und haben daher meist eine sehr schlechte Prognose mit einer Fünfjahresüberlebensrate von rund 30% [83]. Derzeit existieren keine erfolgreichen Screening-Programme zur Früherkennung.

Die Rolle der COX-2 bei diesen Tumoren als auch der Einsatz selektiver COX-2-Inhibitoren zur Therapie von Ovarialkarzinomen ist bisher erst wenig charakterisiert. Erhöhte COX-2-Expression konnte bereits sowohl in benignen als auch in malignen Tumoren des Ovars gezeigt werden [84]. Aus einer vorangegangenen Studie der Arbeitsgruppe [8] gibt es Hinweise darauf, daß die COX-2 ein unabhängiger prognostischer Faktor bei Ovarialkarzinomen ist. Im Aszites von Patienten mit malignen Tumoren des Ovars waren die PGE2-Spiegel signifikant erhöht gegenüber der Kontrollgruppe. Bei Karzinomen mit COX-2-Expression war die mittlere Überlebensrate reduziert, was sich besonders deutlich bei Patientinnen unter 60 Jahren zeigte.
Aus einer anderen Arbeit geht hervor, daß der Anteil an Nonrespondern in der Platin-Chemotherapie erhöht ist, wenn die Tumoren COX-2-Expression aufweisen [85]. Hier konnte jedoch kein Zusammenhang zur Prognose nachgewiesen werden. Die geringe Zahl an Untersuchungen läßt betreffs der prognostischen Bedeutung der COX-2 noch keine abschließenden Aussagen zu.

Die bisherigen Daten zu der Frage, ob die regelmäßige Einnahme von NSAIDs das Erkrankungsrisiko für Ovarialkarzinome senken kann, geben kein eindeutiges Bild. Einige Untersuchungen zeigen ein vermindertes Risiko durch Einnahme von NSAIDs [86], Aspirin [87,88] und Acetaminophen [89]. In einer anderen Arbeit konnte kein Zusammenhang zwischen Aspirin-Einnahme und dem Erkrankungsrisiko nachgewiesen werden [90].

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Zu den direkten Wirkungen der NSAIDs auf Ovarialkarzinomzellinien sind bisher kaum Ergebnisse vorhanden. Es gibt Hinweise auf antiproliferative und apoptoseinduzierende Effekte durch die Behandlung von Ovarialkarzinomzellinien mit NSAIDs [91]. Auch diese Wirkungen konnten nur in Konzentrationen erreicht werden, die vielfach höher sind als die zur Inhibition der COX-2 benötigten. Es gibt ebenfalls keine Aussagen darüber, ob es sich dabei um COX-abhängige oder -unabhängige Mechanismen handelt. Daher soll diese Problematik in der vorliegenden Arbeit untersucht werden.


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17.01.2005